CN104127870A - 鸭甲型肝炎病毒冻干制剂的制备方法及其冻干制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸭甲型肝炎病毒冻干制剂，其制备方法是将含有鸭甲型肝炎病毒的材料与冻干稀释液混合后，无菌匀浆，冷冻干燥，即得；其中，含有鸭甲型肝炎病毒的材料为经尿囊腔接种鸭甲型肝炎病毒24小时后死亡的8-10日龄鸡胚吸取尿囊液后的整个胚体或因鸭甲型肝炎病毒致死鸭的肝脏组织；冻干稀释液为磷酸盐缓冲液或生理盐水；该方法操作简单、成本低廉，不需要添加冻干保护剂，制得的鸭甲型肝炎病毒冻干制剂可以在10℃～-80℃保存，病毒效价无明显变化，保存条件要求低，保存时间长。

Description

鸭甲型肝炎病毒冻干制剂的制备方法及其冻干制剂

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种鸭甲型肝炎病毒冻干制剂的制备方法，还涉及由该方法制得的冻干制剂。

背景技术

鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis,DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus,DHV)引起的一种高度致死性传染病，以发病急、病程短、发病率和死亡率高为特点。鸭病毒性肝炎分为3个各自独立的没有血清学关系的血清型：I型、II型和III型。其中，血清I型鸭肝炎病毒(DHV-I)又称鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)，是目前我国流行的主要鸭肝炎病毒，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失，威胁着养鸭业的健康发展。

鸭甲型肝炎病毒目前发现有三种基因型，即DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3，根据报道，我国目前流行的主要是DHAV-1，三种基因型均属于小RNA病毒科禽肝病毒属，病毒粒子呈球形或类球形，核衣壳呈20面体对称，直径为20-40nm，无囊膜，胞浆内繁殖，核酸为不分节段的单股正链RNA。该病毒对***、氯仿、甲醇、胰酶、硫酸铵、常用消毒剂等有一定程度的抵抗力；能耐受pH3.0的酸性环境；对热也有较强抵抗力，56℃加热1小时仍有部分病毒存活。鸭甲型肝炎病毒不能凝集任何动物的红细胞，可在鸭胚和鸡胚的绒毛尿囊腔及鸡胚组织、鸭胚肝细胞、鸭胚肾细胞、鹅胚肾细胞等中增殖。

病毒的保存在病毒研究中是一个十分重要的环节。例如，在对某病毒株生物学特性进行长期、深入研究时，或对不同年代、不同地域的流行分离病毒株进行异同比较时，都需要保持病毒的遗传稳定性。而病毒弱毒疫苗种毒的保存、灭活疫苗种毒的保存等同样与病毒保存有着紧密的联系。病毒保存的方法有：冰箱保存法(普通冰箱保存：4～8℃；低温冰箱保存：-20℃～-40℃；超低温冰箱保存：-85℃)、液氮保存法(-196℃)和冷冻真空干燥保存法(冻干法)。其中，冷冻真空干燥保存法因不易发生液体泄漏导致污染、保存时间长、保存条件简单及保存成本低(不需消耗液氮)等优点而成为病毒保存的一种较好方法。在冷冻真空干燥保存法中，在冻干前通常需要加入冻干保护剂，冻干保护剂的作用是使保存对象在冻干过程中免受损伤并减少在保存过程中的死亡。冻干保护剂的种类有很多，如牛/马血清、无菌牛奶等，但不同保存对象适用的冻干保护剂不一定相同，需要研究者根据保存对象的特点采用适宜的冻干保护剂才能获得所需要的保存效果。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鸭甲型肝炎病毒冻干制剂，制备简单，成本经济，保存条件要求低，保存时间长。

经研究，本发明提供如下技术方案：

1.鸭甲型肝炎病毒冻干制剂的制备方法，是将含有鸭甲型肝炎病毒的材料与冻干稀释液混合后，无菌匀浆，冷冻干燥，即得；所述含有鸭甲型肝炎病毒的材料为经尿囊腔接种鸭甲型肝炎病毒24小时后死亡的8-10日龄鸡胚吸取尿囊液后的整个胚体或因鸭甲型肝炎病毒致死鸭的肝脏组织；所述冻干稀释液为磷酸盐缓冲液(PBS)或生理盐水。

进一步，所述鸭甲型肝炎病毒为1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)。

进一步，所述含有鸭甲型肝炎病毒的材料为经尿囊腔接种鸭甲型肝炎病毒24小时后死亡的9日龄鸡胚吸取尿囊液后的整个胚体或因鸭甲型肝炎病毒致死鸭的肝脏组织。

进一步，所述含有鸭甲型肝炎病毒的材料与冻干稀释液的质量比为1:1～1:10。

进一步，所述含有鸭甲型肝炎病毒的材料与冻干稀释液的质量比为1:5。

进一步，所述冷冻干燥是先在4℃预冻0.5小时、-20℃预冻1小时，再-70℃冷冻过夜，次日真空干燥24-48小时。

2.采用上述方法制备的鸭甲型肝炎病毒冻干制剂。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种简单、经济的鸭甲型肝炎病毒冻干制剂的制备方法，只需将含鸭甲型肝炎病毒的材料(鸡胚的胚体或鸭的肝脏组织)与适宜比例的冻干稀释液(PBS或生理盐水)混合后匀浆、冻干即可，制得的鸭甲型肝炎病毒冻干制剂可以在10℃～-80℃保存，病毒效价无明显变化，保存条件要求低，保存时间长。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照试剂制造厂商所建议的条件进行。

实施例1、鸭甲型肝炎病毒CH60株冻干制剂的制备

1、病毒株

鸭甲型肝炎病毒CH60株，该病毒株为本实验室分离致弱的病毒株，已申请专利(申请号为201310011872.3)并进行生物材料保藏(保藏编号为CCTCC NO.V201248)。

2、实验用胚

9日龄SPF鸡胚。

3、病毒的增殖

将鸭甲型肝炎病毒CH60株种毒用生理盐水稀释5倍后，加入青霉素和链霉素至终浓度分别为100IU/mL和100μg/mL，经尿囊腔接种20枚9日龄鸡胚，0.2ml/胚，同时设立生理盐水阴性对照胚5枚。接种后的鸡胚用石蜡封闭进针孔，37℃孵化6天，每天照胚2次，在生理盐水阴性对照胚不死亡的前提下，弃去24小时内死亡的鸭甲型肝炎病毒CH60株接种鸡胚，收集24小时后死亡的鸭甲型肝炎病毒CH60株接种鸡胚，4℃冷藏过夜。

4、病毒冻干材料的制备

取前述收集的鸭甲型肝炎病毒CH60株接种鸡胚，在无菌条件下按常规方法吸取尿囊液后，取整个胚体作为病毒冻干材料。

5、病毒冻干制剂的制备

取前述病毒冻干材料，按质量比为1:5加入冻干稀释液(PBS或生理盐水)，无菌匀浆后，分别注入5ml或10ml西林瓶中，每瓶1-2ml，半加塞；依次在4℃预冻0.5小时、-20℃预冻1小时，然后-70℃冷冻过夜，次日真空干燥24小时，即得1型鸭甲型肝炎病毒CH60株冻干制剂。

实施例2、鸭甲型肝炎病毒临床病料冻干制剂的制备

1、病毒冻干材料的来源

因鸭病毒性肝炎人工感染致死的雏鸭肝脏、流行病学和临床症状为典型的鸭病毒性肝炎的雏鸭肝脏。

2、病毒冻干材料的确认

①采用“1型和3型鸭甲肝病毒一步法双重RT-PCR检测试剂盒、引物对及方法”(专利申请号为201310228262.9)检测，结果表明材料中含1型鸭甲型肝炎病毒。

②经中和试验和雏鸭保护实验确定该雏鸭肝脏中含有1型鸭甲型肝炎病毒。

3、病毒冻干制剂的制备

取前述病毒冻干材料，按质量比为1:5加入冻干稀释液(PBS或生理盐水)，无菌匀浆后，分别注入5ml或10ml西林瓶中，每瓶1-2ml，半加塞；依次在4℃预冻0.5小时、-20℃预冻1小时，然后-70℃冷冻过夜，次日真空干燥24小时，即得1型鸭甲型肝炎病毒临床病料冻干制剂。

实施例3、鸭甲型肝炎病毒冻干制剂在冻干前后的特性及效价变化

1、鸭甲型肝炎病毒CH60株对鸡胚半数致死量(ELD₅₀)的测定

将鸭甲型肝炎病毒CH60株种毒用生理盐水连续进行10倍的梯度稀释，即10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8和10^-9，共9个不同稀释度。将各个稀释度的病毒悬液分别接种于9日龄鸡胚尿囊腔，每个稀释度接种5枚鸡胚，0.2ml/胚，同时设立未稀释的鸭甲型肝炎病毒CH60株种毒阳性对照组和生理盐水阴性对照组。接种后的鸡胚用石蜡封闭进针孔，37℃孵化6天，每天照胚2次，观察记录各组鸡胚死亡情况，弃去24小时内死亡鸡胚，记录24小时后死亡鸡胚数，按Reed-Muench法计算鸭甲型肝炎病毒CH60株对鸡胚的半数致死量。

2、鸭甲型肝炎病毒临床病料对鸭胚半数致死量的测定

除病毒材料采用经RT-PCR、中和试验和雏鸭保护实验确认为含有鸭甲型肝炎病毒的雏鸭肝脏外，其余操作步骤和测定方法同前。

3、鸭甲型肝炎病毒冻干制剂在冻干前后的特性及效价变化

观察记录实施例1和2所得鸭甲型肝炎病毒冻干制剂在冻干前后的特性变化，并按前述方法测定实施例1和2所得鸭甲型肝炎病毒冻干制剂在冻干前后对鸡胚的半数致死量。结果见表1，实施例1和2所得鸭甲型肝炎病毒冻干制剂的效价相比冻干前仅略有降低。

表1鸭甲型肝炎病毒冻干制剂在冻干前后的特性及效价变化

注：6.84表示ELD₅₀＝10^-6.84/0.2ml，即将病毒稀释10^6.84倍，每胚接种0.2ml可使50％的鸡胚致死；其余效价数据同此含义。

实施例4、鸭甲型肝炎病毒冻干制剂在不同保存条件下的效价变化

取实施例1和2中所述病毒冻干制剂，分别置4～10℃、0℃、-15～-20℃、-70～-80℃保存不同时间，然后按前述方法测定其对鸡胚的半数致死量。结果见表2，实施例1和2所得鸭甲型肝炎病毒冻干制剂在-80～-70℃、-20～-15℃、0℃和4～10℃条件下均有良好的保存效果，病毒效价无明显降低，保存时间长。

表2冻干制剂在不同保存条件下的效价变化(恢复到冻干前体积)

注：6.5表示ELD₅₀＝10^-6.5/0.2ml，即将病毒稀释10^6.5倍，每胚接种0.2ml可使50％的鸡胚致死；“-”为已经测量不出毒价；其余效价数据同此含义。

实施例5、鸭甲型肝炎病毒冻干制剂对雏鸭的免疫效果

通过测定鸭甲型肝炎病毒CH60株冻干制剂对雏鸭免疫鸭血清中和抗体滴度、免疫雏鸭对1万倍ELD₅₀的鸭甲型肝炎病毒强毒攻毒的抵抗，从而确定冻干制剂的效果。

将1日龄樱桃谷鸭雏鸭200只，随机分为2组，100只/组，1组每只肌肉注射按实施例1制备的于4℃保存10个月的鸭甲型肝炎病毒CH60株冻干制剂1羽份，2组注射灭菌生理盐水0.2ml作为对照,于免疫后第3、5、7、10、15和30日龄分别从1、2组各随机选10只采血测定抗鸭甲型肝炎病毒的中和抗体滴度，同时每只接种1万倍ELD₅₀的鸭甲型肝炎病毒强毒，隔离饲养，观察7天，剖杀观察记录肉眼病理变化并制作肝脏组织学切片观察记录显微病理变化，结果如表3所示。

表3免疫后不同时间血清中抗鸭甲型肝炎病毒中和抗体效价及接种1万倍ELD₅₀的鸭甲型肝炎病毒强毒攻击结果

①注:体重差异分析是指与正常对照鸭进行x²检验的显著分析(体重是指剖杀鸭的平均体重，单位为克)。

从表3可以看出，鸭甲型肝炎病毒CH60株冻干制剂免疫1日龄樱桃谷鸭后：第3天，血清中抗鸭甲型肝炎病毒的中和抗体效价为2^2.1，此时接种1万倍ELD₅₀鸭甲型肝炎病毒强毒，观察7天虽然没有发生雏鸭死亡，但精神稍差、肝脏有较严重病理变化，而非免疫对照组出现80％(8/10)死亡，其余精神差，肝脏有严重病理变化，平均体重极显著低于疫苗免疫鸭。

第5天，血清中抗鸭甲型肝炎病毒的中和抗体效价为2^3.3，此时接种1万倍ELD₅₀鸭甲型肝炎病毒强毒，观察7天没有发生雏鸭死亡，肝脏有较第3天攻毒鸭轻微的病理变化，而非免疫对照组出现50-60％(5/10-6/10)死亡，肝脏有严重病理变化，平均体重极显著低于疫苗免疫鸭。

第7天，血清中抗鸭甲型肝炎病毒的中和抗体效价为2^6.3，此时接种1万倍ELD₅₀鸭甲型肝炎病毒强毒，观察7天临床和肝脏组织学正常，而非免疫对照组出现50-60％(5/10-6/10)死亡，肝脏有严重病理变化，平均体重极显著低于疫苗免疫鸭。

第10天，血清中抗鸭甲型肝炎病毒的中和抗体效价为2^6.8，此时接种1万倍ELD₅₀鸭甲型肝炎病毒强毒，观察7天临床和肝脏组织学正常，而非免疫对照组虽然没有发生雏鸭死亡，但精神稍差、肝脏有较严重病理变化，平均体重显著低于疫苗免疫鸭。

第15天，血清中抗鸭甲型肝炎病毒的中和抗体效价为2^7.2，此时接种1万倍ELD₅₀鸭甲型肝炎病毒强毒，观察7天临床和肝脏组织学正常，而非免疫对照组没有发生雏鸭死亡，但部分(3/10)肝脏有一定病理变化，平均体重与疫苗免疫鸭差异不显著。

第30天，血清中抗鸭甲型肝炎病毒的中和抗体效价为2^6.8～2^7.0，此时接种1万倍ELD₅₀鸭甲型肝炎病毒强毒，观察7天疫苗免疫鸭和非免疫对照鸭临床和肝脏组织学正常，无差异。

可见，按实施例1制备的鸭甲型肝炎病毒CH60株冻干制剂免疫1日龄鸭后3～5天即可产生一定程度免疫力，7天产生较为坚强免疫力，免疫持续期1个月以上。表明按实施例1制备的于4℃保存10个月的鸭甲型肝炎病毒CH60株冻干制剂效果良好。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.鸭甲型肝炎病毒冻干制剂的制备方法，其特征在于，将含有鸭甲型肝炎病毒的材料与冻干稀释液混合后，无菌匀浆，冷冻干燥，即得；所述含有鸭甲型肝炎病毒的材料为经尿囊腔接种鸭甲型肝炎病毒24小时后死亡的8-10日龄鸡胚吸取尿囊液后的整个胚体或因鸭甲型肝炎病毒致死鸭的肝脏组织；所述冻干稀释液为磷酸盐缓冲液或生理盐水。

2.如权利要求1所述的鸭甲型肝炎病毒冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述鸭甲型肝炎病毒为1型鸭甲型肝炎病毒。

3.如权利要求1或2所述的鸭甲型肝炎病毒冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述含有鸭甲型肝炎病毒的材料为经尿囊腔接种鸭甲型肝炎病毒24小时后死亡的9日龄鸡胚吸取尿囊液后的整个胚体或因鸭甲型肝炎病毒致死鸭的肝脏组织。

4.如权利要求1所述的鸭甲型肝炎病毒冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述含有鸭甲型肝炎病毒的材料与冻干稀释液的质量比为1:1～1:10。

5.如权利要求4所述的鸭甲型肝炎病毒冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述含有鸭甲型肝炎病毒的材料与冻干稀释液的质量比为1:5。

6.如权利要求1所述的鸭甲型肝炎病毒冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥是先在4℃预冻0.5小时、-20℃预冻1小时，再-70℃冷冻过夜，次日真空干燥24-48小时。

7.采用权利要求1至6任一项所述方法制备的鸭甲型肝炎病毒冻干制剂。