CN104120180A - 一种人类aldh2基因型检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人类ALDH2基因型检测试剂盒，包括PCR扩增引物、DNA聚合酶和反应缓冲液，所述的DNA聚合酶为经聚乙二醇（PEG）修饰的可耐受血液中PCR反应抑制物的热启动Taq聚合酶，还提供了PCR扩增引物的核苷酸序列。本发明具有如下技术效果：1）DNA聚合酶为经聚乙二醇（PEG）修饰的可耐受血液中PCR反应抑制物的热启动Taq聚合酶，能够实现对人类全血（无需进行核酸提取）的PCR扩增，直接经血液进行PCR扩增；2）实现对样本ALDH2基因型的检测。

Description

一种人类ALDH2基因型检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种人类ALDH2基因型检测试剂盒，属于基因工程技术领域。

背景技术

乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase gene,ALDH)是一种四联体蛋白，催化乙醛和其他脂肪族醛氧化。人体器官和组织中，ALDH有19种同工酶，常见的有ALDH1～ALDH4，其中ALDH2位于线粒体内，而ALDH1、ALDH3及ALDH4位于胞液内。根据底物特异性和亚单位组成，认为只有ALDH1和ALDH2是人体肝脏内的两种主要同工酶，且只有ALDH2表现出遗传多态性。

ALDH2基因位于人类第12号染色体，目前已发现了近百个SNP位点，主要多态性是rs671位点，即ALDH2基因在外显子12处发生点突变(Glu487Lys)，使具有催化活性的野生型等位基因ALDH2*1变为催化能力丧失的突变型等位基因ALDH2*2，从而使ALDH2失去酶的活性。由于遗传，在人群中该酶基因型出现3种情况：具有正常催化活性的野生纯合子型ALDH2*1/*1；催化活性下降的杂合子型ALDH2*1/*2；催化活性丧失的突变纯合子型ALDH2*2/*2。在亚洲人群中，ALDH2*2是频率最高且最重要的突变型，其中研究显示中国人ALDH2*2的频率达18％。

舌下含服***片是治疗冠心病心绞痛急性发作的常规首选方法，然而，该药的临床有效性常因人而异，部分病人舌下含服***不能迅速有效地缓解心绞痛，使心肌严重缺血加重，甚至死亡。研究发现，***的舒血管作用是通过释放一氧化氮(NO)所介导，而ALDH2与***转化为NO密切相关。有研究报道，野生型ALDH2酶对***的催化活性大约是突变型的10倍，ALDH2*1基因型的患者***治疗心绞痛的疗效明显优于ALDH2*2患者，且前者迅速起效率也明显高于后者。由此可见，ALDH2基因检测可指导临床正确使用***，减少用药无效情况。

饮酒后，乙醇通过胃肠道完全吸收入血，经乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase,ADH)代谢为乙醛，代谢过程涉及多个器官和酶***。紧接着，乙醛主要被ALDH进一步代谢为乙酸，最终氧化成二氧化碳和水排出体外。研究已证实，ALDH2是唯一存在于线粒体内，且与亚洲人的饮酒行为密切相关的酶。突变型基因ALDH2*2的存在可引起该酶活性降低10倍以上，严重阻碍酒精在体内的代谢过程，导致大量乙醛滞留在体内。加之高频饮酒易引发酒精依赖现象，进一步加重了肝脏的受累程度，引起ALD。ALD是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病，初期常表现为脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化，是我国常见的肝脏疾病之一，严重危害人民健康，近几年发病呈显著上升趋势。对ALDH2基因型的检测将有助于揭示个体酒精代谢能力，指导检测者正确饮酒，预防酒精性肝病。

摄入人体的乙醇有90％以上是在肝脏内完成代谢过程的，但其在摄入过程中与消化道上皮细胞的直接接触也不容忽视。在饮酒人群中,尤其是重度饮酒者，由于其上消化道长期与大量酒精直接接触，该区域出现癌变(食道癌、口咽癌等)的几率较高。研究显示，ALDH2*2基因型者与饮酒人群患食道癌和口腔癌的风险之间具有明显联系。

乙醛具有明显的致癌作用，ALDH2的生理意义在于对乙醛的解毒作用。而ALDH2*2等位基因由于缺乏ALDH酶活性，导致饮酒后血液中乙醛的蓄积。研究发现，携带ALDH2*2基因型者大量饮酒将显著增加患肝癌的危险性。

除此之外，ALDH2*2基因型者也是冠心病、心肌梗死等疾病的高危人群。对ALDH2基因的检测将有助于揭示重大疾病的高危倾向，对指导检测者的日常生活大有益处，也将有助于医生提出个体化指导意见，对相关疾病的预防、治疗及预后具有重大意义。

综上所述，ALDH2基因检测将为***的用药、饮酒指导及相关高风险重大疾病的提示提供有效的参考依据。

目前市场上常用的ALDH2基因检测方法为基因芯片法，基本方法是首先提取血液基因组DNA，接着进行PCR扩增，将产物放入杂交仪中进行杂交，最后取出芯片，放入生物芯片识读仪中分析结果。基因芯片法最大的优点是高通量，同时也存在着许多不足之处，包括技术成本昂贵、操作复杂、检测灵敏度较低及重复性差等。PCR-RFLP即PCR-限制性片段长度多态性技术也曾应用于ALDH2基因检测，但由于其操作繁琐、耗时多、结果可性度低等缺点，未能普及。因此，本领域亟需一种成本低、操作简便、耗时少、灵敏度高且结果准确性好的ALDH2基因型检测试剂。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种不需经核酸提取而直接由人类全血样本进行PCR反应的人类ALDH2基因型检测试剂盒。

本发明的人类ALDH2基因型检测试剂盒，包括PCR扩增引物、DNA聚合酶和反应缓冲液，所述的DNA聚合酶为经聚乙二醇(PEG)修饰的可耐受血液中PCR反应抑制物的热启动Taq聚合酶，所述的PCR扩增引物的核苷酸序列如下：

同时为保证实验结果更准确，易判读，设计了一对扩增产物大小为600bp的内对照引物，核苷酸序列如下：

5’-TGCATCTGGACATGCTTGCT-3’
	5’-TGGCTGGAGGAGACTCCAAA-3’

所述的人类ALDH2基因型检测试剂盒中，所述的反应缓冲液的组成及各组分含量如下：0.18mM脱氧核苷酸(dNTP)，1.8mM氯化镁(MgCl2)，60.3mM氯化钾(KCl)，18.9mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，甘油(glycerol)0.6％(v/v)，作为PCR反应增强剂及稳定剂的二甲基亚砜(DMSO)5％(v/v)、甲酰胺2.5％(v/v)和甜菜碱5％(v/v)。

所述的人类ALDH2基因型检测试剂盒中，还包括DNA Loading dye。

本发明提供了一种由人类全血样本直接进行PCR(聚合酶链式反应)扩增以检测样本ALDH2基因型的方法及其试剂盒，此方法不但成本低、结果准确可靠，且前期无需对血液样本进行核酸提取操作，减少实验室污染风险，降低实验成本且减少实验操作时间。

本发明针对ALDH2的不同亚型基因，设计出两对特异性的基因扩增引物，并冻干在PCR反应板的底部，并且，提供了一套特殊的PCR反应体系，此体系中涵盖经聚乙二醇(PEG)修饰的可耐受血液中PCR反应抑制物的热启动Taq聚合酶，并在反应缓冲液中添加二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺和甜菜碱作为PCR反应增强剂及稳定剂，以保证实验过程的稳定和实验结果的准确。

本发明具有如下技术效果：

1)DNA聚合酶为经聚乙二醇(PEG)修饰的可耐受血液中PCR反应抑制物的热启动Taq聚合酶，能够实现对人类全血(无需进行核酸提取)的PCR扩增，直接经血液进行PCR扩增；

2)实现对样本ALDH2基因型的检测。

附图说明

图1为以EDTA抗凝人血为模板的PCR-SSP检测ALDH2基因型的电泳图；

图2为以DNA为模板的PCR-SSP检测ALDH2基因型的电泳图。

具体实施方式

实施例1

1原料和设备：

1.1试剂盒内含物：

1)8孔200μl PCR反应板，每2孔检测一个样本

2)2对ALDH2不同亚型基因的特异性上下游引物，在每2孔中，第一个孔中添加引物A，第二个孔中添加引物B，且每孔均添加一对内对照引物，所有引物均冻干在PCR反应板底部。

引物A和引物B的核苷酸序列如下：

内对照引物，核苷酸序列如下：

5’-TGCATCTGGACATGCTTGCT-3’
	5’-TGGCTGGAGGAGACTCCAAA-3’

3)PCR反应体系

DNA聚合酶：经聚乙二醇(PEG)修饰的可耐受血液中PCR反应抑制物的热启动Taq聚合酶；

反应缓冲液：组成及各组分含量如下：0.18mM脱氧核苷酸(dNTP)，1.8mM氯化镁(MgCl2)，60.3mM氯化钾(KCl)，18.9mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，甘油(glycerol)0.6％(v/v)，作为PCR反应增强剂及稳定剂的二甲基亚砜(DMSO)5％(v/v)、甲酰胺2.5％(v/v)和甜菜碱5％(v/v)。

DNA Loading dye。

1.2样本的来源

以EDTA抗凝管收集的新鲜或冷冻保存未经反复冻融的全血样本。

1.3所需实验设备

基因扩增仪、电泳仪及配套电泳槽、不同量程的移液器、小型台式离心机(含8联管水平头)。

2检测过程

2.1PCR反应体系的配置

以一次进行4个样本的基因型检测为例，反应体系如表1所示：

表1：PCR反应体系

每个PCR反应孔板中预先冻存有0.4μl10uM内对照引物和0.4μl10uM特异性引物A(或引物B)。

将PCR混合母液(4人份)混匀，然后8联管的每个反应孔均加入16μl的混合液；最后，每孔加入相应全血样品4μl，每两孔检测一个样本，盖上8联管盖或膜，放入基因扩增仪。

2.2PCR反应程序

PCR反应程序如表2所示：

表2：PCR反应程序

2.3实验结果分析

将PCR反应产物，加样到2％的琼脂糖凝胶上，以200V的电压电泳5-7分钟，读取结果；对照判定标准，推出样品ALDH2基因型。

凝胶成像判定标准：(每两孔检测一个样本)

1)两孔均有内对照，大小约为600bp的DNA片段

2)阳性反应会另有大小约为150bp的DNA片段

3)若只有第一个孔出现阳性条带，提示样本为ALDH2野生纯合子型；若只有第二个孔出现阳性条带，提示样本为ALDH2突变纯合子型；若两孔均出现阳性条带，提示样本为ALDH2杂合型。

结果如图1所示，结合判定标准，实验结果分析如下：

1)样本1只有第一个孔出现阳性条带，则为ALDH2野生纯合子型；

2)样本2两孔均出现阳性条带，则为ALDH2杂合型；

3)样本3和样本4均只有第二个孔出现阳性条带，则为ALDH2突变纯合子型。

同时，将上述四种血液样本，进行基因组DNA提取，测量到DNA浓度为10ng/ul。然后配置PCR反应体系，PCR反应体系如表3所示。

表3：PCR反应体系

每个PCR反应孔板中预先冻存有0.4μl10uM内对照引物和0.4μl10uM特异性引物A(或引物B)。

将PCR混合母液(4人份)混匀，然后8联管的每个反应孔均加入10μl的混合液；最后，每孔加入相应DNA样品2μl，盖上8联管盖或膜，放入基因扩增仪，以与全血直接扩增一样的PCR反应程序进行扩增，扩增完后，进行电泳分析。电泳结果如图2所示。

与全血扩增的实验结果比对，根据上述的凝胶成像判定标准，推出样本1为ALDH2野生纯合子型，样本2为ALDH2杂合型，样本3和样本4均为ALDH2突变纯合子型，与全血扩增结果相同。

结论：整个实验流程仅需1.5小时，操作方便快捷，且能正确判别实验样本的ALDH2基因型别，可为***的用药、饮酒指导及相关高风险重大疾病的提示提供有效的参考依据。

Claims (3)

1.一种人类ALDH2基因型检测试剂盒，包括PCR扩增引物、DNA聚合酶和反应缓冲液，其特征在于，所述的DNA聚合酶为经聚乙二醇(PEG)修饰的可耐受血液中PCR反应抑制物的热启动Taq聚合酶，所述的PCR扩增引物的核苷酸序列如下：

还包括一对内对照引物，核苷酸序列如下：

5’-TGCATCTGGACATGCTTGCT-3’ 5’-TGGCTGGAGGAGACTCCAAA-3’

2.根据权利要求1所述的人类ALDH2基因型检测试剂盒，其特征在于，所述的反应缓冲液的组成及各组分含量如下：0.18mM脱氧核苷酸(dNTP)，1.8mM氯化镁(MgCl2)，60.3mM氯化钾(KCl)，18.9mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，甘油(glycerol)0.6％(v/v)，作为PCR反应增强剂及稳定剂的二甲基亚砜(DMSO)5％(v/v)、甲酰胺2.5％(v/v)和甜菜碱5％(v/v)。

3.根据权利要求1所述的人类ALDH2基因型检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括DNA Loading dye。