CN104059966A - Stag2基因突变序列、其检测方法以及stag2基因突变在检测膀胱癌中的应用 - Google Patents

Stag2基因突变序列、其检测方法以及stag2基因突变在检测膀胱癌中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明STAG2基因突变序列、其检测方法以及STAG2基因突变在检测膀胱癌中的应用，属于分子生物学基因检测技术领域。包括下述步骤：(1)、从膀胱癌患者的肿瘤组织和外周血中分别提取肿瘤组织DNA和外周血DNA；(2)、对步骤(1)中提取的两种DNA分别进行全基因组测序和全外显子测序；(3)、对步骤(2)的测序结果进行全外显子组序列比对与体细胞突变检测，得到突变基因；(4)、采用Sanger测序来验证步骤(3)所得突变基因的体细胞替换和***与缺失；(5)、突变基因为显著突变基因的鉴定。本发明具有确立了STAG2的突变是膀胱癌预后差的指标之一，也可以作为治疗膀胱癌的一个新的作用靶点的优点。

Description

STAG2基因突变序列、其检测方法以及STAG2基因突变在检测膀胱癌中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学基因检测技术领域，具体涉及STAG2基因突变序列、其检测方法以及STAG2基因突变在检测膀胱癌中的应用。
背景技术
在全世界各个国家和地区，膀胱癌是一种最常见泌尿生殖***恶性肿瘤。据估计，仅在2008年单年度就有386300例新发病例和150200例死亡病例。过去的研究表明：膀胱癌是一个具有较高异质性的疾病，它有两个不同亚型(浅表型和侵入型)，其临床表现多变和遗传背景复杂。最近，我们开展的一项研究结果表明：在膀胱移行细胞癌中，有八个染色质重塑基因(UTX，MLL-MLL3，CREBBP-EP300，NCOR1，ARID1A和CHD6)存在频发突变。然而，目前我们对膀胱癌的体细胞突变情况仍缺乏***的认识，我们对膀胱癌发生过程中的关键“驱动基因”也知之甚少。
为了确定这些突变基因与膀胱癌发生的相关性，我们采用过去研究中所描述的统计学方法分析了每个基因的体细胞突变率是否显著高于整个基因组的背景突变率。通过该分析，我们一共发现了37个显著突变基因(图1和附表6)，其中包括7个已知膀胱癌的基因(TP53，HRAS，FGFR3，PIK3CA，RB1，KRAS和TSC1)以及我们过去所发现的八个染色质重塑基因(UTX,ARID1A,MLL-MLL3，CREBBP-EP300，NCOR1和CHD6)。此外，我们还分析了染色质重塑相关基因和基因家族的突变情况，并在膀胱癌中观察到多个其他染色质重塑基因的频发突变，包括组蛋白脱甲基酶基因UTX/UTY(30%)，核染色质重塑基因ARID1A/4A(17%)，组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因MLL/MLL3/MLL5(16%)，组蛋白乙酰转移酶基因EP300/400(15%)，SWI/SNF复合体相关基因SMARCA4/C1(7%)和组蛋白脱甲基酶基因JARID1A/B(6%)。总的来说，在99例病例中，至少有57例(58%)患者的染色质重塑基因存在体细胞突变，这进一步表明调节染色质构象的表观遗传学改变和翻译后修饰可能是膀胱癌发生过程中的一种主要的驱动机制。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种检测STAG2基因突变的方法。
本发明的另一个目的在于公开了STAG2基因突变在检测膀胱癌中的应用。
本发明的第三个目的在于公开了通过上述检测方法得到的STAG2基因突变序列。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种检测STAG2基因突变的方法，包括下述步骤：
(1)、从膀胱癌患者的肿瘤组织和外周血中分别提取肿瘤组织DNA和外周血DNA；
(2)、对步骤(1)中提取的两种DNA分别进行全基因组测序和全外显子测序；
(3)、对步骤(2)的测序结果进行全外显子组序列比对与体细胞突变检测，得到突变基因；
(4)、采用Sanger测序来验证步骤(3)所得突变基因的体细胞替换和***与缺失；
(5)、突变基因为显著突变基因的鉴定。
上述技术方案所述的检测STAG2基因突变的方法，其中，步骤(2)中的全基因组测序过程为用Illumina公司的HiSeq2000平台对从膀胱癌患者的肿瘤组织和外周血中分别提取肿瘤组织DNA和外周血DNA，测序方式为双末端测序，测序读长为100bp。
上述技术方案所述的检测STAG2基因突变的方法，其中，步骤(2)中的全外显子组测序过程为对对从膀胱癌患者的肿瘤组织和外周血中分别提取肿瘤组织DNA和外周血DNA进行随机打断后，按照Agilent Technologies说明书提供的实验流程，采用SureSelect Human All Exon50Mb Kit来捕获全外显子组序列；全外显子组测序平台是Illumina公司的HiSeq2000平台，测序方式为双末端测序，测序读长为100bp。
上述技术方案所述的检测STAG2基因突变的方法，其中，步骤(3)中对步骤(2)的测序结果进行全外显子组序列比对与体细胞突变检测的过程为：
(a)、去除含有测序接头和包含五个以上未知碱基的低质量序列，用BWA在容缺口模式下将其余的高质量双末端测序序列比对到NCBI人类参考基因组hg18；
(b)、随后用基因组分析工具包GATK对BWA的比对结果进行了局部重新比对；
(c)、根据BWA的比对结果，利用VarScan找出了所有潜在的体细胞替换位点；
基本排除所有的生殖细胞突变的参数及过滤条件：
(i)肿瘤样本和匹配的血液样本在突变位点的基因组位置必须有足够的覆盖深度(≥8×)；
(ii)对于一个给定的基因组位置，肿瘤和血液样本平均碱基质量值应不小于15；
(iii)变异型应至少被肿瘤标本的20%的总读取数支持,而在血液样本没有高质量的变异支持读取也被认为是变异型；
(iv)在肿瘤组织中，支持突变的序列应不少于三条；
采用上述过滤条件，基于GATK局部重新比对的结果，找出了所有可能的***或缺失类型体细胞突变；为进一步降低假阳性，用SAMtools软件包来检测肿瘤组织中包括单核苷酸变异和***与缺失的所有变异，排除了满足以下任何一个过滤条件的所有体细胞变异：
(i)一致序列Phred质量值或SNP质量值<20；
(ii)比对质量值<30；
(iii)只发生于一条DNA链上的变异；
(iv)单碱基替换位点周围30bp范围内存在可疑的***或者缺失位点。
将所获得的体细胞突变与单核苷酸多态性数据库dbSNP132和1000人基因组计划中获得的SNP数据集进行了比较，排除在上述数据库中记录的所有位点，得到剩余的的变异。
上述技术方案所述的检测STAG2基因突变的方法，其中，步骤(4)中采用Sanger测序来验证步骤(3)所得突变基因的体细胞替换和***与缺失的过程为：对肿瘤组织DNA与外周血 DNA分别进行PCR扩增，扩增产物经Sanger测序得到突变位点。
上述技术方案所述的检测STAG2基因突变的方法，其中，PCR扩增的引物为SEQ NO.12～SEQ NO.77所示。
上述技术方案所述的检测STAG2基因突变的方法，其中，PCR扩增的热循环条件为：94℃5分钟酶的活性化反应；94℃30秒、65℃30秒和72℃30秒，共35个循环；72℃10分钟；PCR反应体系为：2μl dNTP、2μl10X PCR Buffer、1μl TF(10μM)、1μl TR(10μM)、1μl DNA模板、12.5μl dH2O(灭菌蒸馏水)和0.5μl TaKaRa Taq HS。
上述技术方案所述的检测STAG2基因突变的方法，其中，步骤(5)中显著基因的鉴定过程为：根据外显子组测序中找到的同义突变数量来计算样本的背景突变率，背景突变率bi计算公式为bi=1.4×mi/ni，其中i为每一突变类别，该类突变数目的观测值为mi，该类核苷酸在肿瘤样本中成功测序≥8×的总碱基数为ni；1.4为HapMap数据库中非同义突变比同义突变的比值；
基因g作为随机突变基因的概率pg值为7类突变的概率之积，即其中7为同义突变的7个不同的类别；
采用似然比检验来确定每个基因的P值，当P＜0.01时为显著突变基因。
上述技术方案中任一技术方案所述的检测STAG2基因突变的方法检测得到的STAG2基因突变序列。
上述技术方案所述的STAG2基因突变序列在检测膀胱癌中的应用，优选的所述膀胱癌为膀胱移行细胞癌。
本发明具有以下有益效果：
1、STAG2的突变是膀胱癌预后差的指标之一；
2、STAG2的突变可以作为膀胱癌诊断的一个辅助指标；
3、STAG2可以作为治疗膀胱癌的一个新的作用靶点。
附图说明
1、图1为5例患者STAG2染色体缺失；
2、图2为99例膀胱癌患者STAG2的氨基酸测序结果；
3、图3～图7为99例膀胱癌中5例患者发生STAG2缺失。
具体实施方式：
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明STAG2基因突变序列、其检测方法以及STAG2基因突变在检测膀胱癌中的应用作进一步的说明。
本发明实施例中未作特殊说明的操作方法均按照仪器中的说明书进行操作。
试验例1：STAG2基因突变在检测膀胱癌中的应用：
一、样本来源与及选择标准：
通过泌尿生殖***癌症基因组联盟(UCGC)的中国成员机构，从新诊断的患者中获取肿瘤 样本和与其匹配的外周血或正常对照组(相邻的形态正常的膀胱组织)。按照伦理审查委员会规定的制度，每个病人在招聘研究之前均签署了知情同意书。患者的详细的临床资料。所有的标本在收集后用液氮速冻并立即储存在-80℃用于进一步研究。苏木精-伊红(HE)染色切片均由两个病理医生在显微镜下独立地进行评估。在本研究中，我们只选取了膀胱癌细胞纯度超过85%的组织用于DNA提取和后续的测序。
样本的选择标准：1、所有99例患者(患者情况见表1所示)在术前都未经放疗或化疗；2、患者都是由中山肿瘤中心确诊的；3、样本组织都是新鲜组织，切下后30分钟内放入RNAlater中，并在4℃冷藏过夜，其后-80℃低温储存；4、经HE染色，肿瘤细胞超过80%的肿瘤组织；5、正常膀胱组织在病理学检查中显示正常组织无肿瘤细胞污染；6、年龄大于18岁。
表199例膀胱癌患者信息
二、主要试剂和仪器：
SureSelect Human All Exon50Mb Kit
TruSeq RNA样品制备试剂盒(Illumina公司)
Dual96-well GeneAmp PCR System9700(Applied Biosystems)
3730xlDNA分析仪(Applied Biosystems)
EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen,Hilden,Germany)
HotStar Taq DNA聚合酶(Qiagen,Hilden,Germany)
ABI StepOne(Applied Biosystems)
SYBR Premix Ex TaqTMII(TAKARA)试剂
GeneAmp PCR System9700thermal cycler(Life Technologies)
三、操作步骤：
(一)、基因组DNA提取和基于Illumina公司测序平台的全基因组和全外显子组测序：
DNA提取：根据说明书提供的实验步骤，提取表1中99例膀胱癌患者的肿瘤组织和匹配的外周血样本的基因组DNA，构建DNA文库；
全基因组测序所使用的测序平台是Illumina公司的HiSeq2000平台，测序方式为双末端测序，测序读长为100bp；
全外显子组测序：对来自同一批99对肿瘤—血液样本的基因组DNA进行随机打断后，按照Agilent Technologies说明书提供的实验流程，采用SureSelect Human All Exon50Mb Kit来捕获全外显子组序列。全外显子组测序所使用的测序平台是Illumina公司的HiSeq2000平台，测序方式为双末端测序，测序读长为100bp。
(二)、全外显子组序列比对与体细胞突变检测：
1、去除含有测序接头和包含五个以上未知碱基的低质量序列以后，我们使用BWA在容缺 口模式下将其余的高质量双末端测序序列比对到NCBI人类参考基因组(hg18)；
2、随后我们使用基因组分析工具包(GATK)对BWA的比对结果进行了局部重新比对；
3、根据BWA的比对结果，利用VarScan(v2.2)找出了所有潜在的体细胞替换位点；
基本排除所有的生殖细胞突变的参数及过滤条件：
(i)肿瘤样本和匹配的血液样本在突变位点的基因组位置必须有足够的覆盖深度(≥8×)；
(ii)对于一个给定的基因组位置，肿瘤和血液样本平均碱基质量值应不小于15；
(iii)变异型应至少被肿瘤标本的20%的总读取数支持,而在血液样本没有高质量的变异支持读取也被认为是变异型；
(iv)在肿瘤组织中，支持突变的序列应不少于三条。采用上述过滤条件，基于GATK局部重新比对的结果，我们找出了所有可能的***或缺失类型体细胞突变。
为进一步降低假阳性，我们采用SAMtools软件包来检测肿瘤组织中的所有变异(包括单核苷酸变异(SNVs)和***与缺失)。我们排除了满足以下任何一个过滤条件的所有体细胞变异：
(i)一致序列Phred质量值或SNP质量值<20；
(ii)比对质量值<30；
(iii)只发生于一条DNA链上的变异；
(iv)单碱基替换位点周围30bp范围内存在可疑的***或者缺失位点。
为了去除任何以前发现的生殖细胞变异，我们将所获得的体细胞突变与单核苷酸多态性数据库(dbSNP132)和1000人基因组计划中获得的SNP数据集(http://www.1000genomes.org)进行了比较。在上述数据库中记录的所有位点均被排除，其余的变异可用于进一步研究。
(三)、采用Sanger测序来验证体细胞替换和***与缺失：
通过基于PCR扩增的Sanger测序来验证非沉默体细胞替换和***与缺失。我们采用Primer3针对所有可能的体细胞突变位点来设计PCR扩增引物，33对PCR引物如SEQ No.12～44所示(每对引物加入相应配对的肿瘤样本)，PCR引物首先被用来扩增肿瘤组织的DNA；PCR扩增实验均在Dual96-well GeneAmp PCR System9700(Applied Biosystems)***完成，每个反应中都加入了来自不同个体的20ng模板DNA。
(1)、按表2中的组份配制PCR反应体系(在冰上进行反应体系的配制)。
表2PCR反应体系
(2)、在eppendof PCR热循环仪上进行PCR扩增，热循环条件为：94℃5分钟酶的活性化反应；94℃30秒、65℃30秒和72℃30秒，共35个循环；72℃10分钟；
(3)、将获得的PCR产物在4℃保存。
通过上述PCR扩增得到肿瘤组与正常对照组的PCR产物。
(4)、扩增出的PCR片断送到深圳华大基因研究院，PCR扩增产物均由3730xlDNA分析仪(Applied Biosystems)完成测序。所有测序结果都由测序分析软件5.2版本(Applied Biosystems)完成分析。如果肿瘤中突变被成功验证，相同的引物对被用来扩增同一个体的血液DNA，以确定该突变是否为体细胞突变。
突变序列如SEQ No.1～SEQ No.11所示，其中与SEQ No.1相对应的正常序列的第301位上为G，而突变序列中第301位为A；与SEQ No.2相对应的正常基因与突变基因相比，突变基因在第301位上多了碱基A；与SEQ No.3相对应的正常序列的第301位上为G，而突变中第301位为T；与SEQ No.4相对应的正常序列的第301位上为G，而SEQ No.1中第301位为A；与SEQ No.5相对应的正常序列的第301和第302位上为T和G，而突变序列中缺少T和G；与SEQ No.6相对应的正常序列的第301位上为C，而突变中第301位为T；与SEQ No.7相对应的正常序列的第301位上为G，而突变序列中第301位为A；与SEQ No.8相对应的正常序列的第301位为A，而突变序列中缺少A；与SEQ No.9相对应的正常序列的第301位上为T，而SEQ No.1中第301位为C；与SEQ No.10相对应的正常序列的第301位上为C，而突变序列中第301位为T；与SEQ No.11相对应的正常序列的第301位上为C，而突变序列中第301位为T。
(四)、显著突变基因的鉴定：
根据外显子组测序中找到的同义突变数量来估计99例样本的背景突变率，其定义公式为：所观察到的同义突变率乘以HapMap数据库中非同义突变比同义突变的比值(1.4)。简而言之，就是根据突变的相邻序列和突变类型，将同义突变分为7个不同的类别。对于每一突变类别i，假设该类突变数目的观测值为mi，该类核苷酸在99例肿瘤样本中成功测序(≥8×)的总碱基数为ni；那么该类背景突变率bi可计算为bi=1.4×mi/ni。
为了检验某一基因的非沉默突变率(非同义突变)是否明显高于背景突变率，采用从外显子测序数据中得到验证的突变数据进行计算。然后，根据Sjoblom,T.等研究者所建立的统计方法来依次估算每个基因可能作为随机突变基因的概率。具体地说，采用二项分布作为统计模型，以bi作为二项分布中事件的成功概率，以此来估算基因g每类突变发生数量的机率(pgi)。每类突变成功测序的核苷酸数量为99例肿瘤样本中该类突变覆盖深度足够(≥8×)的核苷酸总数。基因g作为随机突变基因的概率(pg)值为7类突变的概率之积，即根据Gad Getz等研究者确定的方法，我们采用似然比检验来确定每个基因的P值。我们将显著突变基因定义为：在99例样本中至少5例发生突变并且其非同义突变率显著高于背景突变率(P＜0.01)。
四：验证步骤
(一)、扩大样本验证STAG2基因突变
1、运用Primer5.0(Premier Biosoft)设计了33对引物（如SEQ No.12～77），来独立扩增基因STAG2基因3号到35号外显子之间的编码序列。（按照primer说明书要求）
2、利用Dual96-well GeneAmp PCR System9700(Applied Biosystems)设备，在另外50例膀胱癌患者的肿瘤组织和匹配的血液样本进行PCR扩增，利用3730xl DNA Analyzer(Applied Biosystems)***来对样本进行测序并通过Applied Biosystems5.2版本测序分析软件对测序结果进行分析。
结果如图3-7所示，表明STAG2在正常组织中没有发现变异，在膀胱癌组织中检测有变异。
(二)、通过亚硫酸盐测序对STAG2启动子甲基化进行分析：
1、根据亚硫酸盐测序说明书的具体操作步骤，我们利用EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen,Hilden,Germany)对99例患者选取30例患者的肿瘤组织和正常组织的基因组DNA进行亚硫酸盐修饰。
2、通过亚硫酸盐测序PCR来测定Proscan所预测的STAG2启动子的甲基化状态。亚硫酸盐PCR引物由MethPrimer33在线程序设计，序列如表3所示(SEQ No.78-No.79)；
表3Bisulfite PCR primers
(i)将2ul经亚硫酸盐处理过的DNA加入50ul的反应液中，并
(ii)加入HotStar Taq DNA聚合酶(Qiagen,Hilden,Germany)后在以下条件下完成扩增反应：95℃10分钟,94℃中1分钟循环45次,61℃中45秒，以及72℃中1分钟，最后72℃条件下延伸10min。
(iii)将PCR产物纯化后，连接至pMD-18T载体。每个样品随机挑选10个白色的克隆进行测序，以确定每一个CpG点的甲基化状态。
(iv)运用The BISMA(Bisulfite Sequencing DNA Methylation Analysis)软件来确定每一个CpG点的甲基化状态并展示其甲基化特征。用log2倍数比(肿瘤组织比正常组织)来衡量每一患者(共30例)STAG2启动子甲基化水平的变化情况。
(v)运用卡方检验计算P值并确定差异甲基化的样本。
结果如表4所示，我们认为甲基化水平≥10%，log2倍数比≥1和P-value≤0.001的STAG2启动子为高甲基化。
表430例肿瘤组织及匹配的正常膀胱癌组织样本中STAG2启动子甲基化状态
在新发现的突变基因中，STAG2基因的非同义突变率显著性最高(P=8×10-11)。STAG2基因的非同义突变率显著高于随机发生的同义突变(P=0.02)。STAG2是一个位于X染色体上的基因，其编码产物是与细胞周期纺锤体检验点功能相关的聚合体的组成部分，该聚合体在细胞***过程中调节姐妹染色单体的分离。如图1和图2所示，11例患者(11%)STAG2基因发生突变，其中9例为截断突变(3例小移码***或缺失，4例无义突变，2例剪接位点突变)。
此外，如图3-图7所示，在99例肿瘤中还发现5例STAG2基因发生缺失，ID分别为B16、B9、B80、B83和B89-12。
我们利用Sanger测序在另外50例膀胱癌病人的肿瘤组织及匹配的正常对照中进一步分析了STAG2基因的全部外显子序列，结果在4个肿瘤样品中发现了5个体细胞突变。我们还采用亚硫酸氢盐测序技术在19例膀胱癌患者中分析了STAG2启动子的甲基化状态。相对于正常样本，我们发现三例肿瘤STAG2启动子甲基化(15%)(见上表4)。为了明确STAG2变异情况和个体生存之间的联系，我们采用Kaplan-Meier生存分析方法进行分析，发现：与野生型个体相比，STAG2体细胞变异的个体预后更差。同样，不论在浅表型或侵入性亚型膀胱癌中，STAG2体细胞突变都与患者生存率显著相关(P<0.001)，这提示STAG2突变可能是一个预测膀胱癌预后差的独立因子。先前有研究表明：在尤因氏肉瘤、胶质母细胞瘤和黑色素瘤中，STAG2的失活可引起染色单体结合缺陷并导致形成非整倍体。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种检测STAG2基因突变的方法，包括下述步骤：
(1)、从膀胱癌患者的肿瘤组织和外周血中分别提取肿瘤组织DNA和外周血DNA；
(2)、对步骤(1)中提取的两种DNA分别进行全基因组测序和全外显子测序；
(3)、对步骤(2)的测序结果进行全外显子组序列比对与体细胞突变检测，得到突变基因；
(4)、采用Sanger测序来验证步骤(3)所得突变基因的体细胞替换和***与缺失；
(5)、突变基因为显著突变基因的鉴定。
2.根据权利要求1所述的检测STAG2基因突变的方法，其特征在于，步骤(2)中的全基因组测序过程为用Illumina公司的HiSeq2000平台对从膀胱癌患者的肿瘤组织和外周血中分别提取肿瘤组织DNA和外周血DNA，测序方式为双末端测序，测序读长为100bp。
3.根据权利要求1所述的检测STAG2基因突变的方法，其特征在于，步骤(2)中的全外显子组测序过程为对对从膀胱癌患者的肿瘤组织和外周血中分别提取肿瘤组织DNA和外周血DNA进行随机打断后，按照Agilent Technologies说明书提供的实验流程，采用SureSelect Human All Exon50Mb Kit来捕获全外显子组序列；全外显子组测序平台是Illumina公司的HiSeq2000平台，测序方式为双末端测序，测序读长为100bp。
4.根据权利要求1所述的检测STAG2基因突变的方法，其特征在于，步骤(3)中对步骤(2)的测序结果进行全外显子组序列比对与体细胞突变检测的过程为：
(a)、去除含有测序接头和包含五个以上未知碱基的低质量序列，用BWA在容缺口模式下将其余的高质量双末端测序序列比对到NCBI人类参考基因组hg18；
(b)、随后用基因组分析工具包GATK对BWA的比对结果进行了局部重新比对；
(c)、根据BWA的比对结果，利用VarScan找出了所有潜在的体细胞替换位点；
基本排除所有的生殖细胞突变的参数及过滤条件：
(i)肿瘤样本和匹配的血液样本在突变位点的基因组位置必须有足够的覆盖深度(≥8×)；
(ii)对于一个给定的基因组位置，肿瘤和血液样本平均碱基质量值应不小于15；
(iii)变异型应至少被肿瘤标本的20%的总读取数支持,而在血液样本没有高质量的变异支持读取也被认为是变异型；
(iv)在肿瘤组织中，支持突变的序列应不少于三条;
采用上述过滤条件，基于GATK局部重新比对的结果，找出了所有可能的***或缺失类型体细胞突变；为进一步降低假阳性，用SAMtools软件包来检测肿瘤组织中包括单核苷酸变异和***与缺失的所有变异，排除了满足以下任何一个过滤条件的所有体细胞变异：
(i)一致序列Phred质量值或SNP质量值<20；
(ii)比对质量值<30；
(iii)只发生于一条DNA链上的变异；
(iv)单碱基替换位点周围30bp范围内存在可疑的***或者缺失位点。
将所获得的体细胞突变与单核苷酸多态性数据库dbSNP132和1000人基因组计划中获得的SNP数据集进行了比较，排除在上述数据库中记录的所有位点，得到剩余的的变异。
5.根据权利要求1所述的检测STAG2基因突变的方法，其特征在于，步骤(4)中采用Sanger测序来验证步骤(3)所得突变基因的体细胞替换和***与缺失的过程为：对肿瘤组织DNA与外周血DNA分别进行PCR扩增，扩增产物经Sanger测序得到突变位点。
6.根据权利要求5所述的检测STAG2基因突变的方法，其特征在于，PCR扩增的引物为SEQ NO.12～SEQ NO.77所示。
7.根据权利要求5所述的检测STAG2基因突变的方法，其特征在于，PCR扩增的热循环条件为：94℃5分钟酶的活性化反应；94℃30秒、65℃30秒和72℃30秒，共35个循环；72℃10分钟；PCR反应体系为：2μl dNTP、2μl10X PCR Buffer、1μlTF(10μM)、1μl TR(10μM)、1μl DNA模板、12.5μl dH2O(灭菌蒸馏水)和0.5μlTaKaRa Taq HS。
8.根据权利要求1所述的检测STAG2基因突变的方法，其特征在于，步骤(5)中显著基因的鉴定过程为：根据外显子组测序中找到的同义突变数量来计算样本的背景突变率，背景突变率bi计算公式为bi=1.4×mi/ni，其中i为每一突变类别，该类突变数目的观测值为mi，该类核苷酸在肿瘤样本中成功测序≥8×的总碱基数为ni；1.4为HapMap数据库中非同义突变比同义突变的比值；
基因g作为随机突变基因的概率pg值为7类突变的概率之积，即其中7为同义突变的7个不同的类别；
采用似然比检验来确定每个基因的P值，当P＜0.01时为显著突变基因。
9.由权利要求1-8中任一权利要求所述的检测STAG2基因突变的方法检测得到的STAG2基因突变序列。
10.权利要求9所述的STAG2基因突变序列在检测膀胱癌中的应用，优选的所述膀胱癌为膀胱移行细胞癌。
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Cited By (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104408284A (zh) * 2014-10-24 2015-03-11 北京微旋基因技术有限公司 癌症体细胞突变基因测序数据分析工作流整合算法
CN104462869A (zh) * 2014-11-28 2015-03-25 天津诺禾致源生物信息科技有限公司 检测体细胞单核苷酸突变的方法和装置
CN105779433A (zh) * 2014-12-15 2016-07-20 天津华大基因科技有限公司 试剂盒及其用途
CN105779432A (zh) * 2014-12-15 2016-07-20 天津华大基因科技有限公司 试剂盒及其用途
CN105779435A (zh) * 2014-12-15 2016-07-20 天津华大基因科技有限公司 试剂盒及其用途
CN105779434A (zh) * 2014-12-15 2016-07-20 天津华大基因科技有限公司 试剂盒及其用途
CN106282320A (zh) * 2015-05-20 2017-01-04 广州华大基因医学检验所有限公司 检测体细胞突变的方法和装置
CN106407745A (zh) * 2016-11-04 2017-02-15 成都鑫云解码科技有限公司 皮肤对应的基因的突变位点的获取方法及装置
CN106554993A (zh) * 2015-09-30 2017-04-05 广州华大基因医学检验所有限公司 试剂盒及其用途
CN106636116A (zh) * 2015-07-31 2017-05-10 深圳市第二人民医院 基因突变序列及其在鉴定膀胱癌干细胞中的应用
CN106834107A (zh) * 2017-03-10 2017-06-13 首度生物科技（苏州）有限公司 一种基于二代测序的预测肿瘤***
CN106916881A (zh) * 2015-12-28 2017-07-04 广州华大基因医学检验所有限公司 试剂盒及其用途
CN107208156A (zh) * 2015-02-09 2017-09-26 10X基因组学有限公司 用于使用变异识别数据来确定结构变异和定相的***和方法
CN107607712A (zh) * 2017-10-24 2018-01-19 李翀 用于预测膀胱癌患者化疗敏感性的***
CN108090328A (zh) * 2017-12-31 2018-05-29 浙江大学 一种基于机器学习和多种统计学原理的癌症驱动基因鉴定方法
CN108388773A (zh) * 2018-02-01 2018-08-10 杭州纽安津生物科技有限公司 一种肿瘤新生抗原的鉴定方法
CN108491689A (zh) * 2018-02-01 2018-09-04 杭州纽安津生物科技有限公司 基于转录组的肿瘤新抗原鉴定方法
CN109680061A (zh) * 2017-10-19 2019-04-26 吕兆洁 与人膀胱癌相关的遗传标记、其检测方法及用途
CN110093417A (zh) * 2018-01-31 2019-08-06 北京大学 一种检测肿瘤单细胞体细胞突变的方法
CN110310701A (zh) * 2019-06-05 2019-10-08 复旦大学 基于EucDiff值预测突变对RNA二级结构影响程度的方法和相关设备
CN110890131A (zh) * 2019-11-04 2020-03-17 深圳市华嘉生物智能科技有限公司 一种基于遗传性基因突变预测癌症风险的方法
CN111445947A (zh) * 2020-03-27 2020-07-24 武汉古奥基因科技有限公司 利用三代全长转录组的高原多倍体鱼类基因组注释方法
CN112562785A (zh) * 2020-12-10 2021-03-26 哈尔滨医科大学附属第一医院 基于atac测序数据筛选子宫内膜癌关键基因的方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103540589A (zh) * 2013-10-28 2014-01-29 深圳市第二人民医院 Tert启动子的单核苷酸多态性序列
CN103748234A (zh) * 2011-07-22 2014-04-23 深圳华大基因科技有限公司 用于膀胱癌诊断的序列及其使用方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103748234A (zh) * 2011-07-22 2014-04-23 深圳华大基因科技有限公司 用于膀胱癌诊断的序列及其使用方法和应用
CN103540589A (zh) * 2013-10-28 2014-01-29 深圳市第二人民医院 Tert启动子的单核苷酸多态性序列

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CRISTINA BALBÁS-MARTÍNEZ,ET AL: "Recurrent inactivation of STAG2 in bladder cancer is not associated with aneuploidy", 《NAT GENET.》 *
SOLOMON ET AL: "Frequent truncating mutations of STAG2 in bladder cancer", 《NAT GENET.》 *

Cited By (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104408284A (zh) * 2014-10-24 2015-03-11 北京微旋基因技术有限公司 癌症体细胞突变基因测序数据分析工作流整合算法
CN104462869B (zh) * 2014-11-28 2017-12-26 天津诺禾致源生物信息科技有限公司 检测体细胞单核苷酸突变的方法和装置
CN104462869A (zh) * 2014-11-28 2015-03-25 天津诺禾致源生物信息科技有限公司 检测体细胞单核苷酸突变的方法和装置
CN105779433A (zh) * 2014-12-15 2016-07-20 天津华大基因科技有限公司 试剂盒及其用途
CN105779432A (zh) * 2014-12-15 2016-07-20 天津华大基因科技有限公司 试剂盒及其用途
CN105779435A (zh) * 2014-12-15 2016-07-20 天津华大基因科技有限公司 试剂盒及其用途
CN105779434A (zh) * 2014-12-15 2016-07-20 天津华大基因科技有限公司 试剂盒及其用途
CN107208156A (zh) * 2015-02-09 2017-09-26 10X基因组学有限公司 用于使用变异识别数据来确定结构变异和定相的***和方法
CN107208156B (zh) * 2015-02-09 2021-10-08 10X基因组学有限公司 用于使用变异识别数据来确定结构变异和定相的***和方法
CN106282320B (zh) * 2015-05-20 2019-10-18 广州华大基因医学检验所有限公司 检测体细胞突变的方法和装置
CN106282320A (zh) * 2015-05-20 2017-01-04 广州华大基因医学检验所有限公司 检测体细胞突变的方法和装置
CN106636116A (zh) * 2015-07-31 2017-05-10 深圳市第二人民医院 基因突变序列及其在鉴定膀胱癌干细胞中的应用
CN106636116B (zh) * 2015-07-31 2020-09-15 深圳市第二人民医院 基因突变序列及其在鉴定膀胱癌干细胞中的应用
CN106554993A (zh) * 2015-09-30 2017-04-05 广州华大基因医学检验所有限公司 试剂盒及其用途
CN106916881A (zh) * 2015-12-28 2017-07-04 广州华大基因医学检验所有限公司 试剂盒及其用途
CN106407745A (zh) * 2016-11-04 2017-02-15 成都鑫云解码科技有限公司 皮肤对应的基因的突变位点的获取方法及装置
CN106834107A (zh) * 2017-03-10 2017-06-13 首度生物科技（苏州）有限公司 一种基于二代测序的预测肿瘤***
CN109680061B (zh) * 2017-10-19 2022-05-20 吕兆洁 与人膀胱癌相关的遗传标记、其检测方法及用途
CN109680061A (zh) * 2017-10-19 2019-04-26 吕兆洁 与人膀胱癌相关的遗传标记、其检测方法及用途
CN107607712A (zh) * 2017-10-24 2018-01-19 李翀 用于预测膀胱癌患者化疗敏感性的***
CN108090328B (zh) * 2017-12-31 2020-04-10 浙江大学 基于机器学习和多种统计学原理的癌症驱动基因鉴定方法
CN108090328A (zh) * 2017-12-31 2018-05-29 浙江大学 一种基于机器学习和多种统计学原理的癌症驱动基因鉴定方法
CN110093417A (zh) * 2018-01-31 2019-08-06 北京大学 一种检测肿瘤单细胞体细胞突变的方法
CN110093417B (zh) * 2018-01-31 2021-03-02 北京大学 一种检测肿瘤单细胞体细胞突变的方法
CN108388773B (zh) * 2018-02-01 2019-11-19 杭州纽安津生物科技有限公司 一种肿瘤新生抗原的鉴定方法
CN108491689A (zh) * 2018-02-01 2018-09-04 杭州纽安津生物科技有限公司 基于转录组的肿瘤新抗原鉴定方法
CN108388773A (zh) * 2018-02-01 2018-08-10 杭州纽安津生物科技有限公司 一种肿瘤新生抗原的鉴定方法
CN110310701A (zh) * 2019-06-05 2019-10-08 复旦大学 基于EucDiff值预测突变对RNA二级结构影响程度的方法和相关设备
CN110890131A (zh) * 2019-11-04 2020-03-17 深圳市华嘉生物智能科技有限公司 一种基于遗传性基因突变预测癌症风险的方法
CN110890131B (zh) * 2019-11-04 2023-08-25 深圳市华嘉生物智能科技有限公司 一种基于遗传性基因突变预测癌症风险的方法
CN111445947A (zh) * 2020-03-27 2020-07-24 武汉古奥基因科技有限公司 利用三代全长转录组的高原多倍体鱼类基因组注释方法
CN112562785A (zh) * 2020-12-10 2021-03-26 哈尔滨医科大学附属第一医院 基于atac测序数据筛选子宫内膜癌关键基因的方法及应用

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