CN104120101A - 一种大肠杆菌突变株及利用该菌生产手性天冬氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株用于废水回用工艺生产天冬氨酸的大肠杆菌菌株HT-ME，保藏编号为CGMCC No.9288。由于现有天冬氨酸生产工艺中的大肠杆菌均不耐盐，耐盐菌HT-ME为天冬氨酸生产工艺改良提供了一个理想的菌种资源。利用HT-ME菌株对现有天冬氨酸生产工艺进行废水回用改造，可以使发酵废水排放量下降三分之二，能减少污染和降低生产成本。

Description

一种大肠杆菌突变株及利用该菌生产手性天冬氨酸的方法

技术领域

本发明属于微生物技术和发酵工程领域，具体的说，涉及一种大肠杆菌突变株及利用该菌株进行废水回用工艺生产手性天冬氨酸的方法。

背景技术

天冬氨酸(Aspartic acid)又称氨基丁二酸,是构成机体蛋白质的主要氨基酸之一。结构式为:HOOC-CH2-CH(NH2)-COOH,分子量133.10。它有两种旋光异构体:D型和L型。通常所说的天冬氨酸是指等量的D型和L型的混合物,为无色单斜棱柱形结晶,溶于水,微溶于75％(质量分数)乙醇,不溶于***。

天冬氨酸为酸性氨基酸之一，属非必需氨基酸，在体内由谷氨酸转氨给草酰乙酸而得，分解则通过脱氨基生产草酰乙酸或经天冬氨酸酶的作用脱氨生成丁烯二酸进入三羧酸循环。它是生物体内赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸以及嘌呤、嘧啶碱基的合成前体。它可作为钾离子、镁离子的载体向心肌输送电解质，从而改善心肌收缩功能，同时降低氧消耗，在冠状动脉循环障碍缺氧时，对心肌有保护作用。它参与鸟氨酸循环，促使氨和二氧化碳生成尿素。降低血液中氨和二氧化碳的含量，增强肝脏功能，消除疲劳。

目前天冬氨酸的合成主要有化学法和酶法合成两种。化学法主要用于生产天冬氨酸的外消旋体DL-天冬氨酸。近年来，波兰、日本、德国用经顺丁烯二酸酐(马来酸酐)和氨化剂直接进行加成反应合成出天冬氨酸。这种方法具有原料易得、过程简单、反应条件温和及产物易分离等特点，适合于大规模生产。

波兰的Machowski S等人用顺丁烯二酸酐和过量氨水与NH4Cl反应，反应在一间歇反应釜中，于140℃、0.4MPa下反应2.5h。将得到的混合物冷却至70℃后用盐酸酸化至pH2.5，再冷却至室温，此时天冬氨酸沉淀析出，将沉淀过滤，4℃下水洗后得到产品，产率为55％。

2002年，浙江大学的邢亚军等在一钛材高压釜中，对顺丁烯二酸酐)进行氨化反应合成了DL-天冬氨酸。通过实验研究对原有合成工艺作出了改进，使产品收率提高到70％以上，并且对产品的分离提纯采用顺丁烯二酸(马来酸)代替盐酸进行酸化结晶从而提高了反应物的利用和减少反应剩余物的污染。

2003年天津大学的王亚权等提出了一种简便的、不使用任何催化剂的化学合成法。实验在聚四氟衬里的250ml高压釜中进行。实验步骤如下：将32.5g顺丁烯二酸酐(分析纯)溶于70ml水中，加入氨水(分析纯)至pH8，充1MPa氮气，然后在电磁搅拌下加热至453K，反应6h，反应后冷却至室温，过滤后得无色晶体，收率63.1％，熔点338℃。产物的红外光谱与DL-天冬氨酸的标准谱图吻合，容量分析表明天冬氨酸含量≥98％。

而酶法合成是目前工业上合成天冬氨酸左旋单体的主要方法，这种方法不仅收率高而且光学纯度高。酶法是用天冬氨酸酶催化氨与富马酸发生加成反应而得，其反应式如下所示：

生物酶法又可分为IC法和FWC法。IC法是固定化细胞法或固定化酶法工艺，即将天冬氨酸酶制备为固定化酶或将具有天冬氨酸酶活力的大肠杆菌制备为固定化细胞，通过酶促反应促使由富马酸转化为L-天冬氨酸的工业化生产。而与固定化细胞法生产L-天冬氨酸相比，游离整体细胞法具有较高的工作活力和生产能力，工艺流程更为简洁，需要的设备投资较少，因而生产成本更低，具有较强的市场竞争力。游离整体细胞法生产L-天冬氨酸的主要流程为：以顺丁烯二酸为原料，在溴化钠与过硫酸氨的催化作用下生成反丁烯二酸，加氨后在大肠杆菌生物反应器内以大肠杆菌培养液为酶源，经过酶促反应生成L-天冬氨酸，最后经过盐酸调节等电点回收，废液则排出进行无害化处理。如果工艺进行改良，用反丁烯二酸代替盐酸进行等电点调节，回收天冬氨酸后将废液回用，补加反丁烯二酸和催化剂后再进行新一轮生产，则废水排放量将大大减少。工艺改良的关键是选育耐受回用废液积累的溴化钠等盐分的大肠杆菌。

在目前天冬氨酸生产工艺中，现有工程菌株对盐分的耐受程度不佳，反应体系中溴化钠与过硫酸氨的累积会对酶促反应有抑制作用，因此无法将废液回用，造成废液排放量大，污染严重的问题。

本发明定位于天冬氨酸生产的工艺改进，利用微生物技术针对性地选育耐盐大肠杆菌，并对获得的菌株进行了分析和应用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种耐盐大肠杆菌突变株，可用于废水回用工艺生产天冬氨酸。

发明人从安徽某天冬氨酸生产企业的污水池中分离、鉴定得到一株耐盐大肠杆菌菌株。对该菌株进行多次辐照诱变筛选，最终获得一株具有高天冬氨酸酶活性的突变株HT-ME。该菌株已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，分类命名为Escherichia coli，保藏编号为CGMCC No.9288，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所(100101)，保藏日期为2014年6月9日。

经形态鉴定及生物学特性研究，保藏号为CGMCC No.9288的菌株具有以下特征：

(1)、菌株HT-ME在PYG培养基中所需生长条件：温度10-40℃(最适35℃)，pH3.5-8.5(最适6.5)，盐度0-8％(w/v，最适0％)。

(2)、菌株HT-ME为革兰氏阴性杆菌，大小0.5-1.0×2^-10(μm)。

(3)、在PYG培养基中菌株HT-ME的代时约为0.2h。

(4)、菌株HT-ME对青霉素、万古霉素、链霉素、红霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素等多种抗生素敏感。

其中，优选的用于传代、保藏菌株的PYG培养基标准配方如下：10g蛋白胨，10g酵母膏，5g葡萄糖，40ml盐溶液(0.25g氯化钙，0.5g氯化镁，1g磷酸氢二钾，1g磷酸二氢钾，10g碳酸氢钠，2g氯化钠，超纯水溶解，定容至1L)，超纯水溶解定容至1L，pH＝7。

对保藏号为CGMCC No.9288菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增与序列测定，测得16S rRNA基因部分片段长度为1465bp(Seq IDNo.1)，CGMCC No.9288菌株的16S rRNA序列具体见序列表。菌株CGMCC No.9288与已知的大肠杆菌标准菌株的16S rRNA基因序列相似性为96.9％，DNA杂交率(Tm法)为80.3％，具有标准菌株不具备的耐盐特性，因此，菌株CGMCC No.9288为大肠杆菌标准菌株的突变株。

本发明的另一目的是提供一种利用该菌株生产手性天冬氨酸的方法。

本发明所述的利用大肠杆菌突变菌株生产手性天冬氨酸的方法，包括如下的步骤：

(1)、以顺丁烯二酸为原料，在溴化钠与过硫酸铵的催化作用下生成反丁烯二酸沉淀，加氨后使沉淀溶解；

(2)、将CGMCC No.9288菌株发酵培养后获得的具有天冬氨酸酶活性发酵液作为酶源与步骤(1)的溶液混合，经过酶促反应生成L-天冬氨酸；

(3)、调节pH至酸性，回收目标产物L-天冬氨酸。

所述方法步骤(1)中，优选的反应条件为温度控制在50-80℃，溴化钠投加量为顺丁烯二酸质量的0.5-5％，过硫酸铵的投加量为顺丁烯二酸的0.5-5％。更优选的反应条件为温度控制在60-75℃，溴化钠投加量为顺丁烯二酸质量的1-2.5％，过硫酸铵的投加量为顺丁烯二酸的1.5-3％，反应完后离心获得反丁烯二酸固体。最优选的反应条件为在75℃水浴条件下，先投加顺丁烯二酸质量1.5％的溴化钠，然后投加顺丁烯二酸质量2.6％的过硫酸铵，反应完后离心获得反丁烯二酸固体。

所述方法步骤(2)中，优选的酶促反应条件为在20-40℃搅拌1-6小时，更优选的酶促反应条件为在30-35℃搅拌2-4小时。

所述方法步骤(2)中，CGMCC No.9288菌株接种于pH值为6‐8(优选7.2)的发酵培养基中，在15‐35℃(优选30-32℃)温度下培养12-36小时(优选24小时)，获得具有天冬氨酸酶活性的发酵液。发酵培养基可选择本领域通用的大肠杆菌发酵培养基，例如LB,牛肉膏蛋白胨培养基等，一个优选的发酵培养基组成如下：10g蛋白胨，10g酵母膏，5g葡萄糖，40ml盐溶液(0.25g氯化钙，0.5g氯化镁，1g磷酸氢二钾，1g磷酸二氢钾，10g碳酸氢钠，2g氯化钠，超纯水溶解，定容至1L)，超纯水溶解定容至1L，pH＝7。

将具有天冬氨酸酶活性的发酵液添加到步骤(1)的反应溶液中，优选的加入量为步骤(1)反应溶液体积的0.1‐5倍，优选为0.5‐3倍，更优选为1‐1.5倍。

所述方法步骤(3)中，优选的反应条件将溶液pH调节1.0-6.0,优选调节pH至2.5-3.0之间。静置，待沉淀完全后过滤得到L-天冬氨酸粗产物。调pH时优选在低于室温下进行。所用的调节pH的试剂为通常的无机酸或有机酸，如盐酸、硫酸、磷酸、醋酸、柠檬酸、顺丁烯二酸、羟基甲磺酸、氢溴酸、甲磺酸、醋酸、三氟醋酸、马来酸、苯磺酸、甲苯磺酸、氨基磺酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、扑酸、对氨基苯磺酸、2一乙酸基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙基磺酸等或其混合物，优选盐酸或顺丁烯二酸。

本发明的另一目的是提供一种利用该菌株用于废水回用工艺生产手性天冬氨酸的方法。

前述的利用酶法合成生产L-天冬氨酸工艺，反应不可避免的会产生废液。现有的工程菌株对盐分的耐受程度不佳，反应体系中溴化钠与过硫酸氨的累积会对酶促反应有抑制作用，因此无法将废液回用，造成废液排放量大，污染严重的问题。而本发明选育的能耐受回用废液积累的溴化钠等盐分的大肠杆菌CGMCC No.9288能较好的解决这一难题，可对现有技术工艺进行改良，通过废液回用，补加顺丁烯二酸和催化剂后再进行新一轮生产，则废水排放量将大大减少。

因此，本发明还提供了一种用于废水回用工艺生产手性天冬氨酸的方法，包括如下步骤：

(1)、回收利用酶法合成天冬氨酸产生的废液，补加顺丁烯二酸，以及催化剂溴化钠与过硫酸铵生成反丁烯二酸沉淀，加氨后使沉淀溶解；

(2)、将CGMCC No.9288菌株发酵培养后获得的具有天冬氨酸酶活性的发酵液作为酶源与步骤(1)的溶液混合，经过酶促反应生成L-天冬氨酸；

(3)、用顺丁烯二酸调节pH至酸性，回收目标产物L-天冬氨酸。

该工艺产生的废液可继续采用上述方法步骤进行循环废水回用，直至废水累积的总盐浓度不再适合CGMCC No.9288生长为止。

所述方法步骤(1)中，补加的顺丁烯二酸终浓度至100g/L以上，优选至500-700g/L以上。优选的反应条件为温度控制在50-80℃，溴化钠投加量为顺丁烯二酸质量的0.1-2％，过硫酸铵的投加量为顺丁烯二酸的0.1-2％。更优选的反应条件为温度控制在60-75℃，溴化钠投加量为顺丁烯二酸质量的0.1-0.5％，过硫酸铵的投加量为顺丁烯二酸的0.2-1％，反应完后离心获得反丁烯二酸固体。最优选的反应条件为在75℃水浴条件下，先投加顺丁烯二酸质量0.15％的溴化钠，然后投加顺丁烯二酸质量0.26％的过硫酸铵，反应完后离心获得反丁烯二酸固体。

所述方法步骤(2)中，优选的酶促反应条件为在20-40℃搅拌1-6小时，更优选的酶促反应条件为在30-35℃搅拌2-4小时。CGMCCNo.9288菌株发酵培养的条件如前所述。

所述方法步骤(3)中，优选的反应条件为用顺丁烯二酸调节pH至1.0-6.0，优选调节pH至2.5-3.0之间。溶液静置，待沉淀完全后过滤得到L-天冬氨酸粗产物。调pH时优选在低于室温下进行。

本发明培育获得一株具有高天冬氨酸酶活性的突变株HT-ME(CGMCC No.9288)。大肠杆菌HT-ME对生长条件要求简单，生长迅速，在15-45℃、pH3.0-8.0、盐度0-8％(w/v)范围内均能生长，最佳生长条件大约在35℃、pH6.5、盐度0％左右。HT-ME菌株为天冬氨酸生产工艺改良提供了一个理想的菌种资源，克服了目前天冬氨酸生产工艺中常规工程菌株对盐分的耐受程度不佳、反应体系中溴化钠与过硫酸铵的累积会对酶促反应有抑制作用因此无法将废液回用，造成废液排放量大、污染严重的缺点。HT-ME菌株耐盐范围较为广泛，同时也保持了较好的富马酸-天冬氨酸转化率。利用HT-ME菌株对现有天冬氨酸生产工艺进行废水回用改造，使得发酵废水排放量下降三分之二，减少了污染，降低了生产成本，因而可以产生良好的社会经济效益。

具体实施方式

实施例1利用HT-ME菌株进行小规模发酵生产天冬氨酸

(1)、以680g顺丁烯二酸为原料溶解于1升水中，在6.8g溴化钠与13.6g过硫酸氨的催化作用下生成反丁烯二酸沉淀，离心获得沉淀，加1L22％浓氨水后使沉淀溶解得到反丁烯二酸氨溶液；

(2)、将CGMCC No.9288菌株以PYG培养基(pH7.0)在35℃，溶解氧4ppm，发酵培养24小时后获得的具有天冬氨酸酶活性发酵液作为酶源，与步骤(1)的溶液等量混合，35℃搅拌孵育3小时，经过酶促反应生成L-天冬氨酸；

(3)、在10℃低温条件下用8％盐酸以每分钟0.5pH的调节速率进行调节，直至pH＝2.5，随后静置6小时过滤得天冬氨酸粗产物。反应的转化率为98.6％

实施例2利用HT-ME菌株进行废水回用生产手性天冬氨酸

(1)、以实施例1步骤(1)催化反应的废液和步骤(3)过滤天冬氨酸粗产物后的溶液混合进行废水回用处理，加入顺丁烯二酸至终浓度为700g/L，然后再加入1.3g溴化钠与2.8g过硫酸铵，在其催化作用下生成反丁烯二酸沉淀，离心获得沉淀，加足量浓氨水后使沉淀溶解得到反丁烯二酸氨溶液；

(2)、将CGMCC No.9288菌株以LB培养基(pH7.0)在35℃、溶解氧4ppm条件下发酵培养24小时后获得的具有天冬氨酸酶活性发酵液作为酶源，与步骤(1)的溶液等量混合，35℃搅拌孵育3小时，经过酶促反应生成L-天冬氨酸；

(3)、在室温条件下用顺丁烯二酸固体粉末以每分钟0.5pH的调节速率进行调节，直至pH＝2.5，随后静置6小时过滤得天冬氨酸粗产物。回收天冬氨酸后的废水可以再补加顺丁烯二酸至浓度为700g/L后作为原料反复进行生产，直至HT-ME菌株发酵液的转化率(测定方法如下所述)达不到80％为止。

生产过程中，采用高锰酸钾滴定法测定反丁烯二酸转化率：2ml反应液+30ml10％硫酸溶液煮沸后用0.1mol/L高锰酸钾溶液滴定。转化率＝(反应前溶液滴定消耗的高锰酸钾溶液体积-反应后溶液滴定消耗的高锰酸钾溶液体积)/反应前溶液滴定消耗的高锰酸钾溶液体积。

第一次生产平均转化率为98.3％，第二次循环平均转化率为92.1％，第三次循环平均转化率为85.5％，第四次循环平均转化率为60.2％，由此可得，HT-ME菌株可用于废液连续循环三次的天冬氨酸生产工艺，使转化率保持在85％以上，该工艺三次循环生产排放一次废水，废水排放量约为常规工艺的三分之一。

Claims (10)

1.一种耐盐大肠杆菌突变株，保藏编号为CGMCC No.9288。

2.根据权利要求1所述的耐盐大肠杆菌突变株，其特征在于，所述菌株16S rRNA基因部分片段序列与Seq ID No.1所述一致。

3.一种利用权利要求1所述大肠杆菌突变菌株生产手性天冬氨酸的方法，包括如下的步骤：

(1)、以顺丁烯二酸为原料，在溴化钠与过硫酸铵的催化作用下生成反丁烯二酸沉淀，加氨后使沉淀溶解；

(2)、将CGMCC No.9288菌株发酵培养后获得的具有天冬氨酸酶活性发酵液作为酶源与步骤(1)的溶液混合，经过酶促反应生成L-天冬氨酸；

(3)、调节pH至酸性，回收目标产物L-天冬氨酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法步骤(1)中反应条件为温度控制在50-80℃，溴化钠投加量为顺丁烯二酸质量的0.5-5％，过硫酸铵的投加量为顺丁烯二酸的0.5-5％。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法步骤(2)中，CGMCC No.9288菌株接种于pH值为6‐8的发酵培养基中，在15‐35℃温度下培养12-36小时，获得具有天冬氨酸酶活性的发酵液。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法步骤(3)中，反应条件为将溶液pH调节至1.0-6.0,待沉淀完全后过滤得到L-天冬氨酸粗产物。

7.一种利用权利要求1所述大肠杆菌突变菌株进行废水回用工艺生产手性天冬氨酸的方法，包括如下步骤：

(1)、回收利用酶法合成天冬氨酸产生的废液，补加顺丁烯二酸，以及催化剂溴化钠与过硫酸铵生成反丁烯二酸沉淀，加氨后使沉淀溶解；

(2)、将CGMCC No.9288菌株发酵培养后获得的具有天冬氨酸酶活性的发酵液作为酶源与步骤(1)的溶液混合，经过酶促反应生成L-天冬氨酸；

(3)、用顺丁烯二酸调节pH至酸性，回收目标产物L-天冬氨酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，该工艺产生的废液可继续采用上述方法步骤进行循环废水回用，直至废水累积的盐浓度不再适合CGMCC No.9288生长为止。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法步骤(1)中，补加的顺丁烯二酸终浓度至100g/L以上。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法步骤(3)中，反应条件为用顺丁烯二酸调节pH至1.0-6.0。