CN104087547B

CN104087547B - 一种工程菌及制备(3r，5r)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的方法

Info

Publication number: CN104087547B
Application number: CN201410314478.1A
Authority: CN
Inventors: 吴坚平; 陈少云; 何秀娟; 杨立荣; 徐刚
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-07-03
Filing date: 2014-07-03
Publication date: 2016-06-15
Anticipated expiration: 2034-07-03
Also published as: CN104087547A

Abstract

本发明公开了一种工程菌及制备(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的方法，该工程菌包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因为卤代醇脱卤酶基因；该方法包括培养工程菌并诱导卤代醇脱卤酶基因表达，离心取细胞，用缓冲液重悬，获得静息细胞悬液；往静息细胞悬液中添加(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯和NaCN进行反应，反应完成后，从反应液中分离纯化得到产物。本发明通过该酶的催化作用，简化了(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的生产工艺，无大量反应副产物生成，降低了生产成本。

Description

一种工程菌及制备(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种工程菌及利用该工程菌制备(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的方法。

背景技术

他汀类药物是一类羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的竞争性酶抑制剂药物，也是主要的降血脂药物。HMG-CoA还原酶催化HMG-CoA还原成3-甲基-3，5-二羟基戊酸的反应是胆固醇的生物合成途径，他汀类药物通过抑制HMG-CoA还原酶的合成，可抑制体内胆固醇的合成，从而降低细胞游离胆固醇水平，反馈性上调细胞表面低密度脂蛋白受体表达，促进循环血液中极低密度脂蛋白胆固醇残粒和低密度脂蛋白的清除，最终降低血清中总胆固醇和低密度脂蛋白的水平，有效防止动脉粥样硬化和冠心病的发生。在结构上，他汀类药物通常由憎水性的刚性平面结构母核和具有双手性中心的(3R，5S/R)-双羟基己酸酯组成。其中，治疗心脑血管疾病的药物阿托伐他汀就是他汀类药物中的一种，而(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯则是阿托伐他汀的关键中间体。

(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯是合成伐他汀侧链的重要中间体，其化学结构为：

目前，在医药工业生产中，制备(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的方法很多，主要分为化学法和生物酶法。其中，公开号为WO2004094243A1的专利公开了一种以(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为原料制备(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的方法，该方法需要在低温以及硼烷和硼氢化钠作用下才能发生反应，造成整个工艺制备过程的安全性难以控制，工业化成本也较高，无法大面积推广生产。

相对而言，生物酶法的反应条件更加温和环保。例如公开号为WO2008042876A2的专利公开了一种以(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为底物，通过生物酶的催化作用，室温下即可获得(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯。但是该制备方法存在操作步骤繁琐、成本高的问题。

公开号为WO2008/042876A2的专利也公开了利用酿酒酵母基因工程改造酮还原酶将6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯催化获得(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的工艺，并利用一种葡萄糖脱氢酶完成辅酶的再生反应，通过该工艺路线可获得立体异构纯的(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯。但是该工艺需要两种酶联合作用才能完成辅酶循环，造成生产成本升高。与此同时，反应中产生的葡萄糖酸会改变反应体系的pH值，需要通过补加碱溶液加以控制，增加了反应条件控制的难度，溶解在反应液中的葡萄糖酸也会大大增加后处理的难度。

因此，如何能够简化制备工艺，仅通过一种催化剂就能实现(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的制备，无大量反应副产物，且获得立体异构纯的(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯，是我们有待解决的重要问题。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术中的不足，提供一种利用工程菌制备(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的一步化制备方法，简化制备工艺，降低生产成本。

一种工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因为卤代醇脱卤酶基因。

所述卤代醇脱卤酶基因的碱基序列如SEQIDNO.3所示。所述工程菌含有带卤代醇脱卤酶基因的表达载体pET-30a(+)。作为优选，卤代醇脱卤酶基因为hhdh基因，该基因为全合成基因，且连接在pMD18-HHDH质粒上。

宿主细胞为大肠杆菌，优选为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

所述卤代醇脱卤酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，使工程菌分泌卤代醇脱卤酶，本发明的反应式为：

如上述反应式所示，在整个反应过程中，卤代醇脱卤酶催化(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯与NaCN发生取代反应获得(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯。上述卤代醇脱卤酶是一种裂合酶，它能催化邻卤醇的分子内亲核取代反应，形成环氧化合物，还可以高选择性地催化接受卤离子和卤离子以外的一系列非自然亲核试剂，如CN^-、N₃、NO₂、OCN^-、SCN^-、HCOO^-。目前，卤代醇脱卤酶主要用于催化4-氯-3羟基丁酸乙酯发生氰基化反应，来制备另一种阿托伐他汀的关键中间体(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，但在(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的制备中采用卤代醇脱卤酶还未有报道。

一种利用权利要求1～3所述的工程菌制备(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的方法，包括：

(1)培养工程菌并诱导卤代醇脱卤酶基因表达，离心取细胞，用缓冲液重悬，获得静息细胞悬液；

(2)往静息细胞悬液中添加(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯和NaCN进行反应，反应完成后，从反应液中分离纯化得到(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯。

所述培养工程菌的培养基液配方为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，pH为7.0。

所述培养工程菌的温度为35～40℃，转速为180～220rpm。

培养液中工程菌的量会影响反应体系中卤代醇脱卤酶的量，过低的工程菌数量会造成酶类不足、底物过量；而过量的工程菌又会造成卤代醇脱卤酶过剩，造成资源的浪费。诱导剂浓度与诱导温度和时间也是决定工程菌表达卤代醇脱卤酶量和质的重要因素。作为优选，所述诱导卤代醇脱卤酶基因表达的方法为：至培养液的OD₆₀₀达到0.8～1.2，加入0.4～0.8mMIPTG，16～22℃温度下诱导20小时。

适宜的反应温度和反应溶液pH值有利于反应的进行，所述反应的温度为25～35℃，pH为7.0～9.0。若温度过高、pH值偏酸容易造成反应过程中卤代醇脱卤酶的失活，更为优选，所述反应的温度为25～35℃，pH为7.0～7.5时，此反应条件下酶类催化效率最佳，(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的产率最高。

本发明将卤代醇脱卤酶基因导入宿主细胞构建的工程菌可表达卤代醇脱卤酶，通过该酶的催化作用可实现从(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯到(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的一步化生产，简化了(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的生产工艺，无大量反应副产物生成，降低了生产成本。

附图说明

图1为质粒pMD18-HHDH的图谱。

图2为基因hhdh的电泳图；

M：核酸Marker，1和2：基因hhdh样品。

图3为质粒pET30-HHDH的图谱。

图4为基因工程菌EcoH诱导表达的蛋白质SDS-PAGE电泳图；

M：蛋白质Marker，1：pET-30a(+)空载质粒对照破胞上清，2：基因工程菌EcoH诱导菌体破胞上清，3：pET-30a(+)空载质粒对照破胞上清，4：基因工程菌EcoH诱导菌体破胞沉淀。

图5为(4R-cis)-6-氯甲基-2，2-二甲基-1，3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯的气相分析标准图谱。

图6为(4R-cis)-6-氰甲基-2，2-二甲基-1，3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯的气相分析标准图谱；

分析条件如下：色谱柱：SE54CapillaryColumn60m×0.54mm×lμm；载气：N₂；柱温：120℃5min，30℃/min，260℃5min；检测器280℃；进样器280℃；进样器1.0μL。

图7为(4R-cis)-6-氯甲基-2，2-二甲基-1，3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯的¹HNMR谱图。

图8为(4R-cis)-6-氯甲基-2，2-二甲基-1，3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯的¹³CNMR谱图。

图9为(4R-cis)-6-氰甲基-2，2-二甲基-1，3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯的¹HNMR谱图。

图10为(4R-cis)-6-氰甲基-2，2-二甲基-1，3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯的¹³CNMR谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

本发明采用的酶活力单位定义为：每分钟催化底物反应产生1μmol产物。

(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯分析检测是通过衍生反应，衍生成(4R-cis)-6-氯甲基-2，2-二甲基-1，3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯而后检测的。反应式如下：

(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯衍生反应的操作如下：1mL含(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的萃取液，依次加入100μL丙酮，0.006g(约10μL)2，2-二甲基丙烷，0.001g对甲苯磺酸。30℃震荡反应8h，加入100μL饱和NaHCO₃溶液，无水硫酸钠除水，备用待测。衍生的产物为(4R-cis)-6-氯甲基-2，2-二甲基-1，3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯。

(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯分析检测是通过衍生反应，衍生成(4R-cis)-6-氰甲基-2，2-二甲基-1，3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯而后检测的。反应式如下：

(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯衍生反应的操作如下：1mL含6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的萃取液，依次加入100μL丙酮，0.006g(约10μL)2，2-二甲基丙烷，0.001g对甲苯磺酸。30℃震荡反应8h，加入100μL饱和NaHCO₃溶液，无水硫酸钠除水，备用待测。衍生的产物为6-氰甲基-2，2-二甲基-1，3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯。

(4R-cis)-6-氯甲基-2，2-二甲基-1，3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯的分析结果见图9。(4R-cis)-6-氰甲基-2，2-二甲基-1，3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯的分析结果见图10。

转化率、产率的计算公式如下：

底物转化率(％)＝(初始底物浓度一剩余底物浓度)/初始底物浓度×100％

产物产率(％)＝产物浓度/理论产物最大浓度×100％

实施例1质粒pET30-HHDH的构建

用引物F_HHDH/R_HHDH克隆hhdh基因，得到长度为765bp的hhdh基因。核酸电泳验证基因大小，如图2。

引物F_HHDH的序列为：

5’-CGCGGATCCATGTCAACCGCAATTGTAAC-3’；

引物R_HHDH的序列为：

5’-CCGCTCGAGCTACTCTGGCATACCAGG-3’。

hhdh基因序列如下：

ATGTCAACCGCAATTGTAACAAACGTTAAGCATTTTGGGGGAATGGGGTCTGCACTTCGTCTCTCGGAAGCAGGACATACAGTGGCTTGCCACGATGAAAGCTTCAAACACCAAGACGAACTTGAAGCCTTTGCCGAAACCTATCCACAACTCATCCCAATGTCGGAACAAGAACCAGCGGAACTCATCGAGGCAGTTACCTCCGCTCTCGGTCACGTTGATGTACTTGTGAGCAACGACATCGCTCCGGTCGAGTGGCGCCCAATCGATAAATACGCTGTAGAGGACTATCGCGATACTGTCGAGGCGCTCCAAATTAAGCCATTTGCACTGGTCAACGCCGTTGCAAGTCAAATGAAGAAGCGCAAAAGCGGACATATTATCTTTATTACCTCTGCTGCTCCAGTTGGGCCTTGGAAGGAACTTTCTACCTACTCGTCAGCCCGTGCAGGTGCATCTGCTTTGGCAAATGCCCTTTCGAAGGAACTCGGTGAATACAACATTCCGGTGTTCGCAATCGCTCCAAATTATCTTCACAGTGGGGATAGTCCATACTACTACCCATCGGAACCGTGGAAAACGTCGCCAGAACACGTTGCCCATGTCCGTAAAGTCACTGCGCTCCAGCGGTTAGGTACACAGAAAGAATTGGGAGAACTCGTCACTTTTCTCGCGTCTGGTAGTTGTGACTATCTGACCGGCCAGGTGTTCTGGTTGGCCGGCGGATTCCCAGTGATCGAGCGTTTTCCTGGTATGCCAGAGTAG

BamHI和XhoI双酶切hhdh基因，回收酶切后的基因条带，BamHI和XhoI双酶切pET-30a(+)质粒，回收酶切后的质粒条带，将酶切后的hhdh基因和酶切后的pET-30a(+)质粒，用连接酶连接，转化克隆宿主EscherichiacoliDH5α。用引物F_HHDH/R_HHDH进行菌落PCR验证转化重组子，然后提取重组质粒，进行测序。测序结果表明无误的重组质粒，即为重组质粒pET30-HHDH，质粒图谱如图3所示，-20℃保存备用。

实施例2基因工程菌的构建及诱导表达

用实例1中构建的质粒pET30-HHDH，转化表达宿主EscherichiacoliBL21(DE3)。用引物F_HHDH/R_HHDH做菌落PCR，验证转化的重组子。验证无误的基因工程菌即为EcoH。将EcoH接种到发酵培养基中恒温震荡培养16h，培养条件为35℃，180rpm。待菌体浓度长到OD₆₀₀＝0.8时，加入0.4mMIPTG(终浓度)，16℃诱导20h。

实施例3基因工程菌的构建及诱导表达

用实例1中构建的质粒pET30-HHDH，转化表达宿主EscherichiacoliBL21(DE3)。用引物F_HHDH/R_HHDH做菌落PCR，验证转化的重组子。验证无误的基因工程菌即为EcoH。将EcoH接种到发酵培养基中恒温震荡培养16h，培养条件为40℃，220rpm。待菌体浓度长到OD₆₀₀＝1.2时，加入0.8mMIPTG(终浓度)，22℃诱导20h。

实施例4基因工程菌的构建及诱导表达

用实例1中构建的质粒pET30-HHDH，转化表达宿主EscherichiacoliBL21(DE3)。用引物F_HHDH/R_HHDH做菌落PCR，验证转化的重组子。验证无误的基因工程菌即为EcoH。将EcoH接种到发酵培养基中恒温震荡培养16h，培养条件为37℃，200rpm。待菌体浓度长到OD₆₀₀＝1.0时，加入0.6mMIPTG(终浓度)，16℃诱导20h。

实施例5(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的制备

取一定量的实施例4工程菌EcoH发酵液，5000rpm离心收集菌体，然后用100mMHEPES缓冲液重悬，即得EcoH的静息细胞悬液。控制细胞负载量为2g干细胞/L。投入10mM的(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯和100mM异丙醇，通过自动添加5％的NaCN，控制pH为7.5，控制温度为30℃。反应8h后，5000rpm离心，取上清。加入NaCl至饱和，再用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，可得(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯。转化率大于99％，产率大于94％。

实施例6(3R，5R)6-氰基-3，5-羟基己酸叔丁酯的制备

取一定量的实施例2工程菌EcoH发酵液，5000rpm离心收集菌体，然后用100mMHEPES缓冲液重悬，即得EcoH的静息细胞悬液。控制细胞负载量为2g干细胞/L。投入15mM的(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯和100mM异丙醇，通过自动添加5％的NaCN，控制pH为8.0，控制温度为25℃。反应12h后，5000rpm离心，取上清。加入NaCl至饱和，再用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，可得(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯。转化率大于99％，产率约88％。

实施例7(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的制备

取一定量的实施例3工程菌EcoH发酵液，5000rpm离心收集菌体，然后用100mMHEPES缓冲液重悬，即得EcoH的静息细胞悬液。控制细胞负载量为2g干细胞/L。投入20mM的(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯和100mM异丙醇，通过自动添加5％的NaCN，控制pH为8.5，控制温度为35℃。反应16h后，5000rpm离心，取上清。加入NaCl至饱和，再用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，可得(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯。转化率大于99％，产率约为62％。

Claims

1.一种制备(3R,5R)6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法，包括：

所述工程菌包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因为碱基序列如SEQIDNO.3所示的卤代醇脱卤酶基因；所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)；

所述工程菌含有表达载体pET-30a(+)，所述卤代醇脱卤酶基因连接在表达载体pET-30a(+)上；

(2)往静息细胞悬液中添加(3R,5S)6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯和NaCN进行反应，反应完成后，从反应液中分离纯化得到(3R,5R)6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养工程菌的培养基液配方为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，pH为7.0。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养工程菌的温度为35～40℃，转速为180～220rpm。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，诱导卤代醇脱卤酶基因表达的方法为：至培养液的OD₆₀₀达到0.8～1.2，加入0.4～0.8mMIPTG，16～22℃温度下诱导20小时。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应的温度为25～35℃，pH为7.0～9.0。