CN104109189A - Thr-Pro-Pro-Thr四肽的液相合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种四肽的液相合成方法，具体的，本发明涉及四肽Thr-Pro-Pro-Thr的液相合成方法，该四肽C端苏氨酸的羧基具有酰胺结构，N端为自由氨基。

Description

Thr-Pro-Pro-Thr四肽的液相合成方法
技术领域
本发明涉及一种四肽的液相合成方法，该四肽具有Thr-Pro-Pro-Thr的氨基酸序列，其C端苏氨酸的羧基具有酰胺结构。
背景技术
抑郁症是最常见的神经精神类疾病，严重影响人的身心健康。在我国随着生活节奏的加快，社会压力的增加，抑郁症发病率显著增高。
药物治疗是抑郁症治疗的主要手段。主要治疗药物包括三环类抗抑郁药如丙咪嗪，阿米替林等；选择性5-羟色胺重摄取抑制剂，如氟西汀，舍曲林等；5-羟色胺/去甲肾上腺素重摄取双重抑制剂，如万拉法新，度洛西汀等。但是，常用药物起效慢，一般需要数周到数月时间，且存在效率不高和毒副反应明显等缺点。
GLYX-13是一种新型抗抑郁药物，目前正在进行II期临床研究。它通过调节大脑中的NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受体而起作用，且没有像***一样有严重的和限制级的副作用，例如出现幻觉和精神***症类等。GLYX-13能够发挥强烈、快速、持续的抗抑郁作用，起效时间小于24小时，并且可持续平均7天。作为肽类药物，GLYX-13耐受性好，使用安全。
GLYX-13为一个四肽，具有Thr-Pro-Pro-Thr的序列结构，其N端为自由氨基，C端为酰胺结构。GLYX-13的合成方法包括传统的固相肽合成及液相肽合成方法两种，由于其序列短，固相合成氨基酸用量大，成本高，且不易实现大量制备。液相法氨基酸用量小，收率高，可以大量制备。
发明内容
本发明提供四肽Thr-Pro-Pro-Thr的液相合成方法，该方法由两个二肽片段缩合而成，相比逐个延长肽链的方法可提高反应收率，使用水作为肽键缩合反应后处理溶剂，避免大量使用有机溶剂，中间体不需柱层析纯化，具有低成本及环保的特点。
本发明提供的四肽Thr-Pro-Pro-Thr的液相合成方法，包括以下步骤：
1)苏氨酸羧基酰胺结构H-Pro-NH2的合成：氨基叔丁氧羰基(Boc)/侧链羟基叔丁醚保护或氨基9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的苏氨酸在-15℃条件下，与氯甲酸异丁酯和N-甲基***啉作用，形成混合酸酐，再与氨水反应，生成羧基酰胺化的保护苏氨酸。然后用盐酸/有机溶剂或三氟乙酸(TFA)脱除Boc保护基，或者用哌啶/N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除Fmoc保护基。
2)H-Pro-Thr-NH2二肽片段的合成：Boc或Fmoc保护的脯氨酸在-15℃条件下，与氯甲酸异丁酯和N-甲基***啉作用，形成混合酸酐，再与上步制备的羧基酰胺化的苏氨酸缩合反应，生成保护的二肽。然后用盐酸/有机溶剂或三氟乙酸(TFA)脱除保护基，或者用哌啶/N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除Fmoc保护基。将反应液倒入纯水中，通过弱碱或弱酸来调节溶液的PH值，使脱除保护基后的二肽从水中析出，过滤，洗涤，真空干燥，得到氨基  自由的二肽片段H-Pro-Thr-NH2。
3)Boc-Thr(tBu  )-Pro-OH二肽片段的合成：氨基Boc或Fmoc保护，侧链羟基叔丁醚保护或侧链无保护的脯氨酸在-15  ℃条件下，与氯甲酸异丁酯和N-甲基***啉作用，形成混合酸酐，再与羧基甲酯保护的脯氨酸H-Pro-OMe反应，生成保护的二肽。然后用NaOH皂化反应脱除甲酯保护基。将反应液倒入纯水中，加酸调节溶液的PH值，使羧基自由的二肽从水中析出，过滤，洗涤，真空干燥，得到保护的二肽片段Boc-Thr(tBu)-Pro-OH。
4)四肽H-Thr-Pro-Pro-Thr-NH2的合成：保护的二肽片段Boc-Thr(tBu)-Pro-OH在-15  ℃条件下，与氯甲酸异丁酯和N-甲基***啉作用，形成混合酸酐，再与氨基自由的二肽片段H-Pro-Thr-NH2缩合，生成保护的四肽。然后用盐酸/有机溶剂或三氟乙酸(TFA)脱除保护基。将反应液倒入纯水中，通过弱碱或弱酸来调节溶液的PH值，使脱除保护基后的四肽从水中析出，过滤，洗涤，真空干燥，得到目标化合物四肽H-Thr-Pro-Pro-Thr-NH2。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述。
实施例1四肽H-Thr-Pro-Pro-Thr-NH2制备
1.1苏氨酸羧基的酰胺化(H-Thr-NH2)
500ml三口瓶中加入Boc-Thr(tBu)-OH20g(0.073mol)，无水四氢呋喃(THF)150ml，搅拌使固体溶解。冰盐浴降温到-10  ℃～-15℃，加入N-甲基***啉8ml，然后滴加氯甲酸异丁酯10ml，保持温度不高于-10  ℃，滴加完毕后保持低温反应10min，然后加入氨水20ml，冰浴反应30min，然后室温反应8h。停止反应，加水300ml，加乙酸乙酯200ml提取析出物，水洗3遍。无水硫酸钠干燥6h。过滤，然后减压蒸除溶剂，得白色固体16.6g，产率83％。
将上述产物溶于50ml三氟乙酸或2N盐酸/乙酸乙酯溶液，室温反应1h，蒸除溶剂后得白色固体，即羧基酰胺化的苏氨酸三氟乙酸/盐酸盐H-Thr-NH2.HCl。
1.2脯氨酸-苏氨酸二肽片段H-Pro-Thr-NH2的制备
500ml三口瓶中加入Boc-Pro-OH20g(0.093mol)，无水四氢呋喃(TH    F)200ml，搅拌使固体溶解，冰盐浴降温到-10℃～-15  ℃，加入N-甲基***啉11ml，然后滴加氯甲酸异丁酯13ml，保持温度不高于-10  ℃，滴加完毕后保持低温反应10min。H-Thr-NH2.HCl14.5g溶于50ml四氢呋喃中，加入N-甲基***啉11ml。将上述溶液加入到反应液中，低温反应30min，然后室温反应8h。停止反应，加水300ml，加乙酸乙酯200ml提取析出物，水洗3遍。无水硫酸钠干燥6h。过滤，然后减压蒸除溶剂，得白色固体25.7g，产率82％。
将上述产物溶于100ml三氟乙酸或2N盐酸/乙酸乙酯溶液，室温反应1h，蒸除溶剂后得白色固体，即脯氨酸-苏氨酸二肽盐酸盐H-Pro-Thr-NH2.HCl。
将上述产物溶于100ml纯水中，加入碳酸钠溶液调节PH值，析出白色固体，过滤，真空干燥，得目标产物脯氨酸-苏氨酸二肽片段H-Pro-Thr-NH223g。
1.3保护的苏氨酸-脯氨酸二肽片段Boc-Thr(tBu)-Pro-OH的制备
Boc-Thr(tBu)-OH20g(0.073mol)溶于无水四氢呋喃(THF)150ml，搅拌使固体溶解。冰盐浴降温到-10  G～-15  ℃，加入N-甲基***啉8ml，然后滴加氯甲酸异丁酯10ml，保持温度不高于-10  ℃，滴加完毕后保持低温反应10min。脯氨酸甲酯盐酸盐H-Pro-OMe.HCl12g溶于30ml四氢呋喃中，加入N-甲基***啉8ml。将上述混合溶液加入到反应液中，冰浴反应30min，然后室温反应8h。停止反应，加水300ml，加乙酸乙酯200ml提取析出物，水洗3遍。无水硫酸钠干燥6h。过滤，减压蒸除溶剂，得白色固体24.9g，产率81％。
上述产物溶于30ml N，N-二  甲基甲酰胺(DMF)溶液中，加人2N NaOH水溶液，室温搅拌反应1h，加水200ml，用5％柠檬酸调节PH值到3，加乙酸乙酯200ml提取析出物，有机相水洗3遍。无水硫酸钠干燥6h。过滤，减压蒸除溶剂，得白色固体Boc-Thr(tBu)-Pro-OH23.8g，收率84％。
1.4四肽H-Thr-Pro-Pro-Thr-NH2的制备
Boc-Thr(tBu)-Pro-OH20g(0.054mol)溶于无水四氢呋喃(THF)150ml，搅拌使固体溶解。冰盐浴降温到-10  ℃～-15  ℃，加入N-甲基***啉6ml，然后滴加氯甲酸异丁酯7ml，保持温度不高于-10  ℃，滴加完毕后保持低温反应10min。脯氨酸-苏氨酸二肽盐酸盐H-Pro-Thr-NH2.HCl13.6g溶于50ml四氢呋喃中，加入N-甲基***啉6ml。将上述混合溶液加入到反应液中，冰浴反应30min，然后室温反应8h。停止反应，加水300ml，加乙酸乙酯200ml提取析出物，水洗3遍。无水硫酸钠干燥6h。过滤，减压蒸除溶剂，得白色固体25.4g，产率82％。
将上述产物溶于150ml三氟乙酸或2N盐酸/乙酸乙酯溶液，室温反应1h，蒸除溶剂后得白色固体，即目标化合物羧基酰胺化的四肽盐酸盐H-Thr-Pro-Pro-Thr-NH2.HCl。
上述化合物H-Thr-Pro-Pro-Thr-NH2.HCl20g溶于100ml甲醇中，加入5％碳酸氢钠溶液100ml，水300ml，过滤析出物，水洗至PH中性，真空干燥。得白色固体15.8g，即目标化合物羧基酰胺化的四肽H-Thr-Pro-Pro-Thr-NH2。

Claims (2)

1.四肽H-Thr-Pro-Pro-Thr-NH2的液相合成方法，该方法由两个二    肽片段缩合而成，使用水作为缩合反应后处理溶剂，中间体不需柱层析纯化。
2.权利要求1所述的四肽H-Thr-Pro-Pro-Thr-NH2的液相合成方法，包括以下步骤：
1)苏氨酸羧基酰胺结构H-Thr-NH2的合成：氨基叔丁氧羰基(Boc)或9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的苏氨酸在-15℃条件下，与氯甲酸异丁酯及N-甲基***啉作用，形成混合酸酐，再与氨水反应，生成羧基酰胺化的保护苏氨酸。然后用盐酸/有机溶剂或三氟乙酸(TFA)脱除Boc保护基，或者用哌啶/N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除Fmoc保护基。
5)二肽片段H-Pro-Thr-NH2的合成：Boc或Fmoc保护的脯氨酸在-15℃条件下，与氯甲酸异丁酯及N-甲基***啉作用，形成混合酸酐，再与上步制备的羧基酰胺化的苏氨酸缩合反应，生成氨基保护的二肽。将反应液倒入纯水中，滤出析出物，干燥。然后用盐酸/有机溶剂或三氟乙酸(TFA)脱除Boc保护基，或者用哌啶/N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除Fmoc保护基。将反应液倒入纯水中，通过弱碱或弱酸来调节溶液的PH值，使脱除保护基后的二肽从水中析出，过滤，洗涤，真空干燥，得到氨基自由的二肽片段H-Pro-Thr-NH2。
2)Boc-Thr(tBu)-Pro-OH二肽片段的合成：氨基Boc保护，侧链羟基叔丁醚保护或侧链无保护的脯氨酸在-15℃条件下，与氯甲酸异丁酯及N-甲基***啉作用，形成混合酸酐，再与羧基甲酯保护的脯氨酸H-Pro-OMe反应，生成保护的二肽。然后用NaOH皂化反应脱除甲酯保护基。将反应液倒入纯水中，加酸调节溶液的PH值，使羧基自由的二肽从水中析出，过滤，洗涤，真空干燥，得到保护的二肽片段Boc-Thr(tBu)-Pro-OH。
3)四肽H-Thr-Pro-Pro-Thr-NH      2的合成：保护的二肽片段Boc-Thr(tBu)-Pro-OH在-15  ℃条件下，与氯甲酸异丁酯及N-甲基***啉作用，形成混合酸酐，再与氨基自由的二肽片段H-Pro-Thr-NH2缩合，生成保护的四肽。然后用盐酸/有机溶剂或三氟乙酸(TFA)一次性脱除保护基。将反应液倒入纯水中，通过弱碱来调节溶液的PH值，使脱除保护基后的四肽从水中析出，过滤，洗涤，真空干燥，得到目标化合物四肽H-Thr-Pro-Pro-Thr-NH2。
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