CN104045704B - PEG化重组人IFN-λ1、其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种PEG化重组人IFN‑λ1、其制备方法和用途。具体来说,本发明实现了对重组人IFN‑λ1的PEG定点修饰,本发明还提供了由此获得的PEG化重组人IFN‑λ1在制备治疗慢性乙型肝炎或肝癌的药物中的用途。根据本发明的方法制备的PEG化重组人IFN‑λ1的均一性好,纯度大于98%。PEG化重组人IFN‑λ1可以显著抑制荷瘤裸鼠皮下肿瘤的生长,显著降低裸鼠血清中HBsAg含量,同时显示了较好的安全性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域。更具体而言,涉及一种通过重组技术和化学修饰技术而获得的干扰素、及其制备方法和用途。尤其涉及一种聚乙二醇化修饰的重组人IFN-λ1、其制备方法及其在制备治疗慢性乙型肝炎或肝癌的药物中的用途。
背景技术
干扰素-λs(IFN-λs)是一类新型干扰素,分类定为III型干扰素,由IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)和IFN-λ3(IL-28B)组成。2003年由美国科学家首次报道了该型干扰素(Sheppard P.等人,2003;Kotenko1S.V.等人,2003)。
IFN-λ基因位于19号染色体,基因中含有多个内含子,其基因结构与IL-10家族成员十分相似,而与IFN-α相差甚远。在氨基酸组成上,IFN-λs也只有15-19%的氨基酸与IFN-α相同。尽管如此,IFN-λs在功能上与IFN-α十分相似,可以抑制乙型肝炎/丙型肝炎病毒(HBV/HCV)的复制,还可以抑制脑心肌炎病毒(EMCV)、人巨细胞病毒(CMV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、单纯疱疹病毒(HSV-2)等病毒的活性(Bobek M.D.等人,2005)。除了抗病毒活性外,在细胞学实验中,IFN-λs可以抑制神经内分泌肿瘤、食管癌、结肠癌、肺癌以及Burkitt’s淋巴瘤细胞和黑色素瘤细胞的增殖,并已有用mIFN-λs在小鼠体内通过调动宿主的免疫机制抑制小鼠肿瘤细胞如黑色素瘤、纤维肉瘤及肝癌细胞增殖的报道(Abushahba W.等人,2010)。
IFN-λs的受体属于Ⅱ类细胞因子受体家族,由结构特异的异源二聚体复合物组成。IL-28Rα是配基结合亚基,决定了受体与IFN-λ结合的特异性,IL-10βR是辅助亚基。与广泛表达的I型IFN(IFN-α/β)受体不同,IFN-λ受体的表达有细胞特异性,主要表达于上皮细胞表面,例如在肝脏中的所有细胞都表达IFN-α的受体,而IFN-λ的受体只在肝细胞表达。同样在外周血淋巴细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、中性粒细胞和单核细胞等都广泛表达IFN-α受体,但是除了B淋巴细胞外在造血细胞中没有检测到IFN-λ受体的表达(Muir A.J.等人,2010)。这种不同IFN家族受体分布的差异性将影响IFN在体内的效应,与目前临床上普遍使用的I型IFN在治疗上的毒副作用及耐受性差相比,IFN-λs具有潜在的优势,能够在发挥抗病毒、抗肿瘤及参与免疫调节等生物活性的同时有效地减少对造血和中枢神经***的毒副作用。
但是和I型IFN相似,IFN-λs相对分子质量较小(约为20kD),易于被肾小球滤过;体内不稳定,易被蛋白酶降解,血浆半衰期短;治疗周期长,需要频繁注射,导致患者的依存性降低;作为异源***表达的重组蛋白类生物制剂也存在免疫原性问题。所有这些都有可能减弱IFN-λs的临床效果。
聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)是一种无毒性、无免疫原性、安全的聚合物。用PEG链共价偶联修饰蛋白质是自上世纪70年代以来发展最为成功的在体内输送多肽及蛋白质药物的技术。PEG修饰蛋白质在治疗上的益处包括:
-增加了蛋白质分子量,减少肾小球滤过率从而延长了血浆半衰期;
-增加了蛋白质理化稳定性,减少蛋白酶的降解;
-降低了毒性及限制了蛋白质的免疫原性;
-增加了蛋白质药物的可溶性;
-通过改善蛋白质药物动力学性能,与未修饰蛋白质药物相比,有效地增强了药物在体内的活性(Veronese FM等人,2005)。对蛋白质的PEG化修饰方法主要是采用单甲氧基PEG分子(mono-methoxyPEG,mPEG)与蛋白质表面反应性基团共价偶联,其主要的修饰途径是对N末端氨基或赖氨酸侧链氨基进行酰化修饰,但是这种修饰方式容易产生异质性(即异构体混合物)。
肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内常见肿瘤死亡率中位列第三。全世界每年有超过60万例新增肝癌患者,其中约55%的患者在中国。慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是诱发肝癌最重要的危险因素,在我国大约有80%的肝癌患者有HBV感染史(Yang,J.D等人,2010;Parkin,D.M.等人,2005)。IFN-α用于抗HBV治疗在临床上被认为是有效的,也有益于预防HBV感染相关的肝癌。然而临床上仍有相当比例的慢性HBV感染者对IFN-α治疗无应答,而且病人常因为出现难以耐受的毒、副作用包括疲劳、发热、厌食、抑郁症和骨髓抑制等而中断IFN-α的治疗。IFN-λs尤其是IFN-λ1(IL-29)可以通过在肝细胞表面特异表达的IFN-λ受体激发抗病毒活性,抑制HBV病毒复制,提示IFN-λ1可以用于治疗慢性HBV感染以及HBV感染相关的肝癌患者(Doyle SE.等人,2006)。
发明内容
根据本发明的一方面,提供了一种PEG化重组人IFN-λ1(也称PEG-rhIFN-λ1)。其氨基酸组成和野生型人IFN-λ1相近,且具有与野生型人IFN-λ1相同的生物活性。
上述PEG化重组人IFN-λ1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。由181个氨基酸组成,其N端第46位为谷氨酰胺。第112位的半胱氨酸残基(简称C112)是PEG化修饰的。
本发明所提供的rhIFN-λ1为缺失了N-糖基化位点的低糖化突变体IFN-λ1,其N端第46位为谷氨酰胺,由毕赤酵母(Pichia pastoris)体系表达,其氨基酸序列、专用分泌性表达载体、转基因细胞系和宿主菌均公开于公开号为CN10235192A中国专利申请中,申请人为中国医学科学院基础医学研究所。
本发明所提供的rhIFN-λ1产生自嗜甲醇酵母-毕赤酵母菌株,毕赤酵母兼具原核和真核表达***的许多优点,同时可以通过特异的信号肽引导形成可溶性分泌表达,使重组外源蛋白形成正确折叠。本发明所采用的毕赤酵母表达和纯化的方法已公开于授权公告号CN1962873B中国专利中,专利权人为中国医学科学院基础医学研究所。
在一些实施方式中,本发明的PEG-rhIFN-λ1,其中所述PEG为直链或支链结构。
在一些实施方式中,所述PEG分子量在20~40千道尔顿范围内;优选20千道尔顿。
在一些实施方式中,所述PEG选自马来酰亚胺-PEG(mPEG-MAL)、乙烯基砜-PEG(mPEG-VS)、二硫吡啶-PEG(mPEG-Pyridyl disulfides)和碘乙酰胺-PEG(mPEG-iodoacetamide)。
在一些具体的实施方式中,所述PEG为mPEG-MAL。
根据本发明的另一方面,还提供了PEG-rhIFN-λ1的制备方法,包括步骤:
提供重组人IFN-λ1;
向重组人IFN-λ1中加入PEG;
偶联反应在2-8℃进行12-30小时,再在18-25℃进行1-3小时;
通过阳离子交换层析对偶联反应产物进行第一次纯化;
通过凝胶过滤层析进行第二次纯化;
收获PEG化重组人IFN-λ1。
在一个具体的实施方式中,偶联反应在4℃进行24小时,再在18-25℃进行2小时。
在一些实施方式中,所述PEG选自马来酰亚胺-PEG(mPEG-MAL)、乙烯基砜-PEG、二硫吡啶-PEG和碘乙酰胺-PEG。在一个具体的实施方式中,PEG是mPEG-MAL。
在一些实施方式中,所述PEG分子量为20~40千道尔顿。在一个具体的实施方式中,PEG是分子量为20千道尔顿。
在一个具体的实施方式中,重组人IFN-λ1与PEG的分子摩尔比为l:5。
通过串联四级杆飞行时间质谱仪分析上述方法所制备的PEG-rhIFN-λ1,与未经PEG修饰的rhIFN-λ1进行比较,结果显示mPEG-MAL的偶联位点位于rhIFN-λ1的C112上,是定点修饰。
根据本发明的再一方面,提供了PEG-rhIFN-λ1在制备治疗慢性乙型肝炎或肝癌的药物中的用途。
在一些实施方式中,PEG-rhIFN-λ1单独施用或与联合施用。在一些实施方式中,PEG-rhIFN-λ1单独施用或与其它药物例如化疗药物联合施用。化疗药物例如但不限于多柔比星、奥沙利铂、5氟尿嘧啶或亚叶酸钙。在一些具体的实施方式中,PEG-rhIFN-λ1单独施用。在另一些具体的实施方式中,PEG-rhIFN-λ1与多柔比星联合施用。
在具体的实施方式中,本发明的PEG-rhIFN-λ1在持续分泌乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的肝癌细胞株Hep3B所建的荷瘤裸鼠动物模型中显著抑制荷瘤裸鼠皮下肿瘤的生长,显著降低裸鼠血清中的HBsAg含量。
附图说明
图1:PEG修饰反应混合物的分离纯化。
A:CM Sepharose F.F.阳离子交换层析描记图;峰1.mPEG-MAL-rhIFN-λ1;峰2.rhIFN-λ1;
B:SDS-PAGE图,M.蛋白分子量标记;1道.PEG反应混合物;2道.mPEG-MAL-rhIFN-λ1(洗脱峰1);3道.rhIFN-λ1(洗脱峰2)。
图2:PEG-rhIFN-λ1的SDS-PAGE检测结果。
A:SDS-PAGE考马斯亮蓝染色;M.蛋白质分子量标记;1道.rhIFN-λ1;2道.mPEG-MAL-rhIFN-λ1(箭头所示)。
B:SDS-PAGE钡-碘染色;M.蛋白质分子量标记;1道.rhIFN-λ1;2道.mPEG-MAL-rhIFN-λ1(箭头所示)。
图3:ISRE双荧光素酶报告基因实验检测PEG-rhIFN-λ1的体外活性。
图4:PEG-rhIFN-λ1的体外稳定性及活性。
A1:BCA法测定经37℃孵育后蛋白的含量,rhIFN-λ1(◇),PEG-rhIFN-λ1(△);
A2:荧光素酶报告基因实验检测37℃孵育后rhIFN-λ1(◇)和PEG-rhIFN-λ1(△)的活性;
B1:ELISA检测经与大鼠血清共同孵育后rhIFN-λ1(◇)和PEG-rhIFN-λ1(□)的含量;
B2:荧光素酶报告基因实验检测经与大鼠血清共同孵育后rhIFN-λ1(◇)和PEG-rhIFN-λ1(□)的活性。
图5:PEG-rhIFN-λ1和rhIFN-λ1大鼠体内药代动力学曲线。
图6:PEG-rhIFN-λ1用于荷瘤裸鼠治疗的肝癌肿瘤生长曲线,*P<0.05;**P<0.01。
图7:PEG-rhIFN-λ1用于肝癌荷瘤裸鼠治疗的血清HBsAg-ELISA检测结果,**P<0.01。
图8:PEG化修饰位点的质谱鉴定。
A:PEG-rhIFN-λ1,序列IQPQPTAGPRPR;
B:rhIFN-λ1,序列CIQPQPTAGPRPR。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的实施方式和具体的操作过程进行详细的阐述,但应当理解本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。试剂盒的使用根据制造商或供应商所提供的说明书进行。
实施例1、rhIFN-λ1的获得
制备低糖化突变体rhIFN-λ1所用的分泌性表达载体、转基因细胞系、宿主菌、发酵表达及蛋白纯化方法均在公开号为CN10235192A中国专利申请中有详细描述。
实施例2、PEG-rhIFN-λ1的制备方法
将实施例1所获得的rhIFN-λ1蛋白用25mM Tris-HCl pH8.0的缓冲液透析平衡,rhIFN-λ1浓度调整至1mg/ml;
按rhIFN-λ1与PEG的分子摩尔比为l:5的比例,加入PEG粉末(20kD直链mPEG-MAL,由北京凯正生物工程发展有限公司提供);
轻轻搅拌使粉末溶解;
4℃反应24h后,再室温(18-25℃)反应2h获得偶联反应产物;
对上述偶联反应产物进行阳离子交换层析:将上述偶联反应产物加入5倍体积的缓冲液A(25mM NaAC,pH4.5)稀释;之后上样于经缓冲液A平衡的阳离子交换层析柱(GE Healthcare Life Sciences提供的CM Sepharose F.F)上;洗脱采用从缓冲液A到缓冲液B(25mMNaAC,0.5M NaCl,pH4.5)的线性洗脱(0~100%);收集各洗脱峰;
对上述收集的洗脱峰进行凝胶过滤层析:缓冲液为50mM PBS,150mM NaCl,pH7.0,层析柱为Superdex75,Hiload16/60预装柱(GEHealthcare Life Sciences公司产品);
收获纯化的PEG-rhIFN-λ1。
实施例3、均一性检验
上述阳离子交换层析分离的结果如图1所示,经PEG修饰的rhIFN-λ1均一性好(图1,B,泳道1),这表明本发明的制备方法不仅提供单一的修饰方式,并且阳离子交换层析可将未修饰的rhIFN-λ1(图1,B,泳道3)与20kD mPEG-MAL单修饰的PEG-rhIFN-λ1(图1,B,泳道2)很好地分离(图1,A)。
实施例4、纯度检验
将实施例2所获得的纯化产物经SDS-PAGE电泳后,分别进行考马斯亮蓝染色和钡-碘染色检测。
用钡-碘染色法染色可直接检测PEG,方法是:SDS-PAGE电泳结束后,将蒸馏水淋洗后的凝胶浸泡在5%的氯化钡溶液中30min,用蒸馏水将氯化钡洗掉后将凝胶浸泡在0.1mM碘溶液中30min,然后再用蒸馏水脱色。
检测结果见图2,其中图2的A为考马斯亮蓝染色,泳道1为分子量约为20kD的rhIFN-λ;泳道2为20kD mPEG-MAL修饰的PEG-rhIFN-λ1;图2的B为钡-碘染色,可见只有PEG-rhIFN-λ1可以显色(图2,B,泳道2);检测结果显示,纯化后的PEG-rhIFN-λ1纯度大于98%。
实施例5、PEG化位点的鉴定
将实施例2纯化获得的PEG-rhIFN-λ1和未修饰的rhIFN-λ1,经胰蛋白酶降解后,进行串联四级杆飞行时间质谱仪分析,收集谱图,与数据库中由野生型IFN-λ1经胰蛋白酶降解产生的所有多肽片段的理论值比较,在PEG修饰和未修饰的两个样品中,均捕捉到含有C15、C49、C145和C171的多肽片段,两个样品没有差异。分析胰蛋白酶降解图谱显示,含有C112的多肽片段长,分子量大于串联四级杆飞行时间质谱仪所能捕捉的范围,提示仅胰蛋白酶降解后的分析结果尚不能明确判断PEG是定点修饰于C112位点上。
为此,PEG-rhIFN-λ1和未修饰的rhIFN-λ1又经蛋白酶K降解,行串联四级杆飞行时间质谱仪分析,在未修饰的rhIFN-λ1样品中捕捉到含有C15、C49和C112的多肽片段,其中含有C112的多肽片段氨基酸序列为“CIQPQPTAGPRPR”,而在PEG-rhIFN-λ1样品中除了捕捉到含有C15、C49的多肽片段外,还捕捉到与C112相邻的多肽片段,其氨基酸序列为“IQPQPTAGPRPR”。综合经胰蛋白酶和蛋白酶K分别降解后的质谱分析结果,在未修饰的rhIFN-λ1样品中,含有Cys的5个多肽片段均被捕捉到,而在PEG-rhIFN-λ1样品中,只捕捉到了除C112外的其它4个含有Cys的多肽片段,表明由于C112位有20kD mPEG-MAL的修饰,分子量远远大于串联四级杆飞行时间质谱仪所能捕捉到的范围,因此可以证实mPEG-MAL定点修饰于C112位上(结果见图8)。
rhIFN-λ1的氨基酸序列中总共有5个Cys残基,但是mPEG-MAL的修饰仅仅位于rhIFN-λ1氨基端起第112位半胱氨酸残基上,这表明本发明的PEG-rhIFN-λ1的修饰均一性高、同质性好,是一种定点修饰。
实施例6、PEG-rhIFN-λ1的体外活性
采用pISRE-luciferase报告基因测活法测定PEG-rhIFN-λ1的体外活性。
pISRE-luciferase报告基因测活法的原理:干扰素与细胞表面特异性受体结合后,启动信号级联反应,导致干扰素刺激基因因子(ISGF,IFN-stimulated gene factor)进入细胞核与顺式元件干扰素刺激应答元件(ISRE,IFN-stimulated response element)相互作用,从而调节基因的转录,最终产生干扰素介导的抗病毒,抗肿瘤细胞增殖以及免疫调节的生物学效应(Williams BR,1991)。
本实施例中以ISRE组装成荧光素酶报告基因质粒pISRE-TA-luc,通过检测干扰素刺激后ISRE调控的荧光素酶报告基因的表达水平可以反映干扰素的生物活性。
具体方法如下:收集对数期HepG2细胞(肝癌细胞株),调整细胞悬液浓度,以2×105个/孔接种细胞至6孔板,37℃,5%CO2,孵育过夜;用lipofectamine2000转染pISRE-TA-luc(5ug)和pRL-SV40(0.1ug,内参)质粒,37℃,5%CO2,孵育24小时,更换成无血清培养基饥饿2~4小时;在培养基中分别添加rhIFN-λ1、PEG-rhIFN-λ1各100ng/ml,继续培养24小时后收集细胞,用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega公司产品)在TD20/20发光仪分别读值,记录检测结果,以各时间点Luciferase/Renilla的比值作为ISRE报告基因的表达水平。
PEG-rhIFN-λ1体外活性实验的结果见图3,PEG修饰后仍保留28%的活性,说明rhIFN-λ1确实被PEG化。
实施例7、PEG-rhIFN-λ1的体外稳定性
水溶液中热稳定性分析:将rhIFN-λ1、PEG-rhIFN-λ1脱盐至20mMPBS,pH7.2溶液中,将两个蛋白的浓度均调整到400μg/ml,置于37℃,于0h,4h,8h,24h,48h,72h取样,10,000rpm离心20min后取上清用BCA法(试剂盒为Pierce公司产品)检测剩余蛋白含量;同时利用pISRE-luciferase报告基因测活法分析蛋白的剩余活性,结果以剩余蛋白含量及活性百分数表示。
PEG-rhIFN-λ1在水溶液中的热稳定性结果见图4,A1和A2,未经PEG修饰的rhIFN-λ1在37℃8h后剩余蛋白含量下降至40%,24h后蛋白含量下降至20%,而PEG-rhIFN-λ1在整个观察期剩余蛋白含量与原蛋白含量没有明显减少,3天后仍然保持在90%(图4,A1)。且ISRE荧光素酶报告基因反映的生物活性仍能保留在75%以上,而未经PEG修饰的rhIFN-λ1所保留的生物活性则小于30%(图4,A2)。上述实验结果确实说明PEG修饰rhIFN-λ1后重组蛋白稳定性增强,生物活性保持时间延长。
血清中热稳定性分析:将rhIFN-λ1、PEG-rhIFN-λ1脱盐至20mMPBS,pH7.2溶液中,将两个蛋白调整到相同浓度,加入等体积的SD大鼠血清,置于37℃,于0h,4h,8h,12h,24h,48h,72h取样,10,000rpm离心20min后取上清用IL-29ELISA试剂盒(ebioscience公司产品)定量检测剩余蛋白含量;同时利用pISRE-luciferase报告基因测活法分析蛋白的剩余活性,结果以剩余蛋白含量及活性百分数表示。
PEG-rhIFN-λ1在血清中热稳定性结果如图4,B1和B2所示,无论是剩余蛋白含量还是ISRE报告基因活性均有一定程度的下降,但是与未修饰的rhIFN-λ1相比,3天后剩余蛋白含量和ISRE报告基因生物活性均可保持在40%以上,远高于未PEG化rhIFN-λ1,表明PEG与rhIFN-λ1的偶联显著增加了rhIFN-λ1的热稳定性以及延迟了血清中蛋白酶对rhIFN-λ1的降解。
实施例8、PEG-rhIFN-λ1大鼠药代动力学研究
实验采用SD大鼠,雌性,体重270-290g,随机分组,每组3只,分笼喂养,给药前动物禁食12h;以200μg/kg体重的剂量分别给予单次皮下注射rhIFN-λ1和PEG-rhIFN-λ1;给药后尾静脉取血,取血时间分别为:rhIFN-λ1—注射后0、5min、10min、0.5h、1h、2h、3h、4h、12h、24h;PEG-rhIFN-λ1—注射后0、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h;血样经5,000rpm,10min离心后取血浆部分,置-70℃保存,用ELISA(IFN-lambda1PlatinumELISA,ebioscience公司)检测血浆中IFN-λ1的含量。用Kinetica软件进行曲线拟合,计算各种药代动力学参数。检测数据采用Excel软件统计,统计结果以平均数±标准差(x+SD)表示。结果见图5和表1:
表1.rhIFN-λ1和PEG-rhIFN-λ1的药代动力学参数
PK参数 | rhIFN-λ1(x±SD) | PEG-rhIFN-λ(x±SD) |
AUC(ng h/ml) | 160.72±25.36 | 2082.16±203.44 |
C最大(ng/ml) | 54.05±4.21 | 69.18±4.58 |
T最大(h) | 0.50±0.04 | 7.35±2.10 |
t1/2(h) | 1.46±0.25 | 15.70±0.77 |
CL(ml/h/kg) | 417.49±65.18 | 31.91±3.26 |
注:AUC:曲线下面积;C最大:最大峰浓度;T最大:达峰时间;t1/2:消除半衰期;CL:消除率。
结果显示:经kinetica软件拟合优度比较,rhIFN-λ1和PEG-rhIFN-λ1在SD大鼠体内过程均符合一级吸收的一房室模型。与未经PEG修饰的rhIFN-λ1相比,PEG-rhIFN-λ1皮下注射后血浆内的最大峰浓度(C最大)提高,达峰时间(T最大)和消除半衰期(t1/2)显著延长,分别为rhIFN-λ1的1.28倍、14.7倍和10.75倍;药时曲线下面积显著增加(为rhIFN-λ1的12.9倍),消除率(CL)降低了92.4%。这些数据表明,rhIFN-λ1经过PEG的修饰可以有效地改善rhIFN-λ1在体内的吸收及分布,能够明显地延长其生物半衰期,提高rhIFN-λ1在体内的生物利用度。
实施例9、PEG-rhIFN-λ1对人皮下肝癌异种移植肿瘤模型的安全性和药效学评价研究
实验采用人肝癌细胞株—Hep3B,该细胞株有HBV基因组整合,可持续产生HBsAg,可作为观察抗HBV药物疗效的细胞模型(Chen HC.等人,1997)。
实验方法:BALB/c裸鼠背部皮下接种Hep3B细胞,建立人肝癌Hep3B细胞株异种移植肿瘤动物模型,每只鼠右侧背部皮下接种5×106Hep3B细胞加Matrigel胶,0.1ml/只。待肿瘤平均体积约232mm3时,根据肿瘤大小随机分组。实验分组见表2:
表2.实验设计
注:给药体积:10μl/g体重;NS:生理盐水;Qd:每天给药一次;Q4d:每四天给药一次;Q7d:每周给药一次。
实验过程中,常规监测包括肿瘤生长及治疗对动物正常行为的影响,实验动物的活动性,摄食和饮水情况,体重变化情况(每周测量2次),眼睛、被毛及其它异常情况。根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价,根据相对肿瘤增殖率(T/C(%))和肿瘤生长延迟时间(T-C)进行疗效评价。
肿瘤体积增殖率T/C(%):在某一时间点,治疗组和对照组肿瘤体积的百分比值。T和C分别为治疗组和对照组在某一特定时间点的肿瘤体积均值。
计算公式如下:T/C(%)=TTV/CTV*100%(TTV:治疗组肿瘤体积均值;CTV:阴性对照组肿瘤体积均值)。
肿瘤延迟时间T-C:指肿瘤生长至一定体积(本实验为1200mm3)时,治疗组比对照组延迟的天数。T为治疗组的平均肿瘤体积达到特定值时所需天数;C为对照组平均瘤体积达到同样值时所需天数。T-C值越大,延迟时间越长,说明药效越好;反之亦然。
各治疗组和对照组小鼠肿瘤体积生长变化的情况见图6。结果显示,未经PEG修饰的rhIFN-λ1(每天给药)对荷瘤裸鼠皮下肝癌肿瘤生长有一定的抑制作用,但抑制作用较弱。给药结束时,T/C(%)值分别为79.3%(3a组)和79.1%(4a组),与阴性对照组小鼠肿瘤体积相比,差异没有显著性。
与未PEG化rhIFN-λ1作用相比,PEG-rhIFN-λ1(给药次数减少),但对荷瘤裸鼠皮下肝癌肿瘤生长的抑制作用呈剂量依赖效应。给药结束时,0.1mg/kg和2.5mg/kg组T/C(%)值分别是85.31%(3b组)和54.84%(4b组),其中2.5mg/kg(4b组)肿瘤体积与阴性对照组相比有非常显著的差异(P=0.002),并且肿瘤体积达到1200mm3的时间比阴性对照组延迟了13天。
PEG-rhIFN-λ1与化疗药多柔比星合用比单独使用化疗药的效果好,给药结束时,0.1mg/kg和2.5mg/kg PEG-rhIFN-λ1分别与化疗药合用组的T/C(%)值为65.59%(5组)和64.29%(6组),单独使用化疗药组的T/C(%)值为74.81%(2组),PEG-rhIFN-λ1与化疗药合用的两组肿瘤体积均显著小于阴性对照组(P值分别为0.016和0.012),肿瘤体积达到1200mm3的时间比阴性对照组分别延迟了7.5天和6.5天(表3)。
表3.各治疗组肿瘤体积T/C(%)值和T-C延迟时间
注:a.平均值±标准误差;b.相对肿瘤体积相较于阴性对照组。
PEG-rhIFN-λ1对Hep3B人肝癌肿瘤模型的安全性结果:实验期间,阴性对照组小鼠在肿瘤接种21天后体重下降超过10%,说明该动物模型具有明显恶瘤质特征。各给药组体重与阴性对照组比较无显著差异,且未出现药物毒性反应;阴性对照组和各给药组于细胞接种第36天终止实验,小鼠进行了安乐死并解剖,主要脏器未发现异常,表明小鼠对rhIFN-λ1和PEG-rhIFN-λ1的耐受性好,药物安全性良好。不同治疗组和对照组给药后体重变化见表4。
表4.各治疗组和对照组体重变化情况
注:a.平均值±标准误差。
实施例10、PEG-rhIFN-λ1对人皮下肝癌细胞Hep3B异种移植肿瘤模型中血清HBsAg的检测
由于人肝癌细胞株Hep3B有HBV基因组整合,可持续产生HBsAg,进行异种移植肿瘤实验时可从荷瘤裸鼠血清中检测到HBsAg(Knowles BB.等人,1980)。动物实验终止时,收集小鼠血清,-80℃保存,采用HBsAg-ELISA检测试剂盒(上海科华生物工程股份有限公司)分析小鼠血清中的HBsAg含量。
结果见图7,2.5mg/kg未经PEG修饰的rhIFN-λ1组小鼠血清中HBsAg的含量与阴性对照组相比,仅下降了4.7%,而rhIFN-λ1经PEG修饰后,可以有效地增强抗HBV作用,抑制Hep3B细胞分泌HBsAg,0.1mg/kg和2.5mg/kg PEG-rhIFN-λ1组小鼠血清中HBsAg的含量分别下降了28.5%和62.5%,其中2.5mg/kg组血清中HBsAg的含量与阴性对照组相比有非常显著性的差异(P=0.000),表明本发明所提供的新型PEG-rhIFN-λ1具有肯定的抗HBV感染的作用。
参考文献
Abushahba W.,et al.(2010)Antitumor activity of Type I and Type IIIinterferons in BNL hepatoma model.Cancer Immunol Immunother.59:1059–1071;
Bobek M.D.,Boyd B.S.&Chisari F.V.(2005)Lambda interferoninhibits hepatitis B and C virus replication.J Virol.79(6):3851-3854;
Chen HC.,et al.(1997)Suppressive effects of destruxin B on hepatitisB virus surface antigen gene expression in human hepatoma cells.AntiviralRes.34(3):137-144;
Doyle SE.,et al.(2006)Interleukin-29Uses a Type1Interferon-LikeProgram to Promote Antiviral Responses in Human Hepatocytes.Hepatology.44:896-906;
Knowles BB.,et al(1980)Human hepatocellular carcinoma cell linessecrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen.Science.25;209(4455):497-499;
Kotenko1S.V.,et al.(2003)IFN-λs mediate antiviral protectionthrough a distinct class II cytokine receptor complex.Nature immunology.4(1):69-77;
Muir A.J.,et al.(2010)Phase1b study of pegylated interferon lambda1with or without ribavirin in patients with chronic genotype1hepatitis Cvirus infection.Hepatology.52(3):822-32;
Parkin,D.M.,et al.(2005)Global cancer statistics,2002.CA Cancer J.Clin.55,74–108;
Sheppard P.,et al.(2003)IL-28,IL-29and their class II cytokinereceptor IL-28R.Nat Immunol.4(1),63-68;
Veronese FM,Pasut G.(2005)PEGylation,successful approach todrug delivery.Drug Discov Today.10(21):1451-1458;
Williams BR.(1991)Signal transduction and transcriptionalregulation of interferon-alpha-stimulated genes.J Interferon Res.11(4):207-213;
Yang,J.D.&Roberts,L.R.(2010)Hepatocellular carcinoma:a globalview.Nat.Rev.Gastroenterol.Hepatol.7,448–458。
Claims (13)
1.一种PEG化重组人IFN-λ1,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,其中第112位的半胱氨酸残基是PEG化修饰的。
2.根据权利要求1所述的PEG化重组人IFN-λ1,其中所述PEG为直链PEG或支链PEG。
3.根据权利要求1所述的PEG化重组人IFN-λ1,其中所述PEG分子量为20至40千道尔顿。
4.根据权利要求3所述的PEG化重组人IFN-λ1,其中所述PEG分子量为20千道尔顿。
5.根据权利要求1所述的PEG化重组人IFN-λ1,其中所述PEG选自:马来酰亚胺-PEG、乙烯基砜-PEG、二硫吡啶-PEG和碘乙酰胺-PEG。
6.根据权利要求5所述的PEG化重组人IFN-λ1,其中所述PEG为马来酰亚胺-PEG。
7.一种PEG化重组人IFN-λ1的制备方法,其包括步骤:
用25mM pH为8.0的Tris-HCl缓冲液透析平衡重组人IFN-λ1蛋白,将重组人IFN-λ1浓度调整至1mg/ml;
按重组人IFN-λ1与PEG的分子摩尔比为l:5的比例,向重组人IFN-λ1中加入PEG;
偶联反应在4℃进行24小时,再在18-25℃进行2小时;
通过阳离子交换层析对偶联反应产物进行第一次纯化;
通过凝胶过滤层析进行第二次纯化;
收获所述的PEG化重组人IFN-λ1。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其中所述的PEG选自:马来酰亚胺-PEG、乙烯基砜-PEG、二硫吡啶-PEG和碘乙酰胺-PEG。
9.根据权利要求7所述的制备方法,其中所述的PEG为马来酰亚胺-PEG。
10.根据权利要求7所述的制备方法,其中所述PEG分子量为20至40千道尔顿。
11.根据权利要求10所述的制备方法,其中所述PEG分子量为20千道尔顿。
12.权利要求1-6中任一项所述的PEG化重组人IFN-λ1在制备治疗慢性乙型肝炎或肝癌的药物中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途,其中所述PEG化重组人IFN-λ1单独施用或联合施用。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007013944A2 (en) * | 2005-07-20 | 2007-02-01 | Zymogenetics, Inc. | Use of truncated cysteine il28 and il29 mutants to treat cancers and autoimmune disorders |
WO2007041713A1 (en) * | 2005-10-04 | 2007-04-12 | Zymogenetics, Inc. | Production and purification of il-29 |
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---|---|---|---|---|
WO2007013944A2 (en) * | 2005-07-20 | 2007-02-01 | Zymogenetics, Inc. | Use of truncated cysteine il28 and il29 mutants to treat cancers and autoimmune disorders |
WO2007041713A1 (en) * | 2005-10-04 | 2007-04-12 | Zymogenetics, Inc. | Production and purification of il-29 |
WO2009149377A1 (en) * | 2008-06-05 | 2009-12-10 | Zymogenetics, Llc | Use of pegylated type iii interferons for the treatment of hepatitis c |
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