CN104136423B - 核糖核苷酸还原酶抑制剂和使用方法 - Google Patents

核糖核苷酸还原酶抑制剂和使用方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了通过与RRM2结合并且干扰RRM1/RRM2全酶活性来抑制核糖核苷酸还原酶(RR)的新型化合物以及合成这些新型化合物的方法。所述化合物可以用于抑制RR活性以及治疗与RRM2表达有关的各种病状，例如像某些癌症类型、线粒体疾病或变性疾病。

Description

核糖核苷酸还原酶抑制剂和使用方法
相关申请
本申请要求2012年2月1日提交的美国申请No.13/364,263的权益，该美国申请的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
政府利益
本发明是在政府支持下在由美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)授予的拨款号CA127541下进行的。政府拥有本发明的某些权利。
发明背景
核糖核苷酸二磷酸还原酶(RR)是脱氧核糖核苷酸合成通路中的一种普遍存在于人类、细菌、酵母以及其它生物体中的受高度调节的酶(Jordan 1998)。RR负责使核糖核苷酸二磷酸重新转化成2'-脱氧核糖核苷酸二磷酸，这一过程对于DNA合成和修复来说是必不可少的(Thelander 1986；Jordan 1998；Liu 2006)。RR直接牵涉到肿瘤生长、转移以及药物抗性(Yen 1994；Zhou 1995；Nocentini 1996；Fan 1998；Zhou 1998)。
转移性癌细胞的增殖需要过量的dNTP进行DNA合成。因此，RR活性的增强是必需的，这是因为它帮助提供供原发和转移性癌细胞中的DNA复制使用的额外dNTP。由于这种在DNA合成中的关键作用，因此RR代表了癌症疗法的一个重要的靶标。然而，在用于癌症治疗的RR抑制剂的研发方面几乎没有进展。当前处于临床使用中 的三种RR抑制剂(羟基脲、3-氨基吡啶-2-甲醛缩氨基硫脲(3-AP)以及GTI2040)各自具有显著的缺点。因此，在本领域中需要用于靶向和治疗基于RR的癌症的更有效的组合物和方法。
发明概述
在某些实施方案中，提供了一组新型化合物，包括COH4、COH20和COH29以及其各种化学衍生物。还提供了包含这些化合物的组合物和药物制剂。
在某些实施方案中，提供了用于抑制细胞中的RR活性的方法，所述方法是通过使所述细胞与本文所提供的一种或多种化合物接触来实现的，所述化合物包括COH4、COH20和/或COH29。
在某些实施方案中，提供了用于抑制表达RRM2的细胞生长或增殖的方法，所述方法是通过使所述细胞与治疗有效量的本文所提供的一种或多种化合物接触来实现的，所述化合物包括COH4、COH20和/或COH29。
在某些实施方案中，提供了用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法是通过施用治疗有效量的本文所提供的一种或多种化合物来实现的，所述化合物包括COH4、COH20和/或COH29。在某些实施方案中，所述癌症可以特征在于RRM2过表达，并且在某些实施方案中，所述癌症可以对使用羟基脲进行的治疗具有抗性。
在某些实施方案中，提供了用于抑制表达RRM2的干细胞增殖的方法，所述方法是通过使所述干细胞与治疗有效量的本文所提供的一种或多种化合物接触来实现的，所述化合物包括COH4、COH20和/或COH29。
在某些实施方案中，提供了一种具有下式的化合物：
结构VIA。
在结构VIA中，R是取代或未取代的芳基。R1、R2、R3、R4、R5、R6以及R7独立地是氢、-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、氧代、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基。R8、R9、R10以及R11独立地是羟基保护基。R8和R9任选地连接在一起形成取代或未取代的杂环烷基。R10和R11任选地连接在一起形成取代或未取代的杂环烷基。
在某些实施方案中，提供了一种组合物，所述组合物包括具有结构VIA或其实施方案的化合物以及有机溶剂(例如非极性溶剂或极性非质子溶剂)。
在某些实施方案中，提供了一种组合物，所述组合物包括具有结构VIA或其实施方案的化合物以及羟基脱保护剂。
在某些实施方案中，提供了一种用于合成具有以下结构的化合物的方法：
所述方法包括使羟基脱保护剂与具有下式的化合物接触：
结构VIA。
从而去除R8、R9、R10以及R11保护基。在结构VIA中，R是取代或未取代的芳基。R1、R2、R3、R4、R5、R6以及R7独立地是氢、-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、氧代、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基。R8、R9、R10以及R11独立地是羟基保护基。R8和R9任选地连接在一起形成取代或未取代的杂环烷基。R10和R11任选地连接在一起形成取代或未取代的杂环烷基。
在某些实施方案中，提供了用于合成和/或纯化本文公开的各种化合物的方法，所述化合物包括COH4、COH20和/或COH29。在某些实施方案中，提供了用于合成和/或纯化COH29或各种COH29合成中间体的方法。在这些实施方案中的某些实施方案中，本文提供的合成方法利用藜芦醚作为起始物质，并且在这些实施方案中的某些实施方案中，COH29合成是经由1-(3,4-二甲氧基苯基)-2-苯基乙酮、4-(3,4-二甲氧基苯基)-5-苯基噻唑-2-胺以及N-(4-(3,4-二甲氧基苯基)-5-苯基噻唑-2-基)-3,4-二甲氧基苯甲酰胺中间体来完成的。在这些实施方案中的某些实施方案中，COH29的合成经由以下合成途径进行：
附图简述
图1：经由siRNA抑制被植入有人类HepG2肝癌细胞的小鼠的RRM2使肿瘤生长减少。
图2：与正常组织相比RRM2在癌症组织和癌细胞系中过表达。
图3：RRM2转染子增强人类癌细胞系的侵袭潜能。
图4：RRM2上的V形配体结合口袋的预测。铁簇以红色示出。
图5：NCI-3类似物的合成策略
图6：HU、3-AP、NCI-3、COH4以及COH20在体外对RR活性的抑制作用。
图7：COH20对细胞内RR活性的抑制作用。
图8：COH20在KB细胞中对dNTP池的抑制作用。
图9：3-AP、HU、COH4以及COH20在体外在人类***LNCaP癌细胞中的细胞毒性。
图10：3-AP、HU、COH4以及COH20在体外在人类KB癌细胞中的细胞毒性。
图11：3-AP、HU、COH4以及COH20在体外在正常人类成纤维细胞(NHDF)中的细胞毒性。
图12：3-AP、HU、COH4以及COH20在体外在人类KBHUR癌细胞中的细胞毒性。
图13：3-AP、HU、COH4以及COH20在体外在人类KBMDR(多药抗性)细胞中的细胞毒性。
图14：COH20对人类KB和KBMDR细胞增殖的抑制作用。
图15：上图：在使用3-AP或COH20处理后对KB细胞进行流式细胞测量术。下图：在使用3-AP或COH20处理后对KB细胞进行膜联蛋白染色。
图16：COH20在大鼠体内的单次剂量药物代谢动力学。
图17：在正常小鼠体内进行的COH20最高耐受剂量确定。
图18：对RRM2与COH20和3-AP的结合进行的Biacore分析。
图19：COH20对RRM1与RRM2的结合的干扰作用。
图20：单次剂量施用COH29对癌细胞生长的抑制作用。
图21：多次剂量施用COH29对癌细胞生长的抑制作用。
图22：多次剂量施用COH29对癌细胞生长的抑制作用。结果根据细胞系组织来源进行分组。
图23：多次剂量施用COH29对癌细胞生长的抑制作用。
图24：多次剂量施用COH29对癌细胞生长的抑制作用。
图25：COH29在大鼠体内的药物代谢动力学。
图26：COH29的合成。
发明详述
以下发明详述仅意图说明本发明的各种实施方案。因而，所论述的具体改动方案并不被视为对本发明的范围的限制。对于本领域技术人员将显而易见的是，可以作出各种等同方案、变化以及改动而不背离本发明的范围，并且应当了解的是，这些等同的实施方案将被包括 在本文中。
在本文使用以下缩写：3-AP，3-氨基吡啶-2-甲醛缩氨基硫脲；DCM，二氯甲烷；DMF，二甲基甲酰胺；dNTP，脱氧核糖核苷酸三磷酸；HU，羟基脲；RR，核糖核苷酸还原酶；RRM1，核糖核苷酸还原酶大亚单位；RRM2，核糖核苷酸还原酶小亚单位。
如本文所用的短语“治疗有效量”指的是化合物产生所需的治疗作用的量。确切的治疗有效量是组合物将在功效方面在给定的受试者体内产生最有效的结果的量。该量将根据多种因素而变化，这些因素包括但不限于治疗性化合物的特征(包括活性、药物代谢动力学、药效学以及生物利用度)、受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和分期、一般身体状况、对给定剂量的反应性和药物类型)、制剂中一种或多种药学上可接受的载体的性质、以及施用途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规的实验，即通过监测受试者对化合物施用的反应并且相应地调整剂量来确定治疗有效量。关于另外的指导，参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro编著,第20版,Williams&Wilkins PA,USA)(2000)。
如本文所用的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”病状可以指预防或缓解病状、减缓病状发作或发展速率、降低病状发展的风险、预防或延迟与病状有关的症状发展、减轻或遏止与病状有关的症状、使病状完全或部分消退、治愈病状或其某种组合。对于癌症，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”可以指抑制或减缓赘生性和/或恶性细胞生长、增殖和/或转移；预防或延迟赘生性和/或恶性细胞生长、增殖和/或转移发展、或其某种组合。对于肿瘤，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”可以指根除所有或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长和转移、预防或延迟肿瘤发展、或其某种组合。
如本文所用的“特征在于过表达RRM2”的癌症指的是在mRNA或蛋白质层面上以大于相应正常细胞或组织的RRM2表达水平的水 平表达RRM2的任何癌症类型。举例来说，如果***癌细胞系在mRNA或蛋白质层面上以大于在相应正常***细胞中所观测到的RRM2表达水平的水平表达RRM2，那么该***癌细胞系是特征在于过表达RRM2的癌症。如本文所用的特征在于过表达RRM2的癌症还指的是与正常的未转化的细胞或组织相比其中RRM2抑制剂表现出另外的或选择性作用的任何癌症类型。举例来说，如果一种癌症类型由于与正常的细胞在有丝***指数方面存在差异而对核苷酸池具有更大的依赖性，从而使得它对抑制RRM2更敏感，那么所述癌症类型是特征在于RRM2过表达的癌症。
如本文所用的术语“羟基保护基”是共价结合至单价羟基氧原子的单价化学部分，该单价化学部分用以防止羟基部分与本文所述的化学合成方法中所用的试剂反应(通常被称为“保护”羟基)并且可以在不使羟基部分形成为一部分的分子降解的条件下被去除(通常被称为使羟基“脱保护”)，从而产生游离羟基。羟基保护基可以是对酸不稳定的、对碱不稳定的或在其它试剂存在下不稳定的。羟基保护基包括但不限于活化亚乙基保护基、苯甲基醚保护基、基于硅的碳酸酯保护基、缩醛保护基或环状缩醛保护基。羟基保护基包括甲基苯甲基、对甲氧基苯甲基、烯丙基、三苯甲基、对甲氧基苯基、四氢吡喃基、甲氧基甲基、1-乙氧基乙基、2-甲氧基-2-丙基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基、2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基、甲基硫甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、 其中n是0或1；R12是氢、-OH、-OR16或者取代或未取代的烷基，其中R16是取代或未取代的烷基；并且R13、R14以及R15是取代或未取代的烷基。
如本文所用的术语“羟基脱保护剂”是用以去除羟基保护基，从而 产生游离羟基的化合物或元素。可用于本发明的方法中的羟基脱保护剂包括：溴化锌、溴化镁、四氯化钛、二甲基溴化硼、三甲基碘化甲硅烷、银(Ag+)盐、汞(Hg+)盐、锌、二碘化钐、钠汞齐、三氟乙酸、氢氟酸、盐酸、氢化、(TBAF)四正丁基氟化铵、三氟化硼、四氟化硅、三溴化硼、芳基甲醚、四丁基氟化铵、氢气/Pd/C、Zn/酸或氨。
本文所用的缩写具有它们在化学和生物领域内常规的含义。本文所阐述的化学结构和化学式是根据化学领域已知的化合价标准规则来建构的。
在取代基通过它们常规的从左向右书写的化学式来指定的情况下，它们同样涵盖因从右向左书写结构而产生的在化学上相同的取代基，例如-CH2O-等同于-OCH2-。
除非另有说明，否则术语“烷基”单独或作为另一个取代基的一部分意指直链(即无支链)或支链碳链(或碳)或其组合，可以是完全饱和、单不饱和或多不饱和的并且可以包括二价基团和多价基团，具有所示数目的碳原子(即C1-C10意指一至十个碳)。饱和烃基的实例包括但不限于诸如以下的基团：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、(环己基)甲基、例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及高级同系物和异构体。烷氧基是经由氧连接基团(-O-)连接至分子其余部分的烷基。
除非另有说明，否则术语“杂烷基”单独或与另一个术语组合意指稳定的直链或支链或其组合，包括至少一个碳原子和至少一个选自O、N、P、Si以及S的杂原子，并且其中氮原子和硫原子可以任选地被氧化，并且氮杂原子可以任选地被季铵化。该一个或多个杂原子O、N、P、S以及Si可以位于杂烷基的任何内部位置上或位于烷基与分 子其余部分的连接位置上。实例包括但不限于：-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3、-CH＝CH-N(CH3)-CH3、-O-CH3、-O-CH2-CH3以及-CN。最多两个或三个杂原子可以是连续的，例如像-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。在首先叙述“杂烷基”，继而叙述具体杂烷基(如-NR'R″等)的情况下，应当了解的是，术语杂烷基和-NR'R″并非是多余的或相互排斥的。相反，叙述这些具体的杂烷基以使得更加清楚明了。因此，术语“杂烷基”在本文中不应当被解释为不包括具体的杂烷基，如-NR'R″等。
除非另有说明，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”分别单独或与其它术语组合意指“烷基”和“杂烷基”的环状形式。另外，对于杂环烷基，杂原子可以占据杂环与分子其余部分的连接位置。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。“亚环烷基”和“杂亚环烷基”分别单独或作为另一个取代基的一部分意指衍生自环烷基和杂环烷基的二价基团。
除非另有说明，否则术语“芳基”意指多不饱和的芳族烃取代基，所述取代基可以是单个环或稠合在一起(即稠环芳基)或共价连接的多个环(优选地1至3个环)。稠环芳基指的是稠合在一起的多个环，其中这些稠环中的至少一个是芳基环。术语“杂芳基”指的是含有至少一个诸如N、O或S之类的杂原子的芳基(或芳基环)，其中氮原子和硫原子任选地被氧化，并且一个或多个氮原子任选地被季铵化。因此，术语“杂芳基”包括稠环杂芳基(即稠合在一起的多个环，其中这些稠环中的至少一个是杂芳环)。5,6-稠环杂亚芳基指的是稠合在一起的两个环，其中一个环具有5个成员并且另一个环具有6个成员，并且其中至少一个环是杂芳基环。同样，6,6-稠环杂亚芳基指的是稠合在一 起的两个环，其中一个环具有6个成员并且另一个环具有6个成员，并且其中至少一个环是杂芳基环。并且6,5-稠环杂亚芳基指的是稠合在一起的两个环，其中一个环具有6个成员并且另一个环具有5个成员，并且其中至少一个环是杂芳基环。杂芳基可以经由碳或杂原子连接至分子的其余部分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基以及6-喹啉基。用于上文所述的芳基和杂芳基环***中的每一个的取代基选自下文所述的可接受的取代基。杂芳基的非限制性实例包括吡啶基、嘧啶基、噻吩基、呋喃基、吲哚基、苯并噁二唑基、苯并间二氧杂环戊烯基、苯并二噁烷基、硫代十氢化萘基(thianaphthanyl)、吡咯并吡啶基、吲唑基、喹啉基、喹喔啉基、吡啶并吡嗪基、喹唑啉酮基、苯并异噁唑基、咪唑并吡啶基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯基、萘基、联苯基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、吡嗪基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、呋喃并噻吩基、吡啶基、嘧啶基、苯并噻唑基、嘌呤基、苯并咪唑基、异喹啉基、噻二唑基、噁二唑基、吡咯基、二唑基、***基、四唑基、苯并噻二唑基、异噻唑基、吡唑并嘧啶基、吡咯并嘧啶基、苯并***基、苯并噁唑基或喹啉基。上述实例可以被取代或未被取代，并且上述每一个杂芳基实例的二价基团是杂亚芳基的非限制性实例。
上述术语(例如“烷基”、“杂烷基”、“芳基”以及“杂芳基”)中的每一个均包括所示基团的取代和未取代的形式(如本文所示)。每一种类型的基团的优选取代基提供于下文中。
烷基和杂烷基(包括经常被称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基以及杂环烯基的那些基团)的 取代基可以是选自但不限于以下的多种基团中的一种或多种：-OR'、＝O、＝NR'、＝N-OR'、-NR'R″、-SR'、-卤素、-SiR'R″R″'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R″、-OC(O)NR'R″、-NR″C(O)R'、-NR'-C(O)NR″R″'、-NR″C(O)2R'、-NR-C(NR'R″R″')＝NR″″、-NR-C(NR'R″)＝NR″'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R″、-NRSO2R'、-NR'NR″R″'、-ONR'R″、-NR'C＝(O)NR″NR″'R″″、-CN、-NO2，所述取代基的数目在零至(2m'+1)的范围内，其中m'是所述基团中碳原子的总数。R、R'、R″、R″'以及R″″各自优选地独立地指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基(例如被1-3个卤素取代的芳基)、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基、或芳基烷基。当本发明的化合物包括不止一个R基团时，例如，这些R基团中的每一个均经过独立的选择，当R'、R″、R″'以及R″″基团存在不止一个时，这些基团各自也是经过独立的选择。当R'和R"连接至同一个氮原子时，它们可以与氮原子组合形成4元、5元、6元或7元环。举例来说，-NR'R″包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据上文对取代基的论述，本领域技术人员将理解的是，术语“烷基”意指包括包含结合至除氢基团以外的基团的碳原子的基团，如卤代烷基(例如-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。与对于烷基所述的取代基相似，芳基和杂芳基的取代基是不同的并且选自例如：-OR'、-NR'R″、-SR'、-卤素、-SiR'R″R″'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R″、-OC(O)NR'R″、-NR″C(O)R'、-NR'-C(O)NR″R″'、-NR″C(O)2R'、-NR-C(NR'R″R″')＝NR″″、-NR-C(NR'R″)＝NR″'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R″、-NRSO2R'、-NR'NR″R″'、-ONR'R″、-NR'C＝(O)NR″NR″'R″″、-CN、-NO2、-R'、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基以及氟(C1-C4)烷基，所述取代基的数目在零至芳环***上开放化合价的总数范围内；并且其中R'、R″、R″'以及R″″优选地独立地选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂芳基。当本发明的化合物包括不止一个R基团时，例 如，这些R基团中的每一个均经过独立的选择，当R'、R″、R″'以及R″″基团存在不止一个时，这些基团各自也是经过独立的选择。
两个或更多个取代基可以任选地连接形成芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基。发现这些所谓的成环取代基典型地，但未必连接至环状基本结构。在一个实施方案中，成环取代基连接至基本结构的相邻成员。举例来说，连接至环状基本结构的相邻成员的两个成环取代基产生稠环结构。在另一个实施方案中，成环取代基连接至基本结构的单个成员。举例来说，连接至环状基本结构的单个成员的两个成环取代基产生螺环结构。在又另一个实施方案中，成环取代基连接至基本结构的不相邻成员。
芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地形成式-T-C(O)-(CRR')q-U-的环，其中T和U独立地是-NR-、-O-、-CRR'-或单键，并且q是0至3的整数。或者，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-A-(CH2)r-B-的取代基置换，其中A和B独立地是-CRR'-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR'-或单键，并且r是1至4的整数。由此形成的新环的一个单键可以任选地被双键置换。或者，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-(CRR')s-X'-(C″R″R″')d-的取代基置换，其中s和d独立地是0至3的整数，并且X'是-O-、-NR'-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR'-。取代基R、R'、R″以及R″'优选地独立地选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂芳基。
如本文所用的术语“杂原子”或“环杂原子”意指包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、磷(P)以及硅(Si)。
如本文所用的“取代基”意指选自以下部分的基团：
(A)-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、氧代、卤素、未取代 的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、未取代的杂芳基以及
(B)烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基以及杂芳基，它们被选自以下的至少一个取代基取代：
(i)氧代、-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、卤素、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、未取代的杂芳基，以及
(ii)烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基以及杂芳基，它们被选自以下的至少一个取代基取代：
(a)氧代、-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、卤素、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、未取代的杂芳基，以及
(b)烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，它们被选自以下的至少一个取代基取代：氧代、-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、卤素、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基以及未取代的杂芳基。
如本文所用的“大小限制的取代基(size-limited substituent)”或“大小限制的取代基(size-limited substituent group)”意指选自上文对于“取代基”所述的所有取代基的基团，其中每一个取代或未取代的烷基是取代或未取代的C1-C20烷基，每一个取代或未取代的杂烷基是取代或未取代的2元至20元杂烷基，每一个取代或未取代的环烷基是取代或未取代的C3-C8环烷基，并且每一个取代或未取代的杂环烷基是取代或未取代的3元至8元杂环烷基。
如本文所用的“低级取代基(lower substituent)”或“低级取代基(lowersubstituent group)”意指选自上文对于“取代基”所述的所有取代基的基团，其中每一个取代或未取代的烷基是取代或未取代的C1-C8 烷基，每一个取代或未取代的杂烷基是取代或未取代的2元至8元杂烷基，每一个取代或未取代的环烷基是取代或未取代的C3-C7环烷基，并且每一个取代或未取代的杂环烷基是取代或未取代的3元至7元杂环烷基。
在一些实施方案中，在本文的化合物中所述的每一个取代的基团均被至少一个取代基取代。更确切地说，在一些实施方案中，在本文的化合物中所述的每一个取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、取代的芳基、取代的杂芳基、取代的亚烷基、取代的杂亚烷基、取代的亚环烷基、取代的杂亚环烷基、取代的亚芳基和/或取代的杂亚芳基均被至少一个取代基取代。在其它实施方案中，这些基团中的至少一个或全部被至少一个大小限制的取代基取代。在其它实施方案中，这些基团中的至少一个或全部被至少一个低级取代基取代。
在本文的化合物的其它实施方案中，每一个取代或未取代的烷基可以是取代或未取代的C1-C20烷基，每一个取代或未取代的杂烷基是取代或未取代的2元至20元杂烷基，每一个取代或未取代的环烷基是取代或未取代的C3-C8环烷基，和/或每一个取代或未取代的杂环烷基是取代或未取代的3元至8元杂环烷基。
在一些实施方案中，每一个取代或未取代的烷基是取代或未取代的C1-C8烷基，每一个取代或未取代的杂烷基是取代或未取代的2元至8元杂烷基，每一个取代或未取代的环烷基是取代或未取代的C5-C7环烷基，和/或每一个取代或未取代的杂环烷基是取代或未取代的5元至7元杂环烷基。
术语“药学上可接受的盐”意指包括根据本文所述的化合物上所存在的具体取代基，使用相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐。当本发明的化合物含有具有相对酸性的官能团时，可以通过使这些化合物的中性形式与足量的所需碱在不加溶剂的情况下或在合适的惰 性溶剂中接触来获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基盐或镁盐或类似盐。当本发明的化合物含有具有相对碱性的官能团时，可以通过使这些化合物的中性形式与足量的所需酸在不加溶剂的情况下或在合适的惰性溶剂中接触来获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括衍生自无机酸的那些酸加成盐，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等；以及衍生自相对无毒的有机酸的盐，所述有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、顺丁烯二酸、丙二酸、苯甲酸、丁二酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、草酸、甲烷磺酸等。还包括氨基酸盐(如精氨酸盐等)以及有机酸盐(如葡糖醛酸盐或半乳糖醛酸盐等)(参见例如Berge等,“Pharmaceutical Salts”,Journal of Pharmaceutical Science,1977,66,1-19)。本发明的某些具体化合物含有碱性官能团和酸性官能团，这两种官能团允许化合物转化成碱加成盐或酸加成盐。
因此，本发明的化合物可以如与药学上可接受的酸形成的盐的形式存在。本发明包括这些盐。这些盐的实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、甲烷磺酸盐、硝酸盐、顺丁烯二酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、反丁烯二酸盐、酒石酸盐(例如(+)-酒石酸盐、(-)-酒石酸盐或其包括外消旋混合物在内的混合物)、丁二酸盐、苯甲酸盐，以及与诸如谷氨酸之类的氨基酸形成的盐。这些盐可以通过本领域技术人员已知的方法来制备。
优选地通过使所述盐与碱或酸接触并且以常规的方式分离母体化合物以使得化合物的中性形式再生。化合物的母体形式在某些物理特性(如在极性溶剂中的溶解性)方面不同于各种盐形式。
本发明的某些化合物可以非溶剂合物形式以及溶剂合物形式(包括水合物形式)存在。一般来说，溶剂合物形式等同于非溶剂合物形式并且被涵盖在本发明的范围内。本发明的某些化合物可以多晶或无 定形的形式存在。一般来说，所有物质形式对于由本发明所涵盖的用途来说均是等同的，并且意图落入本发明的范围内。
符号表示取代基与化合物的其余部分的连接点。
如本文所用的术语“盐”指的是本发明的方法中所用的化合物的酸盐或碱盐。可接受的盐的说明性实例是无机酸盐(盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐等)、有机酸盐(乙酸盐、丙酸盐、谷氨酸盐、柠檬酸盐等)、季铵盐(甲基碘化铵盐、乙基碘化铵盐等)。
本发明的某些化合物具有不对称碳原子(光学或手性中心)或双键；可以根据绝对立体化学被限定为(R)-或(S)-或对于氨基酸来说被限定为(D)-或(L)-的对映体、外消旋体、非对映体、互变异构体、几何异构体、立体异构形式以及单独的异构体涵盖在本发明的范围内。本发明的化合物不包括本领域已知的太不稳定以至于不能合成和/或分离的化合物。本发明意指包括呈外消旋和光学纯形式的化合物。光学活性(R)-异构体和(S)-异构体或(D)-异构体和(L)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂来制备，或使用常规技术来拆分。当本文所述的化合物含有烯键或其它几何不对称中心时并且除非另外说明，否则意图是这些化合物包括E型几何异构体和Z型几何异构体这两者。
如本文所用的术语“异构体”指的是具有相同数目和种类的原子，并且因此具有相同的分子量，但在这些原子的结构排列或构型方面不同的化合物。
如本文所用的术语“互变异构体”指的是以平衡形式存在的并且容易从一种异构形式转化成另一种异构形式的两种或更多种结构异构体中的一种。
对于本领域技术人员来说将显而易见的是，本发明的某些化合物可以互变异构形式存在，化合物的所有这些互变异构形式均落入本发明的范围内。
除非另有说明，否则本文所述的结构还意指包括该结构的所有立体化学形式；即针对每一个不对称中心的R型和S型构型。因此，本发明的化合物的单个立体化学异构体以及对映体和非对映体混合物落入本发明的范围内。
除非另有说明，否则本文所述的结构还意指包括不同之处仅在于一个或多个同位素富集原子的存在的化合物。举例来说，具有本发明的结构，然而不同的是氢被氘或氚置换，或碳被13C-富集或14C-富集碳置换的化合物落入本发明的范围内。
本发明的化合物还可以在构成这些化合物的一个或多个原子处含有非天然比例的原子同位素。举例来说，这些化合物可以使用放射性同位素，例如像氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)进行放射性标记。本发明的化合物的所有同位素变化形式均涵盖在本发明的范围内，无论是否具有放射性。
如本文所用的术语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”意指一个/种或多个/种。另外，如本文所用的短语“被a[n]取代”意指指定的基团可以被任何或所有所指定的取代基中的一个或多个取代。举例来说，在诸如烷基或杂芳基之类的基团“被未取代的C1-C20烷基或未取代的2元至20元杂烷基取代”的情况下，该基团可以含有一个或多个未取代的C1-C20烷基和/或一个或多个未取代的2元至20元杂烷基。此外，在部分被R取代基取代的情况下，该基团可以被称为“R取代的”。在部分是R取代的部分的情况下，该部分被至少一个R取代基取代并且每一个R取代基任选地是不同的。
对本发明的化合物的描述受本领域技术人员已知的化学键合的原则限制。因此，在基团可以被多个取代基中的一个或多个取代的情况下，对这些取代进行选择以便符合化学键合原则并且得到并非在本质上不稳定和/或本领域的普通技术人员已知有可能在环境条件(如水性、中性以及多种已知的生理条件)下不稳定的化合物。举例来说， 遵照本领域技术人员已知的化学键合原则使杂环烷基或杂芳基经由环杂原子连接至分子的其余部分，从而避免获得在本质上不稳定的化合物。
dNTP在真核细胞中的产生受到RR紧密调节，RR催化脱氧核糖核苷酸合成中的限速步骤(Jordan 1998)。RR由大亚单位和小亚单位组成。在人类中，已经识别出一个大亚单位(RRM1，也被称为M1)和两个小亚单位(RRM2(也被称为M2)和p53R2)(Tanaka 2000；Liu2006)。小RR亚单位形成两个等同的双核铁中心，这两个双核铁中心使得在催化期间引发电子转移所需的酪氨酰自由基稳定化(Ochiai1990；Cooperman 2003；Liu 2006)。
RRM1是含有控制RR全酶活性和底物特异性的底物和变构效应位点的170Kd二聚体(Cory 1983；Wright 1990；Cooperman 2003；Liu2006)。
RRM2是含有用于酶活性的酪氨酸自由基和非血红素铁的88Kd二聚体(Chang1979)。p53R2在内含子1中含有p53结合位点并且编码与RRM2具有显著相似性的具有351个氨基酸的肽(Tanaka 2000)。RRM2与p53R2的氨基酸序列具有80％的相似性(Tanaka 2000)。
p53R2已经被鉴定为p53的转录靶标(Nakano 2000；Tanaka 2000；Yamaguchi2001)，而RRM2在转录上受细胞周期相关因子(如NF-Y和E2F)调节(Filatov 1995；Currie1998；Chabes 2004；Liu 2004)。因此，p53R2的表达由紫外(UV)光、γ-照射或亚德里亚霉素(Doxorubicin，Dox)处理以p53依赖性方式诱导，但RRM2并非如此(Lozano 2000；Tanaka2000；Guittet 2001)。在p53突变或缺失的细胞中，RRM2在暴露于UV照射的细胞的DNA修复过程中可以代替p53R2(Zhou2003；Liu 2005)。已经发现p53R2的还原能力强于RRM2，这可以在使p21稳定化方面提供分子伴侣的作用(Xue 2007)。
已经观测到RB肿瘤抑制剂抑制RR亚单位作为调节细胞周期进 程的机制(Elledge1990)。经常在肿瘤中观测到RB失活，这使得dNTP水平升高并且使得肿瘤细胞对诸如5-氟尿嘧啶(5-Fu)和HU之类的药物具有随之而来的抗性(Angus 2002)。虽然RRM2亚单位过表达会经由它与多种活化致癌基因的协作而促进转化和致瘤潜能(Fan 1998)，但RRM1亚单位过表达在体内会抑制恶性潜能(Fan 1997)。已经发现RRM2的表达增加会提高癌细胞的药物抗性特性并且提高侵袭潜能，而抑制RRM2会使得药物抗性逆转并且使得肿瘤细胞的增殖减少(Zhou 1995；Huang 1997；Zhou 1998；Goan 1999；Chen 2000；Nakano2000；Kuschak 2002)。正常细胞在非增殖状态下表达非常低水平的RR，而大多数的赘生性细胞过表达RR，从而提供dNTP池用于DNA合成和细胞增殖。因此，对RRM2进行特异性抑制有可能提供抗赘生物益处。
虽然RR代表了癌症疗法的一个重要的靶标，但在临床使用中仅存在三种RR抑制剂：羟基脲(HU)、3-氨基吡啶-2-甲醛缩氨基硫脲 以及GTI2040。HU通过还原酪氨酰自由基来阻断DNA合成，已经作为癌症治疗剂被销售超过30年并且是唯一可商购获得的RR抑制剂(Nocentini 1996)。然而，对HU治疗的抗性是一个常见的问题(Lassmann 1992；Nyholm 1993；Le 2002)。3-AP是一种小分子铁螯合剂，它使RR失活，已被发现会造成缺氧、呼吸窘迫以及血红细胞的高铁血红蛋白。另外，3-AP选择性靶向p53R2而非RRM2。GTI2040是一种反义分子，迄今在人类试验中无效。与这三种RR抑制剂有关的其它问题是RR阻断不完全、半衰期短以及RR的再生。另外，p53R2突变会引起遗传性线粒体耗竭综合征，但不会引起癌症，并且p53R2敲除小鼠表现出肾小管病症，而没有表现出明显的癌症生长(Kimura 2003)。这些观测结果表明RRM2导致肿瘤增殖和转移潜能，而p53R2由用于DNA修复的DNA损伤信号所诱导。因此，用于癌症疗法中的理想的RR抑制剂应当具有大于HU的效力、小于3-AP的铁螯合能力并且特异性靶向RRM2。
如本文所公开，RRM2已被证实为一种抗癌靶标。已发现经由 siRNA抑制RRM2会减少植入有人类HepG2肝癌细胞的小鼠的肿瘤生长。测定出RRM2在癌细胞中的表达显著高于在相应的正常细胞中的表达。另外，转染了RRM2的人类KB和PC3细胞相比于它们未转染的对应细胞表现出增强的侵袭潜能，这表明RRM2增强了癌细胞的侵袭潜能。
在来自NCI的发展治疗规划(Developmental Therapeutics Program，DTP)的多样化合物文库中进行筛选以识别抑制RR的化合物。在这次筛选中识别出的将RRM1/RRM2活性抑制80％或更大程度的四种化合物中有三种共有类似的结构骨架NCI-3。NCI-3具有以下结构：
以合成方式并且合理地对来自筛选过程的初始选中物进行优化以获得RR抑制剂COH1、COH2、COH4、COH20以及COH29，它们的结构示于下文中。
COH29(N-(4-(3,4-二羟基苯基)-5-苯基噻唑-2-基)-3,4-二羟基苯甲酰胺)：
这些化合物中的每一种均表现出在显著程度上抑制RR的能力，并且COH20和COH29这两者均跨越广泛的癌细胞类型表现出抑制癌细胞生长的能力。因此，在某些实施方案中，本申请公开了新型RR抑制剂、包含这些抑制剂中的一种或多种的组合物、制剂以及试剂盒，以及使用这些抑制剂抑制RR、抑制细胞生长或增殖、治疗癌症和/或抑制干细胞增殖的方法。
COH20由以下三种基本结构单元组成：药效基团(用于抑制RR活性)、结合基团(用于选择性)以及连接基团(以连接药效基团与结合基团)。如本文所公开，COH20在体外对重组RR和细胞内RR这两者均表现出较低的微摩尔范围的抑制作用，并且引起dNTP池减少。生物化学分析揭示COH20靶向RRM2。在结合RRM1/RRM2复合体后，COH20看似存在于RRM1与RRM2之间的界面处的V形口袋处，并且经由新型的儿茶酚基团稳定化机制来阻断自由基转移通路。考虑到COH20的大小和化学组成以及距双核铁中心的距离，所结合的配体(在这个口袋中)看似不与3-AP一般易受铁螯合作用影响或不与HU一般牵涉到直接淬灭最初形成的酪氨酰自由基。已发现COH20在体外在小于10μM的浓度下抑制人类白血病细胞系REH和MOLT-4、人类***癌细胞系LNCaP以及人类口咽癌细胞系KB生长，而对正常的成纤维细胞表现出小于HU的细胞毒性。COH20还对HU抗性细胞系KBHUR表现出大于3-AP的细胞毒性，这指示它能够克服HU药物抗性。COH20在低于3-AP或HU(80μM分别对比200μM和>1000μM)的浓度下对KBMDR细胞表现出细胞毒性，这指示COH20相较于3-AP更有效地规避了MDR。另外，COH20在向小鼠施用时具有非常低的毒性，没有出现铁螯合或高铁血红蛋白的迹象。
如本文所公开，COH29对广泛的人类癌细胞系显示出有前景的生长抑制作用，这些癌细胞系包括：
·人类非小细胞肺癌细胞系NCI-H23、NCI-H522、A549-ATCC、EKVX、NCI-H226、NCI-H332M、H460、H0P62、HOP92；
·人类结肠癌细胞系HT29、HCC-2998、HCT116、SW620、COLO205、HCT15、KM12；
·乳腺癌细胞系MCF7、MCF7ADRr、MDAMB231、HS578T、MDAMB435、MDN、BT549、T47D；
·卵巢癌细胞系OVCAR3、OVCAR4、OVCAR5、OVCAR8、IGROV1、SKOV3；
·人类白血病细胞系CCRFCEM、K562、MOLT4、HL60、RPMI8266、SR；
·肾癌细胞系UO31、SN12C、A498、CAKI1、RXF393、7860、ACHN、TK10；
·黑色素瘤细胞系LOXIMVI、MALME3M、SKMEL2、SKMEL5、SKMEL28、M14、UACC62、UACC257；
·***癌细胞系PC3、DU145；以及
·CNS癌细胞系SNB19、SNB75、U251、SF268、SF295、SM539。
在某些实施方案中，除了结肠癌细胞系HT29、黑色素瘤癌细胞系UACC-257、卵巢癌细胞系NCI/ADR-RES以及肾癌细胞系CAKI-1之外，COH29对NCI 60种人类癌细胞系显示出小于约10μM的GI50。另外，当通过静脉内推注施用COH29时，对COH29进行的药物代谢动力学研究显示出剂量依赖性方式。
COH4、COH20以及COH29代表了具有高抗肿瘤活性的独特的RR抑制剂，这些RR抑制剂与先前公开的RR抑制剂相比提供了显著的优点。确切地说，COH20提供了独特的机制和靶标特异性，以大于HU的效力干扰了RRM1/RRM2界面处的自由基转移通路并且减轻了在3-AP的情况下所观测到的铁螯合作用相关副作用。因此，本文在某些实施方案中提供了小分子RR抑制剂和使用这些抑制剂抑制RR以及治疗癌症的方法。本文公开的抑制剂能够克服HU抗性(癌症疗法的常见障碍)并且还能够克服多药抗性。
在某些实施方案中，如本文所公开的新型RR抑制剂是COH1、COH2、COH4、COH20或COH29，或其药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药衍生物。
在某些实施方案中，如本文所公开的新型RR抑制剂是：
其药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药衍生物，其中：
R1和R2独立地选自氢、烷基以及芳基；
R3选自烷基；以及
X选自Br、卤素、烷基以及芳基。
在某些实施方案中，如本文所公开的RR抑制剂是：
或其药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药衍生物，其中
X选自卤素、取代和未取代的烷基以及取代和未取代的芳基；
R1-R2独立地选自H、OH、取代和未取代的烷基以及取代和未取代的芳基；以及
R1-R2可以组合于一起形成环，其中该环是芳基或非芳基。
如本文所用的术语“卤素”意指F、Cl、Br、I以及At。
本文公开的RR抑制剂特异性地靶向RRM2，从而抑制RRM1与RRM2之间的相互作用并且抑制RR复合体的活性。因此，这些抑制剂可以被用于某些癌症，包括与RRM2过表达有关或存在合适的治疗指数的癌症。如本文所公开，相比于在正常的细胞中，RRM2可能在乳腺癌细胞中过表达，并且外源性RRM2的表达会增强癌细胞的侵袭潜能。已显示，本文公开的抑制剂在体外抑制多种癌细胞类型生长，从而支持了将这些抑制剂用于治疗广泛的癌症。
先前的研究已显示RRM2高表达于结肠中的干细胞中(Liu2006)。在结肠癌的早期，RRM2表达略微减少。然而，一旦肿瘤变得具有侵袭性，RRM2的表达就显著增加。这些结果支持了本文的研究结果，即RRM2的表达与癌细胞侵袭性增强有关。另外，它们支持了将本文公开的抑制剂用于抑制导致癌症的干细胞生长或增殖，从而预防或减缓某些癌症类型发作。
除了癌症之外，本文公开的抑制剂还可以用于治疗与RR或RR过表达有关的其它病状，例如像各种线粒体疾病、氧化还原相关疾病或变性疾病。另外，这些抑制剂还可以用于抑制表达RR的细胞生长或增殖。
本文在某些实施方案中提供了用于对本文公开的小分子RR抑制剂进行小规模和大规模合成的方法。在这些实施方案中的某些实施方案中，所合成的小分子RR抑制剂是COH29。使用本文提供的方法合成的小分子RR抑制剂可以通过本领域已知的各种方法纯化。可以 利用的具体纯化步骤包括例如沉淀、研磨、结晶或色谱技术，如硅胶色谱法。
在某些实施方案中，提供了用于合成COH29的方法。在这些实施方案中的某些实施方案中，起始物质是具有以下结构的化合物：
其中R1、R2以及R3各自独立地是氢、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的烷基。在这些实施方案中的某些实施方案中，起始物质化合物是具有以下结构的藜芦醚(1,2-二甲氧基苯)：
在某些实施方案中，合成COH29中的第一步骤是使起始物质化合物转化成具有以下结构的第一中间化合物：
其中R是取代或未取代的芳基，包括例如苯基，并且R1、R2以及R3各自独立地是氢、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的烷基。在这些实施方案中的某些实施方案中，第一中间化合物是具有以下结构的1-(3,4-二甲氧基苯基)-2-苯基乙酮：
在某些实施方案中，通过将起始物质化合物添加到包含含无水AlCl3的二氯甲烷(CH2Cl2)和具有以下结构的化合物的混合物中以使起始物质化合物转化成第一中间化合物：
其中R是取代或未取代的芳基，包括例如苯基。在某些实施方案中，具有结构IV的化合物是苯乙酰氯。在某些实施方案中，例如使用二氯甲烷和/或己烷使第一中间化合物从合并的有机层中沉淀。在某些实施方案中，如本文所提供的COH29合成方法的第一步骤概述如下：
在某些实施方案中，合成COH29中的第二步骤是使具有结构III的第一中间化合物转化成具有以下结构的第二中间化合物：
其中R是取代或未取代的芳基，包括例如苯基，并且R1、R2、R3以及R7各自独立地是氢、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的烷基。在这些实施方案中的某些实施方案中，第二中间化合物是具有以下结构的4-(3,4-二甲氧基苯基)-5-苯基噻唑-2-胺：
在某些实施方案中，通过将第一中间化合物和三溴化吡啶盐溶解 于二氯甲烷中，继而洗涤并且干燥以使第一中间化合物转化成第二中间化合物。在某些实施方案中，然后使干燥的反应混合物与硫脲在乙醇中混合。在某些实施方案中，可以将所得产物浓缩，洗涤，并且通过研磨和干燥来纯化。
在某些实施方案中，如本文所提供的COH29合成方法的第二步骤概述如下：
在某些实施方案中，合成COH29中的第三步骤是使具有结构V的第二中间化合物转化成具有以下结构的第三中间化合物：
其中R是取代或未取代的芳基，包括例如苯基，并且R1、R2、R3、R4、R5、R6以及R7各自独立地是氢、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的烷基。在这些实施方案中的某些实施方案中，第二中间化合物是具有以下结构的N-(4-(3,4-二甲氧基苯基)-5-苯基噻唑-2-基)-3,4-二甲氧基苯甲酰胺：
在某些实施方案中，通过将第二中间化合物、4-二甲基氨基吡啶 以及Et3N添加到含有3,4-二甲氧基苯甲酸和二甲基甲酰胺的经过亚硫酰氯处理的酰基氯溶液中来使第二中间化合物转化成第三中间化合物。在某些实施方案中，可以使用NaHCO3使反应物骤冷。在某些实施方案中，可以使用二氯甲烷萃取所得悬浮液，并且在这些实施方案中的某些实施方案中，可以使用己烷研磨萃取产物。
在某些实施方案中，如本文所提供的COH29合成方法的第三步骤概述如下：
在某些实施方案中，合成COH29中的第四步骤是使具有结构VI的第三中间化合物转化成COH29。在这些实施方案中的某些实施方案中，将第三中间化合物与三溴化硼在甲苯中混合，并且在这些实施方案中的某些实施方案中，将反应物用乙醇骤冷，继而从水中沉淀。在某些实施方案中，所得产物经历一个或多个纯化步骤。在这些实施方案中的某些实施方案中，使用C-18硅胶，任选地继而通过结晶来纯化产物。
在某些实施方案中，如本文所提供的COH29合成方法的第四步骤概述如下：
在某些实施方案中，COH29的合成产生50％或更大的最终产率，并且在这些实施方案中的某些实施方案中，最终产率是60％或更大、70％或更大、80％或更大、或90％或更大。
在某些实施方案中，提供了使用图26中所示的合成途径大规模合成COH29的方法。
提供以下实施例以便更好地说明本申请要求保护的发明，并且不应当被解释为限制本发明的范围。就提及具体物质来说，仅是为了说明起见而不意图限制本发明。本领域技术人员可以在不运用创造性能力的情况下并且在不背离本发明范围的情况下研发等同的手段或反应物。
在某些实施方案中，提供了具有下式的化合物：
结构VIA。
在结构VIA中，R是取代或未取代的芳基。在实施方案中，R是未取代的苯基。R1、R2、R3、R4、R5、R6以及R7独立地是氢、-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、氧代、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基。在实施方案中，R7不是-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、氧代或卤素。R8、R9、R10以及R11独立地是羟基保护基。R8和R9任选地连接在一起形成取代或未取代的杂环烷基(例如5元杂环烷基)。R10和R11任选地连接在一起形成取代或未取代的杂环烷基(例如5元杂环烷基)。R1、R2、R3、R4、R5、R6以及R7还可以独立地是氢、取代或未取代的芳基(例如苯基)、或取代或未取代的烷基(例如C1-C10烷基)。
在R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7是取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、取代的芳基或取代的杂芳基的情况下，取代基可以是如上文所定义的取代基。取代基还可以是如上文所定义的大小限制的取代基。取代基还可以是如上文所定义的低级取代基。
在R是取代的芳基的情况下，取代基可以是如上文所定义的取代基。取代基还可以是如上文所定义的大小限制的取代基。取代基还可以是如上文所定义的低级取代基。
在实施方案中，R8、R9、R10以及R11独立地是取代或未取代的烷基(例如C1-C10烷基)、取代或未取代的杂烷基(例如2元至10元杂烷基)、取代或未取代的环烷基(例如C3-C8环烷基)、取代或未取代的杂环烷基(例如3元至6元杂环烷基)、取代或未取代的芳基(例如苯基)、或取代或未取代的杂芳基(例如5元或6元杂芳基)。在实施方案中，R8、R9、R10以及R11是取代或未取代的烷基(例如C1-C10烷基)、取代或未取代的杂烷基(例如2至10元杂烷基)、或取代或未取代的芳基(例如苯基)。在实施方案中，R8、R9、R10以及R11独立地是取代的甲硅烷基。如本文所用的“取代的甲硅烷基”指的是至少一个杂原子是硅原子的取代的杂烷基。硅原子可以直接连接至所保护的羟基的氧原子，从而形成甲硅烷基醚。在实施方案中，取代的甲硅烷基被以下基团取代：未取代的烷基(例如C1-C5烷基)、未取代的杂烷基(例如2至5元杂烷基)、未取代的环烷基(例如C3-C6环烷基)、未取代的杂环烷基(例如3至6元杂环烷基)、未取代的芳基(例如苯基)、或未取代的杂芳基(例如5元或6元杂芳基)。在实施方案中，取代的甲硅烷基被以下基团取代：未取代的烷基(例如C1-C5烷基)、未取代的芳基(例如苯基)、或未取代的杂芳基(例如5元或6元杂芳基)。在相关实施方案中，取代的甲硅烷基的硅原子直接连接至化合物其余部分的氧原子，从而形成甲硅烷基醚。
在R8、R9、R10以及R11是取代的烷基、取代的杂烷基(例如取代的甲硅烷基)、取代的环烷基、取代的杂环烷基、取代的芳基或取代的杂芳基的情况下，取代基可以是如上文所定义的取代基。取代基还可以是如上文所定义的大小限制的取代基。取代基还可以是如上文所定义的低级取代基。
R1、R2、R3、R4、R5、R6以及R7还可以独立地是氢、-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、氧代、卤素、R17取代的或未取代的烷基(例如C1-C10烷基)、R17取代的或未取代的杂烷基(例如2元至10元杂烷基)、R17取代的或未取代的环烷基(例如C3-C8环烷基)、R17取代的或未取代的杂环烷基(例如3至6元杂环烷基)、R17取代的或未取代的芳基(例如苯基)、或R17取代的或未取代的杂芳基(例如5元或6元杂芳基)。在实施方案中，R7不是-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、氧代或卤素。R8和R9可以任选地连接在一起形成R18取代的或未取代的杂环烷基(例如5元杂环烷基)。R10和R11可以任选地连接在一起形成R19取代的或未取代的杂环烷基(例如5元杂环烷基)。R可以是R19A取代的或未取代的芳基。R8、R9、R10以及R11可以是R19B取代的或未取代的烷基(例如C1-C10烷基)、R19B取代的或未取代的杂烷基(例如2元至10元杂烷基)、R19B取代的或未取代的环烷基(例如C3-C8环烷基)、R19B取代的或未取代的杂环烷基(例如3元至6元杂环烷基)、R19B取代的或未取代的芳基(例如苯基)、或R19B取代的或未取代的杂芳基(例如5元或6元杂芳基)。
R12、R13、R14、R15以及R16可以独立地是R19C取代的或未取代的烷基(例如C1-C10烷基)、R19C取代的或未取代的杂烷基(例如2元至10元杂烷基)、R19C取代的或未取代的环烷基(例如C3-C8环烷基)、R19C取代的或未取代的杂环烷基(例如3元至6元杂环烷基)、R19C取代的或未取代的芳基(例如苯基)、或R19C取代的或未取代的杂芳基(例如5元或6元杂芳基)。R12、R13、R14、R15以及R16可以独立地是R19C取代的或未取代的烷基(例如C1-C10烷基)、或R19C取代的或未取代的芳基(例如苯基)。
每一个R17、R18、R19、R19A、R19B以及R19C独立地是-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、氧代、卤素、R20取代的或未取代的烷基(例如C1-C10烷基)、R20取代的或未取代的杂烷基(例如2元至10元杂烷基)、R20取代的或未取代的环烷基(例如C3-C8环烷基)、R20取代的或未取代的杂环烷基(例如3元至6元杂环烷基)、R20取代的或未取代的 芳基(例如苯基)、或R20取代的或未取代的杂芳基(例如5元或6元杂芳基)。每一个R20独立地是-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、氧代、卤素、R21取代的或未取代的烷基(例如C1-C10烷基)、R21取代的或未取代的杂烷基(例如2元至10元杂烷基)、R21取代的或未取代的环烷基(例如C3-C8环烷基)、R21取代的或未取代的杂环烷基(例如3元至6元杂环烷基)、R21取代的或未取代的芳基(例如苯基)、或R21取代的或未取代的杂芳基(例如5元或6元杂芳基)。每一个R21独立地是-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、氧代、卤素、未取代的烷基(例如C1-C10烷基)、未取代的杂烷基(例如2元至10元杂烷基)、未取代的环烷基(例如C3-C8环烷基)、未取代的杂环烷基(例如3元至6元杂环烷基)、未取代的芳基(例如苯基)或未取代的杂芳基(例如5元或6元杂芳基)。
在实施方案中，每一个R17、R18、R19、R19A、R19B以及R19C独立地是-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、氧代、卤素、未取代的烷基(例如C1-C10烷基)、未取代的杂烷基(例如2元至10元杂烷基)、未取代的环烷基(例如C3-C8环烷基)、未取代的杂环烷基(例如3元至6元杂环烷基)、未取代的芳基(例如苯基)、或未取代的杂芳基(例如5元或6元杂芳基)。
在实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6以及R7独立地是氢、-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、氧代、卤素、未取代的烷基(例如C1-C10烷基)、未取代的杂烷基(例如2元至10元杂烷基)、未取代的环烷基(例如C3-C8环烷基)、未取代的杂环烷基(例如3元至6元杂环烷基)、未取代的芳基(例如苯基)、或未取代的杂芳基(例如5元或6元杂芳基)。在实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6以及R7中的至少一个是氢。在实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6以及R7中的至少两个是氢。在实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6以及R7中的至少三个是氢。在实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6以及R7中的至少四个是氢。在实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6以及R7中的至少五个是氢。在实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6以 及R7中的至少六个是氢。在实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6以及R7是氢。
在实施方案中，R8、R9、R10以及R11独立地是未取代的烷基(例如C1-C10烷基)、未取代的杂烷基(例如2元至10元杂烷基)、未取代的环烷基(例如C3-C8环烷基)、未取代的杂环烷基(例如3元至6元杂环烷基)、未取代的芳基(例如苯基)、或未取代的杂芳基(例如5元或6元杂芳基)。
在实施方案中，R8、R9、R10以及R11独立地是活化亚乙基保护基、苯甲基醚保护基、基于硅的碳酸酯保护基或环状缩醛保护基。在实施方案中，R8、R9、R10以及R11是甲基苯甲基、对甲氧基苯甲基、烯丙基、三苯甲基、对甲氧基苯基、四氢吡喃基、甲氧基甲基、1-乙氧基乙基、2-甲氧基-2-丙基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基、2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基、甲基硫甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、 符号n是0或1。R12是氢、-OH、-OR16、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基。在实施方案中，R12是氢、-OH、-OR16或取代或未取代的烷基。在实施方案中，R12是氢。R16是取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基。在实施方案中，R16是取代或未取代的烷基。R13、R14以及R15独立地是取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基。
在R12、R13、R14、R15以及R16是取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、取代的芳基或取代的杂芳基的情况下，取代基可以是如上文所定义的取代基。取代基还可以是如上文所定义的大小限制的取代基。取代基还可以是如上文所定义的低级取代基。
在实施方案中，R12是氢、甲基或-OCH3。R13、R14以及R15可以是未取代的C1-C5烷基或未取代的苯基。在实施方案中，R13、R14以及R15可以是未取代的C1-C5烷基。
在实施方案中，R是未取代的芳基(例如苯基)。R1、R2、R3、R4、R5、R6以及R7可以独立地是氢、未取代的芳基(例如苯基)、或未取代的烷基(例如C1-C5烷基)。
在实施方案中，R8和R9任选地连接在一起形成缩醛保护基，并且R10和R11任选地连接在一起形成缩醛保护基。“缩醛保护基”是根据它在化学合成领域中的常见含义来使用的，其中缩醛基经常被用于保护儿茶酚羟基部分。缩醛保护基可以具有下式：
在结构VIC中，R22和R23独立地是氢、取代或未取代的烷基(例如C1-C5烷基，如甲基)或者取代或未取代的芳基(例如苯基)。符号表示与儿茶酚氧原子(即分别连接至R8、R9和R10以及R11的氧原子)的连接点。在实施方案中，R22和R23独立地是氢、未取代的烷基(例如C1-C5烷基，如甲基)或未取代的芳基(例如苯基)。在一些实施方案中，R22和R23是氢。在实施方案中，R22和R23是未取代的烷基(例如C1-C5烷基)。在实施方案中，R22和R23是甲基。在一些实施方案中，R22和R23是未取代的芳基(例如苯基)。在实施方案中，缩醛保护基是 二苯亚甲基缩醛。
在实施方案中，具有结构VIA的化合物具有下式：
在结构VIB中，R、R8、R9、R10以及R11如上文所定义，包括其所有实施方案在内。在具有结构VIA或VIB的化合物的实施方案中，R是未取代的芳基。在结构VI或VIB的实施方案中，R是未取代的苯基。
在实施方案中，提供了一种组合物，所述组合物包括具有结构VIA或其实施方案或者结构VIB或其实施方案的化合物以及有机溶剂(例如非极性溶剂或极性非质子溶剂)。在实施方案中，有机溶剂是非极性溶剂(例如甲苯或1,4-二噁烷)。在实施方案中，有机溶剂是二噁烷。在实施方案中，有机溶剂是极性非质子溶剂(例如丙酮、二甲基甲酰胺、乙腈或二甲亚砜)。在实施方案中，有机溶剂是二甲基甲酰胺。
在实施方案中，提供了一种组合物，所述组合物包括具有结构VIA或其实施方案或者结构VIB或其实施方案的化合物以及羟基脱保护剂。羟基脱保护剂是可用于去除如本文所述的羟基保护基的化学剂。有用的化学剂被选为羟基脱保护剂以使具有结构VIA及其实施方案、结构VIB及其实施方案以及结构VID及其实施方案的化合物的降解减到最低程度。在实施方案中，脱保护剂是还原剂、酸性剂或碱性剂。在实施方案中，脱保护剂是三溴化硼、芳基甲醚、四丁基氟化铵、还原剂(例如钯还原剂，如氢气/Pd/C)、金属酸剂(例如Zn/酸，如Zn/乙酸或Zn/HCl)或氨。
在某些实施方案中，提供了一种用于合成具有以下结构的化合物 的方法：
该方法包括使羟基脱保护剂(如上文所述)与具有下式的化合物接触：
在结构VIA和结构VID中，R、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10以及R11如上文所定义，包括所有的实施方案在内。在实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6以及R7独立地是氢、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的烷基。R8、R9、R10以及R11可以独立地是羟基保护基。R8和R9任选地连接在一起形成取代或未取代的杂环烷基。R10和R11任选地连接在一起形成取代或未取代的杂环烷基。
实施例
实施例1：确定RRM2为抗癌疗法的靶标：
将RRM2-荧光素酶融合构建体(“pR2Luc”)通过尾静脉高压注射(HPTV)单独或与RRM2siRNA(“siR2B+5”)组合[质粒0.25mg/kg、siRNA 1.25mg/kg]施用于植入有人类HepG2肝癌细胞的雌性BALB/c小鼠。体内生物发光成像揭示在数周内在小鼠肝癌细胞内出现强效下调(图1)。接受与RRM2siRNA组合的RRM2的小鼠相比于接受单独RRM2或与对照siRNA(“si对照”)组合的RRM2的小鼠表现出肿瘤生长显著减少。这些结果表明RRM2在癌症生长中起关键的作用并且 证实它为治疗靶标。
通过RT-PCR测量35个人类新鲜冷冻的乳腺癌活检样本和相应的正常组织样本中RRM2mRNA的表达水平。确定RRM2和β-肌动蛋白看家基因的最佳PCR引物和探针浓度以在扩增期间达到最高效率。使用Taqman PCR混合物(Applied Biosystems,Foster City,CA)以20μl的最终体积，添加1μL来自每一个样本的cDNA来进行PCR反应。观测到相比于相应的正常组织，乳腺癌组织中RRM2的表达显著增加(p<0.05)(图2A)。蛋白质印迹揭示除胎儿肝脏和睾丸以外的正常人类组织均表达低水平的RRM2，而癌细胞表达显著更高水平的RRM2(图2B)。
将人类口咽癌KB(野生型p53)和人类***癌PC3(截短型p53)细胞用有义RRM2(分别是KBM2和PC3M2)和对照载体转染，并且通过蛋白质印迹分析确认所引起的RRM2过表达。将转染子施用于Borden腔室中的基质胶的上层。72小时后，使用乙醇固定侵袭到下层的细胞，使用亚甲基蓝染色，并且计数和研究。RRM2转染的细胞与未转染的细胞相比表现出增强的侵袭潜能(图3)。
实施例2：识别新型RR抑制剂：
对来自NCI的发展治疗规划(DTP)的多样化合物文库进行虚拟筛选过程以识别潜在的RR抑制剂。DTP文库含有2,000种不同的化合物。对根据X射线晶体结构所识别的人类RRM2上的新型配体结合口袋(PDB 2UW2)进行选择以识别出紧靠着RRM1/RRM2界面但远离二酪氨酰基-二铁中心以避免铁螯合副作用的潜在抑制剂化合物。这个配体结合口袋由32个在人类和小鼠RRM2蛋白质家族当中保守的氨基酸残基组成，紧靠着RRM1/RRM2界面。所述配体结合口袋的结构示于图4中。所述口袋在C端结构域处由螺旋α7、α8以及α10组成。V形口袋的狭窄内端衬以靠近二酪氨酰基二铁簇中心后方的疏水性残基。位于该口袋的开放端附近的诸如D271、R330以及E334 之类的极性残基可以潜在地与柔性C端相互作用。该口袋主要衬以具有暴露于表面的带电荷残基的内部疏水性残基。
将对接到配体结合口袋中的化合物使用TRIPOS FlexX对接工具识别并且使用嵌入式一致性对接评分进行排序。使用已知的用于测定小分子抑制剂的效力和亚单位选择性的半高通量基于全酶的测定法对在虚拟筛选中表现出等于或大于3-AP的结合亲和力的前80种RR抑制剂候选者进行体外筛选(Shao 2005)。该测定法利用重组RRM1/RRM2或RRM1/RRM2复合体并且通过HPLC测量[3H]CDP还原活性(即将CDP还原成dCDP)。十种化合物表现出在体外将天然RRM1/RRM2活性抑制大于50％的能力，并且这些化合物中的四种将酶活性抑制80％或更大程度。这四种表现出≥80％抑制作用的化合物中的三种共有类似的结构骨架(NCI-3，NSC#659390和NSC#45382)，并且相较于其它测试化合物还显示出更好的溶解性和更低的毒性。NCI-3(二羟基苯基噻唑，DHPT)具有以下结构：
使用图5中所示的策略合成一系列NCI-3类似物。通过将多种R基团连接至氨基噻唑基团而产生另外24种NCI-3类似物。以这种方式产生的化合物包括COH1、COH2、COH4、COH20以及COH29。
实施例3：对新型NCI-3类似物进行表征：
使用上文所述的体外全酶测定法测试NCI-3和在实施例2中合成的NCI-3类似物抑制RR活性的能力。COH4表现出显著的RR抑制作用。COH20甚至更有效，在体外将重组RRM1/RRM2复合体抑制90.2％(图6)。各种化合物的IC50结果示于表1中。
表1：
化合物 IC50±S.D.(μM)
HU 148.0±7.34
3-AP 1.2±0.13
NCI-3 19.1±0.43
COH4 15.3±1.8
COH20 9.3±2.3
与3-AP形成鲜明的对比，COH20对RR的抑制作用几乎不受铁添加影响(表2)。
表2：
进行定点诱变、Biacore分析以及NMR饱和转移差(STD)分析来验证结合口袋和COH20与RRM2之间的配体/蛋白质相互作用。通过使结合口袋中的某些关键的残基突变而产生RRM2点突变体。这些残基包括Y323、D271、R330以及E334，它们中的每一个均带电荷并且存在于结合口袋的表面上；以及G233，它位于口袋的深处。对这些突变体的抑制作用减弱证实了这些突变的残基牵涉到配体结合并且验证了所述结合口袋。有趣的是，唯一不会减弱抑制作用的突变是G233V。这表明通过引入缬氨酸侧链而稳定化的疏水性口袋的存在。
为了证实COH20抑制RR活性的能力并非特定针对重组RR，进 行测定以测试COH20对细胞内RR的作用。使经过10μM COH20处理的KB细胞溶解，并且在高盐缓冲液中提取蛋白质并且使其穿过G25交联葡聚糖凝胶(Sephadex)柱以去除诸如dNTP之类的小分子。将洗脱物与[3H]CDP在反应缓冲液中混合以监测RR活性。使用COH20处理会使细胞内RR活性降低约50％(图7)。如通过蛋白质印迹所测量，使用COH20处理对RRM2的蛋白质水平没有影响，这指示COH20对RR活性的作用并不是因为RRM2表达减少。
在使用10μM COH20处理后通过聚合酶模板测定法测量来自KB细胞的dNTP池。将处理前和处理后的细胞沉淀与100μl的15％三氯乙酸混合，在冰上孵育十分钟，并且以高速离心五分钟。收集上清液并且使用两份50μl等分部分的氟利昂(Freon)/三辛胺(55％/45％)提取以中和三氯乙酸。在每次添加后，将样本以高速离心并且收集上清液。使用每一种样本的两份5μl等分部分(每一份用于每次一式两份)来检测dATP、dCTP、dGTP以及dTTP的浓度。每一个试管中的反应混合物含有50mM Tris-HCL(pH 7.5)、10mM MgCl、5mM DTT、0.25mM模板/引物、1.25μM 3H-dATP(对于dCTP测定)或3H-dTTP(对于dATP测定)以及0.3单位的测序酶(2.0)，总体积是50μL。使DNA合成在室温下进行20分钟。在孵育后，将40μl的每一种反应混合物点样于Whatman DE81离子交换纸(2.4cm直径)上。将所述纸在室温下干燥30-60分钟，用5％Na2HPO4(3×10分钟)洗涤，并且用蒸馏水冲洗一次，并且用95％乙醇再冲洗一次。使每一张纸干燥并且存放于小瓶中，并且将5ml闪烁液添加至每一个小瓶中。使用液体闪烁计数器对氚标记的dNTP进行计数并且与以0.25pmol/μL、0.5pmol/μL、0.75pmol/μL以及1.0pmol/μL dNTP制备的标准品相比较。为了进行比较，使用新添加的抑制剂进行两组重复反应。发现COH20使KB细胞中的dATP、dCTP、dGTP以及dTTP池减少，这指示抑制RR会引起dNTP产生同时减少(图8)。将使用其它细胞系进行类似实验。
使用MTT测定法来评价COH4和COH20对人类白血病REH和MOLT-4细胞、人类***癌LNCaP细胞、人类口咽癌KB细胞以及 正常成纤维细胞NHDF细胞的体外细胞毒性。将5,000个细胞与各种浓度的药物一起接种到六孔板上，持续72小时。COH20在低于10μM下对癌细胞系具有细胞毒性，而对正常的细胞产生小于3-AP的细胞毒性。结果概述于表3中。LNCaP、KB以及NHDF的结果示于图9-11中。基于COH20表现出细胞毒性的广泛范围的癌细胞类型，COH20预期对多种另外的癌细胞类型具有细胞毒性，这些另外的癌细胞类型包括结肠癌、乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、白血病以及淋巴瘤细胞。
表3：
使用KBHUR(源自于过表达RRM2的KB细胞的HU抗性克隆)重复体外细胞毒性测定。COH20在显著低于所测试的其它RR抑制剂的浓度下对KBHUR具有细胞毒性，这证实COH20能够克服HU抗性(图12)。另外，已发现COH20在低于3-AP或HU的浓度下对KBMDR(在细胞膜上过表达MDR泵的KB克隆)具有细胞毒性(图13)。实时增殖测定证实COH20还抑制KBMDR细胞的细胞增殖(图14)。将使用也过表达RRM2的吉西他滨(gemcitabine)抗性细胞系KBGem重复类似实验。基于使用其它细胞系得到的结果，预期COH20还将对KBGem表现出细胞毒性和生长抑制作用。
使用上文所述的MTT测定法测试COH29对一组人类癌细胞系的体外细胞毒性。COH29显著地抑制广泛的癌细胞类型生长，其中在除结肠癌HT29、黑色素瘤UACC-257、卵巢癌NCI/ADR-RES以及肾癌CAKI-1外的所有所测试的细胞类型中IC50均低于约10μM(图20-24)。代表性结果概述于表4中。
表4：
细胞系 IC50
白血病CCRF-CEM 2.8μM
白血病MOLT-4 2.5μM
白血病SUP B15 5.0μM
卵巢癌OV90 2.6μM
对经过9μM或27μM的COH20或3μM的3-AP处理24小时的KB细胞进行流式细胞测量术和膜联蛋白染色。这些结果显示COH20处理以剂量依赖性方式使细胞停滞在S期(图15，上图)。使用COH20处理72小时后，膜联蛋白染色显示显著的细胞死亡，指示细胞凋亡(图15，下图)。COH20诱导细胞凋亡的效力与3-AP大致相同。
将COH20以1mg/kg注射到三只雄性大鼠体内以进行单次剂量药物代谢动力学评价。发现COH20从血浆中的消除呈三指数，首先是快速初始衰退期(可能进行组织分布或肝脏摄取)，然后是中期(组合的分布和消除)和较缓慢的末期(消除)(图16)。终末半衰期(T1/2)是约5.5小时。将使用各种剂量的COH20进行更详细的药物代谢动力学研究以确定诸如清除率、生物利用度以及组织/血浆分配系数之类的参数。
使用相同的技术对COH29进行药物代谢动力学评价，其中以25mg/kg的剂量施用COH29。三次重复分析的结果概述于表5中。曲线下面积(AUC)计算结果显示COH29在通过静脉内推注施用时以剂量依赖性方式起作用(图25)。
表5：
为了确定COH20的最高耐受剂量，以在10至160mg/kg范围内 的剂量向小鼠静脉内施用COH20。除160mg/kg组中死亡的一只小鼠以外，所有处理组的体重均保持稳定，这指示COH20是具有极小毒性的可耐受化合物(图17)。不存在致命的铁螯合或诱发高铁血红蛋白的迹象，进一步指示COH20不具有显著的铁螯合副作用。
使用Biacore T100仪器来研究COH20或3-AP与RRM2之间的配体-蛋白质相互作用。将野生型RRM2分离并且使用标准胺偶联方法在25℃下并且以10微升/分钟的流速固定到CM4传感器芯片上。确切地说，使用1:1比率的0.4M N-乙基-N0-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和0.1M N-羟基丁二酰亚胺(NHS)进行7分钟注射来使流槽的羧甲基葡聚糖表面活化。将RRM2在10mM乙酸钠(pH 4.5)中稀释至25μg/ml并且注射到靶标流槽上以进行靶标固定(8000RU)。将10mM乙酸钠(pH 4.5)缓冲液注射到参考流槽中以进行空白对照固定。使用1M乙醇胺-HCl(pH 8.5)进行7分钟注射来封闭剩余的活化表面。使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为固定期间的运行缓冲液。将COH20和3-AP溶解于DMSO中以制备100mM储液。然后将化合物在运行缓冲液(PBS、1.5％DMSO、10倍羧甲基葡聚糖、0.002％甲基-6-O-(N-庚基氨甲酰基)-α-D-吡喃葡萄糖苷)中连续稀释至适当的运行浓度。将样品以60微升/分钟的流速在25℃下注射到参考流槽和靶标流槽(固定有RRM2)上。将缔合和解离分别测量180秒和60秒。以五种不同的浓度一式三份测试所有化合物。对每一种化合物的浓度系列进行至少两次。在一系列给定的化合物浓度范围内，将样品随机化以使***误差减到最低程度。在样品之间，通过将0.3％SDS注射30秒来使传感器芯片再生。结果显示COH20与RRM2之间存在显著的相互作用，但COH20与3-AP之间不存在显著的相互作用(图18)。
还使用Biacore T100分析COH20干扰RRM2与RRM1结合的能力。在25℃下以30微升/分钟的流速将固定浓度的RRM1(1μM)在一系列两倍稀释浓度的COH20(3.125-25μM)不存在和存在的情况下注射到参考流槽和靶标流槽(固定有RRM2)上。将缔合和解离分别测量90秒和60秒。使用相同的条件进行两次重复的运行。在样品之间， 通过将0.3％SDS、0.2M Na2CO3注射30秒来使传感器芯片再生。发现COH20干扰RRM1/RRM2在界面处的相互作用(图19)。
将使用小鼠异种移植模型在体内对COH20的细胞毒性功效进行测试。将使用诸如KB、KBHUR以及KBGem之类的人类癌细胞系建立异种移植肿瘤模型。为了建立KB异种移植模型，将1-5×106个KB细胞于0.1ml体积的盐水中注射到5-6周大的裸雌性小鼠的右后侧腹中。使用数显卡尺每周监测肿瘤体积两次。当肿瘤体积达到约100-160mm3时，将小鼠分组(每组十只)，以使得一组内所有小鼠的中值和平均体重以及肿瘤体积约相同。1)以单次剂量单独施用COH20以确定有效剂量；2)以不同的时间间隔单独施用COH20以进行时程研究；或3)将COH20与诸如化学治疗剂之类的已知癌症治疗剂组合施用。在约四周的监测期内，在各个时间点分析肿瘤细胞生长的变化、体重、器官功能障碍以及铁螯合副作用。在监测期之后，使小鼠安乐死并且通过目视检查和组织学检查对组织、肿瘤以及血浆进行分析。基于COH20在体外对各种癌细胞系的细胞毒性，预期经过COH20处理的小鼠将表现出较高的存活率、肿瘤生长减少以及较少肿瘤相关副作用(例如体重减轻、器官功能障碍)。
可以通过产生各种类似物并且使用定点诱变研究、Biacore分析以及NMR STD实验对它们与RRM2和RRM1/RRM2复合体的结合进行分析来完善和优化诸如COH20和COH29之类的NCI-3类似物的结构。可以进行X射线结晶学研究来确定COH20-RRM2复合体的三维结构。使用这些工具，可以产生另外的具有更高效力、更大选择性以及更低毒性的RR抑制剂。
如上所示，RRM2突变体G233V增强COH20抑制剂活性。据信缬氨酸侧链与所结合的配体之间另外的疏水性相互作用促进增强的结合和抑制作用，这表明从COH20延伸的另外的疏水性侧链可以对结合亲和力进行优化。因此，含有这些疏水性侧链的COH20类似物(例如COH1、COH2、COH4、COH29、具有结构I的化合物以及选 自组I的化合物)也可能是RR抑制剂。
实施例4：COH29的合成和纯化：
使用图26中所概述的合成途径来合成COH29。
步骤1：使1,2-二甲氧基苯(藜芦醚)转化成1-(3,4-二甲氧基苯基)-2-苯基乙酮(中间体1)：
在装备有向冷凝管捕集器中排气的鼓泡器的反应容器中合成中间体1。在0℃下在氮气下将苯乙酰氯(151mL，1.12mol)经过30分钟逐滴添加至无水AlCl3(161g，1.21mol)在二氯甲烷(DCM；CH2Cl2，600mL)中的正在搅拌的悬浮液中。经过六小时逐滴添加藜芦醚(129mL，1.00mol)，同时维持内部温度低于10℃。在完成添加后，去除冷却浴槽。在环境温度下16小时后，将反应物冷却到0℃并且通过逐滴添加2N HCl(700mL)骤冷，同时维持内部温度低于20℃。将有机层用水(600mL)和饱和NaHCO3水溶液(500mL)洗涤，经由硅藻土过滤，并且减压浓缩到约400mL的总体积。添加己烷(1.7L)并且产物在剧烈搅拌下沉淀。过滤所得固体并且用己烷(2×250mL)洗涤滤饼。将固体在真空中在50℃下干燥，得到呈灰白色固体状的1-(3,4-二甲氧基苯基)-2-苯基乙酮(中间体1；213g，831mmol，83％产率)。
步骤2：使中间体1转化成4-(3,4-二甲氧基苯基)-5-苯基噻唑-2-胺(中间体2)：
在装备有向冷凝管捕集器中排气的鼓泡器的反应容器中合成中间体2。将中间体1(213g，831mmol)和三溴化吡啶盐(315g，886mmol)在氮气下溶解于DCM(1.2L)中。在环境温度下五小时后，将反应混合物在冰浴中冷却并且用水(750mL)骤冷，同时维持内部温度低于20℃。将有机层用水(750mL)洗涤并且浓缩至干燥。将所得浆料溶解于乙醇(1.2L)中并且冷却到20℃，并且添加硫脲(114g，1.48mol)。在添加完成后，将反应物在环境温度下搅拌24小时。将反应物减压浓缩并且将所得浆料在EtOAc(1.0L)与2N NaOH(800mL)之间分配。使乳液分离，并且使用EtOAc(750mL)萃取水层。将合并的有机层用水(250mL)洗涤并且减压浓缩。将所得固体用Et2O(1.5L)研磨并且过滤，并且用Et2O(200mL)洗涤滤饼。将产物在真空中在50℃下干燥，得到呈棕褐色固体状的4-(3,4-二甲氧基苯基)-5-苯基噻唑-2-胺(中间体2；230g，736mmol，2个步骤的产率：89％)。
步骤3：使中间体2转化成N-(4-(3,4-二甲氧基苯基)-5-苯基噻唑-2-基)-3,4-二甲氧基苯甲酰胺(中间体3)：
在装备有向冷凝管捕集器中排气的鼓泡器的反应容器中合成中间体3。将亚硫酰氯(100mL，1.36mol)经过两小时逐滴添加到含3,4-二甲氧基苯甲酸(250g，1.36mol)的二甲基甲酰胺(DMF；20mL)在CH2Cl2(1.0L)中的经过冷却的溶液中，同时维持内部温度低于15℃。在添加完成后，将反应物在环境温度下搅拌三小时，然后减压浓缩至干燥。将酰基氯(164g，818mmol，1.5当量)在氮气下分批添加至中间体2(170g，545mmol)、4-二甲基氨基吡啶(4-DMAP；6.73g，54.5mmol，10mol％)以及Et3N(384mL，2.73mol)在DMF(1.0L)中的正在搅拌的悬浮液中，同时维持内部温度低于20℃。将反应物在环境温 度下搅拌15小时，然后分批添加剩余的酰基氯(112g，545mmol)。在环境温度下六小时后，将反应混合物用饱和NaHCO3水溶液(500mL)骤冷，用水(500mL)洗涤，并且减压浓缩。通过快速色谱法(0-5％MeOH/CH2Cl2)纯化产物。将合并的色谱级分减压浓缩至干燥。将固体在真空中在50℃下干燥，得到呈灰白色固体状的N-(4-(3,4-二甲氧基苯基)-5-苯基噻唑-2-基)-3,4-二甲氧基苯甲酰胺(中间体3；245g，515mmol，70％)。
步骤4：使中间体3转化成COH29：
在装备有向冷凝管捕集器中排气的鼓泡器的反应容器中合成COH29。将三溴化硼(BBr3；191mL，1.98mol)在氮气下缓慢添加至中间体3(245g，515mmol)在甲苯(1.2L)中的正在搅拌的溶液中，同时维持内部温度低于15℃。在添加完成后，使反应物升温到环境温度并且搅拌五小时。将反应混合物冷却并且缓慢地用EtOH(800mL)骤冷，同时维持内部温度低于20℃。在添加完成后，将溶液在环境温度下搅拌两小时并且减压浓缩。将所得固体用DCM(1.0L)研磨并且过滤，并且用DCM(100mL)洗涤滤饼。将所得固体溶解于热EtOH(400mL)中，并且缓慢地添加至水(2.4L)中以诱导沉淀。将所得浆料在环境温度下搅拌两小时并且过滤，并且用水(200mL)洗涤滤饼。再将这一研磨过程重复三次，得到灰白色固体。将所得固体在50℃下在真空下干燥24小时，然后在125℃下在真空下干燥24小时，得到COH29(118g，281mmol，55％)。
如上所述，上述内容仅意图说明本发明的各种实施方案。因而，上述具体改动方案不应当被理解为对本发明的范围的限制。对于本领域技术人员来说将显而易见的是，可以作出各种等同方案、变化方案 以及改动方案而不背离本发明的范围，并且应当了解，这些等同的实施方案将被包括在本文中。本文所引用的所有参考文献以引用的方式并入本文，如同在本文充分阐述一般。
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Claims (2)

1.一种合成具有以下结构的化合物的方法：
所述方法包括以下步骤：
(a)使藜芦醚转化成1-(3，4-二甲氧基苯基)-2-苯基乙酮；
(b)使1-(3，4-二甲氧基苯基)-2-苯基乙酮转化成4-(3，4-二甲氧基苯基)-5-苯基噻唑-2-胺；
(c)使4-(3，4-二甲氧基苯基)-5-苯基噻唑-2-胺转化成N-(4-(3，4-二甲氧基苯基)-5-苯基噻唑-2-基)-3，4-二甲氧基苯甲酰胺；以及
(d)使N-(4-(3，4-二甲氧基苯基)-5-苯基噻唑-2-基)-3，4-二甲氧基苯甲酰胺转化成
2.如权利要求1所述的方法，其中经由以下途径进行合成：
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