CN104145818A - 一种非洲菊种质资源的保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种非洲菊种质资源的保存方法，该方法包括选择舌状花刚开放至管状花已吐粉的非洲菊花朵，留花梗长5cm～6cm，经处理后的外植体通过诱导培养，两个不同配方的继代培养基连续继代培养，大棚内生根培养后，育苗袋培养及棚内栽种1年。一个保存周期可保存非洲菊种质资源达3～4年，种质资源材料的田间成活率达90％以上。该方法通过两种不同的继代培养基的依次继代培养和棚内复壮两个环节保存非洲菊种源，降低了激素因素、栽培环境等原因造成的种苗变异和品质退化问题，稳定地保存了非洲菊品质资源的优良性状，是一种新的、有效的非洲菊种质资源保存方法。

Description

一种非洲菊种质资源的保存方法

技术领域

本发明涉及一种非洲菊种质资源的保存方法，属于生物技术领域。

背景技术

非洲菊(Gerbera jamesonil Bolus)又名扶郎花，菊科大丁草属多年生宿根常绿草本花卉。因其花朵硕大,花色丰富,姿态各异,装饰性强,耐长途运输，深受广大消费者青睐。在适宜条件下可周年生产，周年开花，全年可为市场供应鲜切花,为世界五大切花之一。我国自上世纪90年代以来曾大量从荷兰引种栽培,经多年试验,由于气候条件、栽培技术的限制,普遍出现品质退化现象,优良种性严重退化甚至丧失,失去了栽培利用价值,不得不从生产中逐步淘汰。非洲菊品种退化通常表现为花朵变小、过渡色多、花型紊乱、双秆现象、株高参差不齐、生活力下降、抗性和产量降低等。

造成非洲菊品种退化的原因主要是：栽培环境如光照、水分、温度、营养不适宜非洲菊生长发育，土壤板结和盐渍化、连作土地的病原菌大量积累并复合浸染等，导致品种失去原有的典型性；在非洲菊组织培养过程中,培养温度、增殖芽的继代代数以及激素浓度等因素造成非洲菊种苗发生无性变异。所谓种质，是指决定生物体遗传性状并将遗传信息从亲代传给后代的遗传物质，种质资源的调查、收集、保存和评价是科学开发利用植物的基础，对最大限度地发挥种质资源利用潜力具有决定性的作用。

目前，非洲菊种质资源的保存大多以室内组培和田间栽培保存，组培方法主要以幼蕾花托作为非洲菊组织培养的外植体，但幼蕾花托作为外植体存在表面消毒较难，消耗试材量大，且花蕾的大小要求严格，过小容易死亡，过大易染率，材料选择受时间限制，在田间同一时间取材，达到要求的花蕾较少的问题；目前非洲菊组织培养保存的不足表现在继代培养周期较短，保种花费相对较大；棚内栽培保存的不足表现在占地面积多，光、温、水及病虫害控制较难，多年栽培形成土壤板结、盐渍化、病原菌大量积累，连作障碍导致品种失去原有的典型性。因此一种适宜的非洲菊种质资源保存方法对非洲菊的产业发展具有重要意义。

发明内容

针对目前非洲菊种质资源的保存方面存在的缺陷或不足，本发明的提供一种非洲菊种质资源保存方法，目的在于使其外植体取材方便、继代周期加长、保存成本降低、变异降低，能较好地稳定品种种性，满足科学开发利用非洲菊种质资源的需要。

本发明所提供的一种非洲菊种质资源的保存方法，其特征在于步骤如下：

(1)外植体材料的选择和预处理

①选择无病虫危害、种质与亲本一致的非洲菊健壮植株，摘取舌状花刚开放至管状花已吐粉的非洲菊花朵，留花梗长5cm～6cm，***装有5～15mg/L 6-BA水溶液中，放入4℃的冰箱中低温处理3～7天；

②将步骤(1)①处理的材料先用洗衣粉水清洗，再用清水冲洗干净后，在超净环境下，用刀片切除花梗与舌状花边缘，先放入质量百分浓度为0.1％的氯化汞溶液消毒15min，再放入在质量百分浓度为2％的次氯酸钠溶液中加2滴吐温20的混合液中消毒10min，之后用无菌水冲洗3～4次，再用镊子拔去花托上的所有舌状花，用解剖刀切除花萼边缘及花托底部0.2～0.3cm的厚度即为所需的非洲菊外植体；

(2)诱导培养

将(1)②所述的非洲菊外植体放入下列培养基中：

MS基本培养液

在光照强度为1500～2000lx，温度为25±2℃，光照时间为10～12h/d的条件下，诱导培养25～35d至外植体萌发分化出1～2cm高的幼芽，切下幼芽；

(3)第一次继代培养

将步骤(2)切下的幼芽切成单株转接到下列继代培养基Ⅰ中：

MS改良培养液

所述MS改良培养液是：常规MS培养液中大量元素的浓度减半，盐酸硫胺素浓度为2mg/L，盐酸吡哆醇浓度为1mg/L的培养液；

在光照强度为1500～2000lx，温度为18±2℃，光照时间为10～12h/d的条件下培养45～55d；

(4)第二次继代培养

将步骤(3)第一次继代培养的幼芽切成单株转接到下列继代培养基Ⅱ中：

MS改良培养液

所述MS改良培养液与步骤(3)第一次继代培养继代培养基Ⅰ中的MS改良培养液相同；

在光照强度为1500～2000lx，温度为18±2℃，光照时间为10～12h/d的条件下培养60～70d；

(5)将步骤(4)第二次继代培养的幼芽切成单株再重复依次用(3)第一次继代培养和步骤(4)第二次继代培养至2～3年；

(6)将步骤(5)的丛生芽2cm以上的健壮植株切成单株接种到下列生根培养基中进行生根培养：

1/2MS基本培养液

所述的1/2MS基本培养液是：常规MS培养液中全量元素的浓度减半的培养液；

在组培瓶的瓶口包裹封口膜，移至盖有遮光率为70％遮阳网的大棚苗床上培养至植株基部长出3～5条根，大棚的温度控制为18℃-28℃；

(7)将步骤(6)的生根植株取出，按常规洗净苗上的培养基，放入质量百分浓度为0.1％的多菌灵溶液中消毒1～2min后，移栽至装有混合基质的育苗袋中，按常规进行浇水、施肥管理，生长45d后，即得非洲菊移栽苗；所述混合基质为按腐植土︰红土︰珍珠岩的体积比为2︰1︰0.5配制而成；

(8)将步骤(7)获得的移栽苗在棚内栽种1年。

进一步，根据非洲菊种质资源的利用计划，可重复上述步骤(1)至步骤(8)继续保存非洲菊种质资源。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明以舌状花刚开放至管状花已吐粉的非洲菊花朵为外植体材料进行组织培养，减少了对母体植株的伤害(因非洲菊可周年开花，且花期较长，减少对母株的伤害，可减少非洲菊商品的损失)，并且使外植体取材更加灵活，来源更加广阔，可取市场上流行出售的优质品种的花朵作为外植体，为育种工作中的种质引进和保存提供了新途径。

2、整个外植体消毒过程中多余材料的剔出，提高了灭菌率效果；所取的外植体较为成熟，减少了外植体的褐化率和死亡率。

3、对整个非洲菊种质资源保存的关键环节进行了改良。外植体通过低温处理和激素处理，利用MS改良培养液，降低了激素的用量，幼芽分化时间只需25～35d，同时激素用量的减少降低了不定芽发生变异的机率。

4、将常规室内日光灯下的生根培养步骤改为在大棚苗床上培养，不仅节约了生根培养阶段的电费成本，而且提高了生根苗对后续移栽培养的适应能力；无菌生根苗直接移栽进入育苗袋中，省去了组培苗营养钵移栽的环节，移栽成活的种苗便于运输，摘去育苗袋后直接栽种。

5、本发明方法依次用两种不同的继代培养基依次进行继代培养，不仅培养效果好，而且两次继代培养的时间合计可长达105天～125天，降低了保种成本。

6本发明方法保存非洲菊种质资源可达3～4年多，种质资源材料的田间成活率达90％以上。通过本发明两种不同的继代培养基的依次继代培养和棚内复壮两个环节保存非洲菊种源，降低了激素因素、栽培环境等原因造成的种苗变异和品质退化问题，降低了单纯组培保存方法中继代代数过多引起的变异，弥补了目前非洲菊种质资源保存的不足之处，稳定地保存了非洲菊品质资源的优良性状，是一种新的、行之有效的非洲菊种质资源保存方法。

具体实施方式

为了更好地说明本发明，下面给出本发明的实施例，但本发明的内容并不仅限于此。各实施例中无特殊说明的为常规方法。

实施例1

(1)外植体材料的选择和预处理

①选择株型较好、无病虫危害、种质与亲本一致的非洲菊健壮植株，摘取舌状花刚开放的非洲菊花朵，留花梗长5cm～6cm，***装有5mg/L 6-BA水溶液(即6-BA用自来水配制成浓度为5mg/L水溶液)中，放入4℃的冰箱中低温处理7天；

②将步骤(1)①处理的材料先用洗衣粉水清洗，再用清水冲洗干净后，在超净环境下，用刀片切除花梗与舌状花边缘(使材料的大小适于在容器中消毒)，先放入质量百分浓度为0.1％的氯化汞溶液消毒15min，再放入在质量百分浓度为2％的次氯酸钠溶液中加2滴吐温20的混合液中消毒10min，之后用无菌水冲洗3～4次，再用镊子拔去花托上的所有舌状花，用解剖刀切除花萼边缘及花托底部0.2～0.3 cm的厚度即为所需的非洲菊外植体。

(2)诱导培养

将(1)②所述的非洲菊外植体放入下列培养基中：

MS基本培养液

在光照强度为1500～2000lx，温度为25±2℃，光照时间为10～12h/d的条件下，诱导培养25d至外植体萌发分化出1～2cm高的幼芽，切下幼芽。

(3)第一次继代培养

将步骤(2)切下的幼芽切成单株转接到下列继代培养基Ⅰ中：

MS改良培养液

所述MS改良培养液是：常规MS培养液中大量元素的浓度减半，盐酸硫胺素浓度为2mg/L，盐酸吡哆醇浓度为1mg/L的培养液；

在光照强度为1500～2000lx，温度为18±2℃，光照时间为10～12h/d的条件下培养55d。

(4)第二次继代培养

将步骤(3)第一次继代培养的幼芽切成单株转接到下列继代培养基Ⅱ中：

MS改良培养液

所述MS改良培养液与步骤(3)第一次继代培养继代培养基Ⅰ中的MS改良培养液相同；

在光照强度为1500～2000lx，温度为18±2℃，光照时间为10～12h/d的条件下培养70d。

(5)将步骤(4)第二次继代培养的幼芽切成单株再重复依次用(3)第一次继代培养和步骤(4)第二次继代培养至2～3年。

(6)将步骤(5)的丛生芽2cm以上的健壮植株切成单株接种到下列生根培养基中进行生根培养：

1/2 MS基本培养液

所述的1/2MS基本培养液是：常规MS培养液中全量元素的浓度减半的培养液；

在组培瓶的瓶口包裹封口膜，移至盖有遮光率为70％遮阳网的大棚苗床上培养至植株基部长出3～5条根，大棚的温度控制为18℃-28℃。

(7)将步骤(6)的生根植株取出，按常规洗净苗上的培养基，放入质量百分浓度为0.1％的多菌灵溶液中消毒1～2min后，移栽至装有混合基质的育苗袋中，按常规进行浇水、施肥管理，生长45d后，即得非洲菊移栽苗；所述混合基质为按腐植土︰红土︰珍珠岩的体积比为2︰1︰0.5配制而成；

(8)将步骤(7)获得的移栽苗在棚内栽种1年。

实施例2

实施例2除以下操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

(1)外植体材料的选择和预处理

①选择株型较好、无病虫危害、种质与亲本一致的非洲菊健壮植株，摘取舌状花已完全开放，但管状花还未吐粉的非洲菊花朵，留花梗长为5cm～6cm，***装有10mg/L 6-BA水溶液中，放入4℃的冰箱中低温处理5天；

(2)诱导培养

诱导培养基：

MS基本培养液

(3)第一次继代培养

继代培养基Ⅰ：

MS改良培养液

(4)第二次继代培养

继代培养基Ⅱ：

MS改良培养液

实施例3

实施例3除以下操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

(1)外植体材料的选择和预处理

①选择株型较好、无病虫危害、种质与亲本一致的非洲菊健壮植株，摘取管状花已吐粉的非洲菊花朵，留花梗长为5cm～6cm，***装有15mg/L6-BA水溶液中，放入4℃的冰箱中低温处理3天；

(2)诱导培养

诱导培养基：

MS基本培养液

(3)第一次继代培养

继代培养基Ⅰ：

MS改良培养液

(4)第二次继代培养

继代培养基Ⅱ：

MS改良培养液

以上各实施例保存非洲菊种质资源可达3～4年多，种质资源材料的田间成活率达90％以上。通过本发明两种不同的继代培养基的依次继代培养和棚内复壮两个环节保存非洲菊种源，降低了激素因素、栽培环境等原因造成的种苗变异和品质退化问题，降低了单纯组培保存方法中继代代数过多引起的变异，弥补了目前非洲菊种质资源保存的不足之处，稳定地保存了非洲菊品质资源的优良性状，是一种新的、行之有效的非洲菊种质资源保存方法。

Claims (1)

1.一种非洲菊种质资源的保存方法，其特征在于步骤如下：

(1)外植体材料的选择和预处理

①选择无病虫危害、种质与亲本一致的非洲菊健壮植株，摘取舌状花刚开放至管状花已吐粉的非洲菊花朵，留花梗长5cm～6cm，***装有5～15mg/L 6-BA水溶液中，放入4℃的冰箱中低温处理3～7天；

②将步骤(1)①处理的材料先用洗衣粉水清洗，再用清水冲洗干净后，在超净环境下，用刀片切除花梗与舌状花边缘，先放入质量百分浓度为0.1％的氯化汞溶液消毒15min，再放入在质量百分浓度为2％的次氯酸钠溶液中加2滴吐温20的混合液中消毒10min，之后用无菌水冲洗3～4次，再用镊子拔去花托上的所有舌状花，用解剖刀切除花萼边缘及花托底部0.2～0.3cm的厚度即为所需的非洲菊外植体；

(2)诱导培养

将(1)②所述的非洲菊外植体放入下列培养基中：

MS基本培养液

在光照强度为1500～2000lx，温度为25±2℃，光照时间为10～12h/d的条件下，诱导培养25～35d至外植体萌发分化出1～2cm高的幼芽，切下幼芽；

(3)第一次继代培养

将步骤(2)切下的幼芽切成单株转接到下列继代培养基Ⅰ中：

MS改良培养液

所述MS改良培养液是：常规MS培养液中大量元素的浓度减半，盐酸硫胺素浓度为2mg/L，盐酸吡哆醇浓度为1mg/L的培养液；

在光照强度为1500～2000lx，温度为18±2℃，光照时间为10～12h/d的条件下培养45～55d；

(4)第二次继代培养

将步骤(3)第一次继代培养的幼芽切成单株转接到下列继代培养基Ⅱ中：

MS改良培养液

所述MS改良培养液与步骤(3)第一次继代培养继代培养基Ⅰ中的MS改良培养液相同；

在光照强度为1500～2000lx，温度为18±2℃，光照时间为10～12h/d的条件下培养60～70d；

(5)将步骤(4)第二次继代培养的幼芽切成单株再重复依次用(3)第一次继代培养和步骤(4)第二次继代培养至2～3年；

(6)将步骤(5)的丛生芽2cm以上的健壮植株切成单株接种到下列生根培养基中进行生根培养：

1/2MS基本培养液

所述的1/2MS基本培养液是：常规MS培养液中全量元素的浓度减半的培养液；

在组培瓶的瓶口包裹封口膜，移至盖有遮光率为70％遮阳网的大棚苗床上培养至植株基部长出3～5条根，大棚的温度控制为18℃-28℃；

(7)将步骤(6)的生根植株取出，按常规洗净苗上的培养基，放入质量百分浓度为0.1％的多菌灵溶液中消毒1～2min后，移栽至装有混合基质的育苗袋中，按常规进行浇水、施肥管理，生长45d后，即得非洲菊移栽苗；所述混合基质为按腐植土︰红土︰珍珠岩的体积比为2︰1︰0.5配制而成；

(8)将步骤(7)获得的移栽苗在棚内栽种1年。