CN104072597A

CN104072597A - 南美白对虾LvDJ-1蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN104072597A
Application number: CN201410284249.XA
Authority: CN
Inventors: 王维娜; 黄明珠; 刘媛
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2014-06-23
Filing date: 2014-06-23
Publication date: 2014-10-01
Anticipated expiration: 2034-06-23
Also published as: CN104072597B

Abstract

本发明公开了南美白对虾LvDJ-1蛋白及其编码基因与应用。本发明首次获得了南美白对虾的LvDJ-1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白质。经实验证明，南美白对虾LvDJ-1蛋白可以提高南美白对虾抗应激能力，可以应用于制备与水产动物相关的免疫制剂或饲料添加剂，具有广阔的应用潜力。

Description

南美白对虾LvDJ-1蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及南美白对虾LvDJ-1蛋白以及编码该蛋白的基因，包含该基因的载体以及该蛋白的应用。

背景技术

1997年Nagakubo等运用酵母双杂交技术筛选出与c-myc相互作用的一种新的蛋白，第一次发现DJ-1，是帕金森病（Parkinson s disease,PD）较常见的致病基因，以不对称的二聚体形式参与细胞的多种生命活动，如神经损伤、肿瘤发生、转录调控、分子伴侣、免疫、以及抗氧化等。DJ-1蛋白的单体是由11个折叠和8个螺旋组成。其中β3和β4折叠形成1个β发夹结构参与了DJ-1蛋白的二聚化。DJ-1参与各项生命活动的具体机制尚不清楚，通过镉应激、亚硝酸盐应激，溶藻弧菌应激已经干扰LvDJ-1的南美白对虾，初步验证其与抗镉离子、抗亚硝酸盐、抗溶藻弧菌有密切的相关性。

南美白对虾（Litopenaeus vannamei），又名凡纳滨对虾，属节肢动物门（Arthropoda）、甲壳纲（Crustacea）、十足目（Decapoda）、游泳亚目（Natantia）、对虾科（Penaeidae）、对虾属（Penaeus）、Lito-penaeus亚属，是广温广盐性热带虾类。南美白对虾是当今世界养殖产量最高的三大虾类之一。南美白对虾原产于南美洲太平洋沿岸海域。南美白对虾具有生长速度快、适应能力强、产量高等优点,已成为我国最主要的养殖品种之一。但是，由于面对着目前的急剧的气候变化灾害和严重污染的水质问题，从而导致了其致病率和死亡率居高不下，对南美白对虾的人工养殖造成严重的经济打击，也是一个难以解决的问题。如何增强南美白对虾的抗逆能力，提高养殖存活率，是目前亟待解决的难题。

发明内容

针对现有问题，本发明的目的在于提供一种南美白对虾LvDJ-1蛋白、该蛋白的编码基因、以及该蛋白的应用。

本发明所采取的技术方案是：

南美白对虾LvDJ-1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。

编码上述南美白对虾LvDJ-1蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种克隆载体，其含有南美白对虾LvDJ-1蛋白基因。

一种表达载体，其含有南美白对虾LvDJ-1蛋白基因。

生产南美白对虾LvDJ-1蛋白的方法，包括将含有南美白对虾LvDJ-1蛋白基因的表达载体导入宿主细胞中，表达得到南美白对虾LvDJ-1蛋白。

所述宿主细胞为毕赤酵母。

南美白对虾LvDJ-1蛋白在制备水产动物免疫增强剂中的应用。

本发明的有益效果是：

（1）本发明首次获得了南美白对虾的LvDJ-1蛋白基因序列，可以应用于制备重组蛋白、免疫制剂和饲料添加剂，为南美白对虾的生理免疫研究提供了新的实践基础；

（2）本发明所提供的南美白对虾LvDJ-1重组蛋白，经实验证明可以提高南美白对虾抗应激能力，可以应用于制备与虾类相关的免疫制剂或饲料添加剂，具有广阔的应用潜力；

（3）将南美白对虾LvDJ-1核苷酸序列在巴斯德毕赤酵母重组菌株中表达，可以应用于产业化生存，降低了成本的投入，具有较高的经济价值。

附图说明

图1是南美白对虾LvDJ-1基因ORF的PCR扩增产物的电泳鉴定图；

图2是南美白对虾LvDJ-1基因ORF连接酶切接头（EcoRI 、KpnⅠ）的PCR扩增产物的电泳鉴定图；

图3是克隆载体pMD18-T-LvDJ-1双酶切（EcoRI 、KpnⅠ）;

图4是表达载体pPICZaA双酶切（EcoRI 、KpnⅠ）的电泳鉴定图；

图5是pPICZaA表达载体和所构建的pPICZaA-LvDJ-1表达载体单酶切（BstXⅠ）的电泳鉴定图；

图6是重组菌株pPICZaA-LvDJ-1-X-33表达产物LvDJ-1重组蛋白的SDS-Page电泳分析图；

图7是重组菌株pPICZaA-LvDJ-1-X-33表达产物LvDJ-1重组蛋白的western blot鉴定图；

图8是pPICZaA-LvDJ-1毕赤酵母表达载体构建示意图；

图9是南美白对虾LvDJ-1蛋白的氨基酸序列和人LvDJ-1蛋白的氨基酸序列对比图；

图10是南美白对虾LvDJ-1蛋白抗原表位预测分析结果；

图11是重组菌株pPICZaA-LvDJ-1-X-33高密度发酵产物LvDJ-1重组蛋白的SDS-Page电泳分析图；

图12是在镉应激中的，A，B，C三组虾血细胞数目随应激时间的变化情况；

图13是在镉应激中A、B、C三组虾血细胞凋亡情况随应激时间的变化情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版) (Sambrook J, Russell DW，Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社) ，或按照制造厂商所建议的条件。

一、获得南美白对虾LvDJ-1基因的ORF

依据http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ cDNA文库中的EST拼接，得到包括ORF在内的LvDJ-1序列。第一条引物为LvDJ-1S1，【5’- TACACAGGCCTTCTCTCTCCCAAC】（SEQ ID NO.3），第二条引物为LvDJ-1A1，【5’- GTTGTTCCTATGGTCACCTTCATT】（SEQ ID NO.4），以M-MLV reverse transcriptase kit (Promega, Madison, WI, USA)反转录得到的南美白对虾肝脏cDNA为模板，经过touchdown PCR技术，获得PCR扩增产物，对其进行测序并比对，确定为LvDJ-1基因，其长度为564 bp（如SEQ ID NO.1所示），并推测出其氨基酸序列（如SEQ ID NO.2所示）。PCR反应条件为：94℃预变性4分钟；（1）94℃变性30s,退火72℃ 30s，共5个循环；（2）94℃变性30s,退火68℃ 30s，延伸72℃，共5个循环；（3）94℃变性30s，退火55℃ 30s，延伸72℃，共30个循环；最后72℃继续延伸10分钟。PCR扩增产物的电泳图见图1，其中：M为DS2000 Marker；1为PCR扩增产物。PCR产物送去华大基因公司测序，测序结果和比对结果一致。

二、生物信息学方法分析南美白对虾LvDJ-1蛋白序列

使用clustal-X和GeneDoc两个序列分析软件，将南美白对虾LvDJ-1基因的氨基酸序列和人DJ-1基因的氨基酸序列进行序列比对，发现南美白对虾LvDJ-1蛋白序列和人类DJ-1蛋白序列有较高的同源性（图9），并通过http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input分析南美白对虾LvDJ-1蛋白的抗原表位（图10）。

三、南美白对虾LvDJ-1基因序列的合成

根据分析好的南美白对虾LvDJ-1基因的cDNA序列，设计合成上下游两端的引物。上游引物是LVDJ-1SP，在该片段第一位碱基起前加入EcoR1的限制酶切位点以及其保护碱基【5’- GCGAATTCATGTCTCCCAAGAAAGCTCTCGTTCTC】（SEQ ID NO.5）；下游引物是LVDJ-1AP1M，在该片段后***KpnⅠ的限制酶切位点以及该酶切位点的保护碱基、6×his标签、终止密码子【5’- GCGGTACCTTAATGATGATGATGATGATGGAGCAGCATGGCCTTGGCAACAGCAGC】（SEQ ID NO.6）。以反转录得到的南美白对虾肝脏cDNA为模板，经PCR方法扩增南美白对虾的LvDJ-1基因，PCR反应条件为：94℃预变性3分钟；下边为40个循环：94℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30分钟；最后72℃延伸10分钟。PCR扩增产物的电泳鉴定图见图2，其中，M：DS 2000 marker；1：PCR扩增产物。从图2可见PCR扩增后获得一段约600bp的序列。

四、含南美白对虾LvDJ-1序列的克隆载体pMD18-T-LvDJ-1的构建

将上述所获得的基因片段分离纯化，然后与pMD18-T（TAKARA）载体按照该试剂盒提供的体系4℃连接过夜（10h），将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经Amp+抗性和蓝白斑筛选出阳性克隆；通过质粒小提试剂盒(Omega，USA)提取质粒，质粒经过双酶切验证以及测序验证，证明南美白对虾LvDJ-1序列克隆到载体中，命名为pMD18-T-LvDJ-1，克隆载体转化大肠杆菌DH5α所得到的重组菌株命名为pMD18-T-LvDJ-1-DH5α。使用EcoRI 、KpnⅠ对克隆载体pMD18-T-LvDJ-1进行双酶切，酶切图谱图3所示：M为DS 5000 Marker；1：为pMD18-T-LvDJ-1的EcoRI 、KpnⅠ双酶切产物。酶切图谱图4所示，M：DS 5000 Marker；1：完整pPICZaA；2：pPICZaA表达载体的EcoRI 、KpnⅠ双酶切产物。

五、含南美白对虾LvDJ-1序列的表达载体pPICZaA- LvDJ-1的构建

克隆载体pMD18-T-LvDJ-1经小提质粒试剂盒（Omega,USA）抽提后，用限制性内切酶EcoRI和KpnⅠ进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，产物用E.Z.N.A.^?Gel Extraction Kit回收，分离纯化约600bp的南美白对虾LvDJ-1序列。

载体质粒pPICZaA经限制性内切酶EcoRI和KpnⅠ双酶切后分离纯化3.6kb的大片段，与约600bp的南美白对虾LvDJ-1的基因片段以1:3比例混合，用T4连接酶于16℃过夜连接（约15h）。然后，用CaCl₂法将质粒转入大肠杆菌DH5a中，于低盐LB平板筛选出具Zeocin抗性的转化子。以标准方法提取质粒，筛选大小约4.0 kb的重组质粒，经送往Invitrogen公司测序，对测序结果进行比对，为南美白对虾LvDJ-1的基因序列，并正确***到毕赤酵母表达载体pPICZaA中，重组质粒命名为PICZaA-LvDJ-1。质粒构建流程见图7。使用EcoRI 、KpnⅠ对表达载体pPICZaA-LvDJ-1进行双酶切，酶切分析图见图5，其中M：DS5000 Marker；1：pPICZaA载体；2：pPICZaA载体的BstXⅠ酶切产物；3：表达载体pPICZaA-LvDJ-1；4：pPICZaA-LvDJ-1表达载体的BstXⅠ酶切产物。

六、能高效表达南美白对虾LvDJ-1蛋白的毕赤酵母重组菌株pPICZaA-LvDJ-1 -X-33构建

按照Invitrogen公司的The Easyselect^TM Pichia Expression Kit说明书制备毕赤酵母X-33感受态细胞，重组质粒pPICZaA-LvDJ-1用BstXⅠ线形化后凝胶回收，用电击法将重组质粒pPICZaA-LvDJ-1转化到毕赤酵母X-33感受态细胞中，在含有Zeocin 500μg/ml的YPDS平板上28℃进行培养。约3d后长出单克隆菌株。挑取单克隆经诱导培养与鉴定筛选出能高效表达南美白对虾LvDJ-1重组蛋白的毕赤酵母重组株pPICZaA- LvDJ-1 -X-33。

七、利用毕赤酵母基因工程菌pPICZaA- LvDJ-1 -X-33生产重组南美白对虾LvDJ-1蛋白

分别挑取各单克隆工程菌，接种于BMGY中，28℃，200rpm培养OD600至2-6，离心换等体积培养基BMMY，稀释OD600至1.0，每隔24h向培养基中补加0.5%甲醇，培养约96h后，5000rpm离心2min，4℃收集上清。取约1ml上清，用DOC-TCA-丙酮沉淀法对蛋白进行浓缩后，加入5×电泳上样缓冲液，煮沸10分钟后按标准方法跑Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳，同时取阴性对照按同样方法处理后电泳。阴性对照为空载质粒pPICZaA转化X-33后长出的单克隆培养后的上清蛋白。结果见图6，其中：M：蛋白分子量标准；NC：重组菌株pPICZaA- X-33表达产物；1、2：重组菌株pPICZaA- LvDJ-1-X-33表达产物。NC作为阴性对照，位于15Kd和25Kd之间出现一条新的蛋白条带，而阴性对照不出现此蛋白带。

八、南美白对虾LvDJ-1蛋白抗原活性鉴定实验

采用蛋白印迹方法（western blot）对重组南美白对虾LvDJ-1蛋白进行免疫鉴定。其中，一抗采用鼠源his单克隆抗体（Novagen），二抗采用马抗小鼠IgG-AP（鼎国生物公司）。结果如图7所示。其中，M：蛋白分子量标准；NC：重组菌株pPICZaA-X-33表达产物Western blot鉴定图谱；1、2：重组菌株pPICZaA- LvDJ-1-X-33表达产物Western blot鉴定图谱。NC作为阴性对照，说明鼠源his单克隆抗体能够识别带有6×his标签的重组南美白对虾LvDJ-1蛋白，证明得到的蛋白为南美白对虾LvDJ-1蛋白。

九、毕赤酵母工程菌pPICZaA- LvDJ-1 -X-33的高密度发酵

发酵过程参照Invitrogen公司的Pichia Fermentation Process Guidelines，具体步骤如下：

1. 分别在YPDS(Zeocin⁺)提取单克隆菌株，pPICZαA-LvDJ-1-X-33和pPICZαA-X-33，其中pPICZαA-X-33菌株作为空载对照。加入200ml MGY液体培养基到1L的锥形瓶中，30℃，200rpm振荡培养至OD600=2-6（约16-24h）。

2. 组装好发酵罐，加入3L含有4% 甘油的发酵基础培养基（配方见Pichia Fermentation Process Guidelines），然后121℃，灭菌15min，待冷却后，用流加瓶加入氨水，调pH到5。

3. 在火焰圈保护下，将步骤1.1中摇好的菌种接种于发酵罐中。调节通气量，灌压，转速来维持溶氧，使其高于20%。设定发酵温度为28℃，自动流加氨水控制pH 5±0.05。

4. 当发酵罐中的甘油耗尽后（约接种后20个小时），用流加瓶流加每升含12ml PTM1（配方见Pichia Fermentation Process Guideline），设置流加速度为54.45ml/h，直到细胞湿重为200 g/liter结束（流加大约4个小时）。

5. 甘油消耗尽后，开始添加每升含12ml PTM1的甲醇，设定流加速度为10.8 ml/h，两个小时，设定流加速度为21.9 ml/h；两个小时后，设定流加速度为32.7 ml/h，保持这个速度直到发酵结束。这个阶段需要60个小时，总共添加约1.2L的甲醇。此时的细胞湿重约为290 g/liter。

6. 分别取pPICZαA-LvDJ-1-X-33与pPICZαA-X-33发酵的菌液各1ml，上清用DOC-TCA-丙酮沉淀法浓缩后，加5×电泳上样缓冲液，煮沸10分钟后按标准方法跑Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳，pPICZαA-X-33发酵的菌液做为阴性对照组，结果见图11。其中，M：蛋白分子量标准；NC：空载菌株pPICZαA-X-33表达产物；1：重组菌株pPICZaA- LvDJ-1-X-33表达产物。显示pPICZaA- LvDJ-1 -X-33在15Kd和25Kd之间出现一条蛋白条带，而阴性对照不出现此带。结果说明，pPICZaA- rLvDJ-1 -X-33菌种发酵产生了高浓度的重组蛋白。

7. 把发酵液用喷雾干燥器处理，得到粉末，pPICZaA-LvDJ-1 -X-33菌种的发酵液粉末做为饲料添加剂，pPICZαA-X-33菌种的发酵液粉末做为对照，用于饲养实验。

十、动物实验

1 实验条件

选取同一批次、体质健康、规格相近的南美白对虾放养在养殖桶中。水温25～30℃，水体盐度28～32‰，pH值8.1～8.3，溶解氧值大于5.0 mg/L，并且水体持续循环。

2 饲料配置

饲料共分为3种，A为商品料，B为商品料＋1wt% pPICZαA-X-33菌种的发酵液粉末，C为商品料＋1wt%pPICZaA- LvDJ-1-X-33菌种的发酵液粉末。（分别将各组粉料搅拌均匀，每天投喂前准确称量，用水稀释后制备成湿颗粒饲料投喂）。

3 实验虾饲养

本试验设3个实验组，每组30条虾。分别投喂A、B、C组饲料。试验虾平均体重0.20±0.03g，长度为3±0.6cm。养殖水不断充气，水温29± 2℃，水体pH值8.1～8.3，水体盐度28～32‰。上午和下午按照虾体重的5%左右各投喂一次，雨天少量投喂。每天及时清理残饵，观察记录，饲养时间7周。实验前禁食一天。

4.应激实验

4.1实验计划

取用饲喂的南美白对虾做氯化镉应激实验，应激浓度为4.25μmol·L^-1。实验准备1.0 m×0.5 m× 0.5 m的储物箱3个，在每个储物箱先装满40L的海水，，然后每个储物箱分别放A，B，C三组各30条虾，应激24小时，分别在0小时、6小时、12小时、24小时取样，每组取6尾。

4.2血细胞计数以及渗透压的测定

用1 ml一次性无菌注射器预先吸0.2ml抗凝剂，再扎入腹血窦抽约0.2ml血，取完血后，将血液注入1.5ml EP管中，4℃下静置，取血清。血细胞计数板的计数血细胞方法按照WHO手册进行计数，分别计数血细胞3次，取3次结果的平均值为计数结果。

4.2.1血细胞计数的测定原理

细胞的计数一般使用血球计数板。每块计数板由H形凹槽分为2个同样的计数池，计数池高0.1mm。计数池分为9个大方格，每个大格面积为1.0mm.容积为0.1mm³（μl），其中，中央大方格分成25个中方格，位于正中及四角5个中方格是红细胞计数区域。四角的4个大方格是白细胞计数区域。在计数血细胞时，要计算位于中央的大方格中，其正中及四角5个中方格的总细胞数目，再根据公式细胞数/ml=五个中方格内的细胞个数/5×25×10000×稀释倍数。

4.2.2血细胞计数的测定方法

视待测血细胞的浓度，加抗凝剂适当稀释（一般稀释2倍），然后取洁净的血球计数板一块，并在计数区内盖上一块盖玻片。将血细胞轻轻吹打混匀，用移液枪吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴，让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生。静置片刻后，把血球计数板放在显微镜的载物台上然后观察并计数中央的大方格中，其正中及四角5个中方格的总细胞数目。在计数时，要遵循原则：数上线不数下线，数左线不数右线。测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净。每个血样分别计数血细胞3次，取3次结果的平均值为计数结果。

结果显示：应激过程中，在镉应激0小时，三种饲料喂养的虾血细胞数目并没有明显差异。应激6小时后，A，B，C三组的血细胞数目均有下降，但是C组的血细胞数目高于A、B组，并且差异显著。应激12小时后，A，B，C三组的血细胞数目明显下降，但是C组的血细胞数目下降较A、B组少，数目明显高于A、B组。应激24小时后，A，B，C三组的血细胞数目略有上升，C组的血细胞数目略高于A，B组，没有明显差异（见图12）。

4.3 细胞凋亡测定

4.3.1血细胞凋亡的测定原理

细胞凋亡是细胞程序性死亡，当细胞发生凋亡时候，细胞膜的通透性增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。血淋巴细胞凋亡的测定原理：在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由膜脂内侧翻向外侧。Annexin V是一种依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。用标记了FITC的Annexin V作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生，正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的。碘化丙啶( propidine iodide,PI) 是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够细胞膜与细胞核结合呈现红色。将Annexin V与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。在双参数流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为( FIT C－/ PI－) ；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为( FIT C＋/ PI＋) ；而右下象限为凋亡细胞, 显现( FIT C＋/ PI－) 。

4.3.2血淋巴细胞凋亡的测定方法

使用Annexin V/PI apoptosis kit，购自联科生物。具体步骤：

收集血细胞，用MAS抗凝剂进行稀释，调整血细胞浓度大约为1-5×10⁶cells/ml，取200μl稀释的血细胞，在细胞悬浮液中加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI后轻轻混匀，在黑暗环境下静置5分钟，然后使用200目的筛网过滤将细胞悬液转移到上样管中，使用流式细胞仪进行检测。

结果表明：A，B，C三组虾受到镉应激后，应激0小时，三种饲料喂养的虾血细胞的细胞凋亡数目并没有明显差异。随着应激时间的延长，血细胞的细胞凋亡数目不断增加，A、B组血细胞的细胞凋亡数目增加比C组多，在12小时达到最大值，并且A、B组的细胞凋亡数目明显高于C组。应激24小时后，A、B、C三组的血细胞的细胞凋亡数目均有下降，但是C组的血细胞的细胞凋亡数目明显少于A、B组（见图13）。

以上实验表明：实验组C组，食用了含有重组蛋白LvDJ-1的饲料后，在镉应激过程中，其抗应激能力明显优于对照组A、B。由此可见，重组蛋白LvDJ-1能够提高虾类尤其是南美白对虾的免疫力，可用于制备水产动物免疫制剂或饲料添加剂。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

<110> 华南师范大学

<120> 南美白对虾LvDJ-1蛋白及其编码基因与应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 564

<212> DNA

<213> Litopenaeus vannamei

<400> 1

atgtctccca agaaagctct cgttctcctg gccgaggggg cagaggagat ggaagctgtc 60

attgcaattg atacgctgag gagaggcggg atagaagtca ctgttgctgg gctcaatggt 120

gcaggagccg tcaagtgcag ccgagacgtg gtggtcgtcc ctgatgccgc tctagaagac 180

gctgctggaa agggtcccta tgatgccatc gttctccctg gaggcctcaa gggtgccgag 240

agttttggcc agagtgctac tgtgaagacc ctactcactg accaacagaa agctgggcga 300

gttattggag caatctgtgc agcccctgct gtctccctcc ccccccatgg cataggagag 360

ggcaaaaagg tgacctgcta tcctgctctg aaggaccgtc ttgatgctgg caagtacacc 420

taccaggatc agaaagtggt ggaggatggc gagctcatca cctcccaggg cccaggaaca 480

gcttttgact ttggcctggc tcttgtgaag aaacttgtgg attctgagaa gtctgctgct 540

gttgccaagg ccatgctgct ctag 564

<210> 2

<211> 187

<212> PRT

<213> Litopenaeus vannamei

<400> 2

Met Ser Pro Lys Lys Ala Leu Val Leu Leu Ala Glu Gly Ala Glu Glu

1 5 10 15

Met Glu Ala Val Ile Ala Ile Asp Thr Leu Arg Arg Gly Gly Ile Glu

20 25 30

Val Thr Val Ala Gly Leu Asn Gly Ala Gly Ala Val Lys Cys Ser Arg

35 40 45

Asp Val Val Val Val Pro Asp Ala Ala Leu Glu Asp Ala Ala Gly Lys

50 55 60

Gly Pro Tyr Asp Ala Ile Val Leu Pro Gly Gly Leu Lys Gly Ala Glu

65 70 75 80

Ser Phe Gly Gln Ser Ala Thr Val Lys Thr Leu Leu Thr Asp Gln Gln

85 90 95

Lys Ala Gly Arg Val Ile Gly Ala Ile Cys Ala Ala Pro Ala Val Ser

100 105 110

Leu Pro Pro His Gly Ile Gly Glu Gly Lys Lys Val Thr Cys Tyr Pro

115 120 125

Ala Leu Lys Asp Arg Leu Asp Ala Gly Lys Tyr Thr Tyr Gln Asp Gln

130 135 140

Lys Val Val Glu Asp Gly Glu Leu Ile Thr Ser Gln Gly Pro Gly Thr

145 150 155 160

Ala Phe Asp Phe Gly Leu Ala Leu Val Lys Lys Leu Val Asp Ser Glu

165 170 175

Lys Ser Ala Ala Val Ala Lys Ala Met Leu Leu

180 185

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tacacaggcc ttctctctcc caac 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gttgttccta tggtcacctt catt 24

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcgaattcat gtctcccaag aaagctctcg ttctc 35

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<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

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Claims

1.南美白对虾LvDJ-1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者是SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后且具有同等或更高活性的蛋白。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.一种克隆载体，含有权利要求2或3所述的基因。

5.一种表达载体，含有权利要求2或3所述的基因。

6.生产南美白对虾LvDJ-1蛋白的方法，包括将权利要求5所述的表达载体导入宿主细胞中，表达得到南美白对虾LvDJ-1蛋白。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母。

8.权利要求1所述的蛋白在制备水产动物免疫增强剂中的应用。

9.一种免疫增强剂，含有权利要求1所述的蛋白。