CN104067122A - 基于吖啶和吖啶*衍生物的荧光染料 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于吖啶和吖啶衍生物的荧光染料和这种染料在例如生化测定和/或基于细胞的测定中的应用。

Description

基于吖啶和吖啶*衍生物的荧光染料
领域
本发明涉及基于吖啶和吖啶衍生物的荧光染料和这种染料在例如生物化学和/或基于细胞的测定中的应用。
背景
荧光分子，包括染料，已经在无细胞生化测定以及基于细胞的测定中长期用作标记和检测生物分子的试剂。然而，在许多***中，存在背景荧光，并且为了成功地检测相关荧光信号，必须具有良好的信噪比。
许多高度荧光的染料是已知的，并且用于改善信噪比。一种处理此背景荧光问题的备选方法是使用显示与被研究的***不同的荧光寿命的荧光分子。通过这样做，对荧光分子的检测可以从背景中辨别出来。
此前，我们已经描述了9-氨基吖啶衍生物作为长寿命荧光报告分子在生物测定中的应用(见WO2007/049057A2；G.Cotton等，Chem.Commun.，2010，46，6929；和A.Gray等，Anal.Biochem.，2010，402，54)。然而，对于新型荧光分子和/或鉴定用于生化测定和基于细胞的测定中的具有有用的荧光性质如荧光寿命的已知分子总是存在着需求。
概述
我们令人惊讶地发现，一系列基于吖啶和吖啶衍生物的荧光团适合于在生化测定和基于细胞的测定中使用，在所述荧光团中，没有氨基附接在9-位，而是存在主要具有烃基特性的基团。此发现是特别惊人的，因为本领域已知9-氨基吖啶及其衍生物的强荧光性。
因此，从第一方面看来，本发明提供了式(I)的荧光染料作为检测靶分子的方法中的试剂的应用：
(其中：
R1是氢或J-L；
R2是不存在的、氢或J-L；
R3和R4在每一次出现时独立地选自氢、卤素、酰胺、羟基、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的芳基、烷氧基、烷硫基、氨基、单-或二-C1-C4烷基取代的氨基、巯基、羧基、酰基、甲酰基、磺酸根、季铵、J-L、或-K；
如果R2是不存在的则X是不存在的，并且如果R2是存在的，则它所附接到的氮原子是带正电的且X是抗衡离子；
各个J独立地是接头基团；
各个L独立地是氢或K；且
各个K独立地是靶键合基团，
前提是存在至少一个基团K)，所述方法对包括寿命荧光的测量。
从第二方面看来，本发明提供了一种用于测定样品中分析物的存在的方法，所述方法包括：
(i)使所述样品与所述分析物的已知结合伴侣和式(I)的荧光染料：
(其中：
R1是氢或J-L；
R2是不存在的、氢或J-L；
R3和R4在每一次出现时独立地选自氢、卤素、酰胺、羟基、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的芳基、烷氧基、烷硫基、氨基、单-或二-C1-C4烷基取代的氨基、巯基、羧基、酰基、甲酰基、磺酸根、季铵、J-L、或-K；
X是抗衡离子，如果R2是不存在的则所述抗衡离子是不存在的；
各个J独立地是接头基团；
各个L独立地是氢或K；且
各个K独立地是靶键合基团，
前提是存在至少一个基团K)的缀合物在以下条件下接触：所述条件有效地允许所述分析物的至少一部分与所述缀合物中的已知结合伴侣的结合以形成所述分析物和所述缀合物的复合物；
(ii)测量与所述分析物接触之前所述缀合物的荧光寿命或荧光强度；以及
(iv)测量由所述接触所得的混合物的荧光寿命或荧光强度。
从第三方面看来，本发明提供了一种用于在缀合物的存在下测量酶的活性的方法，所述缀合物是由化合物和式(I)的荧光染料之间的缀合所得的缀合物：
(其中：
R1是氢或J-L；
R2是不存在的、氢或J-L；
R3和R4在每一次出现时独立地选自氢、卤素、酰胺、羟基、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的芳基、烷氧基、烷硫基、氨基、单-或二-C1-C4烷基取代的氨基、巯基、酰基、甲酰基、羧基、磺酸根、季铵、J-L、或-K；
X是抗衡离子，如果R2是不存在的则所述抗衡离子是不存在的；
各个J独立地是接头基团；
各个L独立地是氢或K；和
各个K独立地是靶键合基团，
前提是存在至少一个基团K)，
所述方法包括：
(i)测量与所述酶接触之前所述缀合物的荧光寿命或荧光强度；
(ii)使所述酶与所述缀合物接触；以及
(iii)测量由所述接触所得的混合物的荧光寿命或荧光强度。
从第四方面看来，本发明提供了一种如前文所定义的式(I)的荧光染料，其中：
R1是氢或J-H；
R2是J-L；和
R3是氢或J-K。
从第五方面看来，本发明提供了一种根据本发明的第四方面的荧光染料和生物分子的缀合物。
从第六方面看来，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)根据本发明的第五方面的缀合物；和
(ii)所述生物分子的已知结合伴侣，例如酶。
由以下讨论，本发明的其他方面和实施方案将是明显的。
附图简述
图1显示了9，10-二甲基吖啶-10-甲基硫酸盐的荧光性质(a)荧光激发和发射光谱(b)荧光寿命衰减曲线(26.2ns)。在10mM PBS pH7.4中，对于稳态，在激发波长350nm和发射波长490nm，而对于荧光寿命，在激发波长405nm和发射波长473nm长通滤光器中，进行测量；
图2显示了作为pH的函数测得的在磷酸盐缓冲液中的9，10-二甲基吖啶-10-甲基硫酸盐的荧光寿命。使用0.2M磷酸二氢钠和0.2M磷酸氢二钠缓冲液混合物，制备9，10-二甲基吖啶-10-甲基硫酸盐在20mM磷酸钠缓冲液中的1μM的溶液，使用0.1M HCl溶液调节pH至＜6且使用0.1M NaOH溶液调节pH至＞8；
图3显示了当在405nm激发时作为pH的函数测得的对于9，10-二甲基吖啶-10-甲基硫酸盐的荧光发射光谱；
图4显示了对于LLD-DEVDSK和LLD-DEVDSW(LLD＝具有2-(2-羧基乙基)-9，10-二甲基吖啶-10-)的荧光发射光谱。在激发波长405nm，在10mM PBS pH7.4中，以500nM浓度进行测量。实线是LLD-DEVDSK且虚线是LLD-DEVDSW；
图5显示了，对于使用LLD-DEVDSW作为底物和重组半胱天冬酶3酶(每孔1.25和2.5U)的半胱天冬酶3测定，平均寿命对时间的作图。
图6显示了通过AcDEVD-CHO的半胱天冬酶3抑制，即使用LLD-DEVDSW作为底物，AcDEVD-CHO对重组半胱天冬酶3的抑制剂滴定。
图7显示了对于使用LLD-PLGLNaIAR作为底物和具有不同酶浓度的重组MMP2酶的MMP2蛋白酶测定，平均寿命对时间的作图。
图8显示了对于使用LLD-EPEGIYGVLF作为底物和具有不同酶浓度的重组Lck酶的Lck激酶测定，平均寿命对时间的作图。
图9显示了使用LLD-EPEGIYGVLF作为底物的星形孢菌素对重组Lck激酶的抑制剂滴定。
图10显示了使用LLD-EPEGIYGVLF作为底物的各种浓度的ATP对重组Lck激酶的滴定，以测定对于被测定体系的ATP Km。
详细描述
本发明由以下发现引起：基于其中在9-位没有附接氨基，而是在该位置存在主要具有烃基特性的基团的吖啶和吖啶衍生物的荧光团适合于在生化测定和基于细胞的测定中使用。尤其，根据本发明的各种方面的荧光团和/或应用中的某些有利地具有长荧光寿命(例如25至30ns)。这些可以有利地与典型地具有约15至17ns荧光寿命的9-氨基吖啶类相对比。
正如本领域已知的，较长的荧光寿命可以用于提高信噪比，允许在测定中有更灵敏的响应的潜力。与荧光强度不同，荧光寿命通常与探针浓度和体积无关，并且不被自发荧光、光散射和内部过滤效应所影响。此外，对荧光寿命的测量能够使来自荧光化合物库和细胞组分的背景干扰最小化，在药物筛选应用中提供较少的假阳性。因此，典型但不必需的是，根据本发明的第二和第三方面测量荧光寿命(而不是荧光强度)。
首先，描述式(I)的化合物，使用如下定义，除非上下文相反指示。
在本文中，烷基意指饱和的烃基原子团，其可以是直链、环状或支链的(典型地是直链的，除非上下文相反指示)。亚烷基是形式上通过从烷基抽出氢原子而形成的二价原子团。典型的烷基和亚烷基包含1至25个碳原子，更通常1至10个碳原子，还更通常1至6个碳原子，当然要理解的是，在环烷基和亚环烷基中碳原子数的下限是3。
烯基和炔基与烷基的不同在于具有一个以上由碳-碳双键或碳-碳三键构成的不饱和位点。碳-碳双键的存在提供烯基；碳-碳三键的存在提供炔基。亚烯基和亚炔基分别是形式上通过从烯基和炔基抽出氢原子而形成的二价原子团。典型地，烯基、亚烯基、炔基和亚炔基包含2至25个碳原子，更通常2至10个碳原子，还更通常2至6个碳原子。烯基的实例包括乙烯基、苯乙烯基和丙烯酸酯。炔基的实例是炔丙基。为了避免任何歧义，包含碳-碳双键和碳-碳三键两者的烃基原子团可以被看做烯基和炔基两者。
烷基、烯基或炔基(和亚烷基、亚烯基和亚炔基)基团可以被取代，例如一次、两次或三次，例如一次，即形式上替换该基团的一个以上氢原子。这样的取代基的实例是羟基、氨基、卤素、芳基、(包括杂芳基)、硝基、烷氧基、烷硫基、氰基、巯基、酰基和甲酰基。在烷基被芳基取代的情况下，这有时称为芳烷基。典型地，芳烷基包括被任选地取代的芳基所取代的C1-6烷基。
备选地或除了上面刚刚所提到的取代基之外，烷基、烯基或炔基(和亚烷基、亚烯基和亚炔基)基团的取代基在一些实施方案中可以在式(I)的化合物上赋予明显有利的水增溶性质。合适的增溶取代基(其中的一个多个，典型地其中一个，可以仅存在被取代的基团)可以例如选自包括磺酸根、季铵、硫酸根、膦酸根、磷酸根和羧基的组。备选地，增溶基团可以是碳水化合物残基，例如，单糖类。当水增溶取代基存在时，这可以作为烷基的取代基存在，所述烷基典型地是构成R1、R2、R3或R4的C1-6烷基。因此，水增溶的取代的烷基的实例包括C1-C6烷基羧酸根和C1-C6烷基磺酸根，如-(CH2)2-4-SO3 -和-(CH2)2-4-CO2 -，例如-(CH2)2-CO2 -，尽管值得注意的是，这样的增溶取代基可以直接附接到式(I)的化合物的三环核心(如对于取代基R3和R4而言的可能性)。当式(I)的化合物与蛋白质或肽缀合，即用于标记蛋白质或肽时，水溶性可以是特别有利的。
在本文中，芳基意指形式上通过从芳族化合物中抽出氢原子所形成的原子团。除非上下文特别相反指示，芳基典型地是单环基团，例如苯基，尽管术语芳基也包括双环芳基如萘基和三环芳基如菲和蒽。正如本领域技术人员已知的，杂芳族结构部分是包含代替一个或多个碳原子及任选地附接其上的任何氢原子的一个或多个杂原子(典型地，O、N或S)的芳族结构部分亚组。相应地，将理解的是，杂芳基是芳基的亚组。说明性的杂芳族结构部分包括吡啶、呋喃、吡咯和嘧啶。杂芳族环的进一步实例包括哒嗪(其中，两个氮原子是在芳族6元环中相邻的)；吡嗪(其中，两个氮是在6元芳族环中1，4-布置的)；嘧啶(其中，两个氮原子是在6元芳族环中1，3-布置的)；或1，3，5-三嗪(其中，三个氮原子是在6元芳族环中1，3，5-布置的)。
芳基可以被选自例如由以下各项组成的组的取代基取代一次或多次：羟基、氨基、卤素、烷基、芳基、(包括杂芳基)、硝基、烷氧基、烷硫基、氰基、巯基、酰基和甲酰基。
在本文中，酰胺意指官能团-NHCOR或-CONHR，其中R是氢或任选地取代的烷基。
在本文中，酰基意指式-C(O)R的官能团，其中R是任选地取代的烷基。
在本文中，酯意指包含-OC(＝O)-结构部分的官能团。
烷氧基(alkoxy)(与烷氧基(alkyloxy)同义)和烷硫基结构部分分别是式-OR和-SR，其中R是任选地取代的烷基。
在本文中，羧基意指官能团-CO2H，其可以处于脱质子化形式(CO2 -)。
在本文中，磺酸根意指官能团-SO3 -(其为磺酸(-SO3H)的脱质子化形式)，其可以处于质子化形式。
甲酰基意指式-CHO的基团。
卤素是氟、溴、氯或碘。
在本文中，氨基意指式-NH2的基团。在氨基的一个或两个氢原子被烷基取代的情况下，这提供了单-或二烷基-取代的氨基。二烷基-取代的氨基的一个实例是其中两个烷基连接形成亚烷基二价原子团(diradical)，其形式上衍生自已经从其上(典型地从端碳原子上)抽出了两个氢原子的烷基，从而与胺的氮原子一起形成环。正如公知的，在环状胺中的二价原子团不需要必须是亚烷基：吗啉(其中亚烷基是-(CH2)2O(CH2)2-)是一个这样的实例，可以从其制备环状的氨基取代基。
本文对氨基和单-或二烷基-取代的氨基的提及还应被理解为在它们的范围内包括由包含这样的氨基的化合物所得的胺的质子化衍生物。后者的实例可以理解为是盐类，如盐酸盐类。
季铵基团是包含氮原子和三个任选地取代的烷基的取代基，其中所得的与氮原子的四个键提供永久的正电荷。
可以向式(I)的化合物的三环核心附接一个或多个接头基团。这些可以是未取代的(当L是氢时)，或是被靶键合基团K取代的。典型地，连接基团J包括将基团L与式(I)的化合物的三环核心连接的无支链的原子链。各连接基团J典型地包含1至40(例如1至10)个链原子，所述链原子包括碳，且任选地包括氮、氧、硫和/或磷。例如，该链可以是取代的或未取代的(典型地，未取代的)亚烷基(例如亚甲基、亚乙基或亚丙基)、亚烯基(例如亚乙烯基或亚丙烯基)、亚烷氧基链(例如-O(CH2)4-)、或亚烷基甲酰胺(alkyleneanecarboxamido)链，如乙酰胺。在基团R1包含接头基团J的情况下，接头基团J附接到式(I)的化合物的三环核心上的原子通常为碳原子。
靶键合基团K是反应性或官能性基团，其允许式(I)的化合物在合适的条件下与靶分子例如生物分子反应。根据式(I)的化合物的反应性基团可以在合适的条件下与例如生物分子的官能性基团反应；根据式(I)的化合物的官能性基团可以在合适的条件下与例如生物分子的反应性基团反应。可以根据这些缀合策略中的任一种，用式(I)的化合物标记靶标化合物，例如，想要的生物分子。
当K是反应性基团时，这可以选自琥珀酰亚胺基酯、磺基-琥珀酰亚胺基酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、卤代乙酰胺、酰基卤、乙烯基砜、二氯三嗪、碳二亚胺(carbodimide)、酰肼、亚磷酰胺五氟苯基酯和烷基卤。当K是官能性基团时，这可以选自羟基、氨基、巯基、咪唑、羧基、羰基(包括醛、酮和硫酯)、磷酸酯、硫代磷酸酯和氨基氧基。将理解的是，当缀合至生物分子时，K可以变成修饰的，例如，氨基可以变成酰胺基的部分，或羧基可以变成酯基团的部分。借助这些反应性和官能性基团，式(I)的化合物可以与生物分子反应并共价键合至生物分子。熟练技术人员容易得知哪种官能性/反应性基团能够与式(I)的化合物将要偶联/缀合到其上的生物分子的相应的反应性/官能性基团反应。
如果基团R2存在，将也存在抗衡离子X。对抗衡离子X的性质没有特别的限制；这些可以是任何便利的抗衡离子。例如，X可以是卤化物离子，特别是氯离子、溴离子或碘离子，甲苯磺酸根，甲基磺酸根或烷基羧酸根，例如乙酸根或三氟乙酸根。其他实例对技术人员将是明显的。根据本发明的特别的实施方案，R2和抗衡离子X是存在的。
根据本发明的所有方面的实施方案的特别的式(I)的化合物是如上文作为本发明的第四方面所定义的，根据该方面，式(I)的化合物包含R1＝氢或J-H；R2＝J-L；和R3＝氢或J-K。根据其他实施方案，化合物包含：
(i)基团R2，其是烷基，例如C1-6烷基如甲基、乙基或丙基，例如甲基，或者是式-J-K，例如其中J是包含1至6个碳原子的亚烷基接头基团，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基，且其根据特别的实施方案是亚乙基；和/或其中靶键合基团是羧基；和/或
(ii)基团R1，其是式-J-K，例如其中J是包含1至6碳原子的亚烷基接头基团，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基，且其根据特别的实施方案是亚乙基；和/或靶键合基团是羧基。
本发明的第四方面的化合物的前述实施方案的更特别的实施方案包含：基团R2，其是烷基，例如C1-6烷基如甲基、乙基或丙基，例如甲基，或者是式-J-K，例如其中J是包含1至6个碳原子的亚烷基接头基团，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基，且其根据特别的实施方案是亚乙基；且任选地，靶键合基团是羧基。
前文刚刚根据(i)和(ii)定义的的化合物的特别的和更特别的实施方案可以进一步包括：(iii)一个R3或R4是式-J-K的基团，例如其中J是包含1至6个碳原子的亚烷基接头基团，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基，且其根据特别的实施方案为亚乙基；和/或靶键合基团是羧基。
根据前文刚刚描述的(i)至(iii)的特别实施方案，仅仅存在一个靶键合基团，例如羧基。典型地，在本发明的这些和其他实施方案中的靶键合基团经由基团J连接至化合物的剩余部分。
根据本发明的所有方面的特别的实施方案，式(I)的化合物是具有如下所示的式(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)中的一个的染料，其中X-是如前文所述的。
将理解的是，本文所述的荧光染料中的某些可以含有电荷，例如，在季氨基处，这可以用于形成盐或结合带负电的分子如DNA和/或RNA。
一般技术人员可以容易地合成本文所述的式(I)的化合物。可以在化合物合成开始时(例如构建三环核心之前)将靶键合基团引入到式(I)的化合物，或者在它构建之后引入到三环。例如，在取代基R2包含靶键合基团的情况下，可以通过前体与不存在R2基团的式(I)的化合物的反应，通过利用合适的R2(和X-)的前体对三环的中心氮的季铵化，将其引入。以下将描述代表性的合成，技术人员将能够容易地对其修改以制备其他式(I)的化合物。
式(I)的化合物可以与之缀合，例如以提供可用于根据本发明的第一、第二、第三和第六方面的缀合物、和第五方面的缀合物的合适的生物分子，包括但是不限于由以下各项组成的组：抗体，脂类，蛋白质，肽，碳水化合物，含有或者被衍生化而含有氨基、巯基、羰基(包括醛和酮)、羟基、羧基、磷酸酯、硫代磷酸酯、氨基氧基和酰肼基中的一种和多种的核苷酸和含氧或脱氧多核酸，微生物材料，药物，激素，细胞，细胞膜和毒素。
特别优选的用于用本文所述的式(I)的荧光染料标记的生物分子是肽或蛋白质。熟练技术人员明白允许在合成的肽中的具***点进行标记的方法(见例如生物缀合物技术(Bioconjugate Techniques)，G.T.Hermanson，Academic Press(1996))。本文描述的缀合物可以包含细胞进入肽。细胞进入肽可以是Penetratin(Cyclacel，UK)，例如TAT或Chariot。
式(I)的染料特别适合用作荧光寿命染料。按照本发明，术语寿命染料意在表示具有可测量的荧光寿命的染料，所述荧光寿命定义为染料在激发后保持其激发态的时间的平均量(Lackowicz，J.R.，荧光光谱学原理(Principles of Fluorescence Spectroscopy)，Kluwer Academic/PlenumPublishers，New York，(1999))。
关于本发明的第一方面，本文描述的式(I)的染料特别用在许多其中可以测量荧光寿命的生化测定和/或基于细胞的测定中，由此允许检测式(I)的染料可以与之缀合的目标材料，例如生物分子。相应地，可以考虑本发明的第一方面的备选描述为以下方法：包括测量式(I)的化合物和靶分子的缀合物的荧光寿命，所述靶分子可以是本文描述的生物分子。例如，根据本发明的第一方面的应用和方法可以包括如在WO02/099424A2和WO03/089665A1中所述的那些测定，或本发明的第二或第三方面的方法，包括以下叙述的那些实施方案。
在按照本发明的第二方面的测定中，例如，可以使用式(I)的荧光染料以检测样品中存在或是不存在分析物。这通过使(i)分析物的已知结合伴侣和(ii)如本文所定义的式(I)的化合物(例如但不必须按照本文的第四方面)的缀合物与可能含有或可能不含有分析物的样品相接触来完成。在与样品接触之前和之后，测量由在缀合物中的式(I)的荧光染料的存在所引起的荧光强度/荧光寿命。测得的荧光强度或荧光寿命的任何调节都可以与分析物的存在相联系，并且因此用于对它测定。
根据某些实施方案，根据本发明的第二方面所使用的缀合物可以包含分析物的具体的结合伴侣，所述结合伴侣的存在想要能够被检测到。分析物-具体结合伴侣的说明性的对包括：蛋白质/蛋白质，蛋白质/核酸，核酸/核酸，蛋白质/小分子和核酸/小分子伴侣；或者抗体/抗原，凝集素/糖蛋白，生物素/链霉抗生物素蛋白，激素/受体，酶/底物或辅因子，DNA/DNA，DNA/RNA和DNA/结合蛋白。这一清单不是详尽的，并且对技术人员来说其他组合是明显的。将理解的是，对各种组合，组合中的任一成员可以是分析物，或分析物的已知结合伴侣。例如，因此，根据本发明第二方面的实施方案，分析物可以是酶且已知结合伴侣是对其的底物或辅因子；或者分析物可以是酶的底物或辅因子，该酶是已知结合伴侣。
在按照本发明的第三方面的测定中，例如，式(I)的荧光染料可以用于在包含所关注的化合物和式(I)的染料的缀合物的存在下测量酶的活性。这通过使这样的缀合物与酶接触来完成。在与酶接触之前和之后，测量由在缀合物中的式(I)的荧光染料的存在所引起的荧光强度/荧光寿命。测得的荧光强度或荧光寿命的任何调节都可以与酶的活性相联系。
根据某些实施方案，根据本发明的第三方面所用的缀合物的化合物可以是生物分子，例如酶的底物或辅因子，例如酶的底物。例如，生物分子可以对于磷酸化敏感，且酶是激酶。底物可以是肽类底物，例如包含4至20个氨基酸残基的肽类底物。这样的肽类底物也可以构成按照本发明的第二方面的分析物或已知结合伴侣。
这样的底物或辅因子可以包含在缀合物保持完整的同时调节(典型但不必须地，减少)式(I)的化合物的荧光和/或荧光寿命的结构部分。在将荧光(寿命)调节结构部分从式(I)的化合物分离后，例如在通过酶将缀合物裂解后，荧光强度和/或荧光寿命随后可以典型地增加，使用这样的增加来测量酶的活性。
例如，芳族氨基酸如色氨酸可以用于调节式(I)的染料的荧光强度和/或荧光寿命。式(I)的染料和含有色氨酸残基的针对肽酶的肽类底物的缀合物可以用于测量酶的活性，所述残基在肽酶的作用后被从肽类底物裂解。已经公开了用于将荧光标记的肽的荧光猝灭的另外方法。这样，例如WO02/081509，描述了在荧光标记的肽内使用色氨酸、酪氨酸或组氨酸残基在内部将荧光强度猝灭。苯基丙氨酸也可以用于这一目的，同样，萘基丙氨酸，其非天然氨基酸变体，或甚至非天然芳族氨基酸，也是可以的。肽可以用于检测内肽酶和外肽酶活性。涉及荧光寿命测量的其他方法在WO03/089663A2中描述，熟练技术人员被引向该文件。其中描述的技术可以用于本文公开的方法。
备选地，缀合物可以由激酶的底物和式(I)的荧光染料组成，即所述缀合物可以被激酶磷酸化。这样的缀合物可以包含如本文所述的荧光调节结构部分，例如芳族氨基酸(如上文刚刚所述的)。在荧光调节结构部分是酪氨酸的情况下，例如，它的酚式羟基的磷酸化起到将它转化成磷酸根结构部分的作用，从而调节了酪氨酸的芳族环的荧光调节效果，使得造成底物的荧光的增加。
作为上文刚刚所述的本发明的实施方案的变体，缀合物可以包含对通过激酶的磷酸化敏感的底物，所述磷酸化起到允许引入荧光调节结构部分的作用。例如，如在WO2009/001051A2中描述的，可以使用不需要是荧光调节的氨基酸残基(例如丝氨酸或苏氨酸)的侧链的磷酸化，随后暴露于由配位到铁(III)离子的多齿配体构成的荧光调节结构部分。例如，多齿配体可以是含有芳族或杂芳族的和/或是二或三齿的。以此方式，按照本发明第三方面的接触可以在(除了缀合物之外)由铁(III)离子和这样的配体之间形成的螯合物的存在下发生。根据特别的实施方案，螯合物是苯基丙二酸的或2-羟基苯乙酮的。不希望被理论所束缚，被理解的是，根据本发明的这些实施方案，铁(III)离子通过静电相互作用结合到磷酸根结构部分，将芳族配体带到接近荧光团附近，从而造成荧光调节并因此造成底物的荧光的降低。
根据本发明的第三方面的备选实施方案，酶可以用于造成缀合物与化合物之间的连接作用，该化合物在连接后调节(典型地但不必须地，减少)式(I)的化合物的荧光和/或荧光寿命。在酶的反应后，荧光强度和/或荧光寿命随后可以典型地下降，用这种下降测量酶的活性。例如，调节化合物可以是包含色氨酸、酪氨酸、组氨酸、萘基丙氨酸或苯基丙氨酸残基的肽，使得连接作用起到将所述残基带到式(I)的染料附近的作用，从而产生所得的连接作用产物的荧光强度和/或荧光寿命。其他荧光调节结构部分包括例如萘基、吲哚基和苯氧基。
根据本发明的第二方面(当分析物或已知结合伴侣中任一种是酶时)和本发明的第三方面的实施方案，酶可以选自由以下各项组成的组：激酶、磷酸酶蛋白酶、酯酶、肽酶、酰胺酶、核酸酶和糖苷酶，例如激酶和磷酸酶。例如，酶可以选自由以下各项组成的组：血管紧张肽转化(ACE)、半胱天冬酶、组织蛋白酶D、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K、弹性蛋白酶、中性溶酶、嗜热菌蛋白酶、天冬氨酸肽链内切酶(asp-n)、基质金属蛋白1至20、木瓜蛋白酶、纤溶酶、胰蛋白酶、肠激酶和尿激酶。
根据本发明的第三方面的特别的实施方案，所述方法可以用于测定测试化合物所具有的对酶的活性的效果(如果有的话)。根据这些实施方案，本发明的第三方面的方法在存在和不存在测试化合物两种情况下进行。所发现的酶的活性上的任何区别都是该化合物所展示的对酶的活性的效果的指示。例如，该化合物可以起到酶的抑制剂或促进剂的作用。根据特别的实施方案，多个根据本发明的第三方面的方法可以以测试化合物的不同的量或浓度进行。以此方式，例如，在测试化合物是酶的抑制剂的情况下，可以测定IC50值。
对于基于细胞的测定，该测定可以在活细胞上进行或使用细胞组分如细胞壁碎片进行。可以使用任何细胞，包括原核细胞和真核细胞，特别是哺乳动物和人类细胞。
本发明的方法和应用可以在液体介质中进行，通常是溶液，具有任何便利的pH，其将典型地在约5至9的范围内。液体介质典型地是水性的。例如，可以使用水或合适的酸性或碱性溶液，例如缓冲的溶液如磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液。
根据本发明的特别的实施方案，可以根据本发明的各种方面同时使用不同的式(I)的染料，例如缀合到不同化合物的式(I)的染料。在染料的荧光强度和/或荧光寿命允许那些染料彼此区分的情况下，这允许多路检测。进一步的细节可以在WO03/089663A2(下文)中找到。
本发明的方法可以典型地在多孔板的孔中进行，例如具有24、96、384个或更大密度的孔例如864或1536个孔的微量滴定板。合适的仪器是Edinburgh Instruments Nanotaurus Fluorescence Lifetime Platereader。备选地，该方法可以在测定管中或多流体装置的微通道中进行。
可以使用常规的检测方法测量标记的荧光强度和/或寿命。这些方法包括使用光电倍增管作为检测装置的仪器。使用这些方法的一些方式是可能的；例如
i)基于时间相关的单光子计数的方法(查阅：荧光光谱学原理(Principles of Fluorescence Spectroscopy)，(第4章)J R Lakowicz编，第二版，1999，Kluwer/Academic Press)；
ii)基于频率域/相位调制的方法(查阅：荧光光谱学原理(Principles ofFluorescence Spectroscopy)，(第5章)J R Lakowicz编，第二版，1999，Kluwer/Academic Press)；和
iii)基于按时选通的方法(查阅：Sanders等，(1995)分析生物化学(Analytical Biochemistry)，227(2)，302-308)。
合适的装置是Edinburgh Instruments FLS920荧光计，EdinburghInstruments，UK。
荧光强度的测量可以通过电荷耦合装置(CCD)成像仪进行，如扫描成像仪或区域成像仪，以对多孔板的所有孔成像。配合CCD摄像仪的LEADseekerTM***允许在单通中对高密度微量滴定板成像。成像是定量的和迅速的，并且适合于成像应用的仪器现在可以同时对多孔板的整体成像。
本文引用的所用出版物(专利和非专利)通过引用以其全部并入，正如各参考文件的全部内容以其全部在本文中陈述。
现在通过以下非限制性实施例说明本发明。
实施例1
多种被研究的吖啶衍生物的荧光寿命报告在表1中。通过时间相关单光子计数(TCSPC)捕获测定荧光寿命，使用Edinburgh InstrumentsNanotaurus荧光寿命平板读数器，使用激发激光405nm，以及438nm带通、450nm带通或473nm长通发射滤光器，用于检测。
表1：长寿命荧光染料
实施例2：9，10-二甲基吖啶-10-甲基硫酸盐的合成
将9-甲基吖啶(440mg，2.3mmol)溶解在甲苯(10ml)中，并随后加入硫酸二甲酯(652μl，6.9mmol)。将混合物在回流加热2小时并随后使其冷却至室温。通过过滤分离黄色沉淀物并用二***洗涤，随后用二***/二氯甲烷洗涤以提供作为黄绿色粉末的产物(720mg，定量)。通过1H NMR和MS的分析符合结构。
实施例3：9，10-二甲基吖啶-10-甲基硫酸盐的荧光分析
在Edinburgh Instruments FLS920稳态荧光计上进行稳态测量，激发波长为350nm且发射波长为490nm。通过时间相关单光子计数(TCSPC)捕获测定荧光寿命，使用Edinburgh Instruments Nanotaurus荧光寿命平板读数器，使用激发激光405nm和473nm长通发射滤光器，用于检测。
在9，10-二甲基吖啶-10-甲基硫酸盐在pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1μM浓度溶液下测量荧光激发和发射光谱。在图1(a)和图1(b)中分别示出了荧光激发和发射光谱以及荧光寿命衰减曲线。
9，10-二甲基吖啶-10-甲基硫酸盐具有有利地长的约25-30ns的荧光寿命。此外，荧光寿命的大小在三种被测的缓冲液***中得以保持(见表1，项目6)。
实施例4：pH稳定性研究
适合用于生化测定和基于细胞的测定的荧光染料的重要标准是，在5至9的生理学范围内荧光寿命与pH无关的优势。9，10-二甲基吖啶-10-甲基硫酸盐的荧光寿命在3至10的pH范围内是稳定的(见图2)。
在405nm的激发，测量作为pH的函数的荧光发射谱(图3)。对所有pH3至10的溶液观察到在460nm和490nm的发射最大值，但是对于＞pH10的溶液，发射最大值移动至425和450nm。对于pH＞10，这一荧光发射谱和荧光寿命的改变表示在碱性条件下在9-位的酸性甲基质子的脱质子化，提供了如下在方案1中所示的9-亚甲基吖啶：这些甲基质子被报道为是异乎寻常地酸性的，具有类似于乙酸的pKa(Tanaka，Y.等，J.Org.Chem.，2001，66，2227)。
实施例5：具有羧酸结构部分的9，10-二甲基吖啶-10-甲基硫酸盐的衍生化
为了促进荧光团向生物分子如肽和蛋白质的附接，荧光团的羧酸衍生物通常是适宜的：这样的化合物将与在肽和蛋白质上的氨基官能团反应，以允许通过酰胺键形成进行缀合。设计了一系列的吖啶和吖啶化合物，其全部含有羧酸结构部分以能够经由酰胺键连接附接到肽上(见表2)。
表2羧酸衍生化的吖啶/吖啶染料
具有在2-位的羧酸的9，10-二甲基吖啶-10-甲基硫酸盐的衍生化
靶标1：氯化2-(2-羧基乙基)-9，10-二甲基吖啶-10-
以6个步骤合成靶标1，以提供作为氯化物盐的2-(2-羧基乙基)-9，10-二甲基吖啶-10-(方案2)。前三个步骤进行良好，以提供附接有想要的丙酸连接体的吖啶环框架。然而不幸地，在最终的环化步骤(步骤3)期间，甲基酯基团水解，并且决定：为了操作的简易性和为了辅助用于后续步骤的溶解性，将酸转变回酯。在密闭管中，使用甲基碘进行N-甲基化，并且最终酯的水解提供了想要的靶标。
方案2
步骤1：
将3-(4-氨基-苯基)-丙酸1(5g，30.3mmol)在室温在SOCl2(20mL)中搅拌3h。在真空中除去SOCl2，并且将残渣小心地重新溶解在MeOH中并搅拌5min。在真空中除去MeOH，并将残基溶解在DCM中，用10％K2CO3溶液洗涤，经过MgSO4干燥并在真空中浓缩。通过柱色谱进行的纯化(庚烷/EtOAc，70：30)提供作为无色同体的3-(4-氨基-苯基)-丙酸甲酯2(5.37g，29.9mmol，98％)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ6.98(d，J＝8.4Hz，2H，ar)，6.62(d，J＝8.4Hz，2H，ar)，3.66(s，3H，OCH3)，2.83(t，J＝7.8Hz，2H，CH2)，2.57(t，J＝7.8Hz，2H，CH2)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ173.56(C＝O)，144.64(C)，130.54(C)，129.10(CH x2)，115.30(CH x2)，51.54(OCH3)，36.15(CH2)，30.18(CH2)；ESI m/z＝180.17(M+H)+，对C10H13NO2计算＝179.09
步骤2：
将3-(4-氨基-苯基)-丙酸甲酯2(5.37g，29.9mmol)、2-氯苯乙酮(4.09mL，31.5mmol)、Pd(OAc)2(338mg，1.51mmol，5摩尔％)、XantPhos(864mg，1.49mmol，5摩尔％)和Cs2CO3(14.6g，44.8mmol)溶解在二烷(60mL)中。将混合物在110℃搅拌20h。在冷却之后，将混合物通过硅藻土过滤，用DCM洗涤，并在真空中除去溶剂。通过柱色谱进行的纯化(庚烷/EtOAc，80：20)提供作为黄色油的3-[4-(2-乙酰基-苯基氨基)-苯基]-丙酸甲酯3(6.26g，21.1mmol，71％)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ10.41(br，NH)，7.73(dd，J＝8.1，1.4Hz，1H，ar)，7.22(dt，J＝8.5，1.4Hz，1H，ar)，7.11(m，5H，ar)，6.63(dt，J＝7.5，1.1Hz，1H，ar)，3.61(s，3H，OCH3)，2.87(t，J＝7.8Hz，2H，CH2)，2.57(t，J＝7.8Hz，2H，CH2)，2.55(s，3H，COCH3)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ201.16(C)，173.34(C)，148.24(C)，138.49(C)，136.31(C)，134.55(CH)，132.53(CH)，129.21(CH x2)，123.56(CH x2)，118.83(C)，116.29(CH)，114.08(CH)，51.64(OCH3)，35.75(CH2)，30.42(CH2)，28.11(COCH3)；ESIm/z＝280.25(M+H)+，对C18H19NO3计算＝279.35
步骤3：
将3-[4-(2-乙酰基-苯基氨基)-苯基]-丙酸甲酯3(2.20g，7.40mmol)溶解在乙酸(30mL)中。加入H2SO4(2mL)，并将混合物在回流搅拌3h。在冷却至室温后，加入固体K2CO3，直至获得pH6。通过过滤分离固体，并在真空下干燥，以给出作为淡黄色固体的3-(9-甲基-吖啶-2-基)丙酸4(1.71g，6.45mmol，87％)。此材料不用进一步纯化便使用。
步骤4：
将3-(9-甲基-吖啶-2-基)丙酸4(1.35g，5.09mmol)溶解在MeOH(50mL)中，并加入H2SO4(2mL)。将混合物在回流搅拌4h，并随后倒入水中。将产物用DCM萃取，经过MgSO4干燥并在真空中浓缩，以给出作为淡棕色固体的3-(9-甲基-吖啶-2-基)-丙酸甲酯5(1.16g，4.15mmol，82％)。1HNMR(500MHz，CDCl3)δ8.14(m，3H，ar)，7.96(s，1H，ar)，7.68(m，1H，ar)，7.57(m，1H，ar)，7.47(m，1H，ar)，3.62(s，3H，OCH3)，3.14(t，J＝7.8Hz，2H，CH2)，3.04(s，1H，CH3)，2.72(t，J＝7.8Hz，2H，CH2)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ173.18(C)，184.21(C)，147.61(C)，141.43(C)，137.53(C)，131.19(CH)，130.50(CH)，130.26(CH)，129.48(CH)，125.70(C)，125.47(CH)，124.48(CH)，122.65(CH)，51.73(OCH3)，35.39(CH2)，31.47(CH2)，13.60(CH3)；ESI m/z＝280.25(M+H)+，对C18H17NO2计算＝279.33
步骤5：
将3-(9-甲基-吖啶-2-基)丙酸甲酯5(120mg，0.43mmol)溶解在MeI(3mL)中。将混合物在密封管中于90℃搅拌20h。通过过滤收集沉淀物，并在真空下干燥，以给出未反应的5和碘化2-(2-甲氧基羰基-乙基)-9，10-二甲基-吖啶6的混合物(15/85)。将此混合物通过柱色谱纯化(DCM/EtOH，90：10)。1H NMR(500MHz，(CD3)2SO2)δ8.88(d，J＝8.6Hz，1H，ar)，8.72(m，3H，ar)，840(dt，J＝9.9，7.5Hz，2H，ar)，8.01(t，J＝7.6Hz，1H，ar)，4.80(s，3H，NCH3)，3.62(s，3H，OCH3)，3.50(s，3H，CH3)，3.25(t，J＝7.5Hz，2H，CH2)，2.91(t，J＝7.5Hz，2H，CH2)；13C NMR(125MHz，(CD3)2SO2)δ172.46(C)，159.65(C)，140.24(C)，139.93(C)，139.65(CH)，139.32(C)，137.79(CH)，128.05(CH)，127.28(CH)，126.07(CH)，125.60(C x2)，119.29(CH)，119.20(CH)，51.43(OCH3)，38.67(CH3)，34.13(CH2)，29.78(CH2)，16.40(CH3)；ESI m/z＝294.25(M)+，对C19H20NO2计算＝294.37
步骤6：
将碘化2-(2-甲氧基羰基-乙基)-9，10-二甲基-吖啶6(250mg，0.594mmol)溶解在6M HCl(10mL)中，并将混合物在回流搅拌3.5h。在真空中的浓缩提供作为浅棕色固体的氯化2-(2-羧基-乙基)-9，10-二甲基-吖啶7(180mg，0.570mmol，96％)。1H NMR(500MHz，(CD3)2SO2)δ8.88(d，J＝8.7Hz，1H，ar)，8.72(m，3H，ar)，8.40(m，2H，ar)，8.01(t，J＝7.6Hz，1H，ar)，4.80(s，3H，NCH3)，3.50(s，3H，CH3)，3.22(t，J＝7.5Hz，2H，CH2)，2.31(t，J＝7.5Hz，2H，CH2)；13C NMR(125MHz，(CD3)2SO2)δ173.52(C)，159.56(C)，140.63(C)，139.88(C)，139.74(CH)，139.29(C)，137.45(CH)，128.04(CH)，127.26(CH)，125.97(CH)，125.60(C)，125.55(C)，119.24(CH)，119.19(CH)，38.68(CH3)，34.53(CH2)，29.91(CH2)，16.40(CH3)；ESI m/z＝280.26(M)+，对C18H18NO2 +计算＝280.34
在10-位的衍生化
靶标2：溴化10-(2-羧基乙基)吖啶-10-
以4个步骤合成靶标2，以提供溴化10-(2-羧基乙基)吖啶-10-(方案3)。如在Omura，S.等，J.Antibiotics，1992，45，1139中所述，将丙内酯8转化为3-三氟甲磺酰基氧基-丙酸苄酯10。按照Fukuzumi，S.等，J.Mater.Chem.，2005，15，372中所述方案，进行后续与吖啶的反应。
方案3
步骤1
将苄醇(5mL，48.3mmol)在冰浴中冷却，并分部加入60％NaH(50mg，1.25mmol)，将混合物在0℃搅拌30min。随后滴加丙内酯8(0.5mL，7.97mmol)，并将混合物在0℃再搅拌30min。通过加入2M HCl(2mL)使反应猝灭。将混合物用DCM萃取，用水洗涤，经过MgSO4干燥并蒸发。将残余物通过柱色谱纯化(庚烷/EtOAc，80∶20)以提供作为无色油的3-羟基-丙酸苄酯9(1.02g，5.66mmol，71％)。通过1H NMR、13C NMR和MS的分析符合结构。
步骤2
将3-羟基-丙酸苄酯9(360mg，2.0mmol)和吡啶(178μl，2.2mmol)溶解在DCM(8mL)中。将溶液冷却至-20℃，并滴加三氟甲磺酸酐(368μl，2.2mmol)。将混合物在-20℃搅拌30min，并随后在室温搅拌1h。在真空中的浓缩和通过快速柱色谱的纯化(庚烷/EtOAc，80∶20)提供3-三氟甲磺酰基氧基-丙酸苄酯10，其直接用于下一步骤(估计2mmol)。
步骤3
将3-三氟甲磺酰基氧基-丙酸苄酯10(估计2mmol)和吖啶(360mg，2mmol)溶解在DCM(10mL)中，并将混合物在室温搅拌24h。在真空中的浓缩提供在庚烷中沉淀并通过过滤分离的黑色油。通过柱色谱进行的纯化(DCM/EtOH，95∶5)提供作为黄色固体的10-(3-(苄基氧基)-3-氧代丙基)吖啶-10-三氟甲烷磺酸盐11(260mg，0.529mmol，26％)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ9.99(s，1H，ar)，8.54(dd，4H，ar)，8.29(t，2H，ar)，7.83(t，2H，ar)，7.23(m，5H，ar)，5.70(t，2H，CH2)，5.05(s，2H，CH2)，3.25(t，3H，CH2).
步骤4
将10-(3-(苄基氧基)-3-氧代丙基)吖啶-10-三氟甲烷磺酸盐11(250mg，0.508mmol)溶解在乙酸中的30％HBr中，并将混合物在50℃搅拌2h。在真空中的浓缩提供作为淡棕色固体的溴化10-(2-羧基乙基)吖啶-10-13(160mg，0.482mmol，95％)。1H NMR(500MHz，(CD3)2SO2)δ10.25(s，1H，ar)，8.76(d，2H，ar)，8.67(d，2H，ar)，8.49(t，2H，ar)，8.06(t，2H，ar)，5.60(t，2H，CH2)，3.13(t，3H，CH2)；13C NMR(125MHz，(CD3)2SO2)δ171.40(C)，151.49(CH)，140.30(C)，139.53(CH)，130.00(CH)，127.76(CH)，126.43(C)，118.42(CH)，46.16(CH2)，32.52(CH2)；ESI m/z＝252.24(M)+，对C16H14NO2计算＝252.29
靶标3：溴化10-(2-羧基乙基)-9-甲基吖啶-10-
通过类似于靶标2的方式获得靶标3，但使用9-甲基吖啶代替吖啶(方案4)。
方案4
步骤3
将3-三氟甲磺酰基氧基-丙酸苄酯10(估计3.5mmol)和9-甲基吖啶(386mg，2mmol)溶解在DCM(10mL)中，并将混合物在室温搅拌24h。在真空中的浓缩提供黑色油，并且通过柱色谱进行的纯化(DCM/EtOH，100-95∶0-5)提供作为黄色固体的想要的10-(3-(苄基氧基)-3-氧代丙基)-9-甲基吖啶-10-三氟甲烷磺酸盐13(120mg，0.232mmol，12％)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.69(d，2H，ar)，8.60(d，2H，ar)，8.32(t，2H，ar)，7.92(t，2H，ar)，7.27(m，5H，ar)，5.69(t，2H，CH2)，5.06(s，2H，CH2)，3.46(s，3H，CH3)，3.27(t，3H，CH2)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ169.79(C)，161.32(C)，139.93(CH)，138.51(C)，135.02(C)，128.57(CH)，128.44(CH)，128.42(CH)，128.21(CH)，128.03(CH)，126.10(C)，118.52(CH)，67.53(CH2)，46.08(CH2)，33.28(CH2)，16.25(CH3)；ESI m/z＝356.20对C24H22NO2计算＝356.44.
步骤4
将10-(3-(苄基氧基)-3-氧代丙基)-9-甲基吖啶-10-三氟甲烷磺酸盐13(100mg，0.193mmol)溶解在乙酸中的30％HBr中，并将混合物在50℃搅拌2h。在真空中的浓缩提供作为淡棕色固体的溴化10-(2-羧基乙基)-9-甲基吖啶-10-14(65mg，0.187mmol，99％)。1H NMR(500MHz，(CD3)2SO2)δ8.93(d，2H，ar)，8.72(d，2H，ar)，8.44(t，2H，ar)，8.03(t，2H，ar)，5.54(t，2H，CH2)，3.49(s，3H，CH3)，3.13(t，3H，CH2)；13C MR(125MHz，(CD3)2SO2)δ171.41(C)，161.71(C)，139.72(CH)，138.76(C)，128.32(CH)，127.40(CH)，125.67(C)，118.70(CH)，46.08(CH2)，32.48(CH2)，16.59(CH3)；ESI m/z＝266.26对C17H16NO2计算＝266.32.
在9-位的衍生化
靶标4：3-(吖啶-9-基)丙酸
建议合成路径-如在Jensen，H.，J.Am.Chem.Soc.，1926，48，1988中所述。
靶标5：氯化9-(2-羧基乙基)-10-甲基吖啶-10-
靶标5此前已经用于使用荧光强度技术测定水性缓冲液中的阴离子(Geddes，C.D.，Meas.Sci.Technol.，2001，12，R53；Wolfbeis，O.S.，等，Anal.Chem.，1984，56，427；Chen，C.-T.等，Org.Letters2009，11，4858)。然而，没有已知的对靶标5用作荧光寿命报告分子的报道。
靶标5的合成此前已被描述(Wolfbeis，O.S.，等，Anal.Chem.，1984，56，427)，然而，基于我们的用于前述靶标的策略，提出了一种合成路线(方案5)。
方案5
步骤1
将3-(吖啶-9-基)丙酸14(200mg，0.796mmol)溶解在MeOH(3mL)中，并加入H2SO4(0.5mL)。将混合物在回流搅拌4h，并随后倒入水中。将产物用DCM萃取，经过MgSO4干燥，并在真空中浓缩以给出3-(吖啶-9-基)丙酸甲酯15(170mg，0.641mmol，81％)。通过1H NMR、13C NMR和MS的分析符合结构。
步骤2
将3-(吖啶-9-基)丙酸甲酯15(150mg，0.565mmol)溶解在MeI(3mL)中。将混合物在密封管中于90℃搅拌20h。通过过滤收集沉淀物，并在真空下干燥。通过柱色谱进行的纯化(DCM/EtOH，90：10)提供碘化9-(3-甲氧基-3-氧代丙基)-10-甲基吖啶-10-16(120mg，0.295mmol，52％)。1HNMR(500MHz，CDCl3)δ8.89(d，2H，ar)，8.71(d，2H，ar)，8.43(t，2H，ar)，8.00(t，2H，ar)，5.15(s，3H，NCH3)，4.27(t，2H，CH2)，3.70(s，3H，CH3)，2.95(t，2H，CH2)；13C NMR(125MHz，(CDCl3)δ171.46(C)，160.91(C)，141.10(C)，139.22(CH)，128.55(CH)，127.0(CH)，125.34(C)，120.25(CH)，52.45(CH3)，41.47(CH3)，35.15(CH2)，24.91；ESI m/z＝280.19(M)+，对C18H18NO2计算＝280.28.
步骤3：
预期的是，酯向想要的酸的皂化可能使用前述用于靶标1的合成的流程进行(步骤6)。
实施例6：2-[2-(氨基甲酰基甲基-氨基甲酰基)-乙基]-9，10-二甲基-吖啶三氟乙酸盐的合成和荧光性质
被基团官能化从而能够与生物分子如肽缀合的染料的重要特征是，它对于缀合反应期间所用的条件尽可能稳定。在这种情况下，对于用于羧酸结构部分活化以使得能够与氨基形成酰胺键所需要的条件，9，10-二甲基吖啶-10-甲基吖啶核心必须稳定。相应地，甘氨酸在固相载体上使用PyBOP偶联条件利用2-(2-羧基乙基)-9，10-二甲基吖啶-10-染料标记以提供靶标LLD-Gly-CONH2(方案6)。选择此靶标，因为它能够容易地被1H/13CNMR和MS表征以证实染料的稳定性。实际上，通过1H/13C NMR和MS的表征的确证实了，在反相HPLC纯化之后获得了想要的靶标LLD-Gly-CONH2。
合成流程
方案6
将氯化2-(2-羧基乙基)-9，10-二甲基吖啶-10-(40mg，0.13mmol)溶解在DMF(500μl)中，并且然后加入PyBOP(66mg，0.13mmol)、HOBt(917mg，0.13mmol)和DIPEA(88.9μl，0.5mmol)。将混合物声波处理10分钟。使结合Rink酰胺的甘氨酸(200mg，0.13mmol)在DMF(1ml)中溶胀，并然后向树脂中加入预活化的染料溶液，并将混合物声波处理4.5小时。将树脂过滤并用DMF和DCM洗涤，随后在真空中干燥。将水(250μl)、TIS(125μl）和TFA(5ml)加入到干燥树脂中，并将混合物在室温搅拌4小时。将溶液过滤到冷二***(30ml)中，但没有沉淀出现。将染料标记的产物萃取到水(2x30ml)中，并随后冻干。通过RP-HPLC的纯化(Luna C18，250x4.6mm柱，10-50％经过40分钟)提供暗绿色绒毛状固体(9.75mg，23％)。1H NMR(300MHz，(CD3)CN)δ8.77(d，J＝8.4Hz，1H，ar)，8.59(s，1H，ar)，8.50(m，2H，ar)，8.32(m，2H，ar)，7.96(m，1H，ar)，4.72(s，3H，NCH3)，3.76(s，2H，CH2)，3.45(s，3H，CH3)，3.28(t，J＝7.5Hz，2H，CH2)，2.77(t，J＝7.5Hz，2H，CH2)；13C NMR(100MHz，CD3CN)δ174.04(C)，173.43(C)，161.14(C)，142.11(C)，141.37(C)，141.12(CH)，140.74(C)，139.02(CH)，128.97(CH)，128.37(CH)，127.20(CH)，127.15(C)，127.10(C)，119.70(CH)，119.63(CH)，42.90，(CH2)，39.39(CH3)，37.04(CH2)，31.60(CH2)，16.36(CH3)；ESI m/z＝336.25(M)+，对C20H22N3O2计算＝336.41；HRMS336.17060(M)+，对C20H22N3O2计算＝336.17065
实施例7：使用氯化2-(2-羧基乙基)-9，10-二甲基吖啶-10-合成染料标记的肽-通用流程
步骤1：氯化2-(2-羧基乙基)-9，10-二甲基吖啶-10-与肽的附接
将氯化2-(2-羧基乙基)-9，10-二甲基吖啶-10-(22mg，0.07mmol)溶解在DMF(200μl)中，并随后加入PyBOP(36.4mg，0.07mmol)、HOBt(9.5mg，0.07mmol)和DIPEA(23μl，0.17mmol)。将混合物声波处理10分钟。允许结合树脂的肽(100ng)在DMF(500μl）中溶胀，并随后向树脂中加入预活化的染料溶液，并将混合物声波处理4.5小时。将树脂过滤并用DMF和DCM洗涤，随后在真空中干燥。
步骤2：染料-标记的肽从树脂的裂解
将水(125μ)、TIS(62.5μl)和TFA(2.5ml)加入到干燥树脂(约100mg)中，并将混合物在室温搅拌3小时。将溶液过滤到冷二***(30ml)中，并将沉淀的肽离心，用二***(30ml)洗涤，并且冻干，以给出固体。通过制备HPLC的纯化提供了想要的产物。
实施例8：用于半胱天冬酶3测定的2-(2-羧基乙基)-9，10-二甲基吖啶-10-标记的肽底物的设计
使用在实施例7中描述的通用流程，合成两种染料标记的肽：2-(2-羧基乙基)-9，10-二甲基吖啶-10--DEVDSK(LLD-DEVDSK)和2-(2-羧基乙基)-9，10-二甲基吖啶-10--DEVDSW(LLD-DEVDSW)。出于两个原因选择这些肽底物；(1)研究色氨酸(W)作为2-(2-羧基乙基)-9，10-二甲基吖啶-10-荧光的调节剂的效果和(2)DEVDSX是蛋白酶半胱天冬酶3的出色底物。
在水中和在50mM TRIS pH7.5中以1μM肽浓度，测量染料标记的肽的荧光寿命(表3)。在50mM TRIS pH7.4中，LLD-DEVDSK的荧光寿命为29.3ns。用色氨酸替换赖氨酸残基导致荧光寿命明显降低21.5ns至7.8ns，提示色氨酸是9，10-二甲基吖啶-10-的荧光寿命的优异调节剂。
表3荧光寿命数据
色氨酸也显示出调节9，10-二甲基吖啶-10-的荧光强度。于405nm激发时，与LLD-DEVDSK相比，对于LLD-DEVDSW，观察到荧光发射降低90％(在500nm)(图4)。在10mM PBS中以500nM肽浓度进行测量。
实施例9：半胱天冬酶3测定-使用LLD-DEVDSW作为底物
方案7
预期的是，使底物LLD-DEVDSW猝灭的色氨酸的酶介导的裂解将产生荧光强度(增加)和荧光寿命变化(增加)(方案7)，因此使得染料能够被采用作为在生化测定和基于细胞的测定中的荧光报告分子。因此，在使用购买自R&D Systems的重组半胱天冬酶-3酶的生化酶裂解测定中，使用部分猝灭的2-(2-羧基乙基)-9，10-二甲基吖啶-10-标记的肽底物LLD-DEVDSW。使用在含有1mM DTT和0.1％CHAPS的50mM TRIS缓冲液pH7.2中500nM底物浓度，在2.5或1.25单位酶的存在下，进行测定(在384孔板中30μl的最终体积，一式三份)。使用EdinburghInstruments Nanotaurus Fluorescence Lifetime Plate Reader(Ex405nm和473nm长通发射滤光器)，实时地以时间间隔分析测定混合物。在反应进程中，观察到反应混合物的荧光寿命的大变化(从7.3ns至23.4ns)，说明底物正在转化成产物(图5)。荧光寿命从上述荧光寿命的偏移是缓冲液和酶混合物的结果。
实施例10：半胱天冬酶3测定-半胱天冬酶3被AcDEVD-CHO抑制
缓冲液：50mM TRIS pH7.2，含有1mM DTT和0.1％CHAPS
抑制剂：AcDEVD-CHO(1000nM至0.12nM，14个系列稀释液)
底物：LLD-DEVDSW(500nM)
酶：半胱天冬酶3(R&D Systems，252U/ml)，2U/孔
将AcDEVD-CHO的溶液(3000nM在缓冲液中，3x浓缩)系列2倍稀释，以产生14-系列的抑制剂浓度范围。将10μl的每种溶液加入到384孔板中，一式三份。随后将酶(2U在10μl缓冲液中)加入各孔中，并静置60分钟。将LLD-DEVDSW(10μl，1.5μM在缓冲液中，3x浓缩)加入各孔中，以开始测定。在20分钟后，使用Edinburgh Instruments NanotaurusFluorescence Lifetime Plate Reader(Ex405nm和473nm截止发射滤光器)对板分析。使用GraphPad Prism，将平均寿命对log抑制剂浓度的曲线拟合至可变斜率非线性回归模型，以给出对于AcDEVD-CHO为3.3nM的IC50值(见图6)。
实施例11：用于MMP2蛋白酶测定的底物的设计
从2-(2-羧基乙基)-9，10-二甲基吖啶-10-标记的肽底物在半胱天冬酶3测定中的成功应用继续下去，对用于荧光寿命MMP2蛋白酶测定中的LLD标记的肽底物的设计使用同样的原理。在这种情况下，2-(2-羧基乙基)-9，10-二甲基吖啶-10-标记的肽底物LLD-PLGLNalAR含有萘基丙氨酸(Nal)残基作为荧光调节剂，它的裂解将导致荧光强度和荧光寿命的增加(方案8)。
方案8
按照在实施例7中所述的通用流程合成LLD-PLGLNalAR，并将其用于使用购买自EnzoLifeSciences的重组MMP2酶的生化酶裂解测定。使用在含有150mM NaCl、1mM CaCl2、1mM ZnCl2和0.1％CHAPS的50mMTRIS缓冲液pH7.5中1μM底物浓度，在变化的酶浓度的存在下，进行测定(在384孔板中30μl的最终体积，一式三份)。使用Edinburgh InstrumentsNanotaurus Fluorescence Lifetime Plate Reader(Ex405nm和473nm长通发射滤光器)，实时地以时间间隔分析测定混合物。在反应进程中，观察到反应混合物的荧光寿命的大变化(从9.7ns至20.8ns)，说明底物正在转化成产物(图7)。
实施例12：用于酪氨酸激酶测定的底物的设计
按照在实施例7中所述的流程合成以下染料标记的肽；LLD-EPEGIYGVLF(Lck底物)、LLD-EPEGIpYGVLF(Lck产物)，LLD-GGEEEEYFELVKK(Jak2/3底物)和LLD-GGEEEEpYFELVKK(Jak2/3产物)。出于两个原因选择这些肽；(1)研究酪氨酸(Y)作为2-(2-羧基乙基)-9，10-二甲基吖啶-10-荧光的调节剂的效果和(2)EPEGIYGVLF是Lck激酶的底物，且GGEEEEYFELVKK是Jak2和Jak3激酶的底物。
在含有40μM ATP、10mM MgCl2和1mg/ml BSA的50mM TRIS pH7.4中，以1μM肽浓度，测量染料标记的肽的荧光寿命(表4)。在未磷酸化的和磷酸化的Lck肽之间，观察到5.2ns(从13.0ns至18.2ns)的增加，并且在未磷酸化的和磷酸化的Jak2/3肽之间，观察到4.8ns(从11.3ns至16.1ns)的增加，提示酪氨酸也是9，10-二甲基吖啶-10-的荧光寿命的一种良好调节剂。在磷酸化后，中性的苯酚结构部分转化成带负电的物种，从而减轻了酪氨酸的一些调节效果，并相应地观察到荧光的增加。在磷酸化后由酪氨酸引起的调节效果仅仅部分地减轻，并因此磷酸化的肽的荧光寿命不像游离染料那么长。
表4酪氨酸激酶肽的荧光寿命
实施例13：Lck酪氨酸激酶测定-使用LLD-EPEGIYGVLF底物
建议的是，在ATP的存在下LLD标记的底物的激酶介导的磷酸化将导致会被实时监测到的荧光寿命和荧光强度上的增加。因此，在使用购买自EnzoLifeSciences的重组Lck(p56lck)酶的生化酶磷酸化测定中，使用部分猝灭的2-(2-羧基乙基)-9，10-二甲基吖啶-10--标记的肽底物LLD-EPEGIYGVLF。在含有40μM ATP、10mM MgCl2和1mg/ml BSA的50mM TRIS缓冲液pH7.2中使用1μM底物浓度，在变化的酶浓度的存在下，进行测定(在384孔板中30μl的最终体积，一式三份)。使用Edinburgh Instruments Nanotaurus Fluorescence Lifetime Plate Reader(Ex405nm和473nm长通发射滤光器)，实时地以时间间隔分析测定混合物。在反应进程中，观察到反应混合物的荧光寿命的变化(从13.2ns至17.1ns)，说明底物正在转化成产物(图8)。
实施例14：Lck酪氨酸激酶测定-Lck被星形孢菌素抑制
缓冲液A：50mM TRIS pH7.2，含有1mg/ml BSA
缓冲液B：50mM TRIS pH7.2，含有80μMATP，20mM MgCl2和1mg/ml BSA
抑制剂：星形孢菌素(1000nM至0.12nM，14个系列稀释液)
底物：LLD-EPEGIYGVLF(1μM)
酶：Lck(p561ck)(EnzoLifeSciences，18U/ml)，4.5mU/孔
将星形孢菌素的溶液(6000nM在缓冲液A中，6x浓缩)系列2倍稀释，以产生14-系列的抑制剂浓度范围。将5μl的每种溶液加入到384孔板中，一式三份。随后将酶(4.5mU在10μl缓冲液A中)加入各孔中，并静置15分钟。将LLD-EPEGIYGVLF(15μl，2μM在缓冲液B中，2x浓缩)加入各孔中，以开始测定。在30分钟后，使用Edinburgh Instruments NanotaurusFluorescence Lifetime Plate Reader(Ex405nm和473nm截止发射滤光器)对板分析。使用GraphPad Prism，将抑制百分比对log抑制剂浓度的曲线拟合至可变斜率非线性回归模型，以给出对于星形孢菌素为25.9nM的IC50值(见图9)。
实施例15：Lck酪氨酸激酶测定-ATP Km测定
缓冲液A：50mM TRIS pH7.2，含有1mg/ml BSA
缓冲液B：50mM TRIS pH7.2，含有80μM ATP，20mM MgCl2和1mg/ml BSA
ATP：200μM至98nM，12个系列稀释液
底物：LLD-EPEGIYGVLF(1μM)
酶：Lck(p56lck)(EnzoLifeSciences，18U/ml)，3.6mU/孔
将ATP的溶液(600μM在缓冲液A中，3x浓缩)系列2倍稀释，以产生14-系列的浓度范围。将10μl的每种溶液加入到384孔板中，一式三份。随后将酶(3.6mU在5μl缓冲液A中)加入各孔中。将LLD-EPEGIYGVLF(15μl，2μM在缓冲液B中，2x浓缩)加入各孔中，以开始测定。使用Edinburgh Instruments Nanotaurus Fluorescence Lifetime Plate Reader(Ex405nm和473nm截止发射滤光器)，实时地以时间间隔对板分析。从标准曲线将平均寿命值转化为pmol磷酸化肽，并且使用反应初始速率依赖于ATP浓度的曲线，通过使用GraphPad Prism进行非线性回归拟合，测定ATP Km值(见图10)。对于使用LLD-EPEGIYGVLF的Lck激酶，测定ATPKm为36.41μM。
实施例16：染料衍生物III、IV、V、VI和VII与用于荧光寿命分析的肽的附接
使用在实施例7中所述的通用流程，用每种染料衍生物(III-VII)经由N-末端标记肽底物DEVDSK，以使得每种衍生物的荧光寿命值能够被测量和比较。染料标记的肽的荧光寿命在水中和在50mM TRIS pH7.4中以1μM浓度测量(表5)。
表5长寿命染料衍生物的比较

Claims (33)

1.式(I)的荧光染料作为检测靶分子的方法中的试剂的应用：
(其中：
R1是氢或J-L；
R2是不存在的、氢或J-L；
R3和R4在每一次出现时独立地选自氢、卤素、酰胺、羟基、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的芳基、烷氧基、烷硫基、氨基、单-或二-C1-C4烷基取代的氨基、巯基、羧基、酰基、甲酰基、磺酸根、季铵、J-L、或-K；
如果R2是不存在的则X是不存在的，并且如果R2是存在的，则它所附接到的氮原子是带正电的日X是抗衡离子；
各个J独立地是接头基团；
各个L独立地是氢或K；且
各个K独立地是靶键合基团，
前提是存在至少一个基团K)，所述方法包括对寿命荧光的测量。
2.权利要求1所述的应用，其中，各个J独立地包含1至40个链原子，所述链原子包括碳，且任选地包括氮、氧、硫和/或磷。
3.权利要求2所述的应用，其中，各个J独立地是取代的或未取代的亚烷基、亚烯基、亚烷氧基链或亚烷基甲酰胺链。
4.权利要求3所述的应用，其中，各个J独立地是包含2至6个碳原子的未取代的亚烷基链。
5.权利要求1至4中任一项所述的应用，其中，各个K独立地选自由以下各项组成的组：琥珀酰亚胺基酯、磺基-琥珀酰亚胺基酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、卤代乙酰胺、酰基卤、乙烯基砜、二氯三嗪、碳二亚胺、酰肼、亚磷酰胺五氟苯基酯，和烷基卤、羟基、氨基、巯基、咪唑、羧基、羰基、磷酸酯、硫代磷酸酯和氨基氧基。
6.在前权利要求中任一项所述的应用，其中，存在一个基团K。
7.权利要求6所述的应用，其中，所述基团K是羧基。
8.权利要求1至7中任一项所述的应用，其中：
(i)基团R2是存在的且是式-J-L；和/或
(ii)基团R1是氢或是式-J-L。
9.权利要求8所述的应用，其中：
(i)基团R2或者是未取代的烷基，或者是式-J-K；和/或
(ii)基团R1是式-J-K。
10.权利要求8所述的应用，其中，R1是氢或J-H；R2是J-L；且R3是氢或J-K。
11.在前权利要求中任一项所述的应用，其中，R2和抗衡离子X是存在的。
12.权利要求1所述的应用，其中，所述化合物具有式(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)中的一种：
13.在前权利要求中任一项所述的应用，其中，所述靶分子是生物分子。
14.权利要求13所述的应用，其中，所述生物分子选自由以下各项组成的组：抗体，脂类，蛋白质，肽，碳水化合物，含有或者被衍生化而含有氨基、巯基、羰基、羟基和羧基、磷酸酯、氨基氧基硫代磷酸酯和酰肼基中的一种或多种的核苷酸和含氧或脱氧多核酸。
15.一种用于测定样品中分析物的存在的方法，所述方法包括：
(i)使所述样品与所述分析物的已知结合伴侣和式(I)的荧光染料：
(其中：
R1是氢或J-L；
R2是不存在的、氢或J-L；
R3和R4在每一次出现时独立地选自氢、卤素、酰胺、羟基、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的芳基、烷氧基、烷硫基、氨基、单-或二-C1-C4烷基取代的氨基、巯基、羧基、酰基、甲酰基、磺酸根、季铵、J-L、或-K；
X是抗衡离子，如果R2是不存在的则所述抗衡离子是不存在的；
各个J独立地是接头基团；
各个L独立地是氢或K；且
各个K独立地是靶键合基团，
前提是存在至少一个基团K)的缀合物在以下条件下接触：所述条件有效地允许所述分析物的至少一部分与所述缀合物中的所述已知结合伴侣的结合以形成所述分析物和所述缀合物的复合物；
(ii)测量与所述分析物接触之前所述缀合物的荧光寿命或荧光强度；以及
(iv)测量由所述接触所得的混合物的荧光寿命或荧光强度。
16.权利要求15所述的方法，其中，所述分析物和已知结合伴侣选自由以下各项组成的组：抗体/抗原、凝集素/糖蛋白、生物素/链霉抗生物素蛋白、激素/受体、酶/底物或辅因子、DNA/DNA、DNA/RNA和DNA/结合蛋白。
17.权利要求15所述的方法，其中，所述分析物是酶且所述已知结合伴侣是所述酶的底物或辅因子；或者分析物是酶的底物或辅因子，所述酶是已知结合伴侣。
18.一种用于在缀合物的存在下测量酶的活性的方法，所述缀合物是由化合物和式(I)的荧光染料之间的缀合所得的缀合物：
(其中：
R1是氢或J-L；
R2是不存在的、氢或J-L；
R3和R4在每一次出现时独立地选自氢、卤素、酰胺、羟基、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的芳基、烷氧基、烷硫基、氨基、单-或二-C1-C4烷基取代的氨基、巯基、酰基、甲酰基、羧基、磺酸根、季铵、J-L、或-K；
X是抗衡离子，如果R2是不存在的则所述抗衡离子是不存在的；
各个J独立地是接头基团；
各个L独立地是氢或K；且
各个K独立地是靶键合基团，
前提是存在至少一个基团K)，
所述方法包括：
(i)测量与所述酶接触之前所述缀合物的荧光寿命或荧光强度；
(ii)使所述酶与所述缀合物接触；以及
(iii)测量由所述接触所得的混合物的荧光寿命或荧光强度。
19.权利要求18所述的方法，其中，所述缀合物的所述化合物是生物分子。
20.权利要求17至19中任一项所述的方法，其中，所述酶选自由以下各项组成的组：激酶、磷酸酶、蛋白酶、酯酶、肽酶、酰胺酶、核酸酶和糖苷酶。
21.权利要求19所述的方法，其中，所述生物分子是所述酶的底物，并且能够被所述酶裂解。
22.权利要求21所述的方法，其中，所述底物包含荧光调节结构部分，所述结构部分在所述底物被所述酶裂解后从所述式(I)的荧光染料分离。
23.权利要求22所述的方法，其中，所述荧光调节结构部分是色氨酸、酪氨酸、组氨酸、萘基丙氨酸或苯基丙氨酸残基或萘基、吲哚基或苯氧基。
24.权利要求19所述的方法，其中，所述酶是激酶且所述生物分子是所述激酶的底物。
25.权利要求24所述的方法，其中，所述底物包含荧光调节结构部分，所述荧光调节结构部分在所述激酶磷酸化所述底物后改变。
26.权利要求24所述的方法，所述方法在荧光调节结构部分的存在下进行，所述荧光调节结构部分是由配位到铁(III)离子的多齿配体构成的，并且所述激酶对所述底物的磷酸化提供所述铁(III)离子所配位到的磷酸酯基团。
27.权利要求18至26中任一项所述的方法，其中，所述方法在存在和不存在测试化合物两种情况下进行。
28.权利要求15至27中任一项所述的方法，其中，各个测量是对荧光寿命的测量。
29.权利要求1所述的应用，所述应用包括如在权利要求15至28中任一项中所定义的方法。
30.一种如在权利要求10中所定义的式(I)的荧光染料。
31.一种如在权利要求10中所定义的式(I)的荧光染料和生物分子的缀合物。
32.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)如在权利要求10中所定义的式(I)的荧光染料和生物分子的缀合物；和
(ii)所述生物分子的已知结合伴侣。
33.权利要求32所述的试剂盒，其中，所述已知结合伴侣是酶且所述生物分子是所述酶的底物或辅因子。
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