CN104165884B - 一种人类8-氧代鸟嘌呤dna糖基化酶活性的比色分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物领域,涉及一种人类8‑氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的比色分析方法。向0.1~5.0μM的S1中加入0.1~5.0μM的S2,85~100℃反应0.5~2min,10~30℃反应1~5min,交替反应8~15次,再加入hOGG1、BSA和NaBH3CN,35~40℃反应0.5~5h,80~100℃加热1~10min。加入ExoI和ExoIII,35~40℃静置10~60min,加入石墨烯/纳米金,混合均匀。依次加入显色剂和H2O2,进行吸光度测定。本发明的比色分析法比传统无机纳米材料分析方法成本低、操作简单、实用性强。
Description
技术领域
本发明属于生物领域,涉及一种人类8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的比色分析方法。
背景技术
在基因中,8-氧代鸟嘌呤是一种最常见的由于活性氧引起的DNA氧化损伤。在DNA复制过程中,这种损伤可以阻止DNA链伸长,导致由错配引起的基因突变,对基因稳定性产生了巨大威胁。由于其在机体内的含量高、诱变能力强,如今已被看作机体的DNA氧化损伤标志物。
在人体对损伤碱基的修复中,人类8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(human 8-hydroxyguanine glycosylase,hOGG1)是一种重要的修复酶,它可以识别并切除8-氧代鸟嘌呤。此外,hOGG1还具有AP(apurinic/apyrimidinic)核酸内切酶的AP位点的水解功能,在该酶的作用下,可以将受损碱基的位点完全切除,形成一个空的位点,并在5'端位置形成磷酸末端。据此,hOGG1对机体DNA氧化损伤的修复有着重大的意义,故对其活性进行快速准确的定量分析是十分必要的。
传统的hOGG1活性分析方法有仪器法、生物法、生化法等,由于其固有的缺陷已难以应对目前的分析需求。例如,蛋白质印迹法操作复杂,对抗极端环境的适应性差、灵敏性差;流式细胞术、荧光测定实验耗时、费力、成本高;结合了天然酶的分子信标法虽然通过信号放大实现了高灵敏性,但实验的标记过程繁琐,且天然酶的稳定性差,阻碍了该法的推广应用。近年来,无机纳米材料由于其卓越的稳定性、反应活性和简单的制备过程,结合电化学、荧光、比色技术,已被广泛运用于传感分析检测中(Nature nanotechnology,2007,2(9),577-583;Environmental science and technology,2012,46(22),12567-12574;Journal of materials chemistry,2012,22(33),17079-17085)。目前,人们也已利用无机纳米材料成功建立了一些针对hOGG1活性的传感分析平台(Analytical chemistry,2013,85(9),4376-4383),但过程涉及繁琐的标记过程或复杂的操作步骤,影响了实验效率、分析结果和方法的实用性。
石墨烯/纳米金复合物,一种新型的无机过氧化酶催化材料,利用石墨烯与纳米金的接触界面的过氧化酶催化性质,可以快速催化氧化多种有机底物。此外,由于石墨烯片层与单链DNA之间的π-π共轭作用可使单链DNA自发的吸附到石墨烯表面,从而占据了石墨烯/纳米金复合物的界面活性位点,抑制了其过氧化酶催化性质。反应自发进行,无需标记过程。如今石墨烯/纳米金复合物材料由于其优异的性质,如制备过程简单、成本低、反应活性高等,已被用于传感分析中(ACS NANO,2012,6(4),3142-3151)。本发明将石墨烯/纳米金复合物材料应用于样品中hOGG1的活性分析,建立一种hOGG1活性的比色分析方法,解决了传统方法繁琐耗时、成本高、实用性差等缺点,应用前景非常广泛。
发明内容
本发明解决了现有hOGG1活性分析方法繁琐耗时、标记过程复杂、成本高、实用性差等不足,提供了一种简便、快捷、经济、实用的hOGG1活性的定量分析方法。
石墨氧化物和氯金酸的混合液,在碱性条件下,经一步水热合成石墨烯/纳米金复合物,其界面的仿生过氧化酶催化性能可使底物中的显色剂在过氧化氢(H2O2)存在下,从常态氧化至氧化态,从而使体系吸光度值发生改变。含有8-氧代鸟嘌呤的DNA序列1与其互补DNA序列2杂交后,形成含有8-氧代鸟嘌呤的双链DNA。当目标物hOGG1存在于体系中时,其作用的DNA底物会形成shiff碱,在还原剂氰基硼氢化钠的作用下与DNA双链共价结合,阻碍了随后加入的核酸外切酶对序列1的降解作用,而不含有8-氧代鸟嘌呤的序列2则被核酸外切酶降解。捕获目标物hOGG1的序列1由于其与石墨烯之间的π-π共轭作用而吸附到石墨烯/纳米金复合物表面,阻碍了复合物的界面过氧化酶催化性能,在显色剂与H2O2存在条件下,不能使反应体系吸光度产生变化。反之,当体系中不存在目标物hOGG1时,序列1与序列2形成的双链DNA则会被核酸外切酶降解,由于所加入的石墨烯/纳米金复合物的界面过氧化酶催化性能,在H2O2存在条件下氧化显色剂,使反应体系吸光度产生变化。据此,体系的吸光度值在一定范围内与目标物hOGG1的活性呈线性反相关,从而为hOGG1的定量分析提供依据。
本发明提供了一种人类8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的比色分析方法,具体步骤如下:
(1)向0.1~5.0μM的DNA序列S1溶液中加入浓度为0.1~5.0μM的DNA序列S2溶液,在85~100℃温度下反应0.5~2min,继续在10~30℃温度下反应1~5min,如此温度交替反应8~15次,使DNA序列S1与DNA序列S2杂交反应成双链DNA。其中,所述的DNA序列S1为含有8-氧代鸟嘌呤的DNA序列,DNA序列S2为DNA序列S1的互补DNA序列。
(2)依次向步骤(1)获得的双链DNA溶液中加入活性值不大于0.5U/μL的hOGG1、0.01~1.0mg/mL牛血清蛋白和0.01~1.0M氰基硼氢化钠,在35~40℃温度下反应0.5~5h,使hOGG1捕获到DNA序列S1上。然后在80~100℃温度下反应1~10min,终止反应。
(3)向步骤(2)获得的混合液中加入0.05~1.5U/μL核酸外切酶I(Exo I)和0.2~8.0U/μL核酸外切酶III(Exo III),35~40℃温度下静置10~60min。再加入0.5~40.0μg/mL石墨烯/纳米金,混合均匀。
(4)向步骤(3)得到的产物中依次加入0.05~10.0mM显色剂与1.0~100.0mM过氧化氢(H2O2),将得到的混合液立即进行吸光度测定。
所述的显色剂包括四甲基联苯胺(TMB)或2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)。
本发明的有益效果:
(1)灵敏度高,检测下限可达0.0016U/μL。
(2)石墨烯/纳米金复合物采用水热反应一步合成,过程简单、快捷。
(3)相较于传统无机纳米材料分析方法,无标记过程,操作简单、实用性强。
附图说明
图1是本发明所述的hOGG1的活性分析方法示意图。
图2是本发明的方法获得的hOGG1活性分析的标准工作曲线。
图中:DNA序列S1;DNA序列S2;hOGG1;石墨烯/纳米金。
具体实施方式
以下结合技术方案和附图具体说明本发明的具体实施方式。
实施例1
石墨烯/纳米金的制备
石墨烯/纳米金采用水热方法合成。将0.01~1g/L石墨氧化物(GO)溶液,0.2~20.0mM氯金酸(HAuCl4)溶液,0.002~0.2M氢氧化钠(NaOH)溶液混合均匀。超声2~12h后,转移到衬底为聚四氟的水热反应釜中,175~185℃反应8~12h,自然冷却至室温后备用。
实施例2
配置样品中hOGG1含量的测定:
(1)石墨烯/纳米金的制备
石墨烯/纳米金采用水热方法合成。将0.01g/LGO溶液,0.2mMHAuCl4溶液,0.004MNaOH溶液混合均匀。超声2h后,转移到衬底为聚四氟的水热反应釜中,175℃反应12h,自然冷却至室温后备用。
(2)S1与S2杂交
向0.1μM的S1中加入浓度为0.1μM的S2,在85℃温度下反应2min,10℃温度下反应1min,如此温度交替循环反应8次。
(3)分析方法
依次向步骤(2)获得的双链DNA溶液中加入0~0.2U/μL hOGG1,0.01mg/mL BSA与0.01M NaBH3CN,在35℃温度下反应5h,80℃温度下加热10min终止反应。然后向混合液中加入0.05U/μLExo I与0.2U/μLExo III,在35℃温度下静置60min后,加入0.8μg/mL石墨烯/纳米金,混合均匀。最后加入0.1mMTMB与1.0mM H2O2,并立即将得到的混合液转入比色皿中。室温条件下,于波长为652nm处测定反应体系吸光度值随时间变化情况。
(4)标准工作曲线的绘制
步骤(3)中随着样品中hOGG1活性值的增加,体系的吸光度变化值不断增加,在0~0.1U/μL范围内,600s时反应体系吸光度值与hOGG1活性有良好的线性关系,线性相关系数R=0.997。
(5)配置样品中hOGG1活性的测定:
用工作缓冲液(50.0mM NaCl,10.0mM Tris-HCl,10.0mMMgCl,1.0mM DTT,pH7.9)配置活性为0.07U/μL的hOGG1待测样品,用步骤(3)的方法进行检测,检测结果与步骤(4)得到的标准工作曲线对比,计算出hOGG1的活性值。实验结果测出hOGG1活性为0.072U/μL,回收率为102.9%,相对标准偏差RSD为2.71%(n=4)。
实施例2的DNA序列如表1所示,oxoG为8-氧代鸟嘌呤。
表1DNA序列
名称 | 序列 |
S1 | 5’-AATGGAGCACATCAGTToxoGAGCTCCATT-3’ |
S2 | 5’-AATGGAGCTCAACTGATGTGCTCCATT-3’ |
实施例3
配置样品中hOGG1含量的测定:
(1)石墨烯/纳米金的制备
石墨烯/纳米金采用水热方法合成。将0.1g/LGO溶液,2.0mMHAuCl4溶液,0.02MNaOH溶液混合均匀。超声6h后,转移到衬底为聚四氟的水热反应釜中,180℃反应10h,自然冷却至室温后备用。
(2)S1与S2杂交
向0.9μM的S1中加入浓度为1.0μM的S2,在95℃温度下反应1min,25℃温度下反应2min,如此温度交替循环反应10次。
(3)依次向步骤(2)获得的双链DNA溶液中加入0~0.23U/μL hOGG1,0.1mg/mL BSA与0.1MNaBH3CN,在37℃温度下反应2h,90℃温度下加热5min终止反应。然后向混合液中加入0.3U/μLExo I与1.5U/μLExo III,在37℃温度下静置20min后,加入7.9μg/mL石墨烯/纳米金,混合均匀。最后加入1.0mM TMB与30.0mMH2O2,并立即将得到的混合液转入比色皿中。室温条件下,于波长为652nm处测定反应体系吸光度值随时间变化情况。
(4)标准工作曲线的绘制
步骤(3)中随着样品中hOGG1活性值的增加,体系的吸光度变化值不断增加,在0~0.11U/μL范围内,600s时反应体系吸光度值与hOGG1活性有良好的线性关系,线性相关系数R=0.998。
(5)配置样品中hOGG1活性的测定:
用工作缓冲液(50.0mM NaCl,10.0mM Tris-HCl,10.0mMMgCl,1.0mMDTT,pH7.9)配置活性为0.09U/μL的hOGG1待测样品,用步骤(3)的方法进行检测,检测结果与步骤(4)得到的标准工作曲线对比,计算出hOGG1的活性值。实验结果测出hOGG1活性为0.086U/μL,回收率为95.6%,相对标准偏差RSD为2.66%(n=4)。
实施例3的DNA序列如表2所示,oxoG为8-氧代鸟嘌呤。
表2DNA序列
名称 | 序列 |
S1 | 5’-GAGAATGGAGCACATCAGTToxoGAGCTCCATTCTC-3’ |
S2 | 5’-GAGAATGGAGCTCAACTGATGTGCTCCATTCTC-3’ |
实施例4
配置样品中hOGG1含量的测定:
(1)石墨烯/纳米金的制备
石墨烯/纳米金采用水热方法合成。将1g/LGO溶液,20.0mMHAuCl4溶液,0.18MNaOH溶液混合均匀。超声12h后,转移到衬底为聚四氟的水热反应釜中,185℃反应8h,自然冷却至室温后备用。
(2)S1与S2杂交
向5.0μM的S1中加入浓度为5.0μM的S2,在100℃温度下反应0.5min,30℃温度下反应5min,如此温度交替循环反应15次。
(3)依次向步骤(2)获得的双链DNA溶液中加入0~0.5U/μL hOGG1,1.0mg/mL BSA与1.0M NaBH3CN,在40℃温度下反应0.5h,100℃温度下加热2min终止反应。然后向混合液中加入1.5U/μLExo I与8.0U/μLExo III,在40℃温度下静置10min后,加入40.0μg/mL石墨烯/纳米金,混合均匀。最后加入10.0mMABTS与100.0mM H2O2,并立即将得到的混合液转入比色皿中。室温条件下,于波长为405nm处测定反应体系吸光度值随时间变化情况。
(4)标准工作曲线的绘制
步骤(3)中随着样品中hOGG1活性值的增加,体系的吸光度变化值不断增加,在0~0.3U/μL范围内,600s时反应体系吸光度值与hOGG1活性有良好的线性关系,线性相关系数R=0.991。
(5)配置样品中hOGG1活性的测定:
用工作缓冲液(50.0mM NaCl,10.0mM Tris-HCl,10.0mMMgCl,1.0mM DTT,pH7.9)配置活性为0.23U/μL的hOGG1待测样品,用步骤(3)的方法进行检测,检测结果与步骤(4)得到的标准工作曲线对比,计算出hOGG1的活性值。实验结果测出hOGG1活性为0.21U/μL,回收率为91.3%,相对标准偏差RSD为3.19%(n=4)。
实施例4的DNA序列如表3所示,oxoG为8-氧代鸟嘌呤。
表3DNA序列
名称 | 序列 |
S1 | 5’-GGAGCACATCAGTToxoGAGCTCC-3’ |
S2 | 5’-GGAGCTCAACTGATGTGCTCC-3’ |
Claims (2)
1.一种人类8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的比色分析方法,其特征在于,步骤如下:
(1)向0.1~5.0μM的DNA序列S1溶液中加入浓度为0.1~5.0μM的DNA序列S2溶液,在85~100℃温度下反应0.5~2min,继续在10~30℃温度下反应1~5min,如此温度交替反应8~15次,使DNA序列S1与DNA序列S2杂交反应成双链DNA;其中,所述的DNA序列S1为含有8-氧代鸟嘌呤的DNA序列,DNA序列S2为DNA序列S1的互补DNA序列;
(2)依次向步骤(1)获得的双链DNA溶液中加入活性值不大于0.5U/μL的hOGG1、0.01~1.0mg/mL牛血清蛋白和0.01~1.0M氰基硼氢化钠,在35~40℃温度下反应0.5~5h,使hOGG1捕获到DNA序列S1上;然后在80~100℃温度下反应1~10min,终止反应;
(3)向步骤(2)获得的混合液中加入0.05~1.5U/μL核酸外切酶I和0.2~8.0U/μL核酸外切酶III,35~40℃温度下静置10~60min;再加入0.5~40.0μg/mL石墨烯/纳米金,混合均匀;
(4)向步骤(3)得到的产物中依次加入0.05~10.0mM显色剂和1.0~100.0mM过氧化氢,将得到的混合液立即进行吸光度测定。
2.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于,所述的显色剂为四甲基联苯胺或2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐。
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