CN104165872A - 一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，属于生物检测技术领域。包括制备载体、收集菌株、制备烟曲霉生物膜载体、荧光染色方法和共聚焦显微镜观察；将浓度为1～5×10⁵·孢子·ml^-1的烟曲霉放置于无菌玻璃细胞爬片，静置于35～37℃生化培养箱中培养，然后分别在培养的不同时间荧光染色，共聚焦显微镜下观察烟曲霉生物膜胞外多糖的变化。本发明提供的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法实验操作简单、快速准确得出结果和重复性好。

Description

一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法

 

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及以一种用TRITC-conA和FITC-ECA混合染液检测烟曲霉生物膜胞外多糖的方法。

背景技术

近年来随着恶性肿瘤、HIV、器官移植等患者增加，烟曲霉感染呈现出快速发展趋势，感染率仅次于白色念珠菌，成为免疫低下患者主要的死亡原因。烟曲霉导致的侵袭性曲霉病（invasive aspergillosis，IA）死亡率达到30-100%，耐药是导致治疗失败的一个重要原因，一项临床研究检测了1385个IA患者的烟曲霉菌株，发现对唑类耐药的IA患者死亡率达88%，而敏感菌株感染者死亡率为48%。体内外研究发现烟曲霉能形成生物膜，其不但可以在植入的外源性生物材料如人工心脏瓣膜、静脉插管、导尿管等表面生成，还可以在肺部空洞和支气管上皮直接形成。生物膜状态的烟曲霉不仅能形成持续的感染源造成慢性感染，而且还能作为天然屏障抵御抗真菌药，逃避机体免疫，使烟曲霉的耐药性提高几十至几百倍。鉴于生物膜作为烟曲霉耐药的重要机制，国内外对烟曲霉生物膜的研究日益重视。

烟曲霉生物膜由胞外多糖、多元醇、蛋白质、黑色素等物质组成，其中胞外多糖占90%，是生物膜的重要组成部分，而胞外多糖又由不同的多糖成分组成。因为不同的多糖成分在生物膜中发挥不同的作用，所以了解生物膜各种成分在临床及实验研究中的发展变化对研究生物膜感染具有重要的意义，然而目前常用且得到公认的形态学观察方法扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)并不能显示烟曲霉生物膜的成分。利用荧光染色法将生物膜胞外多糖染色观察在细菌生物膜研究中已有运用，但所用方法仅仅能标记一种多糖，不能同时观察到各种多糖成分在数量及分布情况方面的不同，对进一步揭示生物膜中各种多糖的功能形成阻碍。另外，烟曲霉属于真菌，由于细菌和真菌特点不同，它们所形成的生物膜特性也不完全相同，荧光染色法能否运用于烟曲霉生物膜的胞外多糖染色亦未见报道。

发明内容

本发明以荧光染色法将烟曲霉生物膜的胞外多糖染色，利用不同的颜色的染液标识出多糖的具体成分，并且能显示出各种胞外多糖在烟曲霉生物膜生长过程中的分布情况及量的变化。本发明所使用的技术方案为：一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，包括制备载体、收集菌株、制备烟曲霉生物膜载体、荧光染色方法和共聚焦显微镜观察，具体检测步骤如下：

1）制备载体 将直径为10~15 mm玻璃细胞爬片进行灭菌，作为载体；

2）收集菌株 将烟曲霉菌经过96孔板造膜，以结晶紫半定量法筛选出成膜能力最强的菌株，作为试验菌株；

3）制备烟曲霉生物膜载体  将步骤2）获得的菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂平皿上，置于35~37℃培养箱培养活化3~5天，用5~10ml含有吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用20~25ml MOPS缓冲的RPMI-1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPMI-1640液体培养液调整浓度为1~5×10⁵·孢子·ml^-1，将1~2ml孢子悬液加入步骤1）制备的玻璃细胞爬片上，玻璃细胞爬片置于无菌24孔板的孔内，每孔放一个，静置于35~37℃生化培养箱中培养，培养24h取出载体；

4）荧光染色方法  

A：制备TRITC-conA染液，将10~15mg TRITC-conA和5~10ml 0.1mol/l的NaHCO₃溶液置于容器中，并不断搅拌至TRITC-conA颗粒完全溶解，得TRITC-conA染液，并用1.5~3ml避光离心管分装，每个离心管中装80~100μl TRITC-conA染液，置于-20~-25℃冰箱保存；

B：制备TRITC-conA和FITC-ECA混合染液，将步骤A制备的TRITC-conA染液，加入1~3ml去离子水，后加入40~50μl FITC-ECA染液，用漩涡振荡器震荡30~60s，再用离心机以2000~3000rpm转速离心2~4min；

C：将步骤3）制备的烟曲霉生物膜载体用无菌磷酸盐缓冲液漂洗，去除浮游菌；

D：将步骤B制备的TRITC-conA和FITC-ECA混合染液100~120μl滴加到载体上，并轻轻晃动载体使染液均匀涂布，后在室温下避光静置90~100min；

E：将步骤D制备的载体用磷酸盐缓冲液漂洗，洗掉未粘附的多余的染液；

5）共聚焦显微镜观察  用波长为488nm的激发光观察FITC-ECA，用波长为543nm的激发光观察TRITC-conA。

以上所述步骤3）制备的烟曲霉生物膜载体静置于35~37℃生化培养箱中培养48~50h，间隔24h用MOPS缓冲的RPMI-1640换液。

以上所述的TRITC-conA为10~13mg与5~8ml 0.1mol/l的NaHCO₃溶液混合，溶解。 

以上所述的TRITC-conA加入1~2ml去离子水，后加入的FITC-ECA染液为40~45μl。

以上所述的TRITC-conA和FITC-ECA混合染液用漩涡振荡器震荡30~40s，再用离心机以2000~2500rpm转速离心2~3min。

以上所述的TRITC-conA和FITC-ECA混合染液滴加到载体的量为110~120μl，轻轻晃动载体使染液均匀涂布，后在室温下避光静置95~100min。

扫描电镜观察：

（1）将以上制成的烟曲霉菌生物膜取出，每次取2~10个，用体积分数为2.5%戊二醛的固定载体2h；

（2）依次用体积分数为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇梯度脱水，每个浓度脱水10min；（3）临界干燥仪干燥；

（4）真空喷镀金粉；

（5）观察和摄片，条件：电压20kV，放大倍数2000倍。

本发明突出的实质性特点和显著的进步是：

1．操作简单

SEM由于能放大更高的倍数而在观察细微结构方面独具优势，但标本经过梯度脱水、干燥、喷金等过程以后生物膜的结构不同程度受到影响，而且操作麻烦；而本发明检测方法只需经过两次染色，两次干燥固定后即可扫描，操作方便简单。

2．快速、准确

扫描电镜固定时间需要两个小时以上，脱水几次，也需要1个小时以上，加上干燥、喷金和观察整个扫描过程下来需要数小时才能完成，而本发明检测方法从取样到得出结果，只需要100分钟；因为静止培养的烟曲霉生物膜胞外基质90%是由胞外多糖构成的，所以扫描电镜观察到的胞外基质实际上大部分就是胞外多糖。将发明检测结果与扫描电镜过结果进行对比，发现荧光染色方法看到的胞外多糖的变化过程与扫描电镜中观察到的胞外基质的变化过程一致，证实了荧光染色法的准确性。  

3．能标记多种类型的多糖

   本发明检测的方法采用双荧光标记，能分别标记出多种不同类型的多糖，并且能清晰的区分出这些多糖在生物膜形成过程中分布情况，还可以利用相关软件将共聚焦图片进行三维重建，将其中各个成分进行半定量。

4．重现性好

按照本发明检测步骤进行检测，就能快速获得结果。

附图说明

图1是本发明实施例2荧光染色后观察结果 在共聚焦显微镜放大200倍后观察，A-8h，B-12h，C-16h， D-20h， E-24h，F-48h。

图2是实施例2扫描电镜观察结果，放大2000倍观察，A-8h，B-12h，C-16h，D-20h，E-24h，F-48h。

具体实施方式

一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，包括制备载体、收集菌株、制备烟曲霉生物膜载体、荧光染色方法和共聚焦显微镜观察，具体检测步骤如下：

1）制备载体 将直径为10~15 mm玻璃细胞爬片进行灭菌，作为载体；

2）收集菌株 将烟曲霉菌经过96孔板造膜，以结晶紫半定量法筛选出成膜能力最强的菌株，作为试验菌株；

3）制备烟曲霉生物膜载体  将步骤2）获得的菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂平皿上，置于35~37℃培养箱培养活化3~5天，用5~10ml含有吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用20~25ml MOPS缓冲的RPMI-1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPMI-1640液体培养液调整浓度为1~5×10⁵·孢子·ml^-1，将1~2ml孢子悬液加入步骤1）制备的玻璃细胞爬片上，玻璃细胞爬片含有24孔板，静置于35~37℃生化培养箱中培养，培养24h取出载体；

4）荧光染色方法  

A：制备TRITC-conA染液，将10~15mg TRITC-conA和5~10ml 0.1mol/l的NaHCO₃溶液置于容器中，并不断搅拌至TRITC-conA颗粒完全溶解，得TRITC-conA染液，并用1.5~3ml避光离心管分装，每个离心管中装80~100μl TRITC-conA染液，置于-20~-25℃冰箱保存；

B：制备TRITC-conA和FITC-ECA混合染液，将步骤A制备的TRITC-conA染液，加入1~3ml去离子水，后加入40~50μl FITC-ECA染液，用漩涡振荡器震荡30~60s，再用离心机以2000~3000rpm转速离心2~4min；

C：将步骤3）制备的烟曲霉生物膜载体用无菌磷酸盐缓冲液漂洗，去除浮游菌；

D：将步骤B制备的TRITC-conA和FITC-ECA混合染液100~120μl滴加到载体上，并晃动载体使染液均匀涂布，后在室温下避光静置90~100min；

E：将步骤D制备的载体用磷酸盐缓冲液漂洗，洗掉未粘附的多余的染液；

5）共聚焦显微镜观察  用波长为488nm的激发光观察FITC-ECA，用波长为5243nm的激发光观察TRITC-conA。

以上所述步骤3）制备的烟曲霉生物膜载体静置于35~37℃生化培养箱中培养48~50h，间隔24h用MOPS缓冲的RPMI-1640换液。

以上所述的TRITC-conA为10~13mg与5~8ml 0.1mol/l的NaHCO₃溶液混合，溶解。 

以上所述的TRITC-conA加入1~2ml去离子水，后加入的FITC-ECA染液为40~45μl。

以上所述的TRITC-conA和FITC-ECA混合染液用漩涡振荡器震荡30~40s，再用离心机以2000~2500rpm转速离心2~3min。

以上所述的TRITC-conA和FITC-ECA混合染液滴加到载体的量为110~120μl，晃动载体使染液均匀涂布，后在室温下避光静置95~100min。

扫描电镜观察：

（1）将以上制成的烟曲霉菌生物膜于24取出，每次取2~10个，用体积分数为2.5%戊二醛的固定载体2h；

（2）依次用体积分数为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇梯度脱水，每个浓度脱水10min；（3）临界干燥仪干燥；

（4）真空喷镀金粉；

（5）观察和摄片，条件：电压20kV，放大倍数2000倍。

实施例1

（1）制备载体：将直径为13 mm（江苏海门市盛邦实验器材有限公司）玻璃细胞爬片进行灭菌，作为载体。

（2）收集菌株：于2012年9月到2013年5月在广西医科大学第一附属医院检验科细菌室收集到的30株烟曲霉菌，经过96孔板造膜，结晶紫半定量法比较出成膜能力最强的菌株作为受试菌株。

（3）试验试剂和器材：FITC-ECA（Vector Laboratories），TRITC-conA（Invitrogen）， PDA（北京路桥）、MOPS（Sigma）、RPMI-1640粉(Gibco)、扫描电镜SEM（S-3400N，日本日立）。

（4）制备烟曲霉生物膜载体  以灭菌后的玻璃细胞爬片（直径13mm）作为载体。将受试烟曲霉菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂平皿上，置于37℃培养活化3天，用5ml含有吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用20ml MOPS缓冲的RPMI-1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPMI-1640液体培养液调整浓度为1×10⁵·孢子·ml^-1，将1ml孢子悬液加入24孔板中的无菌玻璃细胞爬片上，静置于37℃生化培养箱中孵育，每日用MOPS缓冲的RPMI-1640换液。于培养8、12、16、20、24、48h取出载体，每次取2个，分别行荧光染色和扫描电镜观察。

（5）荧光染色方法 

A、配制TRITC-conA染液，将10mg TRITC-conA溶解于5ml 0.1mol/l的NAHCO3溶液中，用1.5ml避光离心管分装，每个离心管中装80μl TRITC-conA染液，置于-20℃冰箱保存；

B、配制TRITC-conA和FITC-ECA混合染液：将1ml无菌去离子水加入到1支装有TRITC-conA染液的避光离心管中，然后加入40μl FITC-ECA染液，用漩涡振荡器震荡30s，再用离心机以2000rpm转速离心2min；

C、用无菌磷酸盐缓冲液轻轻漂洗载体，去除浮游菌；

D、滴加TRITC-conA和FITC-ECA混合染液100μl到载体上，并轻轻晃动载体使染液均匀涂布，后室温下避光静置90min；

E、将载体用磷酸盐缓冲液轻轻漂洗，洗掉未粘附的多余的染液。

（6）共聚焦显微镜观察

用波长为488nm的激发光观察FITC-ECA，显示为绿光；用波长为543nm的激发光观察TRITC-conA，显示出红光；两种颜色的光重叠部分显示为黄光。

实施例2

荧光染色方法按照实施例1步骤依次进行；图1是荧光染色后观察结果，A：8h时为孢子萌芽阶段，观察到细胞壁上绿色的半乳糖；B：12h时为菌丝延长阶段，观察到细胞壁上绿色的半乳糖；C：16h时菌丝继续生长阶段，观察到红色的葡萄糖和甘露糖开始出现，并且绿色的半乳糖开始出现在细胞壁外，几种多糖开始包绕菌丝；D：20h时菌丝更多，红色的葡萄糖和甘露糖及绿色的半乳糖也在增多，并部分重叠为黄色；E：24h时菌丝已经形成三维结构，红色的葡萄糖和甘露糖及绿色的半乳糖继续增多，并部分重叠为黄色；F：48h时菌丝已经形成有序的三维立体结构，各种胞外多糖基本把菌丝完全覆盖，但是其分布是不均匀的。

扫描电镜观察：（1）用体积分数为2.5%戊二醛的固定2h；（2）依次用体积分数为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇梯度脱水，每个浓度脱水10min；（3）临界干燥仪干燥；（4）真空喷镀金粉；（5）观察和摄片，条件：电压20kV，放大倍数2000倍。结果如图2 所示，A：到8h时孢子萌芽；B： 12h时菌丝延长，菌丝周围未见胞外基质；C： 16h时菌丝继续生长，部分菌丝周围隐约可见少量胞外基质；D：20h时菌丝较前多，菌丝周围的胞外基质有所增加；E：24h时菌丝形成三维结构，胞外基质未能完全覆盖菌丝；F：48h时胞外基质基本覆盖了菌丝，菌丝轮廓仅隐约可见。

实施例3

（1）制备载体：将直径为15 mm玻璃细胞爬片进行灭菌，作为载体。

（2）收集菌株：于2013年4月到2013年10月在广西医科大学第一附属医院检验科细菌室收集到的40株烟曲霉菌，经过96孔板造膜，结晶紫半定量法比较出成膜能力最强的菌株作为受试菌株。

（3）试验试剂和器材与实施例1相同。

（4）制备烟曲霉生物膜载体  以灭菌后的玻璃细胞爬片（直径15mm）作为载体。将受试烟曲霉菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂平皿上，置于35℃培养活化5天，用10ml含有吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用25ml MOPS缓冲的RPMI-1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPMI-1640液体培养液调整浓度为5×10⁵·孢子·ml^-1，将1ml孢子悬液加入24孔板中的无菌玻璃细胞爬片上，静置于35℃生化培养箱中孵育，每日用MOPS缓冲的RPMI-1640换液。于培养8、12、16、20、24、48h取出载体，每次取3个，分别行荧光染色和扫描电镜观察。

（5）荧光染色方法 

A、配制TRITC-conA染液，将15mg TRITC-conA溶解于10ml 0.1mol/l的NAHCO3溶液中，用3ml避光离心管分装，每个离心管中装100μl TRITC-conA染液，置于-25℃冰箱保存；

B、配制TRITC-conA和FITC-ECA混合染液：将3ml无菌去离子水加入到1支装有TRITC-conA染液的避光离心管中，然后加入50μl FITC-ECA染液，用漩涡振荡器震荡60s，再用离心机以3000rpm转速离心4min；

C、用无菌磷酸盐缓冲液轻轻漂洗载体，去除浮游菌；

D、滴加TRITC-conA和FITC-ECA混合染液120μl到载体上，并轻轻晃动载体使染液均匀涂布，后室温下避光静置100min；

E、将载体用磷酸盐缓冲液轻轻漂洗，洗掉未粘附的多余的染液。

（6）共聚焦显微镜观察

用波长为488nm的激发光观察FITC-ECA，显示为绿光；用波长为543nm的激发光观察TRITC-conA，显示出红光；两种颜色的光重叠部分显示为黄光。

实施例4

（1）制备载体：将直径为10mm玻璃细胞爬片进行灭菌，作为载体。

（2）收集菌株：于2013年4月到2013年10月在广西医科大学第一附属医院检验科细菌室收集到的60株烟曲霉菌，经过96孔板造膜，结晶紫半定量法比较出成膜能力最强的菌株作为受试菌株。

（3）试验试剂和器材与实施例1相同。

（4）制备烟曲霉生物膜载体  以灭菌后的玻璃细胞爬片（直径10mm）作为载体。将受试烟曲霉菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂平皿上，置于36℃培养活化4天，用8ml含有吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用23ml MOPS缓冲的RPMI-1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPMI-1640液体培养液调整浓度为3×10⁵·孢子·ml^-1，将1.5ml孢子悬液加入24孔板中的无菌玻璃细胞爬片上，静置于36℃生化培养箱中孵育，每日用MOPS缓冲的RPMI-1640换液。于培养8、12、16、20、24、48h取出载体，每次取4个，分别行荧光染色和扫描电镜观察。

（5）荧光染色方法 

A、配制TRITC-conA染液，将13mg TRITC-conA溶解于8ml 0.1mol/l的NAHCO3溶液中，用2ml避光离心管分装，每个离心管中装90μl TRITC-conA染液，置于-23℃冰箱保存；

B、配制TRITC-conA和FITC-ECA混合染液：将3ml无菌去离子水加入到1支装有TRITC-conA染液的避光离心管中，然后加入45μl FITC-ECA染液，用漩涡振荡器震荡40s，再用离心机以2500rpm转速离心3min；

C、用无菌磷酸盐缓冲液轻轻漂洗载体，去除浮游菌；

D、滴加TRITC-conA和FITC-ECA混合染液110μl到载体上，并轻轻晃动载体使染液均匀涂布，后室温下避光静置95min；

E、将载体用磷酸盐缓冲液轻轻漂洗，洗掉未粘附的多余的染液。

（6）共聚焦显微镜观察

用波长为488nm的激发光观察FITC-ECA，显示为绿光；用波长为543nm的激发光观察TRITC-conA，显示出红光；两种颜色的光重叠部分显示为黄光。

Claims (6)

1.一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于：包括制备载体、收集菌株、制备烟曲霉生物膜载体、荧光染色方法和共聚焦显微镜观察，具体检测步骤如下：

1）制备载体 将直径为10~15 mm玻璃细胞爬片进行灭菌，作为载体；

2）收集菌株 将烟曲霉菌经过96孔板造膜，以结晶紫半定量法筛选出成膜能力最强的菌株，作为试验菌株；

3）制备烟曲霉生物膜载体  将步骤2）获得的菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂平皿上，置于35~37℃培养箱培养活化3~5天，用5~10ml含有吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用20~25ml MOPS缓冲的RPMI-1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPMI-1640液体培养液调整浓度为1~5×10⁵·孢子·ml^-1，将1~2ml孢子悬液加入步骤1）制备的玻璃细胞爬片上，玻璃细胞爬片置于无菌24孔板的孔内，每孔放一个，静置于35~37℃生化培养箱中培养；

4）荧光染色方法  

A：制备TRITC-conA染液，将10~15mg TRITC-conA和5~10ml 0.1mol/l的NaHCO₃溶液置于容器中，并不断搅拌至TRITC-conA颗粒完全溶解，得TRITC-conA染液，并用1.5~3ml避光离心管分装，每个离心管中装80~100μl TRITC-conA染液，置于-20~-25℃保存；

B：制备TRITC-conA和FITC-ECA混合染液，将步骤A制备的TRITC-conA染液，加入1~3ml去离子水，后加入40~50μl FITC-ECA染液，用漩涡振荡器震荡30~60s，再用离心机以2000~3000rpm转速离心2~4min；

C：将步骤3）制备的烟曲霉生物膜载体用无菌磷酸盐缓冲液漂洗，去除浮游菌；

D：将步骤B制备的TRITC-conA和FITC-ECA混合染液100~120μl滴加到载体上，并晃动载体使染液均匀涂布，后在室温下避光静置90~100min；

E：将步骤D制备的载体用磷酸盐缓冲液漂洗，洗掉未粘附的多余的染液；

5）共聚焦显微镜观察  用波长为488nm的激发光观察FITC-ECA，用波长为543nm的激发光观察TRITC-conA。

2.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于：所述步骤3）制备的烟曲霉生物膜载体静置于35~37℃生化培养箱中培养48~50h，间隔24h用MOPS缓冲的RPMI-1640换液。

3.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于：所述的TRITC-conA为10~13mg与5~8ml 0.1mol/l的NaHCO₃溶液混合，溶解。

4.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于：所述的TRITC-conA加入1~2ml去离子水，后加入的FITC-ECA染液为40~45μl。

5.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于：所述的TRITC-conA和FITC-ECA混合染液用漩涡振荡器震荡30~40s，再用离心机以2000~2500rpm转速离心2~3min。

6.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于：所述的TRITC-conA和FITC-ECA混合染液滴加到载体的量为110~120μl，晃动载体使染液均匀涂布，后在室温下避光静置95~100min。