CN104109160B - 吡咯并n杂环类化合物及其制备方法和医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及吡咯并N杂环类化合物及其制备方法和医药用途，具体地，涉及一种式(I)所示吡咯并N杂环类化合物或其盐、其制备方法及其含有它们的药物组合物和它们作为治疗剂特别是作为蛋白激酶抑制剂的用途。

Description

吡咯并N杂环类化合物及其制备方法和医药用途

技术领域

本发明涉及一种新的吡咯并N杂环类化合物，其制备方法及含有其的药物组合物和其作为治疗剂特别是作为蛋白激酶抑制剂的用途。

背景技术

细胞的信号传导是一种基础的作用机制，在信号传导过程中，来自细胞外的刺激被传递到细胞内部，进而调节不同细胞的进程。这些信号可调节多种生理响应，包括细胞增殖、分化、凋亡和运动等，它们以不同种类溶解因子形式存在，包括以旁分泌因子、自分泌因子和内分泌因子为主的生长因子。通过与特定跨膜受体结合，生长因子配体将细胞外信号传递到细胞内信号途径，从而引起个体细胞对细胞外信号的反应。很多信号传递过程是利用蛋白磷酸化的可逆过程，涉及到特定蛋白激酶和磷酰化酶。

蛋白激酶(PKs)是对蛋白质的酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸残基上的羟基的磷酸化起催化作用的酶。在信号传导过程中，蛋白激酶和磷酰化酶的反向机制能够平衡和调节信号流。一个蛋白质磷酸化状态能影响其构象、酶的活性、细胞定位，蛋白激酶和磷酸酶的相应作用被修改，磷酰化在信号传导中是一个重要的调节机制，在信号传导过程中的异常会导致细胞的非正常分化、转化和生长。例如，细胞可通过将其一部分DNA转化为致癌基因而成为癌细胞，酪氨酸激酶就是这样的致癌基因所编码的生长因子受体蛋白；酪氨酸激酶还可以突变为活化形式而导致多种人类细胞的变异，也可以说，过度表达的正常酪氨酸激酶可以引起不正常细胞增殖。

酪氨酸激酶(PKs)通常可以分成两类：蛋白酪氨酸激酶(PTKs)和丝氨酸－苏氨酸激酶(STKs)。PTKs使蛋白质上的酪氨酸残基磷酸化，STKs使蛋白质上的丝氨酸、苏氨酸残基磷酸化。酪氨酸激酶不仅可以是受体型(包括细胞外域、细胞内域和跨膜细胞域)还可以是非受体型(包括全部细胞内域)。PTK活性的一个主要方面是它们涉及到作为细胞表面蛋白生长因子受体。具有PTK活性的生长因子受体被称为受体酪氨酸激酶(“RTKs”)，在人类基因中90种酪氨酸激酶被识别，其中约60种是受体型，约30种是非受体型，这些生长因子受体家族可进一步分为20种受体酪氨酸激酶亚族和10种非受体酪氨酸激酶亚族(Robinson等,Oncogene,2000,19,5548-5557)。

RTKs亚族包括以下几种：(1)EGF族，如EGF,TGFα,Neu和erbB等；(2)胰岛素家族，包括胰岛素受体、***I受体(IGF1)和胰岛素受体相关性受体(IRR))；(3)III型家族，如血小板衍生生长因子受体(PDGF，包括PDGFα和PDGFβ受体)、干细胞因子RTKs(SCFRTK，通常称作c-Kit)、fms-相关酪氨酸激酶3(Flt3)受体酪氨酸激酶和集落刺激因子1受体(CSF-1R)酪氨酸激酶等。它们在控制细胞生长及分化方面起着关键的作用，也是导致产生生长因子和细胞因子的细胞信号的关键传递者(参见Schlessinger and Ullrich,Neuron1992,9,383)。一部分非限制性激酶包括Abl,ARaf,ATK,ATM,bcr-abl,Blk,BRaf,Brk,Btk,CDK1,CDK2,CDK3,CDK4,CDK5,CDK6,CDK7,CDK8,CDK9,CHK,AuroraA,AuroraB,AuroraC,cfms,c-fms,c-Kit,c-Met,cRaf1,CSF1R,CSK,c-Src,EGFR,ErbB2,ErbB3,ErbB4,ERK,ERK1,ERK2,Fak,fes,FGFR1,FGFR2,FGFR3,FGFR4,FGFR5,Fgr,FLK-4,Fps,Frk,Fyn,GSK,gsk3a,gsk3b,Hck,Chk,Axl,Pim-1,Plh-1,IGF-lR,IKK,IKK1,IKK2,IKK3,INS-R,Integrin-linked kinase,Jak,JAK1,JAK2,JAK3,JNK,JNK,Lck,Lyn,MEK,MEK1,MEK2,p38,PDGFR,PIK,PKB1,PKB2,PKB3,PKC,PKCa,PKCb,PKCd,PKCe,PKCg,PKC1,PKCm,PKCz,PLK1,Polo-like kinase,PYK2,tie1,tie2,TrkA,TrkB,TrkC,UL13,UL97,VEGF-R1,VEGF-R2,Yes和Zap70等。人们认为PKs与中枢神经***疾病如老年痴呆症(参见Mandelkow,E.M.等.FEBSLett.1992,314,315;Sengupta,A.等.Mol.Cell.Biochem.1997,167,99)、痛感(参见Yashpal,K.J.Neurosci.1995,15,3263-72)、炎症例如关节炎(参见Badger,J.PharmnExp.Ther.1996,279,1453)、牛皮癣(参见Dvir,等,J.Cell Biol.1991,113,857)、骨骼疾病例如骨质疏松(参见Tanaka等,Nature,1996,383,528)、癌症(参见Hunter and Pines,Cell1994,79,573)、动脉硬化症(参见Hajjar and Pomerantz,FASEB J.1992,6,2933)、血栓症(参见Salari,FEBS1990,263,104)、代谢紊乱如糖尿病(参见Borthwick,A.C.等.Biochem.Biophys.Res.Commun.1995,210,738)、血管增生性疾病如血管生成(参见Strawn等Cancer Res.1996,56,3540;Jackson等J.Pharm.Exp.Ther.1998,284,687)、自身免疫疾病和移植排斥反应(参见Bolen and Brugge,Ann.Rev.Immunol.1997,15,371)、传染病如病毒(参见Littler,E.Nature1992,358,160)和真菌感染(参见Lum,R.T.PCT Int Appl.,WO9805335A1980212)等疾病的靶点有密切的联系。

PTKs信号传导过程中，特定生长因子(配体)之间在细胞外相互作用，随后受体二聚，瞬间内激活蛋白激酶的内在活性，并进行磷酰化。内部信号传导分子的结合位点产生，生成了与细胞质信号分子的复合物，促进各种细胞应答例如细胞***(增殖)，对胞外微环境代谢作用的表达等。

受体酪氨酸激酶磷酰化的结合位点也是与信号传导分子SH2(与src同源)域具有高度亲和力的结合位点。很多与受体酪氨酸激酶相关的细胞内底物蛋白已被确定，可分为两类：(1)有催化区底物(2)无催化区底物，但可作为结合体，且与某些有催化活性的分子相关。受体或蛋白与底物SH2域相互作用的特异性是通过靠近磷酰化酪氨酸残基的氨基酸序列来确定的，SH2域与磷酰化酪氨酸序列周围的氨基酸序列与特定受体结合的差异性与底物磷酰化的差异性是一致的。蛋白酪氨酸激酶机能可通过表达模式和配体可用性来确定，也可由特定受体激活的下游区信号传导路径来确定。因此，磷酰化提供了一个重要可调节的步骤，此步骤可确定由特定受体激活的信号传导的选择性和分化因子受体。受体酪氨酸激酶的非正常表达或突变可能导致不可控制的细胞增殖(如恶性肿瘤生长)或关键发展过程的缺失等。

酪氨酸激酶，在大部分人类肿瘤，如白血病、乳腺癌、***癌、非小细胞肺癌(包括腺癌、肺鳞状上皮细胞癌)、胃肠癌(包括结肠癌、直肠癌和胃癌)、膀胱癌、食管癌、卵巢癌、胰腺癌等癌症中，都会出现突变或过度表达。通过对人类肿瘤细胞进行检测，酪氨酸激酶广泛性与关联性进一步得到了确认。例如：在人类癌症包括肺癌、脑癌、颈癌、胃肠癌、乳腺癌、食管癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌和甲状腺癌中，EGFR酪氨酸激酶会发生突变和过度表达。

“HER”或“Erb”受体酪氨酸激酶亚族包括EGFR、HER2、HER3和HER4。这些亚族由胞外糖基化配体结合域、跨膜域及可将蛋白质上的酪氨酸序列进行磷酰化的胞内细胞质催化域所组成。受体酪氨酸激酶催化活性可通过受体过度表达或配体介导二聚合被激活。HER2家族聚合体有同型二聚体和异型二聚体两种形式。同型二聚化的一个例子是HER1(EGFR)与EGF家族配体(包括EGF，转化生长因子α，betacellulin,与肝磷脂结合的EGF，epiregulin)的聚合，四种HER酪氨酸激酶之间的异型二聚合可通过与heregulin(也称neuregulin)家族配体的结合被加速。虽然HER3的受体之一没有酶活性，但HER2与HER3，或HER3与HER4的异型二聚也可显著地刺激酪氨酸激酶受体二聚合。在各种类型细胞中，受体过度表达可激活HER2激酶的活性。受体同型二聚体和异型二聚体的激活可将受体和其他细胞内蛋白质酪氨酸序列进行磷酰化，随后细胞内信号途径如微管相关蛋白激酶(MAP激酶)和磷脂酰肌醇(-3)激酶(PI3激酶)也被激活，这些信号途径的激活促使细胞增殖，抑制细胞调亡。

RTK另一个亚族包括胰岛素受体(IR)，***-1受体(IGF-1R)，胰岛素受体相关受体(IRR)。IR，IGF-1R与胰岛素，IGF-I和IGF-Ⅱ相互作用，生成了由两种完全胞外糖基化α亚基和两个穿过细胞膜且含有酪氨酸激酶域β亚基构成的异四聚体。

RTK第三个亚族是指血小板源生长因子受体(PDGFR)族，其中包括PDGFRα、PDGFRβ、CSFIR、c-Kit和c-fms。这些受体由含有各种免疫球蛋白样环糖基化胞外域和一个胞外域所组成，其中胞内域中酪氨酸激酶区被不相关的氨基酸序列阻断。

血小板源生长因子受体，如PDGFRα和PDGFRβ等也是跨膜酪氨酸激酶受体。当它们与配体相结合时，或形成同型二聚物(PDGF-AA,PDGF-BB)，或异型二聚物(PDGF-AB)。随后受体二聚，酪氨酸激酶被活化，向下游区发信号来促进肿瘤生长。基因突变是受体不依赖于与配体结合而被激活的原因，也是肿瘤生成的驱动力。在多种不同的肿瘤细胞株内，特别是***癌、结肠癌、卵巢癌、前列酰癌、肉瘤和胶质瘤的细胞中，都发现能够激活PDGFR生长因子－PDGF的表达，其中脑瘤，***癌(包括腺癌和骨转移癌)恶性神经胶质过多症研究数据有研究价值。

c-Kit是PDGF受体家族的成员，当其与配体SCF(干细胞因子)相结合时，活性被激活。在各种不同的实体瘤中对c-Kit表达模式进行了研究，在肉瘤，胃肠道胶质瘤(GIST)，***瘤和类癌瘤中，c-Kit有过量表达（参见Weber等,J.Clin.Oncol.22(14S),9642(2004)）。GIST是一种非上皮细胞瘤，大多数存在于胃部，少数分布于小肠，在食道中存在很少，也有分布在肝、腹膜腔等部位。GIST源于Cajal***(ICC)，ICC可部分形成肠自主神经***，参与控制胃动力。大多数(50～80%)GIST产生是由于c-Kit基因发生突变，在消化道内，c-Kit/CD117染色阳性的一般都为GIST，c-Kit突变能够使其不依赖于SCF激活便具有c-Kit机能，从而使细胞***率增加，导致基因组的不稳定。在畸变肥大细胞瘤、肥大细胞增生病、骨髓增生综合征、荨麻疹等疾病中，也可检测到c-Kit的表达，在急性AML和恶性淋巴瘤中也有c-Kit的表达，在小细胞支气管癌、***瘤、无性细胞瘤、睾丸、上皮内瘤样变、黑素瘤、***癌、成神经细胞瘤、尤因肉瘤都有c-Kit表达(参见Schǔtte et al.,innovartis3/2001)。众所周知，RET(rearranged during transfection)。原癌基因点遗传突变是致瘤的，患有多发性内分泌腺瘤病2(MEN2)病人可能会导致患有嗜铬细胞瘤、甲状腺髓样癌和甲状旁腺腺瘤和增生等病症(见Huang et al.,Cancer Res.60,6223-6(2000))。

因胎肝激酶(Flk)受体亚族与PDGFR亚族很相似，有时被归于该族。此亚族由含激酶***域-受体胎肝激酶-1(KDR/FLK-1,VEGFR2)、Flk-1R,Flk-4和fms样酪氨酸激酶1(Flt-1)所组成。

酪氨酸激酶生长因子受体家族的另外一个成员是成纤维细胞生长因子(FGF)受体亚族。此亚族由四个受体，FGFR1-4、七个配体和FGF1-7组成。虽然目前尚未确定，但这些受体是由包含各种免疫球蛋白样环糖基化的一个胞外域和一个其中酪氨酸激酶序列被不相关的氨基酸序列所阻断的细胞内域组成。

酪氨酸激酶生长因子受体家族的另外一个成员是血管内皮生长因子(VEGF)受体亚族。与PDGF相似，VEGF是二聚糖蛋白，但生物学功能和体内靶细胞特异性不同。特别是，VEGFR与血管生成有关，通过抑制VEGFRs来抑制血管生成，正应用于临床***，且取得了较好疗效。VEGF在各种恶性实体肿瘤中，如肺癌、乳腺癌、非霍奇金恶性淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、恶性胸膜间皮瘤和黑素瘤有强烈表达，且与癌变进程相关，在白血球过多症和淋巴瘤中也有表达。除了其血管生成活性，VEGFR,VEGF配体也可以通过在肿瘤细胞内直接通过pro-survival性质促进肿瘤生长，PDGF也具有血管生成作用。新生血管生成的过程对于肿瘤持续生长起着关键作用，正常情况下，新生血管的生成在人的生理过程如胚胎生长、伤口愈合和女性生殖的各个过程都是非常重要的。然而，非预料或者病理学上的血管生成却与疾病的一系列状态相关，如糖尿病视网膜病、牛皮癣、癌症、类风湿性关节炎、动脉粥样化、卡波济(氏)肉瘤和血管瘤等。血管内皮细胞的生成激活血管生成，具有刺激体内血管内皮细胞中的的生成活性一些多肽已经被确认，包括酸性、碱性的成纤维细胞生长因子(aFGFand bFGF)和血管内皮生长因子。由于VEGF受体的限制表达，其生长因子的活性与aFGF andbFGF活性相比，对内皮细胞相对来讲具有特异性。最近的证据表明，VEGF在正常情况和病理学情况下的血管生成和血管渗透过程中，都是非常重要的刺激剂。VEGF能够诱导血管萌芽表型，它诱导内皮细胞增殖、蛋白酶的表达和迁移来促进毛细血管生成，从而形成超渗透、不成熟的血管网络，这是典型的病理学血管生成的典型特征。人们期望拮抗VEGF活性在治疗与血管生成作用或者血管渗透性相关的疾病如肿瘤特别是抑制肿瘤生长能够有应用的价值。

FLT3(Fms样酪氨酸激酶)是酪氨酸激酶(PTK)Ill型家族成员，在成人和幼儿急性髓细胞样白血病(AML)、急性髓细胞样白血病、骨髓增生异常综合征等白血球过多症中，FLT3基因非正常表达。35％的急性髓细胞样白血病病人的FLT3突变被激活且预后不良，大多数的突变都有在近膜域的结构内复制的现象，5－10％的病人天冬酰氨835发生点突变，FLT3的酪氨酸激酶活性被激活，致使在配体缺失的情况下也有信号存在且发生增殖。据研究，有突变形式受体表达的患者治愈的几率降低。总之，在人白血球过多症和骨髓增生异常综合征中，FLT3突变都与肿瘤的发生相关。

经证实肝细胞生长因子(HGF)受体(c-MET或HGFR)酪氨酸激酶与肿瘤生成、增强细胞运动性、侵袭和转移密切相关(参见Ma,P.C等(2003b).Cancer Metastasis Rev,22,309-25;Maulik,G.等(2002b).Cytokine Growth Factor Rev,13,41-59)。各种肿瘤包括小细胞肺癌(SCLC)中的过度表达或突变可激活c-MET(HGFR)(参见Ma,P.C.等(2003a).CancerRes,63,6272-6281)。

原癌基因c-Met编码肝细胞生长因子受体,是具有酪氨酸激酶活性的细胞膜糖蛋白,对多种细胞增殖、分化具有重要的生理调节作用.c-met基因在许多恶性肿瘤中过表达,是甲状腺滤泡上皮细胞癌变的重要因素,并与甲状腺癌的病理分期、侵袭及转移密切相关。

关于PKT亚族，Plowman等在DN&P7(6):334-339(1994)中有更为详细描述，该文献作为一整体通过引用结合到本文中。

除了PTKs以外，还存在另外的细胞酶家族，称作受体酪氨酸激酶抑制剂，并在此使用后一名称，缩写为“CTK”。CTKs本身缺少细胞外域和跨膜域。目前，已经在11个亚族(Src,Frk,Btk,Csk,Abl,Zap70,Fes/Fps,Fak,Jak,Ack和LIMK)中已经鉴定超过24种CTKs。在目前为止，Src亚族CTKs数目似乎最多，包括Src、Yes、Fyn、Lyn、Lck、Blk、Hck、Fgr和Yrk，且Src亚族酶与肿瘤生成有关。关于CTKs更为详尽的描述，可参见iBolen,1993,Oncogen8:2025-2031，其全文包括任何附图作为一整体提出，通过引用结合到本文中。

与CTKs相类似，丝氨酸-苏氨酸激酶或STKs，在细胞内占据主导地位，虽然仅有几种STK型受体激酶。STKs是最普遍的细胞溶质激酶，即它发挥其功能在部分细胞质中，而不是在胞质细胞器中。胞质溶胶是细胞内一个区域，在此大多数细胞中间代谢和生物合成活性发生；如蛋白质是在胞质溶胶核糖体上进行合成的。

与过度增殖相关疾病如癌症等的特征之一是对细胞传导途径进行破坏，细胞传导途径通过细胞周期来控制进程。在真核细胞中，细胞周期与蛋白质的磷酰化有序的级联反应密切相关，在信号传导的机制中，PKs很多家族似乎在细胞***周期级联中都起着关键的作用。

关于癌症，提出两个主要的假设解释过度细胞增殖，该增殖驱动与已知由PK调节的功能相关的肿瘤发展。即，人们觉得恶性肿瘤生长是由于控制细胞***或增殖的机制被破坏引起的。原癌基因蛋白质产物能够干扰调节细胞生长和增殖的信号传导途径，这些原癌基因的蛋白质产物包括上面讨论的细胞外生长因子，跨膜生长因子PTK受体(RTKs)，细胞质PTKs(CTKs)和细胞溶质STKs。

人们期待着能够合成具有抗肿瘤细胞增殖活性的抑制剂，希望能够抑制PTKs、CTKs或者STKs中的一种或者多种，有效地治疗和改善由PTKs、CTKs或者STKs以及血管生成作用介导的超增殖生理紊乱。

发明内容

本发明的目的在于提供一种式(I)所示的吡咯并N杂环类化合物或其药学上可以接受的盐：

其中：

R₁选自芳基或芳烷基，其中所述芳基或芳烷基任选地被一个或多个卤素原子所取代；优选苯基或苯甲基，其中所述苯基或苯甲基任选地被一个卤素原子所取代。

R₂选自烷基、三氟甲基、芳基或芳烷基，其中所述烷基、芳基或芳烷基任选地被一个或多个卤素原子所取代；优选三氟甲基、乙基或苯基，其中所述三氟甲基、乙基或苯基任选地被一个卤素原子所取代。

R₃选自4～8元含氮杂环基；优选含一个N的4～8元环。

作为优选的技术方案，本发明所提供的吡咯并N杂环类化合物或其药学上可接受的盐包括化合物1～5：

化合物1

化合物2

化合物3

化合物4

化合物5

本发明所述的药学上可接受的盐本发明化合物与选自以下的酸形成的盐：苹果酸、乳酸、马来酸、盐酸、甲磺酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、酒石酸、乙酸或三氟乙酸。

本发明的另一个目的是提供一种含有本发明化合物的药物组合物，其还含有药学上可接受的载体。

本发明的另一个目的是提供本发明化合物的制备方法，其包括如下步骤：

第一步，

第二步，

第三步：

第四步：

其中，

R₁选自芳基或芳烷基，其中所述芳基或芳烷基任选地被一个或多个卤素原子所取代；优选苯基或苯甲基，其中所述苯基或苯甲基任选地被一个卤素原子所取代。

R₂选自烷基、三氟甲基、芳基或芳烷基，其中所述烷基、芳基或芳烷基任选地被一个或多个卤素原子所取代；优选三氟甲基、乙基或苯基，其中所述三氟甲基、乙基或苯基任选地被一个卤素原子所取代。

R₃选自4～8元含氮杂环基；优选含一个N的4～8元环。

本发明的另一个目的在于提供本发明的化合物或组合物在制备治疗与蛋白激酶有关的疾病的药物中的用途，优选地，所述的与蛋白激酶有关的疾病是指白血病、糖尿病、自身免疫病、过度增生病、牛皮癣、骨关节炎、类风湿性关节炎、血管生成、心血管病、多发性成血管细胞瘤、炎症或纤维变性病。

本发明的化合物生物活性高，高效低毒，适合开发成治疗与蛋白激酶有关的疾病的药物。

具体实施方式

实施例1化合物1的制备

化合物1

步骤1：

将起始化合物(8g)和2-***啉-4-基-乙胺(15.00g)于40℃水浴中搅拌至溶解，保温搅拌3小时，TLC表明原料反应完全，停止反应。向反应液中加入100ml乙酸乙酯和100ml饱和氯化钠，搅拌5分钟后分层萃取。合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤(100ml×4)，无水硫酸镁干燥，抽滤除去干燥剂，滤液浓缩后柱层析得到目标化合物(5.60g)。

MS m/z(ESI)：561.65(M+1)。

步骤2：

冰浴下，将起始化合物(5.6g)搅拌下溶解于50ml丙酮中，缓慢加入三甲基铝的丙酮溶液(6.2ml，3mol/L，8.9mmol)，油浴45℃保温反应5小时。TLC表明原料反应完全，撤去油浴，向反应液中加入少量水淬灭反应。反应液用稀氢氧化钠(1mol/L)调节pH至7～9左右，加入50ml饱和氯化钠，用乙酸乙酯萃取(50ml×3)。合并有机相，用硅藻土抽滤，滤液减压浓缩得到目标化合物(4.8g)。

MS m/z(ESI)：500.25(M+1)。

步骤3：

氩气氛下，将起始化合物(4.8g)搅拌下溶解于三氟醋酸中，水浴45℃保温搅拌5分钟，加入甲酸三乙酯(6.8ml，2.5mol)，撤去水浴，反应液温度自然升至室温，继续搅拌约1小时。TLC表明原料反应完全，向反应体系中加入少量水淬灭反应。反应液用稀氢氧化钠(1mol/L)调节pH至7左右，用二氯甲烷萃取(50ml×3)，合并有机相，减压浓缩得到红色固体。固体柱层析得到目标化合物(4.1g)。

MS m/z(ESI)：428.44(M+1)。

步骤4：

室温下，将起始化合物(4.1g)和1-（4-氯基苯基）-3-氢-吲哚-2-酮(3.0g)搅拌下溶解于10ml乙醇中。加入六氢吡啶(10ml，1.0mol)，水浴30℃保温回流1小时。反应体系中有大量固体析出，撤去水浴，反应体系温度自然冷却至室温，抽滤，得到目标化合物(3.6g)。

MS m/z(ESI)：654.11(M+1)。

实施例2化合物2的制备

化合物2

步骤1：

将起始化合物(8g)和2-***啉-4-基-乙胺(17.00g)于40℃水浴中搅拌至溶解，保温搅拌2小时，TLC表明原料反应完全，停止反应。向反应液中加入100ml乙酸乙酯和100ml饱和氯化钠，搅拌7分钟后分层萃取。合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤(100ml×5)，无水硫酸镁干燥，抽滤除去干燥剂，滤液浓缩后柱层析得到目标化合物(6.60g)。

MS m/z(ESI)：520.68(M+1)。

步骤2：

冰浴下，将起始化合物(6.60g)搅拌下溶解于50ml丙酮中，缓慢加入三甲基铝的丙酮溶液(7.0ml，3mol/L，8.9mmol)，油浴45℃保温反应4小时。TLC表明原料反应完全，撤去油浴，向反应液中加入少量水淬灭反应。反应液用稀氢氧化钠(1mol/L)调节pH至5～6，加入70ml饱和碳酸氢钠，用乙酸乙酯萃取(50ml×3)。合并有机相，用硅藻土抽滤，滤液减压浓缩得到目标化合物(5.8g)。

MS m/z(ESI)：474.61(M+1)。

步骤3：

氩气氛下，将起始化合物(5.8g)搅拌下溶解于三氟醋酸中，水浴40℃保温搅拌5分钟，加入甲酸三乙酯(8.0ml，3.5mol)，撤去水浴，反应液温度自然升至室温，继续搅拌约1小时。TLC表明原料反应完全，向反应体系中加入少量水淬灭反应。反应液用稀氢氧化钠(1mol/L)调节pH至7左右，用二氯甲烷萃取(50ml×3)，合并有机相，减压浓缩得到红色固体。固体柱层析得到目标化合物(4.8g)。

MS m/z(ESI)：402.50(M+1)。

步骤4：

室温下，将起始化合物(4.8g)和1-（4-氟基苯基）-3-氢-吲哚-2-酮(3.8g)搅拌下溶解于20ml乙醇中。加入六氢吡啶(10ml，1.0mol)，水浴40℃保温回流2小时。反应体系中有大量固体析出，撤去水浴，反应体系温度自然冷却至室温，抽滤，得到目标化合物(4.1g)。

MS m/z(ESI)：611.72(M+1)。

实施例3化合物3的制备

化合物3

步骤1：

将起始化合物(8g)和2-***啉-4-基-乙胺(18.00g)于50℃油浴中搅拌至溶解，保温搅拌2小时，TLC表明原料反应完全，停止反应。向反应液中加入100ml乙酸乙酯和100ml饱和氯化钠，搅拌5分钟后分层萃取。合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤(100ml×3)，无水硫酸镁干燥，抽滤除去干燥剂，滤液浓缩后柱层析得到目标化合物(6.2g)。

MS m/z(ESI)：596.77(M+1)。

步骤2：

冰浴下，将起始化合物(6.2g)搅拌下溶解于60ml丙酮中，缓慢加入三甲基铝的丙酮溶液(8.3ml，,4mol/L，8.9mmol)，油浴45℃保温反应5小时。TLC表明原料反应完全，撤去油浴，向反应液中加入少量水淬灭反应。反应液用稀氢氧化钠(1mol/L)调节pH至7～9左右，加入50ml饱和氯化钠，用乙酸乙酯萃取(50ml×3)。合并有机相，用硅藻土抽滤，滤液减压浓缩得到目标化合物(5.0g)。

MS m/z(ESI)：550.70(M+1)。

步骤3：

氩气氛下，将起始化合物(5.0g)搅拌下溶解于三氟醋酸中，水浴45℃保温搅拌5分钟，加入甲酸三乙酯(6.8ml，2.5mol)，撤去水浴，反应液温度自然升至室温，继续搅拌约1小时。TLC表明原料反应完全，向反应体系中加入少量水淬灭反应。反应液用稀氢氧化钠(1mol/L)调节pH至7左右，用二氯甲烷萃取(50ml×3)，合并有机相，减压浓缩得到红色固体。固体柱层析得到目标化合物(4.0g)。

MS m/z(ESI)：478.60(M+1)。

步骤4：

室温下，将起始化合物(4.0g)和1-苯基-3-氢-吲哚-2-酮(3.0g)搅拌下溶解于10ml乙醇中。加入六氢吡啶(10ml，1.0mol)，水浴30℃保温回流1小时。反应体系中有大量固体析出，撤去水浴，反应体系温度自然冷却至室温，抽滤，得到目标化合物(3.2g)。

MS m/z(ESI)：669.83(M+1)。

实施例4化合物4的制备

化合物4

步骤1：

将起始化合物(8g)和2-***啉-4-基-乙胺(20.00 g)于30℃水浴中搅拌至溶解，保温搅拌5小时，TLC表明原料反应完全，停止反应。向反应液中加入100 ml乙酸乙酯和100ml饱和氯化钠，搅拌5分钟后分层萃取。合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤(100 ml×4)，无水硫酸镁干燥，抽滤除去干燥剂，滤液浓缩后柱层析得到目标化合物(6.30 g)。

MS m/z (ESI)：539.68(M+1)。

步骤2：

冰浴下，将起始化合物(6.30g)搅拌下溶解于100ml丙酮中，缓慢加入三甲基铝的丙酮溶液(6.2ml，3mol/L，8.9mmol)，油浴45℃保温反应5小时。TLC表明原料反应完全，撤去油浴，向反应液中加入少量水淬灭反应。反应液用稀氢氧化钠(1mol/L)调节pH至7～9左右，加入50ml饱和氯化钠，用乙酸乙酯萃取(50ml×3)。合并有机相，用硅藻土抽滤，滤液减压浓缩得到目标化合物(5.40g)。

MS m/z(ESI)：508.64(M+1)。

步骤3：

氩气氛下，将起始化合物(5.40g)搅拌下溶解于三氟醋酸中，水浴45℃保温搅拌5分钟，加入甲酸三乙酯(6.8ml，2.5mol)，撤去水浴，反应液温度自然升至室温，继续搅拌约1小时。TLC表明原料反应完全，向反应体系中加入少量水淬灭反应。反应液用稀氢氧化钠(1mol/L)调节pH至7左右，用二氯甲烷萃取(50ml×3)，合并有机相，减压浓缩得到红色固体。固体柱层析得到目标化合物(4.6g)。

MS m/z(ESI)：436.24(M+1)。

步骤4：

室温下，将起始化合物(4.6g)和1-（4-甲基苯基）-3-氢-吲哚-2-酮(3.0g)搅拌下溶解于10ml乙醇中。加入六氢吡啶(10ml，1.0mol)，水浴30℃保温回流1小时。反应体系中有大量固体析出，撤去水浴，反应体系温度自然冷却至室温，抽滤，得到目标化合物(3.6g。

MS m/z (ESI)：641.79(M+1)。

实施例5化合物5的制备

化合物5

步骤1：

将起始化合物(8g)和2-***啉-4-基-乙胺(20.00g)于50℃水浴中搅拌至溶解，保温搅拌1小时，TLC表明原料反应完全，停止反应。向反应液中加入150ml乙酸乙酯和120ml饱和氯化钠，搅拌7分钟后分层萃取。合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤(100ml×3)，无水硫酸镁干燥，抽滤除去干燥剂，滤液浓缩后柱层析得到目标化合物(7.10g)。

MS m/z(ESI)：586.73(M+1)。

步骤2：

冰浴下，将起始化合物(7.10g)搅拌下溶解于100ml丙酮中，缓慢加入三甲基铝的丙酮溶液(7.0ml，3mol/L，8.9mmol)，油浴45℃保温反应4小时。TLC表明原料反应完全，撤去油浴，向反应液中加入少量水淬灭反应。反应液用稀氢氧化钠(1mol/L)调节pH至7～8，加入100ml饱和碳酸氢钠，用乙酸乙酯萃取(50ml×3)。合并有机相，用硅藻土抽滤，滤液减压浓缩得到目标化合物(6.3g)。

MS m/z(ESI)：540.66(M+1)。

步骤3：

氩气氛下，将起始化合物(6.3g)搅拌下溶解于三氟醋酸中水浴40℃保温搅拌5分钟，加入甲酸三乙酯(8.0ml，3.5mol)，撤去水浴，反应液温度自然升至室温，继续搅拌约1小时。TLC表明原料反应完全，向反应体系中加入少量水淬灭反应。反应液用稀氢氧化钠(1mol/L)调节pH至7左右，用二氯甲烷萃取(50ml×3)，合并有机相，减压浓缩得到红色固体。固体柱层析得到目标化合物(5.8g)。

MS m/z(ESI)：468.56(M+1)。

步骤4：

室温下，将起始化合物(5.8g)和1-（4-氯基苯基）-3-氢-吲哚-2-酮(5.6g)搅拌下溶解于40ml乙醇中。加入六氢吡啶(10ml，1.0mol)，水浴40℃保温回流2小时。反应体系中有大量固体析出，撤去水浴，反应体系温度自然冷却至室温，抽滤，得到目标化合物(4.9g)。

MS m/z(ESI)：694.23(M+1)。

试验例1VEGF-R2激酶活性测定

本试验采用酶联吸附免疫测定法(ELISA)测定重组人类VEGF-R2蛋白体外激酶活性。

1）材料与试剂：

a.洗涤缓冲液(PBS-T缓冲液)：1x PBS(137mM NaCl、2.7mM KCl、4.3mMNa₂HPO₄、1.4mM KH₂PO₄，调pH至7.2)和0.05%Tween-20

b.1％牛血清白蛋白(BSA，Calbiochem#136593)PBS-T缓冲液

c.中止反应缓冲液：50mM EDTA,pH8.0

d.铕标记抗鼠IgG(PerkinElmer Life Sciences#AD0124)

e.信号倍增液(PerkinElmer Life Sciences#1244-105)

f.链酶亲和素包96孔黄板(PerkinElmer Life Sciences#AAAND-0005)

g.重组人类VEGF-R2激酶(50mM Tris-HCl，pH8.0)，100mM NaCl，5mM DTT，15mM谷酰基胱氨酰甘氨酸和20%甘油(Cell signaling technology#7787)

h.10mM ATP溶液(Cell signaling technology#9804)

i.生物素-胃泌素前体(Biotin-Gastrin Precursor)(Tyr87)肽(Cell signalingtechnology#1310)

j.磷-酪氨酸小鼠mAb(P-Tyr-100)(Cell signaling technology#9411)

k.HTScan^TM酪氨酸激酶缓冲液(4x)

1x激酶缓冲液：

60mM HEPES

5mM MgCl₂

5mM MnCl₂

3μM Na₃VO₄

(Cell signaling technology#9805)

l.1.25M DTT(1000x)(Cell signaling technology)

2）方案：

1.用DMSO稀释受试化合物至所需最终浓度，在每个试验中加入1μl待测化合物、一个阴性对照和空白对照(均不接受任何受试化合物)；

2.用dH₂O1:1稀释6μM底物蛋白(Tyr87)，并在每个测试中加入15μl；

3.将VEGF-R2酶从–80°C直接转移到冰上，酶解冻在冰上；

4.取2.2μg VEGF-R2酶到每个测试中；

5.加入10μlDTT(1.25M)到2.5ml4x HTScan^TM酪氨酸激酶缓冲液(240mM HEPESpH7.5，20mM MgCI₂，20mM MnCI₂，12μM Na₃VO₄)中，制得DTT/激酶缓冲液；

6.转移0.75ml DTT/激酶缓冲液到每个每个测试中，制得4x反应混合液，并在每个测试中加入7.5μl4x反应液；

7.加入2μl ATP(10mM)至498μl dH₂O中,并在每个测试中加入7.5μl；

30μl反应最终测试条件为：

60mM HEPES pH7.5

5mM MgCl₂

5mM MnCl₂

3μM Na₃VO₄

1.25mM DTT

10μM ATP

1.5μM多肽底物

22ng VEGF-R2激酶

8.在25°C下，将反应管温育30分钟；

9.每个测试中加入30μl反应中止缓冲液(50mM EDTA,pH8.0)中止反应；

10.在96孔链酶亲和素(streptavidin)包被培养板每孔中加入25μl反应液和75μldH₂O，在室温下，振摇60分钟；

11.每孔用200μl PBS-T缓冲液洗涤3次，在纸巾上轻拍以除去剩余的液体；

12.用1％牛血清白蛋白PBS-T缓冲液1:1000稀释主要抗体磷-酪氨酸mAb(P-Tyr-100)，并在每孔中加入100μl稀释的p-Tyr-100抗体；

13.室温下，振摇温育60分钟；

14.按第11步所述方法进行洗涤；

15.用1％牛血清白蛋白PBS-T缓冲液1:500稀释铕标记的抗鼠IgG，并在每个孔中加入100μl稀释的抗体；

16.室温下，振摇温育30分钟；

17.每孔用PBS-T缓冲液200μl洗涤5次，在纸巾上轻拍以除去剩余的液体；

18.每孔中加入100μ信号倍增液；

19.室温下，振摇温育5分钟；

20.在波长615nm下，用合适的时间分辨板读取器读取荧光强度。

计算抑制率比值:IR(%)=100-100*(X-B)/(N-B)

X=受试化合物吸光度

N=阳性对照

B=空白

IC₅₀值通过受测化合物一系列浓度递度下的IR值来计算。

3）结果见表1：

表1化合物1～5IC₅₀值

化合物	IC50(VEGFR/bio)(μM)
		1	0.0009
2	0.0008
		3	0.0008
4	0.0010
		5	0.0011

Claims (8)

1.一种式(I)所示的吡咯并N杂环类化合物或其药学上可以接受的盐：

其中：

R₁选自苯基或苯甲基，其中所述苯基或苯甲基任选地被一个卤素原子所取代；

R₂选自三氟甲基、乙基或苯基，其中所述三氟甲基、乙基或苯基任选地被一个卤素原子所取代；

R₃选自4～8元含氮杂环基。

2.根据权利要求1所述的吡咯并N杂环类化合物或其药学上可接受的盐，其中R₃选自含一个N的4～8元杂环。

3.根据权利要求1所述的吡咯并N杂环类化合物或其药学上可接受的盐，包括化合物1～5：

4.根据权利要求1所述的吡咯并N杂环类化合物或其药学上可接受的盐，其中所述的药学上可接受的盐为化合物与选自以下的酸形成的盐：苹果酸、乳酸、马来酸、盐酸、甲磺酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、酒石酸、乙酸或三氟乙酸。

5.一种药物组合物，其包括药物有效剂量的如权利要求1～3中任何一项所述的吡咯并N杂环类化合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。

6.根据权利要求1～3任意一项所述的吡咯并N杂环类化合物的制备方法，其包括如下步骤：

第一步，

第二步，

第三步：

第四步：

其中，

R₁选自苯基或苯甲基，其中所述苯基或苯甲基任选地被一个卤素原子所取代；

R₂选自三氟甲基、乙基或苯基，其中所述三氟甲基、乙基或苯基任选地被一个卤素原子所取代；

R₃选自4～8元含氮杂环基。

7.根据权利要求1～4任一项所述的吡咯并N杂环类化合物或其药学上可接受的盐或者根据权利要求5所述的药物组合物在制备治疗与蛋白激酶有关的疾病的药物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述的与蛋白激酶有关的疾病选自白血病、糖尿病、自身免疫病、过度增生病、牛皮癣、骨关节炎、血管生成、心血管病、多发性成血管细胞瘤、炎症或纤维变性病。