CN104130331A - 一种抗hiv-1病毒药物及其制备和应用 - Google Patents
一种抗hiv-1病毒药物及其制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种抗HIV-1病毒药物（又名嵌合载体Rev-Vif-C），是通过Rev蛋白的结合位点和Vif蛋白的C端拼连接而成，所述的连接为将Rev的多聚化结构域替换Vif的N端。本研究通过设计并构建Rev-Vif-C载体，然后通过多种实验证明Rev-Vif-C载体具有良好的抗病毒效果，提出了一种新的针对HIV-1的Rev蛋白的抗病毒技术。Vif-C载体在降解Rev蛋白中的成功应用，使其有望成为一种新型的基因敲除手段。Vif-C载体可以特异性地降解靶标蛋白，特别适用于容易产生高频突变的病毒靶蛋白的药物研发，只要蛋白自身的结合位点不突变，我们的嵌合载体就会长期有效，从而可以降低抗病毒药物的耐药性。
Description
技术领域
本发明涉及抗病毒药物领域，更具体地，涉及一种抗HIV-1病毒药物及其制备和应用。
背景技术
在20世纪70年代末80年代初，欧洲和美国出现了一种以免疫***功能障碍为主要特征的疾病。随后，各国科学家就开始了对其致病原因以及治疗方案的探寻。直到1983年，法国巴斯德研究小组最先成功分离出了这种新的逆转录病毒之后，人们对于HIV-1的理论研究以及医学治疗也随之越来越多。目前，针对HIV-l的药物主要作用于病毒生活周期中不同环节，尤其是一些所必需的酶类如逆转录酶及蛋白酶。
尽管目前市场上有很多抗HIV-1的药物，HARRT的广泛应用，但是随之产生的耐药性、巨额的医药费用、药物的副作用等问题也不容小觑。HAART虽然可以使相当一部分患者血浆病毒载量降至所能检测的水平以下，但停药后反弹及严重的毒副作用尚未能解决；基因治疗虽然显示了其抗病毒的潜力，并有部分研究成果进入临床试验阶段，但其效率低、外源载体可能带来的不良反应等仍是研发的一个主要障碍。目前，国际上抗HIV-1药物的研发主要有四个热点：一是进入细胞抑制剂；二是中和抗体；三是整合酶抑制剂；四是化学趋化因子受体拮抗剂。科学家们仍然在继续努力探索更加安全有效、更加经济适用的抗病毒药物。
病毒颗粒蛋白表达调节因子Rev（regulation of virion protein expression）是HIV-1转录过程中不可缺少的调控蛋白。Rev与病毒mRNA的RRE相互作用，从而帮助未剪切或部分剪切的HIV-1 mRNA向核外转运。如果Rev的表达受到抑制，未剪接或部分剪接的HIV-1 mRNA将不能向核外转运而导致其在核内完全降解，进一步阻断HIV-1的复制。因此，如何抑制Rev蛋白的表达，将是研发抗HIV-1药物的一个重要靶点。
发明内容
本发明提供一种抗HIV-1病毒药物（又名嵌合载体Rev-Vif-C），所述的抗HIV-1病毒药物主要针对的是HIV-1自身的Rev蛋白。
另外提供一种抗HIV-1病毒药物，所述的抗HIV-1病毒药物是通过Rev 蛋白和Vif蛋白连接而成。
所述的连接为将Rev的多聚化结构域替换Vif的N端。
再提供一种Vif蛋白在制备抗HIV病毒药物中的应用。
另外提供一种上述的抗HIV-1病毒药物的制备方法，包括以下步骤：
S1. Rev的蛋白结构上有两个寡聚化结构域，分别将这两个寡聚化结构域替换Vif蛋白N端的1-79 位氨基酸序列，从而构建了三个新的嵌合蛋白ROL1-Vif-C、ROL2-Vif-C和ROL12-Vif-C, 所述的ROL1-Vif-C,包含Rev N端的寡聚化结构域，所述的ROL2-Vif-C包含Rev C端的寡聚化结构域，所述的ROL12-Vif-C包含Rev N端和C端两个寡聚化结构域，
所述的Rev N端的寡聚化结构域为Rev蛋白氨基酸序列的第9-26位氨基酸，
所述的Rev C端的寡聚化结构域为Rev蛋白氨基酸序列的第51-65位氨基酸，
所述的Rev N端和C端两个寡聚化结构域为Rev蛋白氨基酸序列的第9-65位氨基酸。
所述的Vif-C部分为Vif蛋白氨基酸序列的第80-193位氨基酸
S2. 将这三个嵌合载体分别克隆到表达载体pcDNA3.1上，通过转染进行瞬时表达，其中，S1中，所述的3个载体序列如下SEQ NO:1、SEQ NO:2和SEQ NO:3所示，将载体连接到pcDNA3.1上所用的酶切位点是bamH I and Xhol I。
根据以上的需求提供三种应用，一种为上述的抗HIV-1病毒药物在制备抗HIV-1药物中的应用。
另外一种为上述的抗HIV-1病毒药物在制备抑制HIV-1复制药物中的应用。
一种上述的抗HIV-1病毒药物在降解HIV-1的Rev蛋白中的应用。
Vif蛋白是HIV-1自身的一个重要蛋白，可以结合靶标蛋白，把它们连结到一个E3连接酶（ligase）复合物（Vif-SCF-CUL5 complex）上，然后这个复合物将使靶标蛋白泛素化，从而导致其在proteasome（蛋白酶体）中的降解。本发明主要根据Vif蛋白的泛素化功能，将Rev的多聚化结构域替换Vif的N端，使其能够特异性地结合HIV-1的Rev蛋白，然后通过Vif的泛素化功能降解Rev，以己之矛攻己之盾，从而达到抑制HIV-1复制的目地，具有很强的新颖性和特异性，这也为研发抗HIV-1药物提供了一种全新的思路和方法。
（1）为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种新型的嵌合载体的构建的方法及其在生命科学研究及临床治疗中的应用。
（2）本发明提供了一种保护细胞不受HIV-1攻击的新手段，将患者体内的CD4+T细胞分选出来体外扩增后，使其稳定表达Rev-Vif-C载体，然后回输患者体内，不仅可以保护患者免受HIV-1的再次攻击，同时还能辅助患者清楚体内的HIV-1病毒。
（3）本发明提出了一种全新的抗HIV-1自发突变的新载体——HIV-1的耐药性多因其药物引起的自我突变，而我们的嵌合载体是利用Rev自身结构域的相互结合而构建，可以避免可能的各种突变，因而能对多个HIV-1突变株有很好的抑制效果
（4）本发明提出了一种降解Rev蛋白表达的新技术
（5）本发明提出了一种新的降解多种蛋白的新技术——将某种蛋白的结合为点***到Vif基因的N端，从而通过Vif C端的泛素化通路实现特异性蛋白的降解过程。
附图说明
图1： 嵌合载体Rev-Vif-C的构建模型。
图2： 嵌合载体Rev-Vif-C通过泛素化通路降解Rev蛋白。
图3： 嵌合载体Rev-Vif-C通过抑制Rev-RRE的出核功能抑制多种野生型HIV-1病毒株的复制。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
实施例1 嵌合载体Rev-Vif-C的构建模型
将HIV-1 Rev基因上的两个寡聚化结合结构域（第9-26位氨基酸和第51-65氨基酸）分别克隆到Vif基因的N端，替换到APOBEC3G的结合位点（第1-79位氨基酸），然后连接到pcDNA3.1的载体上形成了3个不同的嵌合嵌合，分别命名为ROL1-Vif-C，ROL2-Vif-C，ROL12-Vif-C。其中ROL1代表Rev的N端部分的寡聚化结合结构域，即第9-26位氨基酸；ROL2代表Rev的C端部分的寡聚化结合结构域，即第51-65位氨基酸；ROL12代表串联Rev的N端和C端的两个寡聚化结合结构域，即第9-26位氨基酸和第51-65位氨基酸。
具体步骤如下：
（1）Rev的蛋白结构上有两个寡聚化结构域，分别将这两个寡聚化结构域替换Vif蛋白N端的1-79 位氨基酸序列，从而构建了三个新的嵌合蛋白ROL1-Vif-C（包含Rev N端的寡聚化结构域，即第9-26位氨基酸）、ROL2-Vif-C（包含Rev C端的寡聚化结构域，即第51-65位氨基酸）和ROL12-Vif-C（包含Rev N端和C端两个寡聚化结构域，即第9-65位氨基酸）
（2）将这三个嵌合载体分别克隆到表达载体pcDNA3.1上，通过转染进行瞬时表达
其中，步骤（1）中，所述的载体构建包括以下步骤：根据HIV-1的Vif蛋白和Rev蛋白分别合成4对引物，然后以HIV-1病毒的PNL4-3质粒序列为模板，利用上述引物进行PCR扩增；然后利用不同的酶切位点将PCR扩增产物克隆到pcDNA3.1上，其中Rev的片段***位置在Vif片段的N端。
实施例2 嵌合载体Rev-Vif-C通过泛素化通路降解Rev蛋白
将HIV-1 Rev基因与RFP融合表达并克隆到pcDNA3.1的载体上，这样可以通过观察RFP的表达来反映Rev的表达情况；同时将Rev基因与HA标签融合表达，方便做western blot来进一步验证Rev的表达情况。
（1）在24孔板的293t细胞中，共转染Rev-RFP和ROL1-Vif-C（或ROL2-Vif-C或ROL12-Vif-C）载体，质粒的量分别为1：0，1：1，1：2，1：3，转染48h后观察RFP的表达，同时在6孔板的293t细胞中，共转染Rev-HA和ROL1-Vif-C载体，质粒的量分别为1：0，1：1，1：2，1：3，转染48h后转染收细胞裂解做Western Blot检测Rev的表达
该实验说明了，三个嵌合载体都可以抑制Rev蛋白的表达，并且具有一定的浓度梯度依赖性。
（2）在24孔板的293t细胞中，共转染200 ng Rev-RFP和200 ng ROL12-Vif-C载体，24 h后加入10 uM的MG132处理细胞，处理12 h后观察RFP的表达
（3）在24孔板的293t细胞中，共转染200 ng Rev-RFP和200 ng ROL12-Vif-C载体，6h后再转染50 nM的si-NC，si-ElonginB，si-ElonginC以及si-Culin5，转染48h后观察RFP的表达
（4）在6cm板的293t细胞中，分别共转染3 ug Ub-Flag，3 ug Rev-HA和2 ug ROL1-Vif-C、ROL2-Vif-C、ROL12-Vif-C载体，转染48h后收细胞裂解做Co-IP富集Rev-HA蛋白，并进一步检测Rev蛋白的泛素化情况
以上三个实验说明了，嵌合载体是通过Vif介导的泛素化通路降解Rev蛋白。
实施例3 嵌合载体Rev-Vif-C通过抑制Rev-RRE的出核功能抑制多种野生型HIV-1病毒株的复制
PDM628上存在SD和SA剪切位点，当Rev蛋白不存在时，PDM 628上携带的luciferase基因被剪辑，导致荧光素酶微量表达；当两种质粒共转时，Rev和RRE结合，将luciferase基因片段带出细胞核，避免被SD和SA剪辑，使荧光素酶大量表达。因此，当Rev蛋白表达收到抑制时，Rev-RRE相关的出核转运***将受到抑制，此时荧光素酶的表达量将下降。基于此原理，可以判断Rev蛋白的功能是否会受到影响。
（1）在96孔板的293t细胞中，分别共转染10 ng pDM628质粒和10 ng的Rev质粒，然后再共转染不同浓度的ROL1-Vif-C、ROL2-Vif-C、ROL12-Vif-C及M10质粒，转染48h后收细胞裂解检测luciferase的表达情况
该实验说明了，三个嵌合载体都可以抑制Rev-RRE相关出核转运***，并且具有一定的浓度梯度依赖性，同时，我们的嵌合载体的效果要明显优于已有的RevM10突变体。
（2）在24孔板的293t细胞中，分别共转染50 ng PNL4-3质粒和不同浓度的ROL1-Vif-C、ROL2-Vif-C、ROL12-Vif-C质粒（50 ng，100 ng，150 ng），转染48h后收上清ELISA检测P24的表达情况（B）在24孔板的293t细胞中，分别共转染50 ng PYU-2质粒和不同浓度的ROL1-Vif-C、ROL2-Vif-C、ROL12-Vif-C质粒（50 ng，100 ng，150 ng），转染48h后收上清ELISA检测P24的表达情况
该实验说明了，三个嵌合载体都可以抑制多种不同的野生型HIV-1的复制，并且具有一定的浓度梯度依赖性。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种抗HIV-1病毒药物及其制备和应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 537
<212> DNA
<213> ROL1-Vif-C
<400> 1
atggcaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gagctcatca gaacagtcag actcatcaag 60
cttctctatc aaagcaaccc acctcccaac cccgagggga cccgacaggc ccgaaggaat 120
agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga acggatcctt 180
ggcacttatc tgggacattt gggtcaggga gtctccatag aatggaggaa aaagagatat 240
agcacacaag tagaccctga actagcagac caactaattc atctgtatta ctttgactgt 300
ttttcagact ctgctataag aaaggcctta ttaggacaca tagttagccc taggtgtgaa 360
tatcaagcag gacataacaa ggtaggatct ctacaatact tggcactagc agcattaata 420
acaccaaaaa agataaagcc acctttgcct agtgttacga aactgacaga ggatagatgg 480
aacaagcccc agaagaccaa gggccacaga gggagccaca caatgaatgg acactag 537
<210> 2
<211> 405
<212> DNA
<213> ROL2-Vif-C
<400> 2
atggacagcg acgaagagct catcagaaca gtcagactca tcaagcttct ctatcaaagc 60
aaccatttgg gtcagggagt ctccatagaa tggaggaaaa agagatatag cacacaagta 120
gaccctgaac tagcagacca actaattcat ctgtattact ttgactgttt ttcagactct 180
gctataagaa aggccttatt aggacacata gttagcccta ggtgtgaata tcaagcagga 240
cataacaagg taggatctct acaatacttg gcactagcag cattaataac accaaaaaag 300
ataaagccac ctttgcctag tgttacgaaa ctgacagagg atagatggaa caagccccag 360
aagaccaagg gccacagagg gagccacaca atgaatggac actag 405
<210> 3
<211> 387
<212> DNA
<213> ROL12-Vif-C
<400> 3
atgatccatt cgattagtga acggatcctt ggcacttatc tgggacattt gggtcaggga 60
gtctccatag aatggaggaa aaagagatat agcacacaag tagaccctga actagcagac 120
caactaattc atctgtatta ctttgactgt ttttcagact ctgctataag aaaggcctta 180
ttaggacaca tagttagccc taggtgtgaa tatcaagcag gacataacaa ggtaggatct 240
ctacaatact tggcactagc agcattaata acaccaaaaa agataaagcc acctttgcct 300
agtgttacga aactgacaga ggatagatgg aacaagcccc agaagaccaa gggccacaga 360
gggagccaca caatgaatgg acactag 387
Claims (7)
1.一种抗HIV-1病毒药物，其特征在于，所述的抗HIV-1病毒药物是通过Rev 蛋白和Vif蛋白连接而成。
2.根据权利要求1所述的病毒药物，其特征在于，所述的连接为将Rev的多聚化结构域替换Vif的N端。
3.一种Vif蛋白在制备抗HIV-1病毒药物中的应用。
4.一种抗HIV-1病毒药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. Rev的蛋白结构上有两个寡聚化结构域，分别将这两个寡聚化结构域替换Vif蛋白N端的1-79 位氨基酸序列，从而构建了三个新的嵌合蛋白ROL1-Vif-C、ROL2-Vif-C和ROL12-Vif-C, 所述的ROL1-Vif-C,包含Rev N端的寡聚化结构域，所述的ROL2-Vif-C包含Rev C端的寡聚化结构域，所述的ROL12-Vif-C包含Rev N端和C端两个寡聚化结构域，
所述的Rev N端的寡聚化结构域为Rev蛋白氨基酸序列的第9-26位氨基酸，
所述的Rev C端的寡聚化结构域为Rev蛋白氨基酸序列的第51-65位氨基酸，
所述的Rev N端和C端两个寡聚化结构域为Rev蛋白氨基酸序列的第9-65位氨基酸，
所述的Vif-C部分为Vif蛋白氨基酸序列的第80-193位氨基酸，
S2. 将这三个嵌合载体分别克隆到表达载体pcDNA3.1上，通过转染进行瞬时表达，其中，S1中，所述的3个载体序列如下SEQ NO:1、SEQ NO:2和SEQ NO:3所示，将载体连接到pcDNA3.1上所用的酶切位点是bamH I and Xhol I。
5.一种权利要求1或2所述的抗HIV-1病毒药物在制备抗HIV-1药物中的应用。
6.一种权利要求1或2所述的抗HIV-1病毒药物在制备抑制HIV-1复制药物中的应用。
7.一种权利要求1或2所述的抗HIV-1病毒药物在降解HIV-1的Rev蛋白中的应用。
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| CN1653085A (zh) * | 2002-05-16 | 2005-08-10 | 巴法里安诺迪克有限公司 | Hiv调节/辅助蛋白的融合蛋白 |
| US20110104789A1 (en) * | 2009-10-30 | 2011-05-05 | Yuntao Wu | Non-integrating rev-dependent lentiviral vector and methods of using the same |
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2014
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Legal Events
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