CN104178539B - 一种规模化制备特定分子量小分子透明质酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种规模化制备特定分子量小分子透明质酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明采用水蛭来源的透明质酸酶，以水为反应介质，水解高分子透明质酸，实现了高效制备370000Da、80000Da、30000Da、9000Da、4000Da特定分子量的透明质酸，实现了发酵罐上制备小分子透明质酸，适合于工业化生产应用。

Description

一种规模化制备特定分子量小分子透明质酸的方法
技术领域
本发明涉及一种规模化制备特定分子量小分子透明质酸的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
透明质酸(hyaluronic acid，简称HA)，俗称玻璃尿酸，是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖为重复双糖单位，通过β(1-3)和β(1-4)糖苷键交替连接而成的大分子酸性黏性多糖，1934年由Meyer等人从牛玻璃球眼中首次提取获得，广泛用于医药、化妆品、食品等领域。研究表明，分子量对透明质酸的活性有很大影响，不同分子量的透明质酸甚至表现出截然相反的活性。
透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，由于HA具有良好的保湿性、粘弹性、渗透性和延展性，同时无任何免疫原性和毒性，被广泛应用于化妆品、食品和医药等行业领域。
根据文献研究表明，分子量大小对HA的生物活性影响较大，不同分子量范围的HA表现出截然不同的生理学功能。高分子量的HA(Mr>2×106)由于具有较好的粘弹性、保湿性、抑制炎性反应、润滑等功能，可应用于高端化妆品行业、眼科手术黏弹剂和关节腔内注射治疗。中等分子量的HA(介于1×105-106)具有良好的保湿性、润滑和药物缓释作用，可广泛用于化妆品、滴眼液、皮肤烧伤愈合及术后防粘连。低分子量的HA和寡聚透明质酸，表现出非常强的生物活性，具有抑制肿瘤扩散、促进创伤愈合、促进骨和血管生成、免疫调节等作用，且易于渗透到真皮中，免疫细胞、细胞因子的激活剂。因此，小分子透明质酸在食品保健、化妆品以及临床医疗领域具有广阔的应用前景。
制备小分子量的方法有物理降解法、化学降解法、酶解法。物理法主要为加热、机械剪切力、紫外线、超声波、60Co照射、γ-射线辐射等方法促使HA发生降解。物理降解法处理过程简单，产品易于回收。但是，这些方法都会带来一定的影响，例如加热法易使HA变色，紫外和超声效率较低等，且产生的小分子分子量范围较大，产品稳定性较差。HA的化学降解方法有水解法和氧化降解法，水解法分酸水解(HCl)和碱水解(NaOH)，氧化降解常用的氧化剂为次氯酸钠(NaClO)和过氧化氢(H2O2)。但化学降解法引入了化学试剂，反应条件复杂，易给HA性质产生影响和给产品的纯化带来困难，且产生大量的工业废水。酶解法是透明质酸在透明质酸酶的作用下，糖链上的糖苷键发生断裂，但通常酶解的成本很高，不适合大规模的工业生产。
本发明为解决制备小分子HA的问题，采用生物酶法催化降解HA，产生分子量范围均一的小分子透明质酸。由于生物酶法反应条件温和、专一性高、且产品纯度高，实现了工业化生产制备小分子透明质酸。
发明内容
本发明公开了一种规模化制备特定分子量小分子透明质酸的方法，是向水中加入高分子透明质酸和透明质酸酶，控制不同反应时间制备不同分子量(聚糖单位)的小分子透明质酸，实现工业化生产。
编码所述透明质酸酶的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示的序列。
所述高分子HA的分子量是104kDa以上。优选2.212×1014Da。
所述方法优选在带有自动温控和搅拌装置的发酵罐中进行。
所述方法的反应体系优选含有透明质酸酶1×106U/L-4×108U/L和高分子透明质酸2-100g/L，在10℃-65℃，400-1000rpm搅拌速度条件下反应1-13h，制备平均分子量在4000Da至370000Da的透明质酸。
进一步优选含有透明质酸酶3×107U/L和高分子透明质酸40g/L，在45℃，700rpm搅拌速度条件下反应不同时间制备不同分子量的透明质酸。
为制备出平均分子量为370000Da的透明质酸，反应时间优选1小时。为制备出平均分子量为80000Da的透明质酸，反应时间优选2.5小时。为制备出平均分子量为30000Da的透明质酸，反应时间优选3.5小时。为制备出平均分子量为9000Da的透明质酸，反应时间优选7小时。为制备出平均分子量为4000Da的透明质酸，反应时间优选12.5小时。
本发明利用透明质酸酶直接降解HA制备小分子透明质酸，具有直接的目的性。与其他方式相比，该发明具有非常大的应用优势。首先，反应条件极其简单，在常温常压下即可实施，透明质酸溶解在水中，不需要缓冲液，生产成本低；其次酶水解工艺不需添加任何有机试剂，无任何污染废弃物产生；最后，由于没有添加盐类，产物在水溶液中比较单一，易于纯化回收，产量极高，实现了工业化生产小分子透明质酸。基于应用分析，本发明方法在工业上用于制备单一寡聚透明质酸及其衍生体具有潜在而非常广泛的价值。
附图说明
图1是酶促反应过程中HA分子量变化趋势图；
图2是分子量370000Da的透明质酸的HPSEC(高效分子排阻色谱)图；
图3是分子量80000Da的透明质酸的HPSEC图；
图4是分子量30000Da的透明质酸的HPSEC图；
图5为分子量9000Da左右的透明质酸的HPSEC图；
图6为分子量4000Da左右的透明质酸的HPSEC图。
具体实施方式
水解产物检测分析方法：使用安捷伦公司的高效液相色谱仪1260进行分析，选择示差检测器RID，使用凝胶色谱柱Ultrahydrogel Linear进行分析。流动相选择0.1M硝酸钠进行洗脱，柱子温度设定为40摄氏度，进样量40μL，每个样品洗脱时间25min，使用中国食品药品检定研究院出产的右旋糖酐作为标准品，利用GPC软件进行平均分子质量的计算。
透明质酸酶活力单位定义：在pH5.5和38℃下，每小时从透明质酸中释放1μg葡萄糖还原当量的还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。DNS还原糖测定方法测定酶活。
实施例1透明质酸酶的表达
全化学合成经改造的透明质酸酶基因序列(SEQ ID NO.1)，酶切连接至表达载体pPIC9K构建重组质粒pPIC9K-His-HaseA3887，转化至E.coil DH5α中，提取质粒测序验证。将重组质粒经SalI线性化后电转入表达宿主P.pastoris GS115中，重组克隆子经PCR验证正确。
重组P.pastoris GS115/pPIC9K-His-HaseA3887克隆子进行发酵培养表达。单克隆接种于5ml的YPD培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)，30℃、200rpm培养16h。按10％的接种量转接于100ml的诱导表达培养基BMGY(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/LK2HPO4，11.8g/LKH2PO4，10×YNB 100ml/L(13.4g/L)，500×生物素1mL(4×10- 4g/L)，甘油10mL)，30℃ 200rpm培养至OD600值为4之间。离心收集菌体，更换至100mL诱导表达培养基BMMY(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/LK2HPO4，11.8g/LKH2PO4，100×YNB100mL/L(13.4g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甲醇5mL)，30℃ 200rpm培养，每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为1.0％(v/v)进行诱导表达，诱导表达96h。
实施例2重组透明质酸酶的纯化制备
SEQ ID NO.1所示的基因经转录翻译后在透明质酸酶N端融合了6个连续组氨酸标签，根据亲和层析原理，该标签能特异性与葡聚糖镍结合。葡聚糖镍先用pH6.0、50mM的磷酸盐缓冲液平衡30min，再加入经过0.45μm过滤的发酵液，在4℃孵育2h，依次用相同缓冲液配置的0、10、20、30、40、50mM的咪唑缓冲液进行洗脱杂质。最后用500mM的咪唑缓冲液洗脱目标蛋白。高浓度咪唑洗脱的目标蛋白进行过夜透析。获得单一条带的透明质酸酶纯蛋白，所得透明质酸酶纯蛋白，经测定，具有透明质酸酶活力。
实施例3小分子量透明质酸的制备
以水蛭来源的透明质酸酶对大分子量透明质酸进行水解，起始分子量大小是2.212×1014Da。上罐体积1L，在发酵罐中加入900mL的水，并加入透明质酸酶3×107U和透明质酸40g，最后加水至1L，在45℃、转速为700rpm条件下反应。每隔半小时取样并在沸水中煮沸10分钟将酶灭活，样品采用0.22μm的滤膜过滤，使用凝胶柱进行分子量测定，绘制出的分子量变化趋势图。发酵罐在1小时高温灭活，可制备出分子量为370000Da的透明质酸；发酵罐在2.5小时高温灭活，可制备出分子量为80000Da的透明质酸；发酵罐在3.5小时高温灭活，可制备出分子量为30000Da的透明质酸，发酵罐在7小时高温灭活，可制备出分子量为9000Da的透明质酸，发酵罐在12.5小时高温灭活，可制备出分子量为4000Da的透明质酸。如图1所示，罐中HA分子量变化趋势图。如图2所示，是分子量370000Da的HPSEC图。如图3所示，是分子量80000Da的HPSEC图。如图4所示，是分子量30000Da的HPSEC图。如图5所示，是分子量9000Da的HPSEC图。如图6所示，是分子量4000Da的HPSEC图。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种制备特定分子量透明质酸的方法，其特征在于，是向水中加入高分子透明质酸和透明质酸酶，控制不同反应时间制备不同分子量的小分子透明质酸；编码所述透明质酸酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述高分子透明质酸的分子量是104kDa以上；反应体系含有透明质酸酶3×107U/L-4×108U/L和高分子透明质酸2-40g/L，在10℃-65℃，400-1000rpm搅拌速度条件下反应1-3.5h，制备平均分子量在30000Da至370000Da的透明质酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应1小时，制备平均分子量为370000Da的透明质酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应2.5小时，制备出平均分子量为80000Da的透明质酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应3.5小时，制备出平均分子量为30000Da的透明质酸。
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