CN104093845B - 植物细胞堆叠的产生和培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及非组织多层细胞堆叠形式的植物细胞材料的产生和培养,及其积累或收获所期望的产物的用途。特别地,本发明提供去除了培养基且多孔结构的、非组织多层细胞堆叠形式的植物细胞材料的产生方法,和所述细胞堆叠的后续维持方法,该方法包括下述步骤:(i)通过从植物细胞悬浮培养物中分离细胞而提供细胞堆叠,其中,使细胞堆叠所包含的液体的含量降低并调整为相当于0.1g~0.9g湿细胞重量/cm3的细胞堆叠密度,从而建立所述细胞堆叠的去除了培养基且多孔结构的性质,以及(ii)将所述去除了培养基且多孔结构的细胞堆叠在非液体环境中以50~100%的相对湿度进行培养。
Description
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域。特别地,本发明涉及非组织多层细胞堆叠形式的植物细胞材料的产生和培养,及其积累或收获所期望的产物的用途。
背景技术
在过去的十年里,一直致力于建立和培养用于积累和收获天然或异源蛋白质和次生代谢物的以植物为基础的***。文献提供了大量的证据材料,证明利用以植物为基础的***产生各种所期望的物质,该所期望的物质或是被分泌到培养基中,或是从生产的细胞、组织、细胞器、甚至整个植物或植物的一部分中被分离出来。同样存在大量的转化方案,以确保建立稳定转化或瞬时转化的植物材料。然而,仍需要可靠、相对合算且快速的技术以从植物细胞高收率地获得所期望的产物。
因此,本发明提供一种以植物为基础的***,以产生高水平的所期望的天然或重组产物,该***利用来自植物细胞悬浮培养物的细胞并克服了现有技术中的问题,特别是对于培养和后续处理中处理大量培养基的需要,该***包括产品的去除、提取和纯化。
相应地,本发明涉及天然或重组蛋白质和代谢物的表达或产生,并且使用由通常建立的植物细胞悬浮培养物作为生产宿主而得到的特定植物细胞材料。
与目前使用和开发的以使用完整植物或至少完整的分化植物组织为基础的众多***不同,利用悬浮细胞具有能够在可控(controlled)、无菌的受控(contained)条件下可重复地产生均质材料的优点。
目前,在植物中表达重组蛋白有两种主要的策略,即,(i)生产稳定的转基因植物或悬浮细胞株,或(ii)在用细菌(例如农杆菌)、病毒(例如烟草花叶病毒、马铃薯病毒X/Y、豇豆花叶病毒等等)或二者组合(例如侵染(magnifection))感染植物表达宿主(植物、组织或细胞)使宿主能够表达异源遗传信息(DNA或RNA)后,瞬时表达异源基因。
虽然本发明也包括稳定转化的植物细胞材料的用途,但是用于瞬时表达的***具有速度优势(基因到产品、抢占市场、紧急应对)以及有可能达到比通常稳定转化的转基因植物或其部分(如细胞)能够获得的高得多的积累水平。
根据优选实施方式,本发明结合了植物悬浮培养物的固有优点和瞬时表达***的优点。
已经尝试并公开了将农杆菌加入到植物悬浮培养物中,接着在悬浮物中进一步培养植物细胞和细菌的方案(参见US 6740526B1),但所述方法的转化效率低。此外,除非采取有效的措施,例如使用抗生素杀灭细菌或使用营养缺陷型菌株抑制生长,农杆菌会迅速地长得超过植物悬浮细胞。其他人描述了共培养的细菌对植物悬浮细胞的直接有害作用(细胞死亡,过敏性反应)。结果,目前尚不存在以植物为基础的生产***,其结合完整植物或组织的瞬时农杆菌渗入/病毒感染的效率和植物悬浮培养物的优点,使得能够优选在无菌可控条件下生产均质的生物质,这是建立符合GMP标准的生产的巨大优势。如上所述,US6740526B1中公开的共同发酵方法存在转化效率低和伴随细菌过度生长的问题,尽管以叶为基础的***实现高转化效率,但是,在扩大规模方面遭遇问题,存在初始生物质生产的时空产率低、且依赖于在可控但并非无菌的条件下生产植物生物质的问题。与微生物***相比生产成本高是这些***没有得到广泛关注和作为生物制品的生产***使用的主要原因。因此,研究和开发着眼于速度和生产鲁棒性(production robustness)的综合优势是很重要的更专业应用,即紧急应对(如流感疫苗,新出现的疾病,个体化用药等)。本发明处理并解决了这些问题,并且提供用于操纵任何指定植物宿主材料的遗传背景的改进手段。
发明内容
根据本发明,提供用于去除了培养基且多孔结构的非组织多层细胞堆叠形式的植物细胞材料的产生以及所述细胞堆叠的后续维持的方法,该方法包括下述步骤:(i)通过从植物细胞悬浮培养物中分离细胞而提供具有多孔结构的细胞堆叠,其中,使细胞堆叠所包含的液体的含量降低并调整为相当于0.1g~0.9g湿细胞重量/cm3、优选0.2g~0.85g湿细胞重量/cm3、更优选0.4g~0.8g湿细胞重量/cm3的细胞堆叠密度,从而建立所述细胞堆叠的去除了培养基且多孔结构的性质;以及(ii)在提供足够的湿度(例如50~100%的相对湿度)以防植物材料严重脱水的同时,在非液体环境中于维持或恢复所述细胞堆叠的多孔结构的条件下培育或培养所述去除了培养基且多孔结构的细胞堆叠。
本领域技术人员已知,组织内的细胞通常紧密相连,通常分化并经常呈现出特定形态和极性的细胞。此外,组织内的细胞通常具有相对于彼此的特征定位。
相反,本发明的细胞堆叠是由植物细胞悬浮培养物产生的。植物细胞悬浮培养物的特有性能是单个细胞或一些细胞的聚集体相对于彼此移动或可移动,并没有表现出更高的组织水平。
因此,本发明的细胞堆叠包括彼此间没有特定的相对定位的单个细胞和细胞簇。这些细胞按所得集合体堆叠成具有大量气隙的三维多孔结构的方式铸型(cast)。在细胞堆叠密度和气隙存在之间有明显的相关性。气隙因为以下几个原因而非常重要。首先,能够进行有效率的气体交换,从而可以容易地将足够量的氧气提供给细胞。其次,气隙可以暂时性且容易地再次被液体(处理)充满。这种暂时的处理可用于使各种试剂与细胞堆叠的所有细胞紧密接触,从而提供有效率的遗传转化方法、生物转化方法、通过洗脱或清洗细胞堆叠而回收产物的方法,以及为诊断目的利用底物或分解物(例如以细胞堆叠为基础的免疫测定)。重要的是这些处理都只是暂时的,以及重新构筑细胞堆叠的多孔结构,并确定细胞堆叠的密度以确保在后续培育步骤中的高生存能力。由于细胞堆叠的多孔性,在某些应用中更重要的是湿度足够高,以防止细胞堆叠因为在细胞/气隙的界面与气相接触的表面积大而变干。
特别是本发明方法的优选实施例包括(i)第一培养步骤,优选在受控和/或无菌的条件下,对植物细胞悬浮物进行培养,以提供均匀的植物生物质,(ii)分离步骤,将液体培养基从植物细胞中分离出来,生成密度在0.1~0.9g湿细胞重量/cm3之间、优选在0.2~0.85g湿细胞重量/cm3之间、最优选在0.4~0.8g湿细胞重量/cm3之间的多孔细胞堆叠,以及(iii)第二培养步骤,在非液体环境中受控条件下将细胞堆叠进一步再培育(见上文)至少一天。根据实际情况和实际操作者的意图,可以将第二培养步骤进行几天。第二培养步骤通常进行2~7天,优选3~5天。
在当前最先进的所有培养方法中,植物细胞材料都是连续不断地(亦即大部分时间)与含有培养基的营养物直接或间接(多孔载体或膜介导)接触。连续的培养基接触仅在细胞从一个培养基转移到另一个培养基时才会短暂(即短时间)地中断。可以对细胞进行过滤或清洗以移除“旧的”培养基,但随后迅速转移到新的培养基中。
与现有技术相比,培养步骤是在保持细胞的生存能力、并以降低的或最小的细胞生长和***促进产物积累的条件下进行的。通过在潮湿的环境中、优选不接触成分或营养物从其中扩散到细胞堆叠的液体或凝胶化的生长培养基地培育良好地通气的堆叠细胞而实现的(US2002/092037A1,WO2005/103271A1)。在现有技术中,细胞薄层被铺板或点样在放置于培养基中的支持(supportive)膜以给细胞提供营养物。然而,在生长培养基中培养细胞层具有因为需要接触该培养基,所以只有少量的生物质能够被处理的缺点。与此相反,本发明的细胞堆叠方法不依赖于支持培养基,是可扩展的,因此适合于工业应用。因此,上述培育或培养步骤(ii)在非液体环境中进行,优选不将去除了培养基的多孔结构细胞堆叠置于(液体或凝胶固化的)维持或生长培养基或与之有任何接触。
根据本发明方法的优选实施例,第二培养步骤进行数周或数月。在这样的情况下,可能必须调整培养条件以维持细胞的生存能力。可以通过例如短暂地(即,至多3小时、优选至多1小时的一段时间)给细胞堆叠提供营养物质和/或降低培育温度而实现。
在现有技术中,悬浮培养物用于积累所期望的产物,该所期望的产物保留在由培养物组成的细胞内或被分泌到培养基中。当生产周期结束后,细胞被破坏以收获积累的产物或被丢弃。悬浮物(例如浸没在液体培养基)中的稳定转化的植物细胞已被用于生产广泛的不同的治疗性重组蛋白(S.Hellwig等,“用于生产重组蛋白的植物细胞培养物”,自然生物技术22:1415~1422,2004年(S.Hellwig et al.,"Plant cell cultures for theproduction of recombinant proteins",Nature Biotechnol22:1415-1422,2004))。
根据本发明,包含悬浮培养物的细胞被用于产生由具有上述特定密度进一步限定的多孔结构细胞堆叠形式的培养基被去除的非组织植物细胞材料。可任选地以使用者定义的形状来提供的细胞堆叠可被看作是由已经生长在液体培养基中的未分化的植物细胞构成的人工生成的多层细胞集合体或细胞饼。源细胞可以是能够积累所期望的产物的、稳定和/或瞬时转化的转基因细胞、突变细胞或野生型(原生)细胞。通过在移除大部分周围的液体培养基的同时,将细胞悬浮物铸型成细胞堆叠结构,产生三维多孔植物细胞材料。虽然优选通过过滤器的真空过滤、压滤、离心分离之类过滤技术,但是只要确保上述细胞堆叠密度,就也可以通过本领域已知的其他方式(例如,在食品工业中使用的分离器,连续离心分离)移除液体培养基。建立、维持和/或重建细胞堆叠所包含的单个细胞或细胞簇之间的气隙提供了确保良好通气(气体交换)的细胞堆叠的多孔结构,对堆叠的植物细胞材料在第二培养阶段的生存能力和生产率来说,这是关键因素。在本发明的上下文中,该培养条件不包括在固化(凝胶化)或液体的培养基中、在悬浮物中或与可能妨碍上述必需的通气的任何液体环境接触的下培养细胞堆叠。因为所述培养实质上是在没有任何包围所述细胞堆叠所包含的每个细胞的培养基或液体的条件下进行的,所以必须确保足够的相对湿度。本领域技术人员可以理解,细胞堆叠的密度(g湿细胞重量/cm3)、液体含量与通气(由足够量和足够体积的气隙的结构决定)之间存在严格的相关性。然而,如将在下面更详细地解释,通气的细胞堆叠可(暂时地)通过与小体积的转化载体或物质、包括但不限于营养物、底物、激素、酶、代谢物和前体接触而处理。在上下文中,“暂时地”意味着,在长期(即数周或数月)培育过程中包括提供营养物质的处理仅在短期内(最多3小时,优选最多1小时)进行,随后再次撤掉该液体培养基并重建多孔细胞堆叠的气隙,得到本文所定义的细胞堆叠密度。
因此,根据本发明的方法任选包括在分别包括或代表生物体、化学物质和/或生物物质或分子的气体、蒸汽、薄雾、粉尘和/或气雾剂等的存在下培养细胞堆叠,。
根据优选的实施方式,包含细胞悬浮培养物的细胞是原生(例如野生型)细胞或者非转基因细胞,在进行第二培养步骤之前,该细胞与至少一种表达载体转化,该表达载体包含至少一种异源核酸序列,该异源核酸序列优选被可操作地连接到功能性启动子,其中,所述至少一种异源核酸序列对在本发明方法的步骤(ii)中积累和收获的所期望的产物进行编码。
本文所用的术语“转化”是指将任何核酸或核酸类似物传递到植物细胞中。在转化后,核酸可以稳定地整合到宿主细胞的基因组中。或者,被传递的核酸可以不被整合到基因组中,并可以对细胞溶质或细胞核或任何细胞器发挥其作用。
核酸可以是自主复制要素(element),诸如类病毒、病毒或解构病毒,或者由一个以上病毒得到的必需要素组合。或者,传递的核酸可以仅是自主复制要素、诸如类病毒,病毒或解构病毒的一个组成部分。其他组成部分可以由宿主细胞或转基因宿主细胞提供/补充。
本文所用的术语“异源”是指所讨论的核苷酸的基因/序列已通过基因工程被引入到植物细胞中。异源基因可以增强内源性等效基因、即通常发挥相同或类似功能的基因向目标蛋白质的表达,或***的序列可以对内源基因或其他序列进行补充。另一种可能性得到被放置在天然存在该核酸序列或其同源物的培养靶细胞内的核酸序列,在其中核酸序列被连接和/或邻接到不会在细胞或者该类型或物种或品种的植物的细胞内自然产生的核酸以控制表达,如可操作地连接到一个或多个调控序列,如启动子序列。另一种可能性是得到通过反义和/或沉默(作为要实现的结果的所期望的产物)诱导现有基因沉默的核酸序列。另一种可能性得到具有调节功能的核酸,如miRNA(期望的产物)。另一种可能性是得到为核酶或适体(所期望的产品)的核酸。
“载体”被定义为包括双链或单链线型或环型的任何质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体及其他,它们能或不能自我传播或移动,可以转化原核或真核宿主,并存在于染色体外(如带复制原点的自主复制质粒)。
“表达载体”是指核酸处于控制之下并且被可操作地连接于用以转录到宿主细胞(例如微生物或植物细胞)中的适当的启动子或其他调节元件的载体。载体可以是在多个宿主中发挥功能的双功能表达载体。在基因组或亚基因组DNA的情况下,可能包含它自己的启动子或其它调控元件,在cDNA的情况下,可以处于用以在该宿主细胞中表达的适当的启动子或其他调控元件的控制之下。“可操作地连接”是指作为同一核酸分子的一部分加入、适当地定位和定向,以使转录从启动子开始。
“生物载体”是能够转化植物宿主细胞、即能够将核酸传递进植物细胞的任何微生物或病毒。“生物载体”的例子是感染性微生物(例如属于放射形农杆菌和根瘤菌的微生物)或病毒(例如烟草花叶病毒、马铃薯X病毒和豇豆花叶病毒)。更具体地,农杆菌是“生物载体”。
对于细胞转化,将生物载体的悬浮物或含有遗传信息的不同的生物载体的混合物施加到如上文所述地产生的细胞堆叠中。该载体感染植物细胞,并传递遗传信息。由于细胞堆叠形式的植物细胞材料的海绵结构,载体仅通过毛细管力即可进入各个靶细胞,无需必须将细胞送达所需的完整叶片或植物的注射或真空浸润之类特别的处理。而且,该细胞堆叠的松散多孔结构可获得载体能够进入的大表面积,因此可实现高转化效率。这一点不同于细胞具有更紧密的细胞间接触而限制载体接触细胞表面、导致较低的转化效率和产物积累的愈伤组织材料和分化的植物组织。通常情况下,细胞堆叠内的50%以上的细胞被转化,远高于现有技术。虽然U.S.Pat.6,740,526 B1中没有报道详细的转化效率数据,但是已经发现该专利所公开的方法比本发明的细胞堆叠方法差(例如参见实施例1,图6C,6D)。这一发现还可以被能获得10~100倍的抗体产量这一观察结果支持(参见例如实施例1)。该载体悬浮物可以容易地应用,例如通过简单的滴加或喷雾。然而,更大和/或更厚的细胞堆叠和某些使用者定义形状可能需要真空或压力辅助应用并移除生物载体悬浮物以达到此处定义的所期望的细胞堆叠密度。与叶片组织的真空辅助浸润相比,所述方法的优点是过量的生物载体悬浮物可被移除并再利用,并且可以立即重新建立细胞堆叠的多孔性。被浸润的叶片的生存能力显著依赖于过量液体的摄取和/或移除以恢复细胞间隙中的气相。因为这是很难控制的,所以使得叶片组织的真空辅助浸润的易变性和失败率高。考虑到具有操作、自动操作、限控、扩大规模以及废物的产生和移除这几个实际的优点,优选的实施方式是将载体悬浮物施用于细胞堆叠。或者,可以在形成细胞堆叠之前,将植物细胞的悬浮物与载体悬浮物混合。气隙的恢复和渗入了农杆菌之类生物载体的细胞堆叠的培养基被去除的培养确保微生物载体不会因它们的过度生长而破坏植物细胞。
可以代替生物载体悬浮物,使用含有核酸或核酸类似物的溶液、或颗粒的悬浮物、或被覆有或含有核酸的乳液。
应用生物载体后,在受控条件下,将细胞堆叠培育或培养一定时间,使该植物细胞堆叠通过恢复各个细胞或细胞簇之间的气隙而重建其多孔结构,并允许植物细胞表达重组蛋白,从而积累所期望的产物。培养条件(如时间、温度、湿度、光强度)可以容易地调整为有利于特定的所期望的产物的合成。无需特殊的设备来支撑细胞堆叠,廉价的一次性塑料托盘就足以对它们进行保持。在培养的第一个周期,通过蒸发和吸收施加有生物载体的液体进行气隙重构。或者,通过真空或压力辅助的方法移除过量的液体而进行气隙重构。培养完成后,收获该细胞堆叠,并通过应用本领域已知的适当的纯化方法从生物质中分离/隔离产物。在分析或诊断结果显示就是所期望的产品的情况下,也可在培育/培养期间进行收获。整个过程可以自动操作,并且可以很容易地扩大规模或缩小规模。这个易于设置且不复杂的方法使得设计高度可控的工艺以满足GMP要求和/或高流通量的应用和/或工业规模生产是可行的。
该方法特别适用于对人体、动物和/或环境有害的产品,因为整个过程可以在完全封闭的条件下进行,因此提供高生物安全性。还适用于在生产工艺中所用的化合物、载体和/或核酸。
本文所用的“收获”一词应理解为包括基于所期望的产物的表达和积累的任何行动。除了包括上述所期望的产物的分离/隔离的收获,收获一般还涉及获得基于天然或重组积累的所期望的产物的任何诊断或分析结果。本领域技术人员清楚在这些情况下,可以排除所期望的产物本身的分离/隔离。
或者,也可以由含有转基因细胞的悬浮培养物生产细胞堆叠,以增加所期望的产物(例如重组蛋白质,代谢物)的生产,例如,通过提供复制***或代谢途径的一个元件或通过下调某宿主因子来实施。
进一步地本发明提供去除培养基、多孔结构非组织多层细胞堆叠形式的植物细胞材料,密度在0.1g~0.9g湿细胞重量/cm3之间、优选在0.2g~0.85g湿细胞重量/cm3之间、最优选在0.4g~0.8g湿细胞重量/cm3之间,是由本发明公开的方法获得的或可由本发明公开的方法获得的。换言之,本发明提供培养基被去除的、多孔结构非组织多层细胞堆叠形式的植物细胞材料,密度在0.1g~0.9g湿细胞重量/cm3之间、优选0.2g~0.85g湿细胞重量/cm3之间、最优选0.4g~0.8g湿细胞重量/cm3之间。
细胞堆叠还可以作为载体悬浮物的补充或代替载体悬浮物,用前体、诱导剂、激素、稳定剂(例如相容性溶质)、抑制剂、RNAi/siRNA分子、信号化合物、酶(例如果胶酶)和/或激发子处理,或在前体、诱导剂、激素、稳定剂(例如相容性溶质)、抑制剂、RNAi/siRNA分子、信号化合物、酶(例如果胶酶)和/或激发子的存在下培养,以生产重组和/或内源(天然)蛋白质或代谢物。
在本发明的具体实施方式中,所采用的物质诱导包含在细胞堆叠中的未分化细胞分化。可以通过例如应用激素或特定的激素组合,或通过转化带转录因子的细胞而实现。
细胞堆叠可以反复使用任何系列的载体悬浮物、核酸溶液或前述物质和/或载体悬浮物、核酸溶液或前述物质的组合进行处理。这意味着基本上只要在每次处理后细胞堆叠的多孔性被维持且气隙得到恢复,本发明的方法就能够反复实施。尤其是还包括使用不同载体悬浮物的混合物来同时共转化具有不同核酸的细胞堆叠的细胞。
细胞堆叠还可以包含不只一个不同种类的细胞和/或不同的克隆和/或不同的转基因细胞株和/或非转基因细胞株。此外,异质性细胞堆叠还可以包含来自不同物种甚至生物界(kingdoms)的细胞,基本上使用植物细胞作为共培养的其它细胞(例如酵母、真菌、动物和人类细胞)的多孔支撑。
在本发明的另一个优选实施方式中,多孔细胞堆叠被用作可繁殖性高且评价共培养生物体的生长和/或生存能力的均匀分析支撑,其中,所述评价用于表征所期望的产物。优选该细胞堆叠用于测试和/或筛选由细胞堆叠产生的分子(代谢物、肽和/或蛋白质)对共培养生物体的活性。此类分析通常包括以下步骤:(1)产生本发明的多孔性细胞堆叠,(2)将化合物、载体和/或核酸添加到细胞堆叠中,可选地将所述细胞堆叠培养适当的期间,(3)对所述多孔细胞堆叠的选择区域接种第二生物体,(4)在使第二生物体生长的条件下培养被接种的多孔细胞堆叠,(5)在合适的培养时间后评价在细胞堆叠中合成的产物对第二生物体、例如对生长和/或生存能力的作用(所希望的产物)。如果使用例如转基因悬浮细胞株,则第二工序可以省略。
因此,本发明提供了通过本文所公开的方法获得或可获得的、和/或具有上述定义的密度的植物细胞材料在分析或诊断目的方面的应用。例如,可以在待分析或诊断的生物体或物质的存在下培养细胞堆叠所包含的细胞。因此,本发明还提供了包含如本文所公开的培养基被去除的多孔结构非组织多层细胞堆叠形式的植物细胞材料的诊断或分析工具。
相应地本领域技术人员容易理解本发明的细胞堆叠也可用于检测与细胞堆叠接触的样品中的分析物(“处理”)。另外,用含有感兴趣的分析物的样品处理细胞堆叠只是短暂地、即在短时间(最多3个小时)内进行。处理后,气隙已经再次被重建,即,必须恢复细胞堆叠的相应密度和孔隙率。然后,在没有与任何液体或凝胶化/凝固的培养基(供给营养物)连续接触的情况下对细胞堆叠进行培养。存在于样品中的分析物可能诱发信号转导、基因表达或导致细胞堆叠的可测量性变化或细胞堆叠所含的细胞的操控(manipulation)的任何其他事件。可测量的变化或操控包括但不限于荧光报告蛋白(fluorescent reporterprotein)、荧光报告分子(fluorescent reporter molecules)、酶、导致细胞死亡、产生自发荧光的改变、可以通过用另外的试剂分析该细胞堆叠或培育该细胞堆叠揭示的生理学或形态学变化,该试剂直接在细胞堆叠或洗出液、提取物或由细胞堆叠衍生的其他样品中产生可检测的信号。应当理解的是,野生型和基因重组植物细胞都可以使用,包括稳定的转基因细胞和瞬时转化细胞。特别是后者可以通过对由野生型细胞产生的细胞堆叠的前一个转化处理而得到。
本发明的细胞堆叠非常适合于不同类型的操控。与悬浮物中的细胞或原生质体细胞相比,细胞堆叠中的细胞的密度高。因此,可以更经济地以获得相同的有效浓度所需的较低值施用化合物(例如生产代谢物的诱导子)。此外,可施用高度浓缩的物质,这对生物转化极其有用。与完整的植物相比,植物组织和/或愈伤组织的一个优点是较大的可进出细胞表面积,这得自于细胞堆叠的多孔疏松结构及其松散的细胞接触。相比悬浮培养物和完整的植物组织,物质可以更容易且有效地施用于细胞堆叠并从细胞堆叠中移除。例如,前体或有毒的化合物可以仅短期施用,并进行脉冲追踪实验。诱导剂可以以更可控且适时地定义的方式施用,从而允许最优基因表达和其它产品积累条件的进一步细化。一系列的前体和底物可以顺序地施用以实现完整转化,并阐明代谢途径。进而,所积累的分泌产物可以通过用合适的缓冲溶液简单地清洗细胞堆叠而收获。有趣的是,这能够实现产品的重复移除(“榨取”),以避免产物降解和/或反馈抑制。这种策略也可用以避免和/或减少对宿主细胞的不利影响,从而将工作效率最大化。
向细胞堆叠提供挥发性物质、包括营养物(例如氨、羧酸、二氧化硫、硫化氢、膦类和有机胺)与现有***相比也有几个优点。以气态形式向悬浮细胞培养物传递这类物质是难以实现的。首先需要将该气体溶解在溶液中,工艺受到溶解度和运输的限制。当使用完整的植物和植物组织时,运输再次构成问题,但更重要的是,需要使用和控制更大的培育量。虽然已经为了研究目的而小规模地进行了实施,但是大规模的工业应用通常过于昂贵。此外,如果产品本身是挥发性化合物,可以利用控制气压来积累和/或收获产品。在此,比悬浮细胞培养物更高的细胞密度(即每单位体积的细胞)和使用者定义形状的可行性和几何形状提供了唯一的工艺设计可能性,例如低压培养,这在任何现有生产***中都是不可能的。因此,本发明为这些类型的应用提供了经济且可扩展的方法。
或者,溶解的化合物可以被传递到气溶胶和/或雾和/或蒸汽形式的多孔细胞堆叠中。这种传递模式对悬浮细胞来说是不可能的。该模式被用于完整植物,但是,大部分被施加的化合物并没有到达其目标,需要更高的剂量、体积和处理次数。化合物透过角质层的吸收非常有限,要通过气孔传递。因此,这种应用被限制为高效的化合物。在此,本发明提供了将显著数量的几乎任何化合物有效率地传递给细胞堆叠的途径。
扩大规模可以通过并行化容易地实现,即,通过简单地生成所需数量的细胞堆叠。或者,扩大规模也可以通过使用适当尺寸的大细胞堆叠或片材、细胞柱(columns)或类似的三维结构而实现。
细胞堆叠的垂直尺寸仅受到在堆叠的底部作用于细胞的力和所获得的孔隙的压实程度的限制。但是,这个问题可以通过使用中间支撑体得到解决。因此,本发明细胞堆叠的典型垂直尺寸范围为几毫米(即3~5mm)到几厘米(即3~15cm)或更大。横向尺寸没有限制。尺寸可为10mm3~10m3。必须确保充分的通气/气体交换,以便例如维持适当的氧气和二氧化碳的含量。挥发性的初级和次级代谢物的积累也必须被控制,因为例如高含量的乙烯可能对细胞是有害的。对于厚度小的细胞堆叠(约3~5cm),通过扩散进行气体交换通常是足够的。较厚的细胞堆叠可能需要积极的通气和/或整合额外的空气通道。在这方面,本发明提供了独特的解决方案,因为该悬浮物细胞可以被铸型成几乎任何使用者定义的形状。
根据优选的实施方式,所期望的产物选自内源性(即天然)和异源蛋白质或多肽、次生代谢物、标记物和分析/诊断结果。
感兴趣的基因包括编码本身是天然药物(例如药品或兽药产品)的蛋白质的基因。
异源核酸可以编码细菌、真菌、植物、非植物或动物来源的基因及其他。可以在本发明的工艺中制备的蛋白质包括异二聚体(例如FSH)、免疫球蛋白、融合抗体、单链抗体和其他抗体形式或衍生物。
这样的蛋白质包括但不限于视网膜母细胞瘤蛋白、p53、血管抑素和瘦蛋白。同样地,本发明的方法可用于生产哺乳动物调节蛋白。其它感兴趣的序列包括蛋白质、激素(例如促卵泡激素)、生长因子、细胞因子、血清白蛋白、血红蛋白、胶原蛋白、索马甜、索马甜样蛋白、表皮生长因子(例如VEGF)、胰岛素、单体或二聚体或分泌型免疫球蛋白A、转铁蛋白或转铁蛋白融合蛋白,以及受体(例如CD16、CD32、CD64、CD89、新生儿Fc受体)。
本领域技术人员可以理解本发明能够生产多种所期望的产品,例如蛋白质和多肽,包括药物相关的(重组)蛋白(例如疫苗、抗体、治疗性酶、变应原和低变应原、抗菌肽、结构蛋白(例如用作生物相容性涂层材料的弹性蛋白和胶原蛋白)、病毒样颗粒、蛋白体等),有营养价值的(重组)蛋白(食品和饲料添加剂),用于诊断用途的(重组)蛋白(例如酶、抗体和工程抗体、其他酶或荧光融合蛋白、被用作阳性对照的抗原、蛋白质阵列的结合配体),以及技术相关性(重组)蛋白(例如亲和吸附剂的结合配体、高值酶、生物催化剂)。
因此,本发明还提供用于生产优选选自天然或异源蛋白质或多肽、次生代谢物、标记物和分析/诊断结果的至少一种所期望的产品的方法。该方法包括:从植物细胞悬浮培养物中生成培养基被去除的多孔结构非组织多层细胞堆叠,其密度为0.1~0.9g湿细胞重量/cm3,优选为0.2~0.85g湿细胞重量/cm3,最优选为0.4~0.8g湿细胞重量/cm3,向细胞堆叠施加适合于诱导或调整所期望产物的生成的溶液、悬浮物和/或气体,将细胞堆叠密度调整到上述范围内,根据需要,将该细胞堆叠在50~100%的相对湿度下培养,使细胞堆叠产生并积累所期望的产物。任选地,该方法还包括从细胞堆叠所包含的生成细胞中收获或隔离积累的所期望产物。
本发明的基于细胞堆叠的***也适合作为用于分子进化、蛋白质工程、代谢工程和合成生物学应用的筛选平台,其中包括将使用或将要使用的基因表达盒、质粒等优化。进而,通过使用本文所述的细胞堆叠,本发明提供用于以高通量、高重现性和自动化的方式评价基因表达构建体和工程化靶蛋白的分析方法。根据本发明和前面提到的内容,这些应用的目标是收集代表例如在第二培养期“收获”的所期望的产品的信息和结果。
另一方面,本发明提供通过所涉及的酶的瞬时表达操控蛋白质翻译后修饰的方法,可以实现例如糖蛋白的糖基化模式的修饰。进而,可以通过沉默(例如糖基转移酶、蛋白酶、泛素连接酶)使内源酶发生基因沉默,以影响产品的质量和数量。
此外,本发明提供一种通过所涉及的途径酶和/或它们的转录因子的瞬时表达生产次级代谢物作为所期望的产物的方法。生化途径也可以通过经由相应的酶的沉默而阻断竞争途径和/或分解代谢以实现操控。同样地,本发明的***非常适于通过如本文所述地生成及培养细胞堆叠对由未做基因性修饰的(天然)细胞培养物生产代谢物加以改进。最后,本发明也可用于在相应诱导剂的存在下培养由内含组成型启动子和/或诱导型启动子的转基因悬浮细胞株产生的细胞堆叠。
一般来说,异源核酸可以通过本领域中使用的任何合适的工艺表达,或者它们也可以被如下地转录或表达:
(i)例如含有被可操作地连接到感兴趣的异源序列的启动子的“裸”DNA的瞬时表达;
(ii)由表达载体、例如复制载体表达。一般来说,本领域技术人员完全能够构建重组基因瞬时表达的载体和设计方案。可以选择或构建合适的载体,该载体含有合适的调节序列,包括启动子序列、终止子片段、多聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记物基因和其它合适的序列。更多详情请参见例如Molecular Cloning:a Laboratory Manual:2nd edition,Sambrook et al,l989,Cold Spring Harbor Laboratory Press or Current Protocolsin Molecular Biology,Second Edition,Ausubel et al.eds.,John Wiley&Sons,1992;
(iii)由非整合载体表达;
(iv)由被传递的T-DNA表达。
应当理解这些分类并不相互排斥,例如,非整合载体也可以是表达载体等。
用于实现这样的表达的方法在本文的其他部分讨论。
构建体可以被引入相对高拷贝数的强启动子,并不发生在选择构建体被整合进基因组的稳定转化体时可能发生的固有的慢化效应(moderating effect)。结果,生成的蛋白质的含量和浓度远超过通过使用现有技术(转基因悬浮培养物或悬浮物中的瞬时表达)中的基于植物细胞的***的蛋白生产方法能够获得的蛋白质的含量和浓度。
因此,本发明的一个实施方式中公开了能够产生编码靶蛋白的mRNA的瞬时转化植物细胞,该靶蛋白由所引入的核酸构建体转录得到,该核酸构建体包含被可操作地连接到启动子的靶核苷酸序列。
因此,“被引入的核酸”作为DNA序列包括以构建体形式提供的异源核酸序列,其能够相对于通常与所述DNA序列的稳定的转基因表达相关联的蛋白质生产水平,以提高了的水平,增加胞外蛋白的生产。
因此,在本发明的优选实施方式中,公开了一种在植物细胞堆叠中实现异源核苷酸序列的表达的方法,该方法包括至少将包含异源核苷酸序列的第一核酸序列引入靶细胞的步骤。
在一个实施例中,提供了产生至少胞外异源蛋白质的方法,该方法包括以下步骤:
(i)将包含编码异源蛋白质的核苷酸序列的第一核酸瞬时导入细胞堆叠所包含的靶细胞,
(ii)通过提供适当的培养条件,使得或允许核酸在一段时间内表达异源蛋白质,
(iii)从产生的细胞中收获积累的异源蛋白质。
可以通过完全传统的方法隔离,并且进行或不进行部分或完全纯化。
细胞堆叠的培养时间可以是达到甚至超过细胞材料保持活力的任何期间,或直至产物饱和;一般优选为约1~10天,更优选为约1~6天。
本领域技术人员当然能够认识到可以将一个以上的基因用在该构建体或每个构建体中。多个载体(每个都包括编码所选择的异源蛋白质的一个或多个核苷酸序列)可以被引入到此处或本文其他部分描述的靶细胞中。这会有助于生产例如酶的例如多个亚基、或例如生化途径的多种酶。这也会有助于例如同时敲除内源基因,例如通过siRNA介导的基因沉默和/或敲入异源酶对产品进行翻译后修饰和/或标记物的表达和/或相同或不同类型的多种产物的生产。
如下面的例子所示,以这种方式引入的异源序列的瞬时表达可在第二次培养期的整个过程中提供高水平的靶多肽,第二次培养期通常是几天,取决于所使用的精确的方法和材料。通过使用如本文中所述的本发明方法,获得异源多肽的积累。
因此,在细胞堆叠所包含的细胞中的瞬时表达代表在很多情况下都有用的工具,它在以前可能被认为是不合适的,例如不稳定的可靠表达,也就是细胞内积累的瞬时表达的异源蛋白质或多肽序列。
该方法在需要高水平的表达、但不希望有病毒构建体(对植物而言是“感染”)或稳定的转基因植物的应用中是特别优选的,例如快速检测是非常重要的或者有问题的序列意味着致命的或不希望的表型的应用。
报告子可以是任何可检测的蛋白,例如本领域中常用的标记物基因(例如GUS)、荧光蛋白(例如GFP或DsRed(红色荧光蛋白)、荧光素酶)等等。优选报告子是非侵入性标记物,例如DsRed或荧光素酶。根据本发明的另一实施方式,由本文所述的本发明方法得到的或能够得到的、培养基被去除的非组织多层细胞堆叠形式的植物细胞材料被用于分析目的。例如,可以将细胞堆叠所包含的细胞在待分析物质的存在下培养。例如,由含有筛选标记物基因(GFP(绿色荧光蛋白)、DsRed、荧光素酶、GUS、分泌型碱性磷酸酶或能够在细胞内产生可检测的化合物的酶)被可操作地连接于诱导型启动子的转基因悬浮细胞株生成的细胞堆叠可用于检测试样中的诱导剂。可选地,可诱导报道基因表达构建体也可以换成由野生型(非转基因)悬浮细胞株在第一步骤中生成的细胞堆叠和然后在第二步骤中分析的测试样品。优选在两个步骤之间有1~5天的培养时间。然后,将合适体积的液体试样或非液体检验样品的液体提取物施加于细胞堆叠。重要的是确保在该步骤中细胞堆叠的多孔结构通过使用适当的测试样品体积比和适当的细胞堆叠重量,或通过在适当的接触时间后移除测试样品的多余液体而得以维持。适当的接触时间为1分钟~2小时,优选为5分钟~1小时,更优选为10~30分钟。液体试样的合适的体积最多为0.75ml/g细胞堆叠,优选为0.5ml/g细胞堆叠,更优选为0.4ml/g细胞堆叠。
诱导型启动子的实例包括但不限于***诱导型启动子、乙醇诱导型启动子、糖诱导型启动子。本领域技术人员也理解使用阻遏物和抑制物的基因电路同样可以使用。例如,将四环素结合于tet-阻遏物导致四环素启动子去阻遏。
根据优选的实施方式,因为操作方便、转化效率高和将核酸和/或化合物传递进入细胞堆叠的细胞的众多可能性,所以本发明提供非常有助于研究和优化重组活动的方法。
本领域技术人员应当理解,本发明的细胞堆叠优于基于叶片的瞬时***、液体培养物中的瞬时***、野生型和/或稳定的转基因悬浮培养物和野生型和/或转基因的整株植物或部分植物的应用。
与本发明相比,基于叶片的瞬时表达***采用分化的植物组织,该分化的植物组织包含不同的细胞类型(异源),而已知悬浮细胞是去分化的。相比基于叶片的***,本发明提供以下优点:
·生物质生产所需的生长设备不占空间;
·不依赖于外部气候条件;
·没有感染植物病原体的危险;
·快速提供大量高度均匀的生物质,这对医药产品尤其重要(降低调整方面的担忧);
·生物质的收获更容易(无需专用收获机具);
·因更低的生物质比例而更容易通过冷冻和/或干燥加以保存;
·生物质更容易处理,产物更容易纯化(木质素少,纤维少,宿主蛋白质少,颜料少);
·生物质是在高度控制的无菌条件下生产的(降低调整方面的担忧);
·与整株植物相比有速度优势,容易扩大生物质的规模(0.1升初始培养物可以在15天内按比例扩大在1000升悬浮培养物中获得100kg生物质;5d2.5升→5d50升→5d1000升);
·更好的时空收率/空间利用率(每平方米生物质;生产和培育通常无需照明,使得细胞堆叠致密堆积);
·感染相同量的生物质需要更少体积的生物载体悬浮物(与罐浸润相比更少“浪费”);
·全面密封比基于叶片和植物的方法容易实施;
·用“细胞堆叠”方法更容易施用细菌或病毒;
·在单个细胞中触发的意外的转录后基因沉默仅限于通过胞间连丝连接的少数相邻细胞,不会影响全身;
·能够更容易且更经济地施用其他化学化合物(例如用于代谢物生产的诱导子、诱导物、激素或前体);
·可以从堆叠的细胞(宿主蛋白少,只能进入完全处理的分泌蛋白)中只洗脱分泌蛋白;
·因封闭也能够生产危险产品(高生物安全水平);
·能够高通量筛选(多孔过滤板);
·可实现更灵活的使用者自定义的大小和形状;
·更易控制自动化;
·可用于植物病原体或其他微生物的标准化生长试验的高度均质的植物细胞材料使高通量筛选和实验方法设计成为可能;
·能同时和/或顺序地以单一格式容易地对不同的方法、技术和操控步骤进行组合。
与液体培养物中的瞬时***相比,优点可以总结如下:
·与在生物反应器(摇瓶或发酵罐)中的悬浮培养物或固体培养基上的愈伤组织生长相比,瞬时传递的转基因的表达增加;
·无需控制或抑制细菌生长以避免植物细胞(抗生素、营养缺陷型菌株)的过度生长;
·与生物反应器悬浮物相比,使用“细胞堆叠”得到较高的农杆菌对植物细胞的比例;
·由于细胞堆叠中的细胞没有被搅动,所以得到更亲密的载体细胞接触,无切断;
·由于在第二培养阶段或时期的高浓缩生物质,所以只需较少量的昂贵化合物(例如用于代谢物生产的诱导剂(乙酰丁香酮)、激素、前体等);
·第二培养阶段在用于生产植物细胞的生物反应器外发生。使得能够例如在第一培养阶段应用连续的发酵策略,以确保悬浮物细胞的持续供给。结果实现对相对昂贵的生物反应器的更理想且更经济的使用,并能够实现更高的生产能力;
·由于细胞堆叠的多孔结构,氧供应的限制并不太重要。
与使用转基因植物相比,根据本发明的***能够更迅速地恢复所期望的产物,并提供没有环境问题或风险的完全封闭体系,确保不与食物链混杂。
与使用稳定的转基因悬浮细胞相比,本发明能够更快速地从基因得到产品,具有更高的生产率,并能生产可能妨碍稳定转化的细胞株的再生的有毒产品。
将进一步参照以下非限制性的附图和实施例说明本发明。本领域技术人员可据此实施本发明的其它实施方式。
附图说明
图1示出由基于pTRA、pUTA和含有带有不同的靶信号的不同荧光蛋白的序列的TRBO系列的表达载体得到的T-DNAs。(A)用于分泌型DsRed的表达的pTRAc rfp-AH,(B)用于ER-保留的DsRed的表达的pTRAc rfp-ERH,(C)用于胞浆DsRed表达的pTRAc rfp-H,(D)用于质体靶向DsRed表达的pTRAc rTPrfp-H,(E)用于蛋白体靶向DsRed表达的pTRAkc glyDS-zenH,(F)用于质体靶向GFP表达的pTRAc rTPgfp,(G)用于质体靶向DsRed表达的pUTATPrfp,(H)使用烟草花叶病毒复制子使胞浆GFP表达的TRBO-G。pTRA的载体骨架基于pPAM(GenBankAY027531)。pUTA的载体骨架包含来自RK2ori的宿主菌株独立质粒复制用的复制起始蛋白trfA。TRBO的骨架来源于pCB301(GenBank AF139061)。LB和RB表示T-DNA的左右边界;SAR表示核基质结合区(scaffold attachment region);P和PA表示带有重复的增强子和花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S基因的终止子的35S-启动子;CHS表示来自查尔酮合成酶基因(P.hortense)的5’-UTR;TL表示烟草蚀纹病毒(TEV)的5’-UTR;SP表示小鼠mAb24的密码子优化信号肽;TP表示来自H.vulgare的GBSSI的转运肽;rTP表示来自S.tuberosum的GBSSI的转运肽;DsRed表示来自Discosoma sp.的红色荧光蛋白;glyDs表示带N-糖基化位点的DsRed变异体;zen表示来自玉米的γ-玉米蛋白的N-末端;GFP表示来自Aequorea victoria的绿色荧光蛋白(S65C突变体,cycle3突变体);RK2ori表示复制的广宿主范围ori;bla表示β-内酰胺酶基因;ColE1ori表示复制的ori(E.coli);His6表示组氨酸标签;KDEL表示ER-保留标签;RBS表示核糖体结合位点;Pnos和pAnos表示胭脂碱合成酶的启动子和终止子;nptII表示新霉素磷酸转移酶基因;Replicase表示烟草花叶病毒(TMV)126K/183K蛋白;MP表示TMV运动蛋白;Rib表示核酶。
图2示出含有不同抗体的序列的pTRA系列的表达载体的T-DNA区域。(A)共表达2G12抗体重链、2G12抗体轻链和质体靶向DsRed的pTRAp2G12F-Ds;(B)共表达ER-保留2G12抗体重链、ER-保留2G12抗体轻链和质体靶向DsRed的pTRAp2G12F-Ds;(C)共表达M12抗体重链、M12抗体轻链和ER-保留DsRed的pTRAk MTAD。SPg表示Igγ-链的信号肽;2G12HC表示人抗-HIV-1gp120Ig2G12γ-重链;SPk表示人Igκ-链的信号肽;2G12LCF表示人抗-HIV-1gp120Ig2G12κ-轻链;pat表示草胺膦乙酰转移酶(phosphinothricinacetyltranferase);M12HC表示人Ig M12γ-重链;M12LC表示人Ig M12λ-轻链。(参见图1)
图3示出基于含有带不同靶信号的色氨酸脱羧酶序列的pSS系列的表达载体的T-DNA(S.Di Fiore et al.,"Targeting tryptophan decarboxylase to selectedsubcellular compartments of tobacco plants affects enzyme stability and invivo function and leads to a lesion-mimic phenotype",Plant Physiol129:1160–1169,2002)。载体骨架来源于pPCV002。(A)用于表达胞浆色氨酸脱羧酶(TDC)的pT-PYT;(B)用于表达质体靶向TDC的pT-CHL。Ω表示烟草花叶病毒的5’-UTR;tags表示c-myc/His6标签;pAocs表示章鱼碱合成酶的终止子。(参见图1、图2)
图4给出表达含有恶性疟原虫(plasmodium falciparum)3D7裂殖子表面蛋白1(GenBank XM_0013 52134)的片段的pTRAkc Msp1(383319)ERH-Ds的T-DNA。
图5示出用农杆菌感染5天后的BY-2细胞的肉眼观察照片,在白光下(A)和用于使DsRed的荧光可视化的绿色激发光下(B),包括用于人抗体(2G12)的重链和轻链的表达框和用于质体靶向红色荧光蛋白(DsRed)的表达框。上:浸润的“细胞堆叠”。下:从与农杆菌的共培养物中收获的细胞悬浮物,最终OD为0.05(左),最终OD为0.1(右)。
图6示出用农杆菌感染5天后的BY-2细胞的代表性显微镜照片,在白光下(A,B)和用于使DsRed的荧光可视化的绿色激发光下(C,D),包括用于人抗体(2G12)的重链和轻链的表达框和用于质体靶向红色荧光蛋白(DsRed)的表达框。得自农杆菌感染“细胞堆叠“的细胞(A,C)。与农杆菌共培养得到的悬浮细胞的最终OD为0.1(B,D)。
图7示出用农杆菌感染6天后的BY-2细胞堆叠的照片,在白光下(A)和用于使DsRed的荧光可视化的绿色激发光下(B),包括用于恶性疟原虫Msp1片段(p38-p33-p19)的表达框和用于质体靶向DsRed的表达框。在培养皿(A)中显示不同的光密度(1,0.5,0.25,0.125,0.0625)。(C)表示通过斑点印迹对来自恶性疟原虫的Msp1-P19的免疫检测。
图8示出在不同的农杆菌株被点在细胞上4天后扁平的BY-2细胞堆叠的照片,分别是:在白光下(A)、带有GFP过滤器组(B)、带有DsRed过滤器组(C)。(1-3)用pTRBO-G转化的EHA105农杆菌的3个克隆,(4-6)用pTRBO-G转化的GV2260农杆菌的3个克隆,(7)含pUTA-TPrfp的EHA105,(8)含有pUTA-TPrfp的GV3101::pMP90RK和(+)阳性对照含有pTRA-rTPgfp的GV3101::pMP90RK。
图9示出在农杆菌感染5天后不同靶向的荧光蛋白在细胞堆叠中的积累。在微柱中0.3g鲜重的细胞堆叠(A)和14ml柱中3克细胞堆叠(B)被瞬时转化。(1)质体靶向GFP,(2)未转化的细胞,(3)分泌型DsRed,(4)ER-保留DsRed,(5)胞浆DsRed,(6)质体靶向DsRed,(7)蛋白体靶向DsRed,(8)与ER-保留DsRed共转化且质体靶向的GFP。这些照片是在白光下(左)、设置有DsRed过滤器(中)和设置有GFP过滤器(右)的条件下拍摄的。DsRed的提取量示于(C)。
图10示出在不同尺寸的柱中瞬时表达DsRed的BY-2细胞堆叠的照片。(A)在白光下,(B)设置有DsRed过滤器。
图11示出通气条件对瞬时表达的DsRed和2G12的表达的影响。(A,B)示出在柱中不同地通气的细胞堆叠的照片,(A)在白光下,(B)设置有DsRed过滤器。(C)示出在农杆菌感染140小时后DsRed和2G12在柱状堆叠的BY-2细胞中的积累。细胞堆叠的重量减轻示于下方的图表。
图12示出在用转基因农杆菌浸润5天后柱状堆叠的细胞的总提取物和洗脱物的经考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。(A)用分泌M12抗体或蛋白体形成DsRed(对照组)的表达构建体感染。(B)用分泌或ER-保留的DsRed的表达构建体感染。凝胶上的提取物样品相当于约10mg新鲜细胞重量(FCW),凝胶上的洗脱物样品相当于约20mgFCW的洗脱物。
图13示出在用不同靶向的色氨酸脱羧酶或GFP进行农杆菌感染后的不同时间点瞬时转化的堆叠细胞中的色胺积累。在农杆菌感染18小时后追加额外的色氨酸(trp)。
图14示出在用含有分泌DsRed(rAH)或ER-保留DsRed(rERH)的植物表达载体的农杆菌浸润4天后由不同地预培养的悬浮培养物产生的长春花细胞堆叠的照片。这些照片是在白光下(A)和设置DsRed过滤器(B)的条件下拍摄的。悬浮细胞分别在MS67培养基或BY-2培养基中培养。
图15示出将不同的曲霉菌点在堆叠上11天后BY-2细胞堆叠的照片。(A)黑曲霉,(B)构巢曲霉,(C)黄曲霉,(D)寄生曲霉。
图16示出从5日龄BY-2野生型悬浮培养物产生的4日龄柱状堆叠细胞的洗脱物(1)和相应于9日龄BY-2野生型悬浮培养物的培养基(2)的经考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。
具体实施方式
实施例1
悬浮物中的瞬时表达与细胞堆叠中的瞬时表达的比较
为了评价在本发明的细胞堆叠中生产瞬时重组蛋白,将DsRed和抗体2G12在农杆菌浸润细胞堆叠中的瞬时表达与在液体培养物中将细胞悬浮物与农杆菌共培养的现有技术方法进行比较。
使用重组农杆菌(菌株GV3101::pMP90RK),其携带在同一个T-DNA上含有用于人抗体(2G12)的重链和轻链的表达框以及用于质体靶向红色荧光蛋白(DsRed)的表达框的二元载体pTRAp-2G12FER-Ds。两种2G12基因都包含ER-保留抗体的KDEL序列(图2B)。该KDEL序列被刻意用来避免抗体分泌,以便直接比较细胞堆叠和悬浮细胞的生产率。
用于瞬时转化的农杆菌菌株如下制备。通过将50μl接种于5ml YEB培养基(5g/l牛肉提取物,1g/l酵母提取物,5g/l蛋白胨,0.5g/l MgSO4,pH7.4,辅以50mg/l羧苄青霉素和25mg/l卡那霉素)由甘油储存液引发培养物。细菌培养物在26℃生长3天至光密度(OD)约为5。将细菌通过离心沉淀而颗粒化,再用浸润培养基(50g/l蔗糖,2g/l葡萄糖,0.5g/l2Mega(Planta Düngemittel,德国),pH5.3,辅以200μM乙酰丁香酮),按OD=1进行悬浮。然后,在应用前,将该细菌悬浮物在22℃培育1小时,。
将烟草(Nicotiana tabacum L.cv.bright yellow,BY-2)细胞在液体培养基(3%蔗糖,4.3g/L的Murashige&Skoog盐,100mg/L肌醇,1mg/L硫胺素,0.2mg/L2,4-二氯苯氧基乙酸,200mg/L KH2PO4,pH5.6)中,在黑暗中、旋转振荡仪(180rpm)上于26℃进行培养。将细胞每周在新鲜培养基中用4%的接种物继代培养,。
植物细胞和农杆菌用消毒设备在无菌条件下进行处理。将50ml分装的4日龄400mlBY-2悬浮培养物倒入75ml带有5.5cm直径的纤维素过滤器(MN615)的布氏漏斗,通过抽真空(约500mbar,1min)完全移除培养基。将得到的细胞堆叠转移到培养皿中,测定新鲜细胞重量(FCW)(重量=4.5g,直径=5.5cm,高度=0.3cm,密度=0.63g/cm3)。然后,将2.5ml OD1的农杆菌悬浮物(0.55ml/g细胞堆叠)均匀地滴到细胞堆叠上,形成完全浸润。调整施加的液体量,使得细胞堆叠被均匀地润湿,但没有被完全淹没,以允许气隙快速恢复。将农杆菌浸润的细胞堆叠在黑暗中于26℃、以95%的相对湿度(RH)培养5天。
为了进行共培养,将2.5ml和5ml OD1的农杆菌悬浮物以与在细胞堆叠中相同和加倍的农杆菌与植物细胞的比率加入至50ml BY-2悬浮培养物。
将共培养培养物在黑暗中于26℃在旋转摇床上以180rpm进行培养。在5天后通过真空过滤从共培养培养物中收获BY-2细胞,将所得细胞堆叠转移到培养皿中。在通过用于DsRed表达的红色发光过滤器的绿色激发光下对从两个实验中得到的细胞进行肉眼观察(图5)。在根据本发明制备的农杆菌感染细胞堆叠中可清晰地观察到红色荧光。引人注目的是,在悬浮物中与农杆菌共培养的细胞中没有观察到红色荧光。细胞的显微分析清楚地表明,相比在悬浮物中共培养的现有技术方法(图6),根据本发明的细胞堆叠方法能够得到更高的感染率以及每个细胞的高DsRed表达。
这两种方法都提取可溶性蛋白,并且对DsRed和抗体的积累进行定量。简言之,将细胞通过超声处理(Bandelin,Sonopuls,间隔0.9s,40W,2×30s)在2个体积(w/v)的提取缓冲液(50mM磷酸钾,500mM氯化钠,10mM硫酸氢钠,pH7.5)中均化。将细胞碎片通过离心过滤(15min,13000g,4℃)颗粒化,将清澈的上清液用于进一步分析。通过测量提取的可溶性蛋白的荧光(激发530±12.5nm,发射590±17.5nm)对DsRed进行定量。抗体的定量是使用蛋白A被偶联至CM5传感芯片的BIACORETM T200仪器进行表面等离子体共振光谱而实施的(例如参见T.Holland et al.,"Optimal nitrogen supply as a key to increased andsustained production of a monoclonal full-size antibody in BY-2 suspensionculture",Biotechnol Bioeng 107:278-289,2010)。
在由共培养悬浮细胞得到的提取物中既没有检测到DsRed,也没有检测到2G12抗体。与此相反,从农杆菌感染细胞堆叠得到的提取物每克FCW含有55μg DsRed和47μg 2G12抗体。
这个例子表明通过使用本发明的细胞堆叠,与悬浮培养物相比,在细胞堆叠中与重组农杆菌共培养后可以通过瞬时表达得到实质上更高收率的重组蛋白质。此外,这个例子清楚地表明,细胞堆叠的高生产率是由于相当高的转化效率(通常为50%~80%)以及在细胞内的更多的产物积累。
实施例2
恶性疟原虫抗原在细胞堆叠中的瞬时表达
为了测试细胞堆叠是否可用于生产疟疾抗原,瞬时生产恶性疟原虫的不同蛋白质。
含二元载体的重组农杆菌菌株,该二元载体带有用于来自恶性疟原虫的Msp1(p38,p33和p19)的ER-保留羧基末端片段的表达框和用于质体靶向DsRed的第二表达框(图4)。如实施例1所述地生长并准备细菌。在感染植物细胞前,将农杆菌浸润悬浮物从OD1连续稀释至OD0.0625。
如实施例1所述地将3日龄的BY-2悬浮培养物用于生长细胞堆叠。将该细胞堆叠切成大约5mm×5mm×10mm的片(图7A)。将六片转移到培养皿中,并以不同光密度的农杆菌悬浮物滴加浸润至饱和(约150μl/细胞堆叠)。阴性对照仅用浸润培养基浸润(图7)。在20℃、95%RH的条件下培育6天后,对堆叠片进行DsRed荧光和抗原表达分析。DsRed是在通过红色发光过滤器的绿色激发光下进行肉眼观察(图7B)。为了检测疟原虫蛋白,如实施例1所述地提取可溶性蛋白,将每个提取物的等分试样点到硝酸纤维素膜上。疟原虫蛋白的存在通过在用NBT/BCIP(硝基蓝四唑/5-溴-4-氯-3’-吲哚基磷酸酯)培养后对P19域和AP偶联第二抗体使用单克隆抗体5.2进行免疫检测而可视化。
所有受感染的细胞堆叠都检测到强烈的DsRed荧光(图7B)。在以OD1的农杆菌浓度浸润的细胞堆叠和以超过10倍稀释的OD0.0625的农杆菌悬浮物浸润的细胞堆叠之间仅检测到荧光强度的微弱差异。所有浸润的细胞堆叠中共转化的疟原虫蛋白的清澈的免疫检测物也都没反映出农杆菌的10倍稀释物(图7C)。用OD1的农杆菌悬浮物浸润得到最高的积累水平。
在另外的实验中,来自恶性疟原虫的其他蛋白质(Pfsp25单独和与DsRed融合;和由来自几种不同的疟疾蛋白的域构成的另一融合蛋白)被成功地表达于不同的BY-2细胞堆叠形式(数据未显示)。本例显示,重组蛋白积累甚至在细胞堆叠被较低量的农杆菌浸润时也高。因此,本发明提供一种更经济的生产方法,该方法对大规模的工业应用特别重要。也表明不同的疟疾蛋白可以有效地表达和生产,并且所公开的方法通常适合于疟疾疫苗和针对其他感染性疾病的疫苗的开发和生产。
实施例3
为筛选应用而使用细胞堆叠
由于细胞堆叠是高度均质化的,所以它们用于筛分目的也很理想。因此,在本例中通过评价所采用的农杆菌菌株和不同的表达载体对瞬时产物积累的影响而表明。使用两种不同的表达载体:含有35S-启动子驱动的质体靶向DsRed的二元载体pUTA-TPrfp(图1G);包含外壳蛋白序列被GFP替换的烟草花叶病毒(TMV)的35S启动子驱动的cDNA序列的二元载体pTRBO-G(图1H)(J.A.Lindbo,“TRBO:a high-efficiency tobaco mosaic virus RNA-based overexpression vector”,Plant Phys145:1232-1240,2007)。每个载体被引入到两个不同的农杆菌菌株中。标准载体pUTA-TPrfp被引入到GV3101::pMP90RK和EHA105中;病毒载体pTRBO-G被引入到GV2260和EHA105中(R.Helens et al.,“A guide to Agrobacteriumbinary Ti vectors”,TIBS5:446-451,2000)。
在GV3101::pMP90RK中的pTRA-rTPgfp被用作阳性对照(图1F)。GV-pUTA-TPrfp、EHA-pUTA-TPrfp和GV-pTRA-rTPgfp的液体培养物被甘油储存液(glycerol stock)引发。对于GV-pTRBO-G和EHA-pTRBO-G培养物,每一个菌株接种由新制备的带质粒DNA的电转化物获得的三个未检查菌落。在标准条件(GV-pUTA-TPrfp、GV-pTRBO-G和GV-pTRA-rTPgfp:50mg/l羧苄青霉素和25mg/l卡那霉素,EHA-pUTA-TPrfp:50mg/l羧苄青霉素,EHA-pTRBO-G:25mg/l卡那霉素)下,生长农杆菌菌株(实施例1)。3天后,将细菌通过离心沉淀颗粒化,并用浸润培养基重新悬浮成OD1。在应用前,将细菌悬浮物在22℃培育3小时。用25ml在标准条件下成长的5日龄BY-2培养物使细胞堆叠(重量=4g,直径=5.5cm,高度=0.3cm,密度=0.56g/cm3)生长(实施例1)。将细胞堆叠倒置于培养皿中,然后将40μl的各农杆菌悬浮物点于光滑的表面。将浸润的细胞堆叠在26℃、95%RH的条件下培育。4天后,在通过用于GFP表达的绿色滤光片的蓝色激发光下(图8B)和通过用于DsRed表达的红色滤光片的绿色激发光下(图8C)对细胞堆叠进行观察。在使用EHA105将表达构建体传递进入植物细胞时,病毒载体以及标准二元载体的荧光蛋白表达明显效率较低。这个结果通过以相同的农杆菌悬浮物感染3g柱状细胞堆叠和使本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时转化得到证实(数据未显示)。这种容易处理小规模“农业试点”的方法也可以用来评价能够影响目标蛋白表达的其他参数(例如,农杆菌的生长条件和预处理,浸润细胞堆叠的浸润培养基组合物或培养条件)。无需使用高技术设备就可以并行分析数百个样品,装有400mlBY-2培养物的1L摇瓶将在5天内提供16次4g细胞堆叠的材料,由400ml11日龄的培养物,能够生产30个细胞堆叠。
实施例4
在柱状细胞堆叠中的瞬时表达
为了测试是否能够生产、浸润和保持柱状细胞堆叠,进行几个实验。在这个例子中,不同靶向版本的红色荧光蛋白DsRed和绿色荧光蛋白GFP被瞬时表达在柱状形式的堆叠细胞中。
使用携带用于分泌型DsRed(图1A)、ER-保留DsRed(图1B)、胞浆DsRed(图1C)、质体靶向DsRed(图1D)、蛋白体靶向DsRed(图1E)和质体靶向GFP(图1F)的二元表达载体的不同农杆菌菌株。如实施例1所述地制备用于农杆菌感染的农杆菌悬浮物。在应用前,将细菌悬浮物在22℃下培育5小时。为了共感染实验,混合2个OD1的农杆菌菌株(分别含有ER-保留DsRed和质体靶向GFP),使各菌株的OD为0.5。
将在标准条件下生长的11日龄BY-2悬浮细胞(实施例1)用于在两种不同类型的无菌聚丙烯柱中生产细胞堆叠。使用体积0.7ml的微型旋转柱(Receiver Column20μm,MACHEREY-NAGEL,德国,图8A)和体积14ml的中长柱(QIAGEN-tip100column,QIAGEN,德国,图9B),二者都配备有20μm聚乙烯玻璃过滤器(filter frit)。通过将悬浮培养物注入连接到真空的柱内而生成细胞堆叠。将培养基通过真空过滤完全移除之后,对所得细胞堆叠的尺寸进行测定。将1ml悬浮培养物用于微柱,得到直径为0.68cm、高度为1.5cm、密度为0.54g/cm3的重量0.3g的细胞堆叠。由10ml悬浮物在中长柱中生成的细胞堆叠的重量为3g,直径为1.4cm,高度为3.6cm,密度为0.54g/cm3。
通过将农杆菌悬浮物移液到细胞堆叠(1ml/g细胞堆叠)上而将该细胞堆叠浸润在柱中。为了实现完全浸润,施加短暂真空直到第一滴液滴离开柱,但细胞堆叠的顶部仍被悬浮物覆盖。在22℃培育该浸润的细胞堆叠30分钟后,通过对柱施加真空将剩余的液体完全移除以恢复气隙。所施加液体的移除通过测定处理过的柱状堆积细胞的重量进行控制。为确保在后续培育期细胞的高存活能力,因细胞堆叠或细胞吸收液体而导致的重量增加优选不超过例如堆叠的原始新鲜细胞重量(FCW)的15%。该细胞堆叠均在26℃和92%相对湿度下于柱中进行培养。农杆菌感染5天后,如实施例1所述地从细胞堆叠中提取全部可溶性蛋白。
在所有浸润的细胞堆叠中均可肉眼观察到荧光蛋白的表达(图9),这表明细胞堆叠中不同的细胞隔室可用于生产重组蛋白。该细胞堆叠表现出均匀的荧光,意味着农杆菌被有效地传递到细胞堆叠的各个区域。根据目标隔室,积累水平方面观察到明显的差异,范围为约40μg/gFCW(质体靶向DsRed)~约160μg/g FCW(胞浆DsRed)(图9C)。靶向到蛋白体的DsRed在体内显示出高荧光,但由于蛋白体的不溶性而无法提取。DsRed和GFP(图9A8和图9B8)的同时表达表明能够用两个分开的农杆菌菌株进行共感染。细胞堆叠的大小(微柱:0.3g或14ml柱:3g)对表达水平没有影响。因此,可以设想微细胞堆叠对筛选和分析目的非常有用,例如,确定大规模生产(例如预培养、感染和共培养条件)的最优参数,评价不同的表达构建体或者开发和研究代谢途径。由于细胞堆叠的高均匀性,所以对统计设计和多元实验特别有用。为了高通量分析,可使用与自动***兼容的96孔过滤板(例如Receiverplate20μm,MULTI96filter plate,均为MACHEREY-NAGEL,德国)。这些过滤板的孔类似于本实施例中用于生成和浸润细胞堆叠的微柱。与96孔板中悬浮培养物内的高通量分析相比,微细胞堆叠具有瞬时表达更有效的优点(见实施例1),并且能够将更多的生物质用于分析。除了上面所用的柱,也对更大的柱进行了测试(图10)。在70ml柱(GenEluteTM HP Plasmid Midiprep Kit filter syringe,US Sigma公司)中12g细胞堆叠(2.8cm直径,3.5cm高度)内、和在150ml柱(聚丙烯柱150ml,MACHEREY-NAGEL,德国)中87g细胞堆叠(3.7cm直径,11cm高度)内,农杆菌感染4天后观察DsRed的表达。该12g细胞堆叠由4日龄的BY-2悬浮培养物产生并用携带质体靶向DsRed的表达构建体的农杆菌浸润(图2B)。87g细胞堆叠由11日龄的培养物产生并用携带ER-保留DsRed的表达构建体的农杆菌浸润(图1B)。与上述标准方法的唯一差别是87g细胞堆叠用OD0.25的农杆菌悬浮物浸润。通过称重确定细胞堆叠的密度,并确认移除了足够的液体以还原气隙。不同的实验还表明不同年龄(即继代培养后几天)的细胞适合于产生本发明的细胞堆叠。而且,不同形状和尺寸的细胞堆叠也是可以的。这个例子表明在无菌可控条件下改变和培育较大的细胞堆叠也是可行的。区别于通常不是无菌的基于叶片的体系。
实施例5
增加通气对瞬时蛋白生产的影响
为调查通气对转化的堆叠细胞性能的影响,对不同设置进行了测试:(1)主动通气的细胞堆叠,(2)被动通气的细胞堆叠,(3)带中央通风道的细胞堆叠,(4)在穿孔柱中的细胞堆叠(图11A)。
如实施例1所述,在标准条件下生长并准备携带二元载体pTRAp-2G12FER-Ds的农杆菌菌株(图2B)。
在标准条件下生长的4.5日龄的BY-2悬浮细胞被用于在14ml的细长柱中生成细胞堆叠(实施例4)。在实验1、2、4中,生成固体细胞堆叠,穿孔柱用密封。在实验3中,直径2.5mm的塑料棒被放置在柱的中心。该细胞堆叠的直径为1.4cm,重量为2.1~2.5g,高度为2.5~2.7cm,密度约为0.57g/cm3。在用农杆菌悬浮物浸润并移除液体(实施例4)后,从柱3移除棒,从柱4移除以提供带中央空气通道的细胞堆叠和从侧方额外供给空气的细胞堆叠。这些柱在恒温箱中于26℃、92%RH进行培养。柱1被连接于抽气泵,该抽气泵被放置在培养箱内以供给26℃、92%RH的空气。泵的容量为50l/小时,并设定为周期性抽吸(开启15分钟,关闭45分钟)。农杆菌感染6天后,测定该细胞堆叠的重量,并从细胞堆叠中提取可溶性蛋白,对DsRed和2G12抗体的表达进行分析(如实施例1所述)。因为细胞堆叠的不同重量损失,基于在培养箱中开始培养的FCW计算DsRed和抗体2G12的量(图11C)。结果表明,由强制通气(图11C1)或增加的表面(图11C4)引起的蒸发所致水分损失,对堆叠细胞的生产率产生不利影响。在重量损失超过20%的细胞中,质体靶向DsRed的积累以及ER-保留抗体的积累都降低。因此,应当使用最大限度地减少了细胞堆叠的干燥(例如通过增加相对湿度或对细胞堆叠进行加湿)的培养条件。另一方面,结果显示,在该范围内,通气是充足的,且不需要用于改善氧气供应和气体交换的措施。
实施例6
从堆叠的细胞中无损地收获分泌的产品
为确定是否可以不破坏细胞地洗脱重组分泌蛋白,将BY-2悬浮细胞堆叠在柱中,并通过农杆菌感染瞬时转化。包含用于分泌型单克隆抗体M12的表达构建体以及ER-保留DsRed(图2C)、分泌型DsRed(图1A)、ER-保留DsRed(图1B)和蛋白体形成DsRed(图1E)的不同农杆菌菌株被分别用于实验。M12抗体(150kDa)和DsRed(108kDa)是大分泌蛋白的例子。因为ER-保留DsRed是细胞内的,所以适合控制以检查是否植物细胞在培育或洗脱时被破坏。不溶性蛋白体形成DsRed用作全细胞提取物的对照。
在标准条件下生长的11日龄的BY-2悬浮细胞(实施例1)被用于在柱中产生细胞堆叠。将10ml悬浮培养物倒入装备有20μm聚乙烯玻璃过滤器的14ml聚丙烯柱(直径1.4cm,高度9cm)中。将培养基通过真空过滤完全移除,通过将农杆菌悬浮物移液到细胞堆叠上(1ml/g细胞堆叠)在柱内将得到的细胞堆叠(重量=3g,直径=1.4cm,高度=3.6cm,密度=0.54g/cm3)浸润。为了实现完全浸润,施加短时真空直到第一滴液滴离开柱,但细胞堆叠的顶部仍然覆盖着悬浮物。在22℃培育该浸润的细胞堆叠30分钟,然后通过对柱施加真空将剩余的液体完全移除以恢复气隙。该细胞堆叠在柱中以26℃、92%相对湿度进行培养。农杆菌感染5天后,用2倍体积的提取缓冲液(50mM磷酸钾,500mM NaCl,10mM亚硫酸氢钠,pH7.5)从堆叠的细胞的200mg FCW样品中提取总可溶性蛋白。为了只回收分泌的蛋白质,如下所述地对剩余的柱堆积细胞进行清洗。对柱施加3ml缓冲液,并通过短时真空将其吸入细胞堆叠。培养30分钟后,通过真空收集缓冲液,并再次施加到细胞上。在连续的三次清洗步骤后,回收到2.7ml洗脱液,随后实施离心澄清。对总提取蛋白制剂和可洗提的蛋白质在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上进行重组蛋白质的含量分析(图12)。凝胶上承载的蛋白量对应于来自10mg细胞堆叠的总提取蛋白和来自20mg细胞堆叠的可洗提蛋白质。抗体(图12A)和DsRed(图12B)的提取物和洗脱物中,该重组蛋白条带的强度几乎相同。这意味着,在这两种情况下,总共生产的重组蛋白的约50%可以被洗脱。但是在洗脱样品中,污染的宿主蛋白的量较低。
M12抗体的量通过表面等离子共振谱、用偶联至传感器芯片的蛋白A进行定量,通过荧光测定DsRed的量。约55%(96μg/g FCW)的总共生产的分泌型M12(175μg/g FCW)和40%(28μg/g FCW)分泌型DsRed(70μg/g FCW)被洗脱。洗脱样品中总共生成的ER-保留DsRed(120μg/g FCW)的只一小部分(小于1%)的存在表明该细胞在分泌蛋白的培养过程中或洗脱过程中没有损坏(也见图12B)。
当使用植物叶片或整株植物瞬时转化的现有技术方法时,分泌产物的选择性制备通过收集细胞间的清洗液在分析规模是可行的,但更大规模是不切实际的。因此,在大规模下,必须从整个生物质提取物中回收分泌的产品。因而,所期望的产物必须从宿主化合物(例如蛋白质、代谢物、木质素、纤维素)的复杂混合物中进行纯化。特别是酚类化合物在下游加工和纯化方面是有问题的。就这方面而言,本发明克服了这些问题,因为分泌的产品可直接从细胞堆叠洗脱而不会破坏植物细胞,并且宿主化合物的污染最小。此外,由于可扩展性,细胞堆叠方法可以在大的产业规模下实施。可以想象的是,在优化的洗脱和培养条件下,从堆叠的细胞重复洗脱分泌的产物将获得所期望产物的更高产率。
实施例7
通过代谢工程生产新的次级代谢物
为了在细胞堆叠中建立一个新的生物合成途径,普通烟草(N.tabacum)中不存在的酶、即色氨酸脱羧酶(TDC;EC 4.1.1.28)在BY-2细胞堆叠中被瞬时表达。
TDC是催化通过1-色氨酸脱羧而生产原生物碱色胺的萜类吲哚生物碱生物合成途径中的早期步骤的胞质酶。色胺是一组与治疗相关的次生代谢物(例如来自长春花的抗癌药物长春碱和长春新碱)的共同前体。为了进一步提高所希望的代谢物的产率,前体色氨酸在第二步骤中转化后提供给细胞堆叠。
例如实施例4所述,4日龄的BY-2悬浮细胞被装填在14ml柱中,提供2g FCW细胞堆叠,密度为0.58g/cm3。该细胞堆叠通过农杆菌感染而瞬时转化成两份(in duplicate)。与用于质体靶向绿色荧光蛋白(GFP)(图1F)、质体靶向TDC(图3A)或用于胞浆TDC(图3B)的植物表达构建体转化的根癌农杆菌菌株GV3101::pMP90RK在标准条件下生长(实施例1)。
将农杆菌菌株离心沉淀而颗粒化,重新悬浮并由浸润培养基调整至OD1。在应用到植物细胞堆叠之前,将该细菌悬浮物在22℃培育4小时。
每个细胞堆叠用2ml农杆菌悬浮物浸润,在22℃培育30分钟,抽真空干燥,再在26℃、92%相对湿度条件下培养。在农杆菌感染18小时后,将细胞堆叠再次用2ml色氨酸溶液(50mM半浓缩浸润培养基)或用2ml半浓缩浸润培养基浸润。在26℃将浸润的细胞堆叠培育30分钟后,将溶液再次通过抽真空而完全移除,将柱状填充的细胞放回培养仓。在农杆菌感染后69小时、91小时和112小时取样约250mg FCW,并在-80℃储存。根据RS Sangwan等人的方法("Direct fluorometry of phase-extracted tryptamine-based fastquantitative assay of l-tryptophan decarboxylase from Catharanthus roseusleaf",Anal Biochem255:39–46,(1998)),稍作修改,提取和检测色胺。
简言之,通过在2体积(v/w)提取缓冲液(50mM磷酸钾,500mM NaCl,10mM硫酸氢钠,pH7.5)(参见实施例1)中实施超声处理,从细胞样品中提取水溶性化合物。将0.9ml蒸馏水加入到0.1ml清澈提取物中后,加入2ml5M NaOH和3.5ml乙酸乙酯。将该乳液通过涡旋10秒进行混合,并于4℃放置16小时使其相分离。通过使用Aminco Bowman AB2荧光光谱仪(Spectronic Instruments,罗彻斯特,纽约)对上层有机相进行荧光分析。在激发波长为280nm和发射波长为350nm、激发光和发射光用狭缝宽度为4纳米及光电倍增管电压设定为575V的条件下,对色胺荧光进行测定。
检测到的色胺水平表明活性TDC被分别表达在质体和胞液中(图13)。所引入的酶将内源性色氨酸转化成新的色胺物质。将额外的色氨酸添加到瞬时TDC表达细胞使得色胺的生产明显增加(5倍于质体靶向TDC,接近10倍于胞浆TDC)。
这个例子还显示本发明的方法可用于生产代谢物。此外,表明细胞堆叠不仅可以被变化成例如产生酶(TDC),而且在后续步骤中底物和/或前体可以很容易地供给到细胞中以提高产物产率。因此,本发明还包括通过例如反复转化、浸润和培养步骤,将任何感兴趣的物质传递到细胞内以优化产物形成(例如,额外的植物营养素、诱导剂、抑制剂)的可能性。细胞代谢的操控可以在通过施加合适的化合物和基因的任意组合来传递遗传信息的期间、之前和/或之后进行。
本领域技术人员容易认识到由野生型、突变的和/或转基因的悬浮培养物制备的细胞堆叠,也可以不进行转化就实施操控,即通过应用不同的化合物。尤其是,这意味着指天然存在的化合物的产率可通过使用本发明的细胞堆叠,并加入合适的底物、激素、抑制剂和/或前体而提高。
实施例8
来自不同植物物种的悬浮培养物的细胞堆叠
除了普通烟草BY-2悬浮细胞,还使用了其他几种植物细胞悬浮物生产细胞堆叠。
长春花
将长春花细胞在MS67培养基(3%蔗糖,4.4g/L Murashige&Skoog盐,0.6mg/l硫胺素,0.2mg/l激动素,1mg/L2,4-二氯苯氧乙酸,pH5.8)或在BY-2培养基(实施例1)中、旋转摇床(180rpm)上、于26℃在暗处进行培养。将细胞每周在新鲜培养基中进行继代培养(20:100)。
拟南芥
将拟南芥细胞在ARA培养基(3%蔗糖,4.4g/L Murashige&Skoog盐,0.5mg/L萘乙酸,0.1mg/l激动素,pH5.7)中、旋转摇床(180rpm)上按16小时亮/8小时暗于26℃进行培养。将细胞每周在新鲜培养基中进行继代培养(15:100)。
本氏烟
将本氏烟草的细胞在BY-2培养基(实施例1)中于26℃、在黑暗中、旋转摇床(180rpm)上进行培养。将细胞每周在新鲜培养基中进行继代培养(20:100)。
由各悬浮培养物制备不同形状的细胞堆叠。实验使用4~5日龄的培养物。如实施例1所述,生成不同厚度(0.2~0.5cm)的饼干样细胞堆叠。如实施例4所述,在14ml的细长柱中制备高度约2~4cm的细胞堆叠。根据不同的植物物种,得到不同密度的细胞堆叠。长春花细胞堆叠的密度通常为0.65~0.75g/cm3,拟南芥细胞堆叠具有约0.55~0.67g/cm3的密度,本氏烟草堆叠具有约0.6~0.7g/cm3的密度。
浸润了携带二元载体pTRAp-2G12FER-Ds的农杆菌的长春花、拟南芥和本氏烟草的细胞堆叠(图2B)呈现出肉眼可见的DsRed表达。对于每个被测试的植物物种,也如实施例1所述地通过表面等离子体共振谱证实了抗体2G12的产生。
有趣的是,根据用于长春花悬浮培养物的培养基,表达水平被观察到有明显的差异。通过将由在MS67培养基中或BY-2培养基中与两种不同的DsRed表达构建体、即pTRAcrfp-AH和pTRAc rfp-ERH(图1A、B)生长的细胞产生的长春花细胞堆叠转化,进行进一步的分析。分泌的DsRed和ER-保留DsRed在细胞中的积累都高得多,细胞是生长在BY-2培养基中的细胞(图14)。这表示预培养条件优化对实现高转化和/或高产物合成的重要性。实验表明,本发明可以应用于来自不同物种的植物细胞。
本领域技术人员公知培养条件(例如温度、通气、搅拌速度、光组成等)和/或培养基组成(例如营养物质、激素、pH、电导率、浸润压等)是植物悬浮培养物的形态学和生理特征的决定因素。各因素的变化对后续步骤中植物细胞的性能有影响。这意味着培养条件和/或培养基组成必须为任何生产而优化。除了初始原料生产的优化,浸润参数(例如农杆菌浓度、接触时间、浸润培养基组成)和细胞堆叠的培养条件(例如时间、温度、通气、送料、添加剂的应用)必须为任何植物细胞株和任何产品而优化。
实施例9
使用堆叠细胞作为病原体培养的底物
使用在标准条件(实施例1)下成长的50ml4日龄BY-2培养物生成3.64ml细胞堆叠(重量=2g,直径=5.5cm,高度=0.15cm,密度=0.55g/cm3)。将细胞堆叠放置在空培养皿中,并用1ml浸润培养基(50g/l蔗糖,2g/l葡萄糖,0.5g/l Ferty2Mega(Planta Düngemittel,德国),pH5.3)浸润,该浸润培养基完全被细胞堆叠(细胞堆叠的重量=3g;密度=0.825g/cm3)吸收。发现该体积量(即,小于或等于1ml/2g细胞堆叠)有利于在培养皿中开始细胞堆叠的培育,因为气隙能够在几小时内再生。通过控制测量因蒸发而减少至小于0.6g/cm3的细胞堆叠的密度得到证实。重要的是,更大量的液体(即超过1ml/2g细胞堆叠)是高度不利的,因为过量的液体使得气隙不能被重新构建,结果使得细胞堆叠的密度太高以至无法适当地维持细胞的生存能力或防止细胞死亡。
下一个处理步骤包括将小体积的四种不同的曲霉种的孢子悬浮物20μl点在细胞堆叠的表面(图15,A-D)。将细胞堆叠培养11天,然后拍摄照片(图15)。
这个例子显示植物细胞堆叠可以被用作不同曲霉种的成长底物。曲霉被选择作为植物病原体的代表,也可作为人类和动物病原体的代表。
在这个例子中,由野生型BY2悬浮细胞制备细胞堆叠,以便随后培养真菌。本领域技术人员理解也可使用转基因悬浮细胞。特别是,可以使用生产抗真菌肽、蛋白质或化合物的转基因细胞堆叠,研究它们对真菌的生长和发育的影响。同样,由野生型细胞生成的细胞堆叠可以先经转化处理,然后用于研究产品对真菌病原体成长的影响。本领域技术人员还可接受本方法也可用于研究抗细菌化合物的影响。在下述实施例11中描述了细胞堆叠在高通量筛选应用中的多滴定板中的使用,显而易见的是这些实施例也可以进行组合。
实施例10
从由转基因悬浮细胞株生成的细胞堆叠中非破坏性地收获分泌产物
在用分泌型单克隆抗体M12与ER-保留DsRed的表达构建体转化后,生成转基因BY2悬浮培养物(图2C)。在含有卡那霉素的板上选择后,转基因愈伤组织被转移到液体培养基中,以建立高度均匀的悬浮培养物。悬浮培养物通过每周将4%的悬浮培养物转移到新鲜液体培养基中进行继代培养(实施例1)。
将5日龄的悬浮培养物的悬浮细胞收集用于生成本发明公开的细胞堆叠或者将细胞进一步在悬浮培养物中进行培养。将细胞堆叠和悬浮培养物再培养4天。如实施例6所述,例如使用14ml聚丙烯柱制备2g FCW(新鲜细胞重量)的细胞堆叠。再次,仔细地监视气隙的构建,并通过测量移除了液体培养基的铸型细胞堆叠的密度,在整个培育/培养中进行控制。最终,在26℃培育细胞堆叠的过程中始终确保90%的相对湿度,以防止细胞堆叠内的细胞干燥。
细胞堆叠或得自(通过真空过滤从培养基中分离出来的)悬浮培养物的细胞的400mg FCW样品的总可溶性蛋白用2倍体积的提取缓冲液(50mM磷酸钾,500mM NaCl,10mM亚硫酸氢钠,pH7.5)提取。
从柱状堆叠细胞中分泌的抗体通过用提取缓冲液(实施例6)清洗该柱状堆叠细胞而回收。简言之,2ml缓冲液施加到2g柱中,通过短时真空被细胞堆叠吸收。培育30分钟后,通过抽真空收集缓冲液,并再次施加到细胞上。在连续三次清洗后,回收到1.6ml洗脱液。从原始悬浮培养基中收集到的样品被用于比较。
在(通过胺耦合固定的)蛋白A表面,通过SPR测定抗体浓度,采用在CHO细胞中产生的纯化人抗体H10作为标准。所有样品均在剂量-反应曲线的线性范围内进行分析。DsRed通过使用DsRed标准由荧光进行确定。
尽管悬浮培养物已达到高细胞生物质,但是在悬浮培养物的上清液中没有检测到抗体。因此,分泌的重组产物的部分为0%。M12抗体的细胞内积累为4.02μg/g FCW转基因BY2悬浮细胞。因此,总收率(细胞上清液中的抗体加上细胞内的抗体)也是4.02g/g。
相比之下,M12的总收率达到11.4μg/g细胞堆叠,这相当于总收率大幅提高了284%。重要的是,可以从细胞堆叠中洗脱分泌的抗体。分泌产物的收率是1.4μg M12抗体/g细胞堆叠,对当于总收率的12%。
该实施例表明可以从转基因悬浮培养物生成的细胞堆叠中得到重组蛋白产物,并且与对照的悬浮细胞相比,收率显著提高284%。
与在悬浮物(分别为5.2μg/g FCW和3.0μg/g FCW)中的细胞相比,在细胞堆叠的细胞中ER-保留DsRed的产率提高70%。
这个例子还清楚地表明,以细胞堆叠的形式培育转基因悬浮细胞不仅允许产品以浓缩的形式被收集(相对于悬浮细胞培养物上清液),该形式对下游加工(包括加工时间和成本均降低)非常有利。
重要的是,细胞堆叠也提供了使用与细胞培养基不同的缓冲液来最大限度洗脱产品(此处为自细胞分泌的重组靶蛋白)的极好切入点,因此细胞堆叠给悬浮细胞提供了额外的好处。悬浮培养物的上清液含有比柱状堆叠细胞洗脱液更大量的多糖。优选多糖量低,因为凝胶状多糖阻碍像过滤和超滤这种下游流程。
此外,对于根据本发明所产生的细胞堆叠,所收获的被分泌的重组蛋白的百分比从0%(悬浮细胞)显著增加至12%(。
最后,本实施例表明在细胞堆叠中的总收率与作为悬浮细胞培养的相同细胞相比也显著增加。
本领域技术人员还将容易地理解,这种方法不限定于由转基因细胞生产和/或分离重组蛋白质,也同样适用于在非转基因或转基因细胞或其他感兴趣的产品中产生次级代谢物,包括(但不限于)初级代谢物、纤维、寡糖和多糖(纤维素、淀粉、半纤维素、木聚糖、果聚糖等)、天然肽和蛋白质、色素、维生素、香料、水果酸或植物细胞的任何其他产品。
实施例11
使用在多滴定板中产生的细胞堆叠
使用在板的底部含有液体可渗透性过滤器的多滴定板(Receiver plate20μm(No.740686.4),MACHEREY-NAGEL,德国),如上所述地生成细胞堆叠。
在接收板(Receiver plate)的每个孔中铸型1ml野生型(非转基因)烟草BY2悬浮培养物,生成96个微小细胞堆叠。使用NucleoVac96真空歧管(MACHEREY-NAGEL,德国),通过抽真空将液体培养基完全移除。用显微镜分析0.2g所得细胞堆叠是否存在气隙,使用独立的对照实验,确定所得细胞堆叠的密度小于0.7g/cm3。
对每个细胞堆叠施加0.8ml携带编码抗体M12(图2C)或抗体2G12(图2A)的pTRA质粒的重组根癌农杆菌悬浮物(OD600nm=0.1)。对每个抗体表达构建体,浸润32微小细胞堆叠。30分钟后,移除任何液体,重新构建气隙并重新建立密度小于0.7g/cm3的细胞堆叠。在多滴定板中的细胞堆叠然后在25℃、90%相对湿度下培养4天。然后,收获细胞堆叠,并提取重组抗体(实施例1)。在蛋白-A表面,使用BiacoreT200仪器(T=25℃,电泳缓冲液=HBS-EP),通过表面等离子体共振测量对32个样品针对每个抗体测定抗体浓度,以确定平均抗体浓度和变异系数(CV)。
抗体M12的平均收率为117.8±14.4μg/g细胞堆叠,变异系数是12.2%。抗体2G12的平均收率为32.3±3.6μg/g细胞堆叠,变异系数是11.1%。
这些对生物测定来说都是优良值,并清楚地说明了基于根据本发明制备的细胞堆叠的分析的优异的再现性和鲁棒性。
这也说明了细胞堆叠的不同的尺寸和几何形状可用于不同的应用,该实验表明细胞堆叠可以以多滴定板形式生成,这有利于高分辨率的高通量应用。
此外,同样清楚的是多滴定板形式的细胞堆叠可以以与在柱中铸型的情况相同或类似的方式操作或处理,包括分泌的或细胞外的产物的洗脱,以用于后续的定量或分析。
本领域技术人员将承认细胞堆叠还可以用于分析目的。例如,可以使由转基因悬浮培养物生成的细胞堆叠或与用于重组抗体、包括(但不限于)例如抗体融合蛋白对纤维素结合蛋白、或连接到或集成到细胞膜(质膜)的重组抗体的基因一同转化的细胞堆叠与包含连接到抗体上的物质的溶液(样品)接触。此处,细胞堆叠的多孔性又是一个明显的优势,因为大体积可以很容易地使细胞堆叠通过以提高灵敏度。此外,显而易见的是清洗步骤、缓冲液交换和酶标抗体的应用或其它检测试剂可以很容易地应用,并从细胞堆叠中移除。在最后的步骤中,底物可应用于,然后酶促转化为可测量的产物,以揭示该物质的存在和浓度。
实施例12
从野生型细胞产生的细胞堆叠中回收内源蛋白
将5日龄的BY-2野生型悬浮培养物的悬浮细胞收集用于生成细胞堆叠或将细胞进一步在悬浮培养物中培养。细胞堆叠和悬浮培养物都再培养4天。如实施例6所述,使用14ml聚丙烯柱制备2.5g FCW(新鲜细胞重量)的细胞堆叠。移除液体后,将细胞堆叠在26℃以90%相对湿度进行培育。5日龄的BY-2悬浮培养物进一步在26℃于旋转摇床上以180rpm进行培养。4天后,收获分泌的蛋白。如实施例6所述,通过用2.5ml缓冲液清洗堆叠而从细胞堆叠中收获分泌的蛋白质。通过使用真空过滤从培养基中移除细胞,从9日龄的悬浮培养物中收获分泌的蛋白。洗脱的或分泌的蛋白的25μl样品在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上分析(图16)。这个例子表明,分泌的天然蛋白质可以从根据本发明生成和培育的细胞堆叠中回收。凝胶上的各条带代表不同的天然蛋白质。凝胶分析也显示,细胞堆叠中的细胞和悬浮物中的细胞之间,分泌的天然蛋白的数量和种类是不同的。在细胞堆叠的细胞(图16,由箭头表示)中,某些天然蛋白的分泌显著增加。
本领域技术人员也将很容易地理解,该方法不限定于从植物细胞中回收天然蛋白质,也同样适用于其它感兴趣的内源性产品,包括次级代谢物、初级代谢物、纤维、寡糖和多糖(纤维素、淀粉、半纤维素、木聚糖、果聚糖等)、天然肽和蛋白质、色素、维生素、香料、水果酸或植物细胞的任何其它产品。本领域技术人员将认识到可由选自广泛的植物物种的悬浮细胞生成该细胞堆叠,包括但不限于长春花、红豆杉、甜菊和青蒿。
Claims (20)
1.一种去除了培养基且多孔结构的、非组织多层细胞堆叠形式的植物细胞材料的产生和所述细胞堆叠的后续维持的方法,该方法包括下述步骤:(i)通过从植物细胞悬浮培养物中分离细胞而提供具有多孔结构的细胞堆叠,其中,使细胞堆叠所包含的液体的含量降低并调整为相当于0.1g~0.9g湿细胞重量/cm3的细胞堆叠密度,从而建立所述细胞堆叠的去除了培养基且多孔结构的性质,以及(ii)将去除了培养基且多孔结构的所述细胞堆叠在非液体环境中以50~100%的相对湿度进行培育,其中,培养步骤(ii)是在没有将去除了培养基且多孔结构的细胞堆叠放置在维持培养基或生长培养基上或者没有接触维持培养基或生长培养基的情况下实施的。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,使细胞堆叠所包含的液体的含量降低并调整为相当于在0.2g~0.85g湿细胞重量/cm3之间的细胞堆叠密度。
3.根据权利要求2所述的方法,其中,使细胞堆叠所包含的液体的含量降低并调整为相当于在0.4g~0.8g湿细胞重量/cm3之间的细胞堆叠密度。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法,其中,从所述植物细胞悬浮培养物中分离的细胞是天然的或转基因的,并且能够积累所期望的产物。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,从所述植物细胞悬浮培养物中分离的细胞是天然的或转基因的,并且能够积累所期望的产物。
6.根据权利要求4所述的方法,其中,所述转基因细胞被瞬时转化或稳定转化以积累所述所期望的产物。
7.根据权利要求5所述的方法,其中,所述转基因细胞被瞬时转化或稳定转化以积累所述所期望的产物。
8.根据权利要求1所述的方法,其中,在进入步骤(ii)前,将步骤(i)所提供的细胞堆叠所包含的细胞与至少一个表达载体瞬时转化,所述表达载体包含至少一种异源核酸序列,所述至少一种异源核酸序列编码所期望的产物。
9.根据权利要求1至3、5至8中的任一项所述的方法,其中,步骤(ii)包括积累和收获所期望的产物。
10.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤(ii)包括积累和收获所期望的产物。
11.根据权利要求4所述的方法,其中,步骤(ii)包括积累和收获所期望的产物。
12.根据权利要求4所述的方法,其中,所期望的产物选自天然和异源蛋白质或多肽、次生代谢物、标记物和分析/诊断结果。
13.根据权利要求5-8、10-11中的任一项所述的方法,其中,所期望的产物选自天然和异源蛋白质或多肽、次生代谢物、标记物和分析/诊断结果。
14.根据权利要求9所述的方法,其中,所期望的产物选自天然和异源蛋白质或多肽、次生代谢物、标记物和分析/诊断结果。
15.一种去除了培养基且多孔结构的非组织多层细胞堆叠形式的植物细胞材料,密度在0.1g~0.9g湿细胞重量/cm3之间,是由权利要求1~14中的任一项所述的方法获得的。
16.根据权利要求15所述的植物细胞材料,所述植物细胞材料的密度在0.2g~0.85g湿细胞重量/cm3之间。
17.根据权利要求15所述的植物细胞材料,所述植物细胞材料的密度在0.4g~0.8g湿细胞重量/cm3之间。
18.由权利要求1~14中的任一项所述的方法获得的、去除了培养基且多孔结构的非组织多层细胞堆叠形式的植物细胞材料在分析方面的应用。
19.根据权利要求18所述的应用,其中,细胞堆叠所包含的细胞在待分析的生物或者待分析的物质的存在下进行培育。
20.一种诊断工具,包括由权利要求1~14中的任一项所述的方法获得的、去除了培养基且多孔结构的非组织多层细胞堆叠形式的植物细胞材料。
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