CN104178461B - 携带cas9的重组腺病毒及其应用 - Google Patents
携带cas9的重组腺病毒及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104178461B CN104178461B CN201410400098.XA CN201410400098A CN104178461B CN 104178461 B CN104178461 B CN 104178461B CN 201410400098 A CN201410400098 A CN 201410400098A CN 104178461 B CN104178461 B CN 104178461B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- encoding gene
- cas9
- sequence
- gene
- sequence table
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title claims abstract description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 85
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 claims description 48
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 33
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 29
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 26
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 14
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 7
- 108010048401 CCAAT-Enhancer-Binding Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000009122 CCAAT-Enhancer-Binding Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 claims description 3
- 239000002574 poison Substances 0.000 claims description 3
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 15
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 abstract description 10
- 230000004853 protein function Effects 0.000 abstract description 5
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 abstract description 4
- 230000004907 flux Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003198 gene knock in Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 16
- 238000011160 research Methods 0.000 description 16
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 14
- 230000009471 action Effects 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 101150061453 Cebpa gene Proteins 0.000 description 11
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 230000008263 repair mechanism Effects 0.000 description 6
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 5
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- 241000218636 Thuja Species 0.000 description 2
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 2
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000008676 import Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 102000005869 Activating Transcription Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010005254 Activating Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010065459 CCAAT-Enhancer-Binding Protein-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102100034808 CCAAT/enhancer-binding protein alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001635598 Enicostema Species 0.000 description 1
- 241000165940 Houjia Species 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 206010027626 Milia Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100439101 Mus musculus Cebpa gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091081548 Palindromic sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 description 1
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 1
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 101710185494 Zinc finger protein Proteins 0.000 description 1
- 102100023597 Zinc finger protein 816 Human genes 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000005645 nematicide Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种携带CAS9的重组腺病毒及其应用。本发明要求保护携带Cas9蛋白的编码基因的重组腺病毒；所述Cas9蛋白如序列表的序列7所示。所述Cas9蛋白的编码基因具体可如序列表的序列6自5’末端第789‑5045位核苷酸所示。本发明还保护以上所述的重组腺病毒在制备用于敲除目的基因的试剂盒中的应用。CRISPR方法具有效率高，速度快，费用低的特点。本发明提供的CAS9的重组腺病毒可用于：(1)蛋白功能细胞平台，快速基因修饰，高通量筛选；(2)肝脏蛋白功能平台，在肝脏实现快速、特异基因敲除；(3)小鼠基因改造平台，制备基因敲除/敲入小鼠。
Description
技术领域
本发明涉及一种携带CAS9的重组腺病毒及其应用。
背景技术
随着基因组注释项目(genome annotation projects)的不断发展和完善，以及蛋白质组计划(proteome projects)的实施，科研人员们已经开始跃跃欲试，想要将组学研究的成果尽早地运用到基础科学研究的各个领域，以及个性化医疗(personalizedmedicine)当中。不过海量的组学信息也给科研人员们出了一个不小的难题，那就是该如何将这些枯燥的数据转换成有意义的蛋白质功能，或者与临床相关的信息呢？解决这个问题的核心就在于尽快开发出一种高效率的、可靠的方法，来帮助科研人员研究基因型(genotype)对表型(phenotype)的影响作用。利用同源重组机制(homologousrecombination)对基因进行定向失活(Targeted gene inactivation)就是这样一种好方法，可以帮助科研人员明确基因或蛋白的功能。不过在实际工作中使用这种方法也会受到好几个因素的限制，比如存在效率太低、费时费力、而且有可能导致突变等的限制。
近十年来出现了两种新的研究手段，可以帮助科研人员对各种细胞和各种生物体内的几乎任意基因进行人工操作。这种新技术就是我们常说的“基因组编辑技术(genomeediting)”，包括锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFN)和转录激活因子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)。这两种核酸酶都是嵌合体，都是由经过设计的、序列特异性的DNA结合元件(programmable,sequence-specific DNA-binding modules)和非特异性的DNA切割结构域结合而成的。ZFN和TALEN都可以对DNA进行各种遗传修饰，这两种核酸酶的作用机制都是先对DNA双链分子进行切割，形成DNA双链断裂切口(DNA double-strand break，DSB)，然后激活细胞内的非同源末端连接(nonhomologous end joining，NHEJ)修复机制(这是一种非保真的、容易出现遗传突变的修复机制)或者同源重组(homology-directed repair，HDR)修复机制(这是一种高保真的修复机制，不容易出现突变)，利用细胞自身的修复机制对DNA进行遗传学修饰。
这种由序列特异性的DNA结合结构域与非特异性的DNA切割结构域组合而成的人工核酸酶就是这种基因组编辑技术的重要组成部分。这些嵌合式的核酸酶能够以极高的效率、极高的精确度对基因组进行人工修饰，切割DNA产生DSB，然后利用NHEJ或HDR等DSB修复机制完成所需要的各种人工修饰。由于科研人员们对锌指蛋白和TALE蛋白等蛋白的DNA结合结构域的设计能力越来越强，所以这种基因组编辑技术的应用范围也一再地被拓展。这些既简单又灵活的核酸酶在遗传工程学领域里发挥了极大的作用，其重要性也在与日俱增，已经站到了遗传工程工作的最前线。
CRISPRs全称为规律成簇间隔短回文重复(Clustered regularly interspacedshort palindromic repeats)，这是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构。这一模式出现在超过40％的细菌和90％的古生菌中。研究表明，CRISPR与一系列相关蛋白、前导序列一起，能为原核生物提供对抗噬菌体等外源基因的获得性免疫能力。
起初，很多研究人员假定这些奇怪的重复序列是毫无意义的，但是2005年，三个生物信息学团队报告，间隔区DNA通常和噬菌体的基因序列相匹配，表明CRISPR在微生物免疫中可能发挥了作用。马里兰州美国国家生物技术信息中心的Eugene Koonin和他的同事提出，细菌和古生菌获得了噬菌体DNA，之后将其作为RNA分子(能阻止外来DNA的匹配)的一个模板保存起来，就像真核细胞利用一个被称作核糖核酸干扰(RNAi)的***摧毁RNA一样。
2007年，Rodolphe Barrangou、Philippe Horvath和其他人证明，他们能通过添加或删除和噬菌体DNA相匹配的间隔区DNA，改变嗜热链球菌对噬菌体攻击的抵抗力。这一发现使得杜邦公司能够为食品生产培育更强壮的菌株。他们同时也发现了其中隐藏的基本的原理：遭遇噬菌体入侵时，CRISPR会作出反应，此时细菌把间隔区DNA和DNA回文序列转录成一串长的RNA分子，tracrRNA(一个额外的RNA片段)和Cas9一起作用产生crRNA(源自间隔区的RNAs)。2011年，Charpentier于在《自然》杂志上提出，Cas9、tracrRNA和crRNA一起以某种方法攻击和crRNA配对的外来DNA。
不仅是食品科学家和微生物学家，很多领域的研究人员都意识到细菌免疫***的重要性，因为它具备一个非常有价值的特性：以某个特定的基因序列为目标。许多科研团队利用它来删除、添加、激活或抑制人体、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞中的目标基因，从而证明了这个技术的广泛适用性。
在以上提到的三种精确操纵基因的技术中，CRISPR的功效和易用性在各方面都更胜一筹。在切割目标DNA方面，CRISPR***要比TALENs更高效，且能比TALENs处理更多的基因。
Zhang Feng和他的同事的实验显示，CRISPR能立刻锁定和切割人体细胞中的两个基因。在与马萨诸塞州怀海德生物医学研究所发育生物学家Rudolf Jaenisch的合作中，Zhang***了小鼠胚胎干细胞中的5个基因。这些工作为培育转基因小鼠打下了基础，这是生物医学研究的一个关键工具。他的团队发现，这能简单地将Cas9信使RNA和两个向导RNAs注入老鼠的卵子或受精卵中。此外，通过对Cas9基因进行改构和利用一对gRNA引入不同的切割位点，CRISPR的脱靶效应问题也被克服。至此，CRISPR技术本身走向完善，并开始进入了应用阶段。
发明内容
本发明的目的是提供一种携带CAS9的重组腺病毒及其应用。
本发明要求保护携带Cas9蛋白的编码基因的重组腺病毒；所述Cas9蛋白如序列表的序列7所示。所述Cas9蛋白的编码基因具体可如序列表的序列6自5’末端第789-5045位核苷酸所示。
所述的重组腺病毒的制备方法包括如下步骤：
(1)将所述Cas9蛋白的编码基因***pDONRTM221载体的attL1和attL2位点之间，得到中间质粒；
(2)将中间质粒与pAD-DEST载体发生gateway反应，得到含有所述CAS9蛋白的编码基因的重组质粒，即为重组质粒pAD-DEST-CAS9；
(3)将重组质粒pAD-DEST-CAS9导入哺乳动物细胞并培养，得到所述重组腺病毒。
所述中间质粒具体可为用序列表的序列6所示的含有Cas9蛋白的编码基因的双链DNA分子替换pDONRTM221载体的attL1和attL2之间的小片段(含attL1和attL2)，得到的重组质粒。
所述哺乳动物细胞具体可为293细胞。
本发明还保护一种重组质粒(重组质粒pAD-DEST-CAS9)，其制备方法如下：
(1)将所述Cas9蛋白的编码基因***pDONRTM221载体的attL1和attL2位点之间，得到中间质粒；
(2)将中间质粒与pAD-DEST载体发生gateway反应，得到含有所述CAS9蛋白的编码基因的重组质粒。
本发明还保护以上任一所述的重组腺病毒在制备用于敲除目的基因的试剂盒中的应用。所述目的基因具体可为CEBPA蛋白的编码基因。所述CEBPA蛋白的编码基因具体可为具有序列表的序列3所示的核苷酸的DNA分子。
本发明还保护一种用于敲除目的基因的试剂盒，包括以上任一所述的重组腺病毒。所述试剂盒还可包括携带所述目的基因的sgRNA的编码基因的重组慢病毒。所述目的基因具体可为CEBPA蛋白的编码基因。所述CEBPA蛋白的编码基因具体可为具有序列表的序列3所示的核苷酸的DNA分子。所述目的基因的sgRNA的编码基因具体可如序列表的序列1或序列2所示。所述携带所述目的基因的sgRNA的编码基因的重组慢病毒的制备方法具体如下：将重组质粒pLenti-U6 sgRNA导入哺乳动物细胞并培养，得到携带所述目的基因的sgRNA的编码基因的重组慢病毒；所述重组质粒pLenti-U6sgRNA的制备方法如下：①合成序列表的序列1所示的双链DNA分子并作为模板，采用序列表的序列4所示的单链DNA分子和序列表的序列5所示的单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；②合成序列表的序列2所示的双链DNA分子并作为模板，采用序列表的序列4所示的单链DNA分子和序列表的序列5所示的单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；③用限制性内切酶SalI和XbaI酶切pLKO.1载体，回收载体骨架；④将步骤①得到的PCR扩增产物、步骤②得到的PCR扩增产物和步骤③得到的载体骨架连接，得到重组质粒pLenti-U6 sgRNA。所述试剂盒还可包括所述重组质粒pLenti-U6 sgRNA。所述哺乳动物细胞具体可为293T细胞。
发明人构建了pLenti-U6 sgRNA慢病毒载体和CAS9腺病毒载体。pLenti-U6 sgRNA慢病毒载体导入哺乳动物细胞并培养，可以得到表达特定基因的小向导RNA(small guideRNA，sgRNA)的重组慢病毒。根据实验的要求，可以设计并合成针对不同基因的pLenti-U6sgRNA载体。CAS9腺病毒载体导入哺乳动物细胞并培养，可以得到表达CAS9蛋白的重组腺病毒。将表达特定基因的小向导RNA的重组慢病毒和表达CAS9蛋白的重组腺病毒共同感染目的细胞，就可以沉默目的细胞中的特定基因，很方便的对各种细胞进行基因组编辑。也可以将表达特定基因的小向导RNA的重组慢病毒和表达CAS9蛋白的重组腺病毒共同感染小鼠，可以对小鼠肝脏(腺病毒在肝脏中可以得到富集)中蛋白进行基因组编辑，从而无需制备转基因组小鼠。制备转基因小鼠耗费的时间长，约需3个月，应用病毒感染的方法仅需1-2周。制备转基因小鼠的单个基因费用在大约15万元，应用病毒感染的方法所需花费在1万元左右。
CRISPR方法具有效率高，速度快，费用低的特点。本发明提供的CAS9的重组腺病毒可用于：(1)蛋白功能细胞平台，快速基因修饰，高通量筛选；(2)肝脏蛋白功能平台，在肝脏实现快速、特异基因敲除；(3)小鼠基因改造平台，制备基因敲除/敲入小鼠。
附图说明
图1为实施例2的结果。
图2为实施例3的步骤3的结果。
图3为实施例3的步骤4的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pLKO.1载体：sigma公司，货号：SHC001。293T细胞：ATCC，编号为CRL-3216。AML12细胞(小鼠正常肝细胞)：ATCC，编号为CRL-2254。293细胞：ATCC，编号为CRL-1573。pAD-DEST载体(pBLOCK-iTTM6-DEST Vector)：Invitrogen公司，产品目录号为V48720。C57小鼠：北京华阜康生物科技股份有限公司。pDONRTM221载体(pDONRTM221Vector)：Invitrogen公司，目录号12536017。
实施例1、sgRNA病毒液和CAS9病毒液的制备
一、靶位点的选择
采用CCAAT增强子结合蛋白-A(CCAAT-enhancer binding protein-alpha,CEBPA)作为靶序列，验证CRISPR/Cas9***的可靠性和真实性，为了避免脱靶效应，选择两个gRNA串联的靶区域，
两个gRNA的DNA序列分别如下：
gRNA1：5’-GAAAGGACGAAACACCGAAGGCGGCCGGGTCGATGTAGGgttttagagctagaaat-3’；
gRNA2：5’-GAAAGGACGAAACACCGCACAGCCGACAGCAGGAGAAGGgttttagagctagaaat-3’。
gRNA1如序列表的序列1所示(其靶区域为序列表的序列3自5’末端第323-345位核苷酸)。gRNA2如序列表的序列2所示(其靶区域为序列表的序列3自5’末端第375-397位核苷酸)。CEBPA蛋白的编码基因的片段如序列表的序列3所示。
二、重组质粒pLenti-U6 sgRNA的构建
1、合成序列表的序列1所示的双链DNA分子。
2、以步骤1合成的DNA分子为模板，采用CRISPR-F和CRISPR-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
CRISPR-F(序列表的序列4)：5’-GTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG-3’；
CRISPR-R(序列表的序列5)：5’-gttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaac-3’。
3、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
4、以步骤3合成的DNA分子为模板，采用CRISPR-F和CRISPR-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
5、用限制性内切酶SalI和XbaI酶切pLKO.1载体，回收约4kbp的载体骨架。
6、采用Gibson Assembly试剂盒(NWB，产品目录号为E2611，说明书见https:// www.neb.com/protocols/2012/09/25/gibson-assembly-master-mix-assemb ly)并按试剂盒说明书操作，使得步骤2得到的PCR扩增产物、步骤3得到的PCR扩增产物和步骤5得到的载体骨架连接，得到重组质粒pLenti-U6 sgRNA。
三、sgRNA重组慢病毒的制备
1、取对数生长期的293T细胞，胰蛋白酶消化后用含10％(体积比)FBS的DMEM培养基悬浮得到细胞悬液，将每20ml细胞悬液(含1.2×107个细胞)接种至一个直径为15cm的细胞培养皿，在37℃、5％CO2培养箱内培养24h(细胞密度达到70％-80％)。
2、完成步骤1后，弃除上清液，加入新配制的DMEM培养基，在37℃、5％CO2培养箱内培养2h。
3、完成步骤2后，借助Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen公司，产品目录号为12566014)并按说明书操作，每个细胞培养皿转染20μg重组质粒pLenti-U6sgRNA，在37℃、5％CO2培养箱内培养8h。
4、完成步骤3后，弃除上清液，用20ml PBS缓冲液(pH7.4、0.01M)洗涤沉淀，然后加入新配制的含10％(体积比)FBS的DMEM培养基，在37℃、5％CO2培养箱内培养48h。
5、完成步骤4后，取上清液。
6、取步骤5得到的上清液，4℃、4000g离心10min，收集上清液。
7、将1体积份lentivirus precipation solution(ALSTEM，产品目录号为VC100)和4体积份步骤6得到的上清液置于离心管中并混匀，然后4000×g离心20min，离心管中的体系分为2层，收集上层清液，即为含有表达gRNA1和gRNA2的慢病毒的病毒液，简称sgRNA病毒液(sgRNA病毒液中的病毒含量为2×107pfu/ml)。
四、重组质粒pAD-DEST-CAS9的构建
1、用序列表的序列6所示的含有Cas9蛋白的编码基因的双链DNA分子替换pDONRTM221载体的attL1和attL2之间的小片段(含attL1和attL2)，得到中间质粒。序列表的序列6中，自5’末端第789-5045位核苷酸为CAS9蛋白的编码基因。
2、中间质粒与pAD-DEST载体发生gateway反应(BP重组)，得到含有CAS9蛋白的编码基因的重组质粒，即为重组质粒pAD-DEST-CAS9。
五、CAS9重组腺病毒的制备
1、取对数生长期的293细胞，胰蛋白酶消化后用含10％(体积比)FBS的DMEM培养基悬浮得到细胞悬液，将每1ml细胞悬液(含5×105个细胞)接种至一个直径为60mm的细胞培养皿，在37℃、5％CO2培养箱内培养24h(细胞汇合率为50-70％)。
2、完成步骤1后，弃除上清液，加入新配制的DMEM培养基，在37℃、5％CO2培养箱内培养2h。
3、用限制性内切酶Pac I酶切重组质粒pAD-DEST-CAS9，使其线性化，得到线性化质粒。
4、完成步骤2后，借助Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen公司，产品目录号：12566014)并按说明书操作，转染6μg步骤3得到的线性化质粒(以单个培养皿计)，在37℃、5％CO2培养箱内培养8h。
5、完成步骤4后，弃除上清液，用20ml PBS缓冲液(pH7.4、0.01M)洗涤，然后加入新配制的含10％(体积比)小牛血清、1％青霉素-链霉素的DMEM培养基，在37℃、5％CO2培养箱内培养7天。
6、完成步骤5后，用细胞刮从培养皿中刮下细胞并移入50ml锥形管，离心收集细胞，用DMEM培养基重悬，得到细胞悬液。
7、将步骤6得到的细胞悬液进行反复冻融(现在液氮中冻结细胞，然后在37℃水浴中溶解，剧烈振荡；共冻融4次)，收集上清液，即为初始病毒液。
8、取对数生长期的293细胞，胰蛋白酶消化后用含10％(体积比)FBS的DMEM培养基悬浮得到细胞悬液，将每1ml细胞悬液(含5×105个细胞)接种至一个直径为60mm的细胞培养皿，在37℃、5％CO2培养箱内培养24h(细胞汇合率为50-70％)。
9、完成步骤8后，加入步骤7得到的初始病毒液，病毒液的体积为细胞培养液的体积的50％，在37℃、5％CO2培养箱内培养4天(培养2-3天即可看到明显的细胞裂解或CPE现象)，然后收集上清液。
10、将15％CsCl和40％CsCl加入Beckman离心管中制备CsCl梯度溶液。
11、将步骤9得到的上清液滴加于步骤10得到的CsCl梯度溶液上，4℃、30000rpm离心16小时，离心管中的体系显示两条带(处于上层的为腺病毒空壳，处于下层的为活病毒颗粒)，收集下层部分，在TBS缓冲液中透析一小时，然后在含有10％甘油的TBS缓冲液中透析两次，得到含有CAS9重组腺病毒的病毒液，简称CAS9病毒液(CAS9病毒液中的病毒含量为10×1010pfu/ml)。
六、制备对照病毒液
用靶向GFP基因的两个gRNA代替gRNA1和gRNA2，进行步骤二和三，得到sgRNA病毒液的对照病毒液，简称对照病毒液。
实施例2、体外活性检测
1、用DMEM培养基悬浮AML12细胞，得到细胞浓度为5×105个/ml的细胞悬液。
2、分组处理
实验组：将1ml步骤1得到的细胞悬液、1ml实施例1的步骤三得到的sgRNA病毒液、0.1ml实施例1的步骤五得到的CAS9病毒液混合，在37℃、5％CO2培养箱内培养48h；
对照组：将1ml步骤1得到的细胞悬液、1ml实施例1的步骤六得到的对照病毒液、0.1ml实施例1的步骤五得到的CAS9病毒液混合，在37℃、5％CO2培养箱内培养48h。
3、完成步骤2后，取细胞，提取基因组DNA，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增。
F1:5’-ATTCGCGACCCGAAGCTGCG-3’；
R1:5’-TGTTCTTGTCCACCGACTTCTTGGCT-3’。
4、取步骤3得到的PCR扩增产物，进行T7E1酶切(设置不进行T7E1酶切的对照处理)，然后进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。对照组进行T7E1酶切的处理、实验组不进行T7E1酶切的对照处理，条带单一。实验组进行T7E1剪切后，出现弥散条带，即在sgRNA和CAS9蛋白的作用下，CEBPA蛋白的编码基因发生了剪切并产生了错配的杂合双链，从而可以被T7E1酶切。
实施例3、体内活性检测
1、分组处理
实验组：取4只C57小鼠，每只尾静脉注射0.1ml实施例1的步骤三得到的sgRNA病毒液和0.1ml实施例1的步骤五得到的CAS9病毒液；
对照组：取1只C57小鼠，每只尾静脉注射0.1ml实施例1的步骤六得到的对照病毒液和0.1ml实施例1的步骤五得到的CAS9病毒液。
2、注射病毒液7天后，取小鼠的肝脏。
3、取步骤2得到的肝脏，提取基因组DNA，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，取PCR扩增产物，进行T7E1酶切(设置不进行T7E1酶切的对照处理)，然后进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。对照组进行T7E1酶切的处理、实验组不进行T7E1酶切的对照处理，条带单一。实验组进行T7E1剪切后，出现弥散条带，即在sgRNA和CAS9蛋白的作用下，CEBPA蛋白的编码基因发生了剪切并产生了错配的杂合双链，从而可以被T7E1酶切。将目的片段测序，结果表明，剪辑比例高达70％以上，
4、取步骤2得到的肝脏，提取总蛋白，进行Western检测，采用的一抗为CEBPα抗体(14AA)(购自Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-61)。结果见图3，实验组小鼠肝脏中的CEBPA蛋白含量显著低于对照组小鼠，即在sgRNA和CAS9蛋白的作用下，CEBPA蛋白的编码基因发生了剪切，从而CEBPA蛋白含量显著降低。
Claims (8)
1.一种用于敲除目的基因的试剂盒，包括携带Cas9蛋白的编码基因的重组腺病毒和携带所述目的基因的sgRNA的编码基因的重组慢病毒；
所述目的基因为编码CCAAT增强子结合蛋白-A的基因；
所述Cas9蛋白如序列表的序列7所示；
所述“携带所述目的基因的sgRNA的编码基因的重组慢病毒”为携带sgRNA1的编码基因和sgRNA2的编码基因的重组慢病毒；所述sgRNA1的编码基因如序列表的序列1所示；所述sgRNA2的编码基因如序列表的序列2所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述Cas9蛋白的编码基因如序列表的序列6自5’末端第789-5045位核苷酸所示。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：“携带Cas9蛋白的编码基因的重组腺病毒”的制备方法包括如下步骤：
(1)将所述Cas9蛋白的编码基因***pDONRTM221载体的attL1和attL2位点之间，得到中间质粒；
(2)将中间质粒与pAD-DEST载体发生gateway反应，得到含有所述CAS9蛋白的编码基因的重组质粒，即为重组质粒pAD-DEST-CAS9；
(3)将重组质粒pAD-DEST-CAS9导入哺乳动物细胞并培养，得到所述重组腺病毒。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述哺乳动物细胞为293细胞。
5.一种用于敲除目的基因的试剂盒，包括携带Cas9蛋白的编码基因的重组腺病毒和携带所述目的基因的sgRNA的编码基因的重组质粒；
所述目的基因为编码CCAAT增强子结合蛋白-A的基因；
所述Cas9蛋白如序列表的序列7所示；
所述“携带所述目的基因的sgRNA的编码基因的重组质粒”为携带sgRNA1的编码基因和sgRNA2的编码基因的重组质粒；所述sgRNA1的编码基因如序列表的序列1所示；所述sgRNA2的编码基因如序列表的序列2所示。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述Cas9蛋白的编码基因如序列表的序列6自5’末端第789-5045位核苷酸所示。
7.如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于：“携带Cas9蛋白的编码基因的重组腺病毒”的制备方法包括如下步骤：
(1)将所述Cas9蛋白的编码基因***pDONRTM221载体的attL1和attL2位点之间，得到中间质粒；
(2)将中间质粒与pAD-DEST载体发生gateway反应，得到含有所述CAS9蛋白的编码基因的重组质粒，即为重组质粒pAD-DEST-CAS9；
(3)将重组质粒pAD-DEST-CAS9导入哺乳动物细胞并培养，得到所述重组腺病毒。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述哺乳动物细胞为293细胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410400098.XA CN104178461B (zh) | 2014-08-14 | 2014-08-14 | 携带cas9的重组腺病毒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410400098.XA CN104178461B (zh) | 2014-08-14 | 2014-08-14 | 携带cas9的重组腺病毒及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104178461A CN104178461A (zh) | 2014-12-03 |
| CN104178461B true CN104178461B (zh) | 2017-02-01 |
Family
ID=51959810
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410400098.XA Expired - Fee Related CN104178461B (zh) | 2014-08-14 | 2014-08-14 | 携带cas9的重组腺病毒及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104178461B (zh) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3613852A3 (en) | 2011-07-22 | 2020-04-22 | President and Fellows of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
| US20150044192A1 (en) | 2013-08-09 | 2015-02-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease |
| US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
| US9228207B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-01-05 | President And Fellows Of Harvard College | Switchable gRNAs comprising aptamers |
| US9737604B2 (en) | 2013-09-06 | 2017-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Use of cationic lipids to deliver CAS9 |
| US9322037B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof |
| US9834791B2 (en) | 2013-11-07 | 2017-12-05 | Editas Medicine, Inc. | CRISPR-related methods and compositions with governing gRNAS |
| US9068179B1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-30 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting presenilin point mutations |
| AU2015298571B2 (en) | 2014-07-30 | 2020-09-03 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9 proteins including ligand-dependent inteins |
| CN104928292B (zh) * | 2015-05-26 | 2019-06-14 | 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） | 一种sgRNA的设计方法及构建的慢病毒载体、质粒 |
| CN108513575A (zh) | 2015-10-23 | 2018-09-07 | 哈佛大学的校长及成员们 | 核碱基编辑器及其用途 |
| CN105802980A (zh) * | 2016-04-08 | 2016-07-27 | 北京大学 | Gateway兼容性CRISPR/Cas9***及其应用 |
| CN105907758B (zh) * | 2016-05-18 | 2020-06-05 | 世翱（上海）生物医药科技有限公司 | CRISPR-Cas9引导序列及其引物、转基因表达载体及其构建方法 |
| WO2018027078A1 (en) | 2016-08-03 | 2018-02-08 | President And Fellows Of Harard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
| CA3033327A1 (en) | 2016-08-09 | 2018-02-15 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| WO2018039438A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
| KR20240007715A (ko) | 2016-10-14 | 2024-01-16 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵염기 에디터의 aav 전달 |
| US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
| EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| JP2020510439A (ja) | 2017-03-10 | 2020-04-09 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | シトシンからグアニンへの塩基編集因子 |
| SG11201908658TA (en) | 2017-03-23 | 2019-10-30 | Harvard College | Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins |
| US11560566B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-01-24 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation |
| US11732274B2 (en) | 2017-07-28 | 2023-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE) |
| SG11201912235PA (en) * | 2017-07-31 | 2020-01-30 | Regeneron Pharma | Cas-transgenic mouse embryonic stem cells and mice and uses thereof |
| US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
| CN111757937A (zh) | 2017-10-16 | 2020-10-09 | 布罗德研究所股份有限公司 | 腺苷碱基编辑器的用途 |
| DE112020001342T5 (de) | 2019-03-19 | 2022-01-13 | President and Fellows of Harvard College | Verfahren und Zusammensetzungen zum Editing von Nukleotidsequenzen |
| CN110055278B (zh) * | 2019-04-23 | 2021-10-15 | 深圳市弘际生物科技有限责任公司 | 一种新型腺病毒包装方法在CRISPR/Cas9基因编辑方法中的应用 |
| EP4146804A1 (en) | 2020-05-08 | 2023-03-15 | The Broad Institute Inc. | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
| CN112342216B (zh) * | 2020-11-13 | 2021-07-23 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 用于提高CHO细胞的表达效率的CRISPR-Cas13d***以及重组CHO细胞 |
| CN113521310A (zh) * | 2021-07-14 | 2021-10-22 | 南通大学 | 一种杀伤基因突变肿瘤细胞药物及其制备方法和应用 |
-
2014
- 2014-08-14 CN CN201410400098.XA patent/CN104178461B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity;F. Ann Ran等;《Cell》;20130912;第154卷;1380-1389页 * |
| Efficient gene editing in adult mouse livers via adenoviral delivery of CRISPR/Cas9;Ranran Cheng等;《FEBS Letters》;20140919;第588卷;3954-3958页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104178461A (zh) | 2014-12-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104178461B (zh) | 携带cas9的重组腺病毒及其应用 | |
| Yan et al. | Establishment of efficient genetic transformation systems and application of CRISPR/Cas9 genome editing technology in Lilium pumilum DC. Fisch. and Lilium longiflorum White Heaven | |
| Loureiro et al. | Crispr-cas: Converting a bacterial defence mechanism into a state-of-the-art genetic manipulation tool | |
| Karlson et al. | CRISPR/dCas9-based systems: mechanisms and applications in plant sciences | |
| CN108148835A (zh) | CRISPR-Cas9靶向敲除SLC30A1基因及其特异性的sgRNA | |
| Bharathkumar et al. | CRISPR/Cas-based modifications for therapeutic applications: a review | |
| CN107893076A (zh) | CRISPR‑Cas9靶向敲除人乳腺癌细胞RASSF2基因及其特异性的sgRNA | |
| CN109153980A (zh) | Vi-b型crispr酶和*** | |
| Yau et al. | Virus-host coexistence in phytoplankton through the genomic lens | |
| CN107995927A (zh) | 用于肝靶向和治疗的crispr-cas***、载体和组合物的递送与用途 | |
| CN106566838A (zh) | 一种基于CRISPR‑Cas9技术的miR‑126全长基因敲除试剂盒及其应用 | |
| CN105518137A (zh) | CRISPR-Cas9特异性敲除猪SALL1基因的方法及用于特异性靶向SALL1基因的sgRNA | |
| CN106414740A (zh) | CRISPR‑Cas9特异性敲除猪SLA‑3基因的方法及用于特异性靶向SLA‑3基因的sgRNA | |
| CN108165581B (zh) | 采用单链核苷酸片段体外修复hba2基因突变的方法 | |
| Gelvin | Plant DNA repair and Agrobacterium T− DNA integration | |
| Wen et al. | An efficient agrobacterium-mediated transformation method for hybrid poplar 84K (Populus alba× P. glandulosa) using calli as explants | |
| Zhang et al. | Virus-induced gene editing and its applications in plants | |
| Niazian et al. | CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in soybean | |
| Han et al. | Efficient Agrobacterium-mediated transformation of hybrid poplar Populus davidiana Dode× Populus bollena Lauche | |
| CN110484549A (zh) | 基因组靶向修饰方法 | |
| Bao et al. | Synthesis of full-length cDNA infectious clones of Soybean mosaic virus and functional identification of a key amino acid in the silencing suppressor Hc-Pro | |
| Lu et al. | Prime editing: An all-rounder for genome editing | |
| Jia et al. | LbCas12a-D156R efficiently edits LOB1 effector binding elements to generate canker-resistant citrus plants | |
| Cao et al. | From genome sequencing to CRISPR-based genome editing for climate-resilient forest trees | |
| Lu et al. | CRISPR/Cas9-mediated hitchhike expression of functional shRNAs at the porcine miR-17-92 cluster |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170201 |