CN104087517B - 一株能同时降解邻苯二甲酸酯和农药的真菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株能同时降解邻苯二甲酸酯和农药的真菌及其应用。该菌株名称为地霉属DY4(Geotrichum sp.DY4)，于2014年5月11日保藏于位于中国武汉武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014194。该菌株能同时降解邻苯二甲酸酯和农药，可用于降解多种PAEs和农药混合物污染，用于土壤生物修复，并为土壤中PAEs和农药的降解机理研究提供了一种新的种质资源。

Description

一株能同时降解邻苯二甲酸酯和农药的真菌及其应用

技术领域

本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，特别涉及一株能同时降解邻苯二甲酸酯和农药的真菌及其应用。

背景技术

人类为了满足日益增长的各种物质需求，在农业生产中大量使用地膜、有机农药、化肥等农用化学品，造成多种有机物对土壤的复合污染。农田土壤中覆盖地膜对农作物具有保温保湿的效果，尤其是在大棚蔬菜和水果的种植过程中起着非常重要的作用。但是地膜中的增塑剂-邻苯二甲酸酯(phthalic acidesters，PAEs)与塑料本身很难牢固结合，稳定性相对较差，PAEs易从塑料地膜中渗出，造成土壤环境污染。PAEs污染不仅影响农田土壤质量和植物的生长，影响土壤微生物的数量和多样性，其具有的***效应和生物累积效应，对人类健康也具有潜在的风险。我国优先污染物黑名单中列出3种PAEs，分别是邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二辛酯(DOP)。

农药也是重要的农业生产资料，对于防治病虫害、去除杂草、调节农作物生长具有重要的作用。但是近年来，随着农药的大量生产和使用，农药污染事件频繁发生，危害也越来越严重。农药在灭杀有害生物的同时，也会破坏农田的生物多样性和生态平衡，农药污染土壤和水体、粮食、蔬菜、水果等与人类的生活、生产密切相关的产品，会造成人畜中毒。毒死蜱(chlorpyrifos)是一种广谱高效、低残留的有机磷杀虫杀螨剂，被国家***和农业部列为替代高毒农药的重要品种，位居有机磷杀虫剂市场的第一位。拟除虫菊酯类农药(pyrethroids)是一类模拟天然除虫菊素仿生合成的广谱性杀虫剂，含有多个苯环结构，高效低毒，杀虫毒力比有机氯、有机磷农药等老一代杀虫剂提高10～100倍，被广泛使用。拟除虫菊酯类农药主要品种有溴氰菊酯、氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氰戊菊酯、甲氰菊酯和联苯菊酯等50多种产品，其品种数和使用量仅次于有机磷农药，位居杀虫剂市场的第二位，其中最常用的为氰戊菊酯。

微生物降解是土壤中有机污染物矿化的主要途径。生物修复被认为是目前去除环境中有机物的最经济有效的方法。近年来，关于PAEs及农药的细菌降解已得到广泛研究，但关于真菌降解的报道较少。其微生物降解研究也都是针对单一的污染物或同一类型污染物，但对于实际土壤环境而言，有机物污染往往是多种有机物同时存在的复合污染，PAEs和农药是农田土壤中最常见有机污染物，筛选出可以同时降解两者的真菌菌株并进行降解过程及机理的研究，将有助于提高土壤中PAEs和农药的降解效率，更好地应用于PAEs和农药有机物复合污染农田土壤的生物修复。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术PAEs和农药复合污染农田土壤生物修复技术中存在的不足，提供一株能同时降解邻苯二甲酸酯和农药的真菌。

本方面的另一目的在于提供所述的能同时降解邻苯二甲酸酯和农药的真菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一株能同时降解邻苯二甲酸酯和农药的真菌，名称为地霉属DY4(Geotrichum sp.DY4)，于2014年5月11日保藏于位于中国武汉武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2014194。

所述的邻苯二甲酸酯包括邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)；

所述的农药为毒死蜱和拟除虫菊酯类农药中的一种以上；

所述的拟除虫菊酯类农药优选为氰戊菊酯和溴氰菊酯中的至少一种；

所述的能同时降解邻苯二甲酸酯和农药的真菌可用于处理受邻苯二甲酸酯和农药污染的土壤，进行环境污染修复。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明提供的真菌在纯培养条件下7天内对邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)三种PAEs的混合体系的总降解率为63.5％～90.9％，对毒死蜱、氰戊菊酯和溴氰菊酯三种农药的混合体系的总降解率为31.6～37.1％；在DBP和氰戊菊酯的混合体系中，DY4对DBP和氰戊菊酯的降解率最高达到65.4％和55.8％；30天内，DY4将灭菌土壤中100mg·kg^-1的DBP和氰戊菊酯分别降解67.3％和57.5％，室内模拟田间土壤有机物降解，人工染毒，对照不进行灭菌处理，DY4对土壤中DBP和氰戊菊酯均有很好的降解效果。本发明菌株可用于降解多种PAEs和农药混合物污染，用于土壤生物修复，并为土壤中PAEs和农药的降解机理研究提供了一种新的种质资源。

附图说明

图1是地霉属DY4对液体混合体系中DBP和氰戊菊酯的降解效果图。

图2是地霉属DY4对灭菌土壤中DBP的降解效果图。

图3是地霉属DY4对灭菌土壤中氰戊菊酯的降解效果图。

图4是地霉属DY4对自然土壤介质中DBP的降解效果图。

图5是地霉属DY4对自然土壤介质中氰戊菊酯的降解效果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1地霉属(Geotrichum sp.)DY4的筛选分离及其对PAEs和农药降解性能

(1)地霉属(Geotrichum sp.)DY4的筛选分离

从广东省某地受PAEs和农药污染农田的耕层(0～20cm)取土样。称取土样10g，装入有90mL去离子水、4～5粒玻璃珠的250mL三角瓶，28℃、180rpm振荡30min，静置30min。取10mL上清液，在上清液中加入140mL含复合PAEs和农药的无机盐培养基【无机盐培养基组成如下：(NH₄)₂SO₄1.0g/L、KH₂PO₄1.0g/L、MgSO₄·7H₂O0.2g/L、CaCl₂0.1g/L、FeCl₃0.01g/L，调节pH值为7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min，下同】中进行3次梯度驯化。每个梯度3种PAEs(DMP、DBP和DEHP，下同)和3种农药(毒死蜱、氰戊菊酯和溴氰菊酯，下同)的浓度分别为100、200和400mg/L(总浓度为600、1200和2400mg/L)，每次取10mL菌液转入140mL新鲜含复合PAEs和农药的无机盐培养基中，28℃、120rpm培养7d，加入氯霉素(终浓度为质量体积比0.02％)抑制细菌生长。最后取1mL菌液涂布平板，平板培养基为马丁氏培养基【葡萄糖10g/L、蛋白胨5g/L、KH₂PO₄1.0g/L、MgSO₄·7H₂O0.5g/L，调节pH值为7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min后冷却至55～60℃，加入氯霉素(终浓度为质量体积比0.02％)，固体培养基需加琼脂(终浓度为质量百分比1.5～2.0％)】，28℃培养7d，将不同形态的菌落分别在马丁氏培养基平板固体培养基上划线得到单菌落，斜面保存。以上操作均在无菌条件下进行。

接种环挑取筛选出来的真菌，分别接入马丁氏液体培养基，摇床28℃、120rpm培养48h诱导孢子萌发和菌丝生长。分光光度计测定菌液660nm下的OD值，适当稀释使其浓度一致。将10mL菌液分别加入90mL复合农药无机盐培养基(3种农药的浓度均为50mg/L，总浓度150mg/L)，28℃，120rpm培养7d，以不接种的复合农药无机盐培养基为非生物降解对照。检测农药降解率和菌丝体干重。菌重测定采用干重法，将菌液用滤纸过滤后，冷冻干燥24h后称重。同样的方法检测PAEs降解率和菌丝体干重。试验结果见表1和表2。

表1 四株真菌对农药的降解率

注1):同一栏同一列的不同字母表示差异显著(P<0.05)

表2 四株真菌对PAEs的降解率

注2):同一栏同一列的不同字母表示差异显著(P<0.05)

四株真菌中，DY4对3种农药和3种PAEs的降解效果最好。将得到的真菌菌株DY4进行分类学鉴定：

①将DY4在马丁氏液体培养基中，28℃、120rpm振荡培养24h，培养液混浊，形成絮状物，表面形成膜；

②将DY4在马丁氏培养基平板上划线，进行形态观察：菌落成平板扩散，生长快，乳白色，绒毛状并带粉状，中心突起，有放射线纹；

③使用显微镜观察，DY4具有真菌隔菌丝和节孢子，无出芽细胞；电镜下观察菌丝裂殖为圆柱形或圆筒形的节孢子，形成有隔膜真菌丝，有的有二叉分枝，无子囊孢子；

④生理特性通过送由广东省微生物研究所检测，检测报告如下：

A、葡萄糖发酵试验：以新鲜培养物分别接种于葡萄糖发酵管，26℃培养，每天观察结果，若能发酵葡萄糖时，则在试管里面的杜氏管中有气体产生；结果为阴性，即杜氏管中无气体产生；

B、硝酸盐试验：以新鲜培养物接种于硝酸钾同化培养基，26℃培养1～3天，每天观察其是否同化硝酸钾；结果为阴性，即硝酸钾含量几乎没有下降；

C、尿素分解试验：以新鲜培养物接种于尿素培养基，26℃培养1天后观察，培养基如呈红色，则为脲酶阳性；不呈红色则为阴性；结果为阴性，即没有脲酶产生。

⑤采用真菌基因组DNA提取试剂盒提取该菌株的基因组，再通过通用引物扩增出26S rDNA(序列如下)，将该序列在NCBI上进行BLAST。结果表明，该菌株的26S rDNA序列与Geotrichum(地霉属)的同源性达99.8％。

TGCCTTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCGGCCTCCAGGTCGAGTTGTAATTTGTAGATTGTACCTTGAGAGCAGATCAAAGTCTGTTGGAACACAGCGCCTTAGAGGGTGACAGCCCCGTAGGATCTTTTCTCATTGTAAGGTACTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGAGGTAAATTCCTTCTAAAGCTAAATATTGACGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTAAAAGGGAAGGGTATTGAATCAGACGTGGTGCTGTTGTTCAGCTTTGCTTCGGCATGGTGTACTCAACAGTACTAGGCCAAGGTGGGGTGTTTGGGAGTGAAAAAGAAATAGGAATGTGGCTCTTCGGAGTGTTATAACCTATTTTCATAACTCCTCAGGCGCCTCAGGACTGCGCTTCGGCAAGGACTTTGGCATAATGATTCTATACCGCCCGTCTTG。

结合以上分类学形态特征、生理生化特征和26S rDNA序列的比对结果，将该菌株命名为地霉属DY4(Geotrichum sp.DY4)，于2014年5月11日保藏于位于中国武汉武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014194。

(2)DY4对DBP和氰戊菊酯降解性能检测

接种环挑取筛选出来的真菌DY4，接入马丁氏液体培养基，28℃、120rpm摇床振荡培养36h诱导孢子萌发和菌丝生长。分光光度计测定菌液660nm下的OD值，适当稀释使其浓度一致(萌发孢子浓度约10⁷/L)。

分别挑选3种PAEs和3种农药中污染最常见、在农作物及食品中残留量较高，且DY4对其降解效果较好的有机物复合在一起(分别为DBP和氰戊菊酯)，研究所筛选出来的真菌对这两种不同类型有机污染物的降解作用。将90mL含不同浓度梯度的DBP和氰戊菊酯的无机盐培养基加入250mL锥形瓶中，设置的DBP和氰戊菊酯的浓度梯度分别为0、25、50、75、100mg/L，1M NaOH溶液调节pH值至7。吸取10mL菌液加入其中，28℃、120rpm条件下，培养7d，观察DBP和氰戊菊酯的降解情况。试验结果如图1所示。

结合表1、2和图1的结果，可见，在纯培养条件下，DY4对液体中3种PAEs和3种农药的降解率分别达到63.5％～90.9％和31.6～37.1％；对DBP和氰戊菊酯的混合体系下两者的降解率最高达到65.4％和55.8％(在25mg·L^-1时的降解率最高，降解规律均是25mg·L^-1>75mg·L^-1>50mg·L^-1>100mg·L^-1)；在混合体系中，DBP的降解率均大于氰戊菊酯，但远远低于PAEs单一成分，说明农药对DY4有一定的影响，使之对PAEs的降解功能下降；但是，地霉属(Geotrichumsp.)DY4可耐受高浓度农药。

本实施例说明，分离所得到的地霉属(Geotrichum sp.)DY4对3种PAEs和3种农药均有很好的降解，且对DBP和氰戊菊酯混合***具有较好的降解能力。

实施例2：生长因子对地霉属(Geotrichum sp.)DY4降解效果的影响

选取外加碳源(葡萄糖)、有机污染物(为DBP和氰戊菊酯)浓度和pH作为影响因子，正交设计(如表3所示)进行DBP和氰戊菊酯的降解条件优化。采用无机盐培养基，每瓶100mL，表3中为2种有机污染物分别达到的浓度值。菌种的扩大培养参考实施例1。通过添加浓度为1mol·L^-1的NaOH溶液调节pH值，28℃/120rpm培养7d，用未接种的无机盐培养基为对照。测定有机物含量和菌液pH值，计算降解率并找出最优降解条件。

采用极差分析方法，表4～7的结果表明：地霉属(Geotrichum sp.)DY4的最佳试验条件为无外加碳源，有机污染物初始浓度为25mg·L^-1，最佳pH值为7.5。

本实施例说明，本发明的地霉属(Geotrichum sp.)DY4对DBP和氰戊菊酯具有较强的耐受能力和较宽的pH适用范围(3.1～7.8)。

表3 生长因子对地霉属(Geotrichum sp.)DY4降解效果影响正交试验设计

表4 地霉属(Geotrichum sp.)DY4在不同条件下对DBP和氰戊菊酯的降解效果

表5 由外加碳源的不同水平计算得出的K、k和R值

注：通过DBP和氰戊菊酯的降解率计算K值、k值和R值(极差)。其中，K为同一因素各水平的试验结果相加之和，k为K值的平均值，R为同一因素中k最大值减k最小值。R值越大说明该因素对试验的影响越大，反之越小。K值越大说明在同一因素中该水平对试验的影响越大，反之越小。

表6 由有机物浓度的不同水平计算得出的K、k和R值

表7 由pH值的不同水平计算得出的K、k和R值

实施例3：地霉属(Geotrichum sp.)DY4对灭菌土壤中DBP和氰戊菊酯的降解效果

试验所用清洁土壤取自华南农业大学水稻试验田0～20cm的耕作层，土壤各项指标如下：有机质2.20％、总氮0.10％、碱解氮130mg·kg^-1、有效磷114mg·kg^-1、速效钾284mg·kg^-1，pH值为6.08，为中壤土。经风干、土壤研磨机研磨后，过100目筛，得到基础土壤。将DBP和氰戊菊酯设置5个浓度梯度，分别为0、25、50、75、100mg·kg^-1，添加于基础土壤中，得到人工染毒土壤。每个人工染毒土壤样品40g，设3个平行，装入洁净玻璃培养皿中，所有样品一天内121℃高压蒸汽灭菌2次，每次20min。菌种用马丁氏液体培养基扩大培养48h后，用分光光度计测定660nm下菌液的OD值，稀释菌液，保持OD值在0.5左右。菌液按5％接种量(每100g土壤中加入5mL菌液)接入各培养皿，1M NaOH溶液调节pH值至7.0～7.5，以相应浓度的不接种土壤为对照，加入适量无菌水，使含水量始终保持在30％左右，将培养皿放入恒温培养箱避光培养。分别在0、15、30d时取样，测定农药的降解率和接种菌的数量。

从图2～3和表8中可以看出，DBP和氰戊菊酯的降解大部分发生在培养前期(0～15d)，添加菌株DY430d后的人工污染土壤中DBP和氰戊菊酯的降解率分别为64.6％～89.2％和68.8％～89.6％，而对照灭菌组DBP和氰戊菊酯的降解率为10.1％～16.7％和14.4％～24.0％。

本实施例说明，菌株DY4对土壤介质中的DBP和氰戊菊酯均具有一定降解能力，且为主要贡献者。

表8 30d后土壤中DBP和氰戊菊酯的总降解率

实施例4：地霉属(Geotrichum sp.)DY4对室内自然土壤中DBP和氰戊菊酯的降解效果

试验所用土壤来源、类型和基本性质与实施例3同。人工染毒土壤，使DBP和氰戊菊酯的浓度为0、40和80mg·kg^-1，每个样品1.5kg，设3个平行，装入洁净陶瓷盆中，菌液按5％(质量比)接种于陶瓷盆土壤中。试验过程中，不断地加入适量无菌水，使土壤含水量始终保持在20％～30％左右，人工气候箱培养。试验20d时补菌种一次，补种量与接种量相同。分别在0、5、10、15、20和30d时取样，检测DBP和氰戊菊酯的降解率。

从图4～5和表9中可以看出，DY4接种处理的DBP和氰戊菊酯总降解率高于未接种处理的，浓度为40mg·kg^-1和80mg·kg^-1时，接种处理的总降解率分别高于未接种处理27.0％和16.6％。

本实施例说明，接种DY4可以提高自然土壤中DBP和氰戊菊酯的降解效率。

表9 30d后自然土壤中DBP和氰戊菊酯的总降解率

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一株能同时降解邻苯二甲酸酯和农药的真菌，其特征在于：名称为地霉属DY4(Geotrichum sp.DY4)，于2014年5月11日保藏于位于中国武汉武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2014194；

所述的农药为有机磷杀虫杀螨剂和拟除虫菊酯类农药中的一种以上。

2.权利要求1所述的能同时降解邻苯二甲酸酯和农药的真菌的应用，其特征在于：所述的真菌用于处理受邻苯二甲酸酯和农药污染的土壤，进行环境污染修复；

所述的农药为有机磷杀虫杀螨剂和拟除虫菊酯类农药中的一种以上。