CN104039957A - 用于产生补身醇的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及源自缬草和/或水蓼且编码补身醇合成酶多肽的核苷酸序列。本发明还提供所述多肽的氨基酸序列。本发明进一步提供遗传修饰以包含本发明的多核苷酸的宿主细胞或生物体。通过用具有补身醇合成酶活性的多肽接触法呢基二磷酸酯制备补身醇和/或补身醇衍生物的方法也是本发明的一部分。

Description

用于产生补身醇的方法和组合物
技术领域
本发明涉及从缬草(Valeriana officinalis)和水蓼(Persicaria hydropiper)分离并且编码补身醇合成酶蛋白的核酸分子，包括核酸分子的表达载体，包括核酸分子的嵌合基因，改变以包含所述核酸分子的宿主细胞，以及补身醇合成酶蛋白自身。这里，本发明进一步提供用于在包含这样的核酸分子的细胞或生物体中产生补身醇或补身醇衍生物的方法，或者用从这样的细胞或生物体分离的多肽接触前体。还提供包括本发明的核酸分子的转基因生物体。本发明特别地涉及具有增强的抗虫性的转基因植物。
背景技术
据报道补身醇具有与异植物生长素吲哚-3-乙酸相当的植物生长调节活性。重要地，在不同的具有生物体学活性的补身烷和去甲补身烷(nordrimanes)(其天然来源利用率有限)的有机合成中，补身醇已通常被用作起始化合物。特别感兴趣的是水蓼二醛，一种从补身醇化学合成及天然合成的补身烷二醛。水蓼二醛被报道具有拒食剂、抗菌、抗真菌、细胞毒素、致敏、杀鱼剂、灭螺、止痛和植物生长调节活性。补身醇已被用作合成其它具有活性生物体学特性的补身烷型倍半萜烯的起始化合物，所述补身烷型倍半萜烯如瓦尔伯醛(warburganal)，一种补身烷型二醛，其与水蓼二醛相似，具有有效的生物体学性质；和(-)-肉桂二醛(cinnamodial)，其具有抗微生物体、拒食剂、杀鱼剂、驱虫活性(Jansen and de Groot1991Nat Prod Rep8:309;Jansen and de Groot2004Nat Prod Rep21:449)。补身醇也已经被用于产生去甲补身烷型化合物，如芳香羟基酮。
通过在萜烯生物体合成途径中的过表达酶催化步骤而代谢工程化植物中的萜烯被显示成功地产生高水平的萜烯。
萜烯是由常见的前体异戊烯焦磷酸酯(IPP)及其异构体二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)通过两种不同的生物体合成途径合成的。
通常，倍半萜烯是由相关前体通过细胞质中的甲瓦龙酸酯途径合成的，单萜和双萜是通过质体中的DXP途径产生的。也观察到前体在质体和细胞质之间的交换。
在两种途径中，IPP被IPP异构酶进一步异构化为DMAPP，随后通过异戊二烯基转移酶形成更高分子量的非环状聚异戊二烯焦磷酸酯前体，以形成非环状焦磷酸酯萜烯前体。例如，这些反应分别生成十碳、十五碳和二十碳前体：香叶基焦磷酸酯(GPP)、法呢基焦磷酸酯(FPP)、香叶基香叶基-焦磷酸酯(GGPP)。萜烯合成酶是在产生萜烯、单萜烯或倍半萜烯化合物的碳骨架的多步反应中催化非环状前体环化的酶。例如，催化环化的最初步骤可以是二磷酸酯基团的电离以形成烯丙基阳离子。然后，该底物进行异构化和重排，这可通过酶的活性位点控制的。例如，产物可以是非环状、单环萜烯、二环萜烯或三环萜烯。
本领域已知GPP和GPP的顺式异构体橙花基二磷酸酯(NPP)是单萜烯生物体合成的底物，并且FPP和GGPP分别为倍半萜烯合成酶和二萜烯合成酶的相应底物(Chen et al.,2011Plant J66:212-229;Schilmiller et al.,2009Proc Natl Acad Sci106:10865-10870;Tholl2006Curr Opin Plant Biol9:297-304;Wang和Ohnuma,2000Biochim Biophys Acta1529:33-48)。一些萜烯合成酶产生单一产物，但是许多萜烯合成酶由相同的前体产生多种产物，或者根据提供的前体可以产生多种化合物(Van Schieet al.,2007Plant Mol Biol64:251-263)。
观察到诱导的萜烯生物体合成与诱导的萜烯合成酶的表达相关(Navia-Gine etal.,2009Plant Phys Biochem47:416-425;Herde et al.,2008Plant Cell20:1152-1168)。
已经鉴定了一些萜烯合成酶(WO2010/064897和WO2009/044336)。此前，来自水蓼的部分纯化的蛋白被鉴定为补身醇环化酶(Banthorpe et al.1992Phytochemistry31:3391)。然而，该参考文献没有提供该蛋白的氨基酸序列、编码该蛋白的基因的核苷酸序列、或用于产生补身醇或其衍生物的任何方法。WO2004031376提供植物倍半萜烯合成酶，及用于制备和使用这些酶以产生多种氧化的和脂肪族倍半帖烯的方法，所述氧化的和脂肪族倍半帖烯包括瓦伦烯、二环大根香叶烯、荜澄茄醇和δ-杜松烯。Jones等人报道了三种从不同种类的檀香属(檀香木)分离的倍半萜烯合成酶，并且它们是使用之前从檀香扩增的萜烯合成酶的引物克隆的(Jones et al.2011Journal of BiologicalChemistry,Vol286pp.17445-17454)。然而，这些参考文献中没有一个提供任何编码补身醇合成酶的核苷酸序列或用于产生补身醇合成酶和/或补身醇和/或补身醇衍生物的任何方法。
相似于其它的补身烷型化合物，补身醇是可以从天然来源分离的。然而，该方法的实用性很小，因为补身醇的含量低且其分离和纯化困难。因此，很多关注都集中于增加补身醇产量的替代方法。
发明内容
本发明提供从缬草和水蓼克隆的补身醇合成酶基因，以及可用于在体外或体内产生补身醇或补身醇衍生物的补身醇合成酶蛋白。
这里，本发明的一个方面是分离的多肽，其具有补身醇合成酶活性，并且包括氨基酸序列SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。还提供编码这样的多肽或其变体或片段的分离的核酸，并且该核酸例如包括核苷酸序列SEQID:1。在一些实施方式中，所述分离的核酸源自缬草。
这里，本发明的一个替代实施方式提供分离的多肽，其具有补身醇合成酶活性，并且包括氨基酸序列SEQ ID NO:4或与所述氨基酸序列SEQ ID NO:4具有至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:4、或其变体或片段的多肽的分离的核酸也在本发明的范围之内。例如，分离的核酸包括核苷酸序列SEQ ID NO:3，并且在一些实施方式中，所述分离的核酸源自水蓼。本发明还涉及包括本发明的核酸序列的嵌合基因。
本发明的一个实施方式提供包括核苷酸序列SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3的表达载体，或包括核苷酸序列SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3的嵌合基因。通常，所述表达载体和/或嵌合基因包括可操作地连接至少一个控制转录、翻译起始或终止的调节序列的核苷酸序列。或者，所述表达载体和/或嵌合基因包括可操作地连接控制转录的至少一个具有固有活性(constitutive activity)的启动子、或至少一个诱导性启动子、或至少一个昆虫-诱导性启动子的核苷酸序列。
在一些其它实施方式中，所述表达载体和/或嵌合基因的核酸序列进一步包括靶向序列。例如，所述靶向序列为将核酸序列的多肽产物靶向至植物细胞质体的转运肽。例如，所述质体为叶绿体。或者，靶向序列为将核酸序列的多肽产物靶向至植物细胞线粒体的转运肽。
本发明的另一个方面是一种用于产生补身醇或至少一种补身醇衍生物的方法，这样的方法包括步骤：(a)用多肽接触法呢基焦磷酸酯(FPP)前体，所述多肽具有补身醇合成酶活性，并且具有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4、或与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；(b)分离补身醇；和(c)可选地，用至少一种将补身醇转化为至少一种补身醇衍生物的酶接触在步骤(a)、(b)中产生的补身醇。
所述方法的一种实施方式进一步提供步骤：在步骤(a)之前用编码本发明的多肽的核酸序列转染能够产生FPP前体的宿主细胞。
在所述方法的一个优选的实施方式中，在允许产生补身醇和/或补身醇衍生物的条件下培养细胞以进行步骤(a)。通常，所述细胞选自∶植物细胞、细菌细胞、和真菌细胞的组中。
所述方法的一个替代实施方式包括羟基化和/或氧化补身醇以产生至少一种具有杀真菌剂、杀虫剂、拒食剂、芳香剂和/或改善食物味道性质的补身醇衍生物。例如，所述补身醇衍生物选自但不限于补身-8-醇、补身-8,11-二醇、补身-8-烯-7-酮、毛喉萜、肉桂二醛、(+)-折叶苔醇、(-)-尤维丁(uvidin)、(+)-异水蓼醇醛、(-)-水蓼二醛、(-)-乌干达二醛(ugandensidial)、(-)-瓦尔伯醛、龙涎香、补身醛(drimenal)、补身酸(drimenoic acid)、异辛辣木素(isodrimenin)、肉桂酸内酯(cinnamolide)、康佛托林(confertolin)、密叶辛木素、补身二醇(drimendiol)和水蓼二醛酸(polygodialacid)。
这里，本发明的实施方式还提供包括本发明的任一种所述分离的核酸序列的转基因生物体。通常，所述生物体包括植物、微生物体或真菌。
本发明的另一个方面提供一种用于产生至少一具有补身醇合成酶活性的多肽，包括步骤∶a)用本发明这里所述的核酸序列或表达载体或嵌合基因的任一种转化宿主细胞或非人类生物体；和b)在允许产生本发明的多肽的条件下培养所述细胞或生物体。另
一个实施方式提供一种用于产生能够产生补身醇和/或与相似的遗传学背景的非转基因植物相比增加的补身醇水平的转基因植物的方法，所述方法包括步骤：a)用编码多肽的核酸转化植物或植物细胞，所述多肽具有补身醇合成酶活性，并且包括氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4、或与氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或者用包括编码多肽的核酸的嵌合基因转化植物或植物细胞，所述多肽具有补身醇合成酶活性，并且包括氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4、或与氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，所述氨基酸序列可操作地连接启动子，和b)再生植物。例如，所述启动子可以是35S启动子。在另一个实施方式中，所述启动子为可由昆虫诱导的。
在一个实施方式中，与相似遗传学背景的非转基因植物相比，所述转基因植物具有提高的抗虫性。
所述方法的一个替代实施方式进一步包括筛选所述转基因植物或通过自交或杂交而由其衍生的植物，以用于产生补身醇和鉴定产生补身醇的植物。例如，这样的转基因植物为农作物。
附图说明
图1显示编码来自缬草的补身醇合成酶的cDNA序列SEQ ID NO:1，其包括翻译序列SEQ ID NO:2。
图2显示编码来自水蓼的补身醇合成酶的cDNA序列SEQ ID NO:3，其包括翻译序列SEQ ID NO:4。
图3描述来自缬草(DSval)的补身醇合成酶氨基酸序列(SEQ ID NO:2)和来自水蓼(DSph)的补身醇合成酶氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的比对。用ClustalW比对氨基酸序列。相同和相似的残基分别以下划线和黑体字显示。
图4描绘显示对表达来自缬草(DSval)或水蓼(DSph)的补身醇合成酶的酵母菌株WAT11进行的气相色谱-质谱(GC-MS)分析结果的一组色谱和质谱曲线。数据组A-D显示来自酵母菌株WAT11的正十二烷层的色谱图。在图中，离子的相对丰度(相对于最高丰度的离子)显示为时间(分钟)的函数。注意到色谱图的y-轴刻度不同。特别地，数据组A显示补身醇标准品(保留时间(rt)=17.7分钟)。数据组B显示用编码来自缬草(DSval)的补身醇合成酶的基因转化的酵母细胞产生补身醇。补身醇产生的峰(rt=17.17分钟)的尺寸匹配对照处理中的空载体产生的峰(rt=17.92分钟)的尺寸，表明补身醇离子的相对丰度较低。数据组C显示用编码来自缬草(DSph)的补身醇合成酶的基因转化的酵母细胞产生补身醇。由补身醇峰(rt=17.17分钟)的尺寸判断，观察到来自缬草的补身醇合成酶具有较强的酶活性，所述补身醇峰的尺寸显著地大于用空载体的对照处理产生的峰(rt=17.92分钟)的尺寸。数据组D显示用空载体转化的酵母细胞在17.92分钟产生可识别的峰。此外，数据组E-G显示补身醇标准品的质谱曲线(数据组E；rt=17.17分钟)匹配在用来自缬草(DSval)(数据组F)和水蓼(DSph)(数据组G)的每种补身醇合成酶蛋白转化之后由酵母细胞产生的补身醇的质谱曲线。
图5描绘来自本氏烟(Nicotiana benthamiana)的叶子的二氯甲烷提取物的一组色谱，所述叶子渗入有包含编码补身醇合成酶(来自缬草)的基因的表达载体(数据组C)、补身醇标准品(数据组B)和空载体对照构建物(数据组A)，所述数据组C的表达载体在具有线粒体靶向的35S启动子(35S-DSval)的控制下编码补身醇合成酶。请注意色谱图的y轴刻度不相同。
图6显示来自本氏烟的叶子的二氯甲烷提取物的一组色谱，所述叶子渗入有包含编码补身醇合成酶(来自缬草)的基因的表达载体(数据组C和D)、补身醇标准品(数据组A)和对照的空载体构建物(数据组B)，所述数据组C和D的表达载体分别在具有质体(数据组C)或胞质(数据组D)靶向的rbcS1启动子(RBCS-DSph)的控制下编码补身醇合成酶。请注意色谱图的y轴刻度不相同。
具体实施方式
一般定义
术语“多肽”指连续聚合的氨基酸残基的氨基酸序列，例如至少15个残基、至少30个残基、至少50个残基。在本发明的一些实施方式中，多肽包括的氨基酸序列为酶、或其片段、或其变体。
术语“分离的”多肽指通过本领域已知的任何方法或方法组合从其自然环境中移出的氨基酸序列，所述方法包括重组方法、生物化学方法和合成方法。
术语“蛋白”指任何长度的氨基酸序列，其中氨基酸是通过共价肽键连接的，并且包括天然存在或合成的寡肽、肽、多肽和全长蛋白。
术语“补身醇合成酶”或“补身醇合成酶蛋白”指能够将法呢基二磷酸酯(FPP)转化成补身醇的酶。
术语“生物功能”、“功能”、“生物活性”或“活性”指本发明的补身醇合成酶催化从FPP形成补身醇的能力。
术语“核酸序列”、“核酸”和“多核苷酸”可互换地使用，是指核苷酸序列。核酸序列可以是单链或双链脱氧核糖核苷酸、或任何长度的核糖核苷酸，并且包括基因的编码和非编码序列、外显子、内含子、正义和反义互补序列、基因组DNA、cDNA、miRNA、siRNA、mRNA、rRNA、tRNA、重组核酸序列、分离的和纯化的天然存在的DNA和/或RNA序列、合成DNA和RNA序列、片段、引物和核酸探针。本领域技术人员认识到除了胸腺嘧啶(T)被尿嘧啶(U)替代之外，RNA的核酸序列与DNA序列相同。
“分离的核酸”或“分离的核酸序列"被定义为在与其中核酸或核酸序列天然存在的环境所不同的环境中的核酸或核酸序列，即实质上是从其他细胞组分分离的，所述细胞组分例如核糖体、聚合酶和许多其它基因组序列，所述基因组序列中其天然存在的细胞中天然伴随这样的核酸。如这里使用的术语“天然存在”当应用于核酸时指在天然细胞中发现的核酸。例如，存在于可以从天然来源分离的且没有被人类在实验室中特意修饰的生物体(例如生物体的细胞)中的核酸序列是天然存在的。
“重组核酸序列”为由使用实验室方法(分子扩增)将来自多于一种来源的遗传物质组装得到的核酸序列，产生非天然存在的且不会以其它方式存在于生物体学生物体中的核酸序列。
“DNA重组技术”指制备重组核酸序列的分子生物体学过程，如描述在例如Weigel和Glazebrook编著的Laboratory Manuals，2002Cold Spring Harbor LabPress；和Sambrook et al.,1989Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring HarborLaboratory Press中。
术语“基因”指包括在细胞中被转录到RNA分子(例如mRNA)的区域的DNA序列，所述区域可操作地连接合适的调控区域，例如启动子。因此，基因可以包括几个可操作地连接的序列，如启动子、包括例如涉及翻译起始的序列的5'前导序列、cDNA或基因组DNA的编码区、内含子、外显子、和/或包括例如转录终止位点的3'非翻译序列。
“嵌合基因”指不是在物种中正常天然存在的任何基因，特别是其中存在的核酸序列的一个或多个部分在天然情况下彼此不相连的基因。例如，启动子在天然情况下不与部分或全部的转录区域或与另一个调控区域相连。术语“嵌合基因”被理解为包括表达构建体，其中启动子或转录调节序列可操作地连接至一个或多个编码序列或反义序列(即，正义链的反向互补序列)或反向重复序列(正义的和反义的，由此所述RNA转录产物在转录时形成双链RNA)。
“3'UTR”或“3'非翻译序列”(也称为“3'非翻译区”或“3'端”)指在基因的编码序列下游存在的核酸序列，其包括例如转录终止位点和(在大部分但非全部的真核imRNAs中的)聚腺苷酸化信号(如AAUAAA或其变体)。在转录终止之后，可切除所述mRNA转录产物的聚腺苷酸化信号下游并且加上聚A尾，该聚A尾涉及将所述mRNA向例如细胞质的翻译位点的转运。
“同源性”指多肽或其片段和参考序列之间的序列相似性或同一性。基于多肽共有的位点中氨基酸序列的数量确定多肽序列的同源性。同源序列涵盖通过本领域已知的化学或酶的方式修饰的本发明的多肽的氨基酸序列。参见Ausubel et al.(eds)2000Current Protocols Mol Biol,Willey&Sons,New York。
“基因的表达”涉及基因的转录和将mRNA翻译到蛋白中。过表达指如通过mRNA、多肽和/或酶活性的水平测量的基因产物在转基因细胞或生物体中的产生超过在相似遗传学背景的非转化细胞或生物体中的产生水平。
如这里使用的“表达载体”指使用分子生物体学方法和重组DNA技术而工程化的核酸分子，其用于将外来或外源DNA递送到宿主细胞中。表达载体通常包括核苷酸序列的合适转录所需的序列。所述编码区通常编码感兴趣的蛋白，但也可以编码RNA例如反义RNA、siRNA等。
“调节序列”指确定本发明的核酸序列的表达水平，且能够调节可操作地连接至调节序列的核酸序列的转录速率的核酸序列。调节序列包括启动子、增强子、转录因子、启动子元件等。
“启动子”指通过为RNA聚合酶及合适的转录所需的其它因子提供结合位点(包括而不限于转录因子结合位点、阻遏蛋白和激活蛋白结合位点)控制编码序列表达的核酸序列。术语启动子的含义还包括术语“启动子调节序列”。启动子调节序列可以包括可影响相连的编码核酸序列的转录、RNA加工或稳定性的上游和下游元件。启动子包括天然导出序列和合成序列。相对于在转录起始位点开始转录的方向，编码核酸序列通常位于启动子下游。
术语“组成性启动子”指允许连续转录与其可操作地连接的核酸序列的未调节的启动子。
如此处使用的术语“可操作地连接”指多核苷酸元件在功能关系方面的连接。当核酸与另一个核酸序列具有功能关系时该核酸是“可操作地连接的”。例如，如果启动子或转录调节序列影响编码序列的转录，则它们可操作地连接编码序列。可操作地连接指被连接的DNA序列通常是邻接的。与启动子序列相连的核苷酸序列相对于待转化的植物可以是同源或异源来源的。该序列也可以是完全或部分合成的。与来源无关，在结合本发明的多肽之后，与启动子序列相连的核酸序列将根据其连接的启动子性质被表达或沉默。相连的核酸可以编码期望在整个植物中一直表达或抑制或者在特定细胞和组织一直表达或抑制的蛋白。这种核苷酸序列优选编码赋予由其改变或转化的宿主细胞或生物体以期望的表型性状的蛋白。更优选地，所述相连的核苷酸序列造成在植物中产生补身醇。优选地，所述核苷酸序列编码补身醇合成酶。
“靶向肽”指将蛋白或多肽靶向至细胞内细胞器，即线粒体或质体，或靶向至细胞外间隙或质外体(分泌信号肽)的氨基酸序列。编码靶向肽的核酸序列可以融合至编码蛋白或多肽的氨基酸末端(例如N-末端)的核酸序列，或者可以用于替换天然的靶向多肽。
术语“同一性的百分数”指两种蛋白序列的相关度的统计度量。使用基于标准排列算法的计算机程序确定两种序列之间序列同一性的百分数。根据标准计算机程序所鉴定，当序列共用至少某一最小百分数的序列时，序列基本上相同。在本发明的范围内优选的计算机程序包括，而不限于CGC程序包(Devereux et al.,1984Nucleic Acid Research12:387)、BestFit、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altshulet al.,1990J Mol Biol215:403)、Meyers等人在1988Comput Appl Biosci4:11中的算法、或Needleman等人在1970J Mol Biol48:443中的算法。优选地，序列同一性指在序列全长上的序列同一性。
术语“引物”指杂交至模板核酸序列且用于聚合与该模板互补的核酸序列的短核酸序列。
如此处使用的术语“宿主细胞”或“转化细胞”指被改变以包括至少一种核酸分子，例如编码期望的蛋白的重组基因或在转录时产生用于产生补身醇的补身醇合成酶蛋白的核酸序列的细胞(或生物体)。宿主细胞优选细菌细胞、真菌细胞或植物细胞。宿主细胞可以包含已经整合到宿主细胞的核或细胞器基因组中的根据本发明的重组基因。或者，宿主可以包含额外染色体的重组基因。
术语“可选择的标记物”指当其表达时可用于选择包括所述可选择的标记物的细胞的任何基因。可选择的标记物的实例描述如下。本领域技术人员应当认识到不同的抗生素或除草剂可选择的标记物适于不同的靶向种类。通常用于植物转化中的可选择的标记物包括赋予对卡那霉素、巴龙霉素(paromymycin)、遗传霉素和aad细菌的相关抗生素的抗性的npt II基因。编码氨基糖苷类3'-腺苷转移酶的基因赋予对抗生素链霉素或大观霉素的抗性，hph基因赋予对潮霉素的抗性。可以使用的其它标记物包括赋予对草甘膦的抗性的突变体EPSP基因、赋予对咪唑啉或磺酰脲除草剂的抗性的突变体乙酰乳酸合成酶(ALS)基因、赋予对除草剂草丁膦的抗性的草丁膦(phospinothricin)乙酰基转移酶基因。也可以使用引起正向选择的选择标记物，如磷酸甘露糖异构酶基因(参见WO93/05163)。
术语“补身醇”用于表示具有式C15H26O的任何补身醇分子，包括(-)-补身醇(CAS：468-68-8)，并且也旨在包括例如这里提及的补身醇和补身醇衍生物，包括来源于补身醇、通过进行羟基化、氧化、乙酰化、异构化、二甲基化等中的一个或多个步骤得到的化合物。如这里使用的“衍生物”指从补身醇获得的任何化合物，包括母体物质的基本元件，包括而不限于补身-8-醇、补身-8,11-二醇、补身-8-烯-7-酮、毛喉萜、肉桂二醛、(+)-折叶苔醇、(-)-尤维丁、(+)-异水蓼醇醛、(-)-水蓼二醛、(-)-乌干达二醛、(-)-瓦尔伯醛、龙涎香、补身醛、补身酸、异辛辣木素、肉桂酸内酯、康佛托林、密叶辛木素、补身二醇和水蓼二醛酸。
相似地，术语“水蓼二醛”指式C15H22O2的任何类型的水蓼二醛分子。实际上，水蓼二醛是以至少两个步骤由法呢基二磷酸酯制备的，第一个步骤是通过酶补身醇合成酶进行，并且接着通过P450酶进行以首先在补身醇上骨架引入羟基化，接着将其氧化成两个醛。
术语“生物体”指任何非人类多细胞或单细胞生物体，如植物或微生物体。优选地，微生物体为细菌、酵母菌、藻或真菌。
术语“植物”可互换地使用以包括植物细胞，包括植物原生质体、植物组织、产生再生的植物的植物细胞组织培养物、或植物的一部分、或植物器官如根、茎、叶、花、花粉、胚珠、胚胎、果实等。任何植物都可以用于进行本发明的方法。优选地，所述植物选自茄科、败酱科、锦葵科、菊科、十字花科、蓼科、禾本科(以前的颖花科)或豆科。
术语“农作物种类”指为了获得食物、饲料或植物副产品(包括碳水化合物、油和药用成分)的目的而载培的植物。
如这里使用的“遗传学背景”指生物体的育种系或种群的遗传型基础。
术语“植物昆虫”或“植物害虫”指感染并损害宿主农作物和观赏植物的昆虫物种。“感染”指在田野或温室区域、在寄主植物表面上或可以接触寄主植物的任何物质、或在土壤中存在大量害虫生物体。害虫包括吸树汁的害虫，如木虱、粉虱、蚜虫、粉蚧、稻飞虱和介壳虫，并且享有共同性质，即使用植物体液作为它们的食物来源。害虫还包括蓟马、蝉、螨和叶蝉。
这里，术语“害虫”也指双翅目昆虫，包括但不限于攻击动物，特别是哺乳动物的吸血或咬虫。也包括吸树汁昆虫和吸血蜱。这样的昆虫或蛛形类动物可以充当人类和/或哺乳动物疾病(如疟疾)的载体。
术语“白粉虱”或“粉虱”指伯粉虱属的物种特别是烟粉虱，刺粉虱属的物种特别是温室粉虱(T.vaporariorum)，和带翅膀的粉虱(T.abutinolea)。烟粉虱的所有生物体类型如生物体型Q和B，以及任何发育阶段如卵、幼虫、蛹和成虫也包括在内。
这里使用的术语“蚜虫”指属于蚜科的植物害虫，包括但不限于棉蚜、黑豆蚜、大豆蚜、夹竹桃蚜、鼠李马铃薯蚜、桃蚜、樱桃瘤蚜、紫罗兰瘤额蚜、衲长管蚜属特别是莴苣蚜虫、麦长管蚜和甘蓝蚜。
术语“拒食剂”指抑制进食但不会直接杀死“害虫”的化合物，但是其可能导致昆虫因饥饿而死亡。术语“拒食剂(feeding deterrent)”或“农药味觉驱避剂”与拒食剂(antifeedant)是同义的。然而，术语“拒食剂”与术语“嗅觉驱避剂”不是同义的，嗅觉驱避剂通常是在昆虫开始进食植物之前抗御昆虫的挥发性化合物。例如，由斯图尔曼十数樟产生的瓦尔伯醛是一种针对非洲粘虫的幼虫的特效拒食剂，但是其可能针对其它昆虫没有任何驱避效应。
术语“昆虫媒介”指能够携带和转运病毒至植物的昆虫。在植物疾病媒介的内容中，昆虫媒介为攻击植物且可以潜在地将疾病传染至植物的昆虫，如吸树汁昆虫白粉虱和蚜虫，其能够将疾病传染至植物。优选地，本发明的修饰的植物对一种或多种害虫发展了增强的抗性。
本发明的多肽
本发明的一个目的是提供编码补身醇合成酶蛋白的新的多核苷酸序列，使用本发明的蛋白用于体外和体内合成补身醇和/或补身醇衍生物的方法，和遗传修饰生物体(特别是植物)以改变补身醇合成酶活性的水平和/或改变补身醇和/或补身醇衍生物的水平的方法。
本发明的一个实施方式提供一种补身醇合成酶、补身醇合成酶同源多肽、及其变体。这里本发明的多肽催化从FPP前体产生补身醇。
本发明的一个相关实施方式提供一种分离的多肽或重组多肽，其具有在SEQID NO:2或SEQ ID NO:4中给出的氨基酸序列、或其片段、或变体或衍生物。优选地，所述变体具有在相关多肽的全长上与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽至少55%的同一性，优选地，所述变体具有在本发明的多肽的全长上70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
具有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或其变体的多肽片段为本发明的多肽的子序列，其保留补身醇合成酶活性和催化FPP以形成补身醇的能力。术语“片段”可以指重组多肽和/或聚集多肽，如二聚体或多聚体。根据本发明的补身醇合成酶蛋白的片段可以包括100个、150个、200个、300个、400个、500个或更多个邻接氨基酸。优选地，这些片段在非人类生物体中保留补身醇合成酶活性，并且能够在宿主细胞或生物体中由FPP产生补身醇。
还包括与具有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽共享同源性的氨基酸序列。同源序列为与氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4基本共享序列同一性或相似性，并且当在植物中过表达或异位表达时保留补身醇合成酶活性的序列。与本发明的多肽具有至少55%同一性的多肽序列被认为具有足够的同一性。
同源序列可以来源于任何植物，包括单子叶植物或双子叶植物，特别是农作物，包括但不限于番茄、胡椒、茄子、莴苣、葵花、油菜、西兰花、花椰菜和卷心菜作物、黄瓜、甜瓜、西瓜、南瓜、倭瓜、花生、大豆、棉花、豆、鳄梨、洋葱、菊苣、韭菜、根类如竹芋、胡萝卜、甜菜、芜菁、小萝卜、山药、木薯、马铃薯、甘薯和秋葵。同源序列也可以来源于农作物种类，包括玉米、大麦、珍珠稷、小麦、黑麦、高粱、稻米、烟草和牧草。同源序列可以来源于乔木种类和肉质果种类，如柠檬、柑橘、橙、葡萄、桃、李子、醋栗、樱桃、甜瓜、草莓和芒果，或者来自观赏植物种类，如木槿、猩猩木、百合、鸢尾、玫瑰和牵牛花、等。另外，同源序列可以来源于农作物植物种类的近缘野生种。例如，同源序列可以来源于茄属植物颠茄，其为载培的番茄(Solanum lycopersicum)的近缘野生种，或者玉蜀黍的近缘墨西哥类蜀黍种类。
同源序列包括直系同源或旁系同源序列。鉴定直系同源物或旁系同源物的方法包括本领域已知且在这里描述的***发育方法、序列相似性和杂交方法。
旁系同源物是由产生具有相似序列和相似功能的两种或多种基因的基因复制得到的。旁系同源物通常群集，并且由相关植物种类之内的基因复制形成。旁系同源物是在相似基因组中使用双序列Blast(pair-wise Blast)分析(Feng和Dollitle,1987J Mol Evol:25:351)或在基因家族的***发育分析期间使用程序如CLUSTAL(Thompson et al.1994Nucl Acid Res22:4573;Higgins et al.,1996MethodsEnzymol266:383)发现的。在旁系同源物中，共有序列可以被鉴定为相关基因内具有与该基因相似的功能的序列。
直系同源物或直系同源序列是彼此相似的序列，因为他们是在来源于共同祖先的种类中被发现的。例如，已知具有共同祖先的植物种类包含具有相似序列和功能的许多酶。本领域技术人员可以例如通过使用CLUSTAL或BLAST程序，构建一个种类的基因家族的多基因树来鉴定直系同源序列并预测直系同源物的功能。用于鉴定或证实同源序列之间的相似功能的方法是比较在过表达或缺乏(敲除(knockouts)/敲减(knockdowns))相关多肽的植物中的转录谱。本领域技术人员应当理解具有相似的转录谱的基因、共有大于50%调节转录的基因、或共有大于70%调节转录的基因、或共有大于90%调节转录的基因具有相似的功能。这里，序列的同源物、旁系同源物、直系同源物和其任何其它变体预期以相似的方式通过使植物产生补身醇合成酶蛋白而作用。
本发明的一个实施方式提供补身醇合成酶蛋白(包括直系同源物和旁系同源物)的氨基酸序列，以及用于鉴定和分离其它生物体中补身醇合成酶的直系同源物和旁系同源物的方法。优选地，如此鉴定的补身醇合成酶的直系同源物和旁系同源物保留补身醇合成酶活性，并且能够由FPP前体起始产生补身醇。
在另一个实施方式中，提供在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中给出的多肽的“变体”或“衍生物”，这样的变体或衍生物为包括与这里多肽的氨基酸序列具有基本相似性的氨基酸序列的多肽，例如优选在其全长上与SEQ ID NO:2或SEQID NO:4具有至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的氨基酸序列。本发明的多肽的氨基酸序列及其变体可以在氨基酸的缺失、添加和/或取代方面不同，然而保留所述多肽的功能等效性(即，从FPP前体开始的补身醇合成)。例如，本发明的多肽的氨基酸可以基于氨基酸残基的疏水性、亲水性、溶解性、极性方面的相似性进行修饰，只要该变体多肽保留与本发明的多肽的功能等效(即从FPP前体开始补身醇合成)。
变体还包括具有补身醇合成酶活性的蛋白，其是通过由具有氨基酸序列SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽进行一种或多种氨基酸的取代、缺失或***而衍生的。优选地，这样的蛋白包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个至约100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15个氨基酸的取代、缺失或***。
变体也可以通过连接共价或非共价连接至多肽骨架的修饰基团而不同于本发明的多肽。变体还包括通过引入N-连接的或O-连接的糖基化位点和/或添加半胱氨酸残基而不同于本发明的多肽的多肽。本领域技术人员会认识到如何修饰氨基酸序列并保持生物活性。
可以使用各种方法确定任何补身醇合成酶蛋白、变体或片段的功能性或活性。例如，在植物、细菌或酵母细胞中瞬时或稳定的过表达可用于测试蛋白是否具有活性，即从FPP前体产生补身醇。可以在酵母菌表达***中评价补身醇合成酶活性，如在本文实施例2中描述的产生补身醇的测试，这表明其功能性。本发明的补身醇合成酶多肽的变体或衍生物保留从FPP前体产生补身醇的能力。本发明的补身醇合成酶的氨基酸序列变体可以具有额外期望的生物功能，包括例如改变底物利用性、反应动力学、产品分布或其它改变。
这里的一个实施方式提供本发明的多肽以用于通过在体外或体内用本发明的多肽接触FPP前体而产生补身醇或至少一种补身醇衍生物的方法中。
为了实施体外方法，具有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽或其变体或片段，例如具有在本发明的多肽全长上至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的那些，可以从(例如在用本发明的多核苷酸转化之后)表达该多肽的任何生物体中分离。
本领域已知可以用核酸转化细胞以产生大量的蛋白，所述核酸编码期望的蛋白，所述蛋白例如被分泌至培养介质中。蛋白可以从培养介质收集，并且进一步用于，例如产生补身醇或补身醇衍生物。
体外或体内产生的补身醇可以进一步用于合成许多补身醇衍生物(Cortes et al.2011Nat Product Communications6:477)。例如，从补身醇合成的一系列化合物包括而不限于补身-8-醇、补身-8,11-二醇、补身-8-烯-7-酮、毛喉萜、肉桂二醛、(+)-折叶苔醇、(-)-尤维丁、(+)-异水蓼醇醛、(-)-水蓼二醛、(-)-乌干达二醛、(-)-瓦尔伯醛、龙涎香、补身醛、补身酸、异辛辣木素、肉桂酸内酯、康佛托林、密叶辛木素、补身二醇和水蓼二醛酸。
另外，如此制备的补身醇可被用作合成龙涎香和龙涎香相关化合物的起始化合物，所述龙涎香和龙涎香相关化合物之前是从几乎灭绝的抹香鲸获得的，并且长期以来由于其芳香性质和独特的定香能力被香料制造者使用。通过在C-11将官能团结合至(-)-补身醇获得的氮化补身醇衍生物可以具有增加的抗真菌活性。通常，补身醇可用于合成具有杀真菌剂、杀虫剂、芳香剂、拒食剂、和/或食物味道改变的性质的补身醇衍生物。
在另一个实施方式中，将细胞工程化以使本发明的多肽积聚在细胞之内。本领域技术人员应当认识到如何从细胞中提取蛋白或多肽，例如通过使用下述技术∶反复冻融、超声处理、通过高压均匀化、过滤、或通过有机溶剂透化等。在提取之后，可以将蛋白在最佳pH值下再悬浮至缓冲溶液中，然后可以向该溶液中加入FPP以产生补身醇。在培养后，可以通过标准分离和纯化过程从该溶液中移出所得补身醇。
可能特别有利地是将补身醇合成酶蛋白直接定位于亚细胞区室，例如质体，优选叶绿体、线粒体、内质网或液胞。将蛋白靶向特定的细胞结构可以为期望表达的蛋白提供最有效的功能。
本领域熟知蛋白可以通过在其N-末端引入叶绿体转运肽而将其靶向至叶绿体。以前已经鉴定了天然存在的叶绿体靶蛋白，该蛋白被合成为包含N-末端叶绿体靶向肽的更大的前体蛋白，所述N-末端叶绿体靶向肽使所述前体靶向叶绿体转运器(chloroplast import machinery)(Hesse et al.1989,EMBO J8:2453;Klosgen et al.1989Mol Gen Genet217:155;Klosgen and Weil1991Mol Gen Genet225:297;Shcherban et al.1995Proc Natl Acad Sci USA92:9245;Park et al.1997J Biol Chem272:6876;Tavladoraki et al.1998FEBS Lett.426:62;Neuhaus and Rogers1998PlantMol Biol38:127;Bih et al.1999,J Biol Chem274:22884;Morris et al.1999BiochemBiophys Res Commun255:328;Terashima et al.1999Appl Microbiol Biotechnol52:516)。
已经发现叶绿体靶向肽对于设计具有过量生成萜烯的植物特别有效，观察到如果所述萜烯在细胞质而不是在质体中过表达，则对宿主有毒性。
为此目的，在一些实施方式中，本发明的嵌合基因包括编码信号或靶向肽的编码区，所述编码区连接至本发明的补身醇合成酶蛋白编码区。
编码适于将补身醇合成酶基因产物靶向至植物细胞的质体或叶绿体的肽的序列的实例包括来自菠菜的铁氧化还原蛋白-NADP+氧化还原酶的转运肽(Oelmulleret al.1993Mol Gen Genet237:261)等(参见US专利申请5,635,618;Wong et al.1992Plant Mol Biol20:81;PCT专利申请WO00/26371)。
这里，适于将补身醇合成酶基因产物靶向到线粒体的序列的实例，如Cox IV靶向信号(Kohler et al.1997Plant J11∶61)也在本发明的范围之内。
为了使补身醇合成酶蛋白分泌到转化的宿主细胞的外部，可以在补身醇合成酶蛋白的氨基末端(例如N-末端)融合合适的分泌信号肽。可以使用基于计算机的分析，使用程序如Signal Peptide搜索程序检测推定的转运肽(SignaIP V3.0;VonHeijne,Gunnar,1986and Nielsen et al.1996)。
还优选的是将连接至这样的肽的蛋白靶向分泌到细胞外，如马铃薯蛋白酶抑制因子II的分泌信号(Keil et al.1986Nucl Acids Res14:5641)、稻米的α-淀粉酶3的分泌信号(Sutliff et al.1991Plant Mol Biol16:579)和烟草PR1蛋白的分泌信号(Cornelissen et al.1986EMBO J5:37)。
根据本发明的特别有效的转运肽包括叶绿体转运肽(Van Den Broeck et al.1985Nature313:358)、或使蛋白转运到叶绿体的最优化的叶绿体转运肽(US5,510,471和US5,635,618)、分泌信号肽或将蛋白质靶向至其它质体、线粒体、ER或另一个细胞器的肽。
除了将本发明的多肽靶向至细胞内细胞器之外，本发明还包括转化质体基因组(优选叶绿体基因组或线粒体基因组)的方法。细胞器的转化是本领域技术人员已知的，并且提供控制环境转基因扩散的手段(Sidorov et al.,1999Plant J19:209;Lutzet al.2004Plant J37:906)。
本发明的多核苷酸
本发明还提供编码本发明的多肽或变体多肽的分离的、重组或合成的多核苷酸。
本发明的一个实施方式提供一种分离的、重组或合成的SEQ ID NO:1核酸序列或其变体，其与编码具有如SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的核酸序列SEQ IDNO:1、或编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的补身醇合成酶的核酸序列SEQ IDNO:3、或在细胞中催化从FPP前体产生补身醇的其片段具有至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。本发明涵盖cDNA、基因组DNA和RNA序列。编码补身醇合成酶或其变体的任何核酸序列在这里都称为补身醇合成酶编码序列。
根据一个优选的实施方式，SEQ ID NO:1的核酸为编码从缬草获得的补身醇合成酶的补身醇合成酶基因的编码序列，如在本文实施例中描述的。
在另一个实施方式中，还提供来源于水蓼且编码补身醇合成酶蛋白的SEQ IDNO:3核酸。
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的多核苷酸的片段指优选地为这里本发明的多核苷酸的至少15bp、至少30bp、至少40bp、至少50bp和/或至少60bp长度的邻接核苷酸。优选地，多核苷酸的片段包括至少25个、更优选地至少50个、更优选地至少75个、更优选地至少100个、更优选地至少150个、更优选地至少200个、更优选地至少300个、更优选地至少400个、更优选地至少500个、更优选地至少600个、更优选地至少700个、更优选地至少800个、更优选地至少900个、更优选地至少1000个本发明的多核苷酸的邻接核苷酸。不受限制，这里多核苷酸的片段可被用作PCR引物和/或探针、或用于反义基因沉默或RNAi。
对本领域技术人员显而易见的是，包括本发明的多核苷酸的基因可以通过本领域已知的方法基于可获得的核苷酸序列信息(如存在于所附的序列表中的)克隆。这些包括例如设计代表这样的基因的侧翼序列的DNA引物，其中之一是以正义方向产生的且引发正义链的合成，并且另一个是以反义互补方式产生的且产生反义链。热稳定的DNA聚合酶(如在聚合酶链反应中使用的那些)通常用于进行这样的试验。或者，代表基因的DNA序列可以是化学合成的，接着被引入可以被可相容的细菌(如大肠杆菌)成倍增加的DNA载体分子中。
在本发明的一个相关实施方式中，提供用于检测编码补身醇合成酶的核酸序列的PCR引物和/或探针。本领域技术人员应当知道基于SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3合成简并或特异性PCR引物对以扩增编码补身醇合成酶或其片段的核酸序列的方法。编码补身醇合成酶的核酸序列的检测试剂盒可以包括编码补身醇合成酶的核酸序列的特异性引物和/或探针，以及使用该引物和/或探针检测样品中编码补身醇合成酶的核酸序列的相关方法。这样的检测试剂盒可用于确定植物是否已经被修饰，即被编码补身醇合成酶的序列转化。
由于遗传密码的简并性，多于一个密码子可以编码相同的氨基酸序列、多个核酸序列可以编码相同的蛋白或多肽。可在合适的地方优化编码补身醇合成酶的核酸序列以增加宿主细胞中的表达。例如，本发明的核苷酸可以由宿主优选的密码子合成以用于改善表达(参见Campbell和Gowri1990Plant Physiol92:1;Bennetzen and Hall1982J Biol Chem257:3026)。用于构建植物优选的合成DNA序列的方法是本领域可获得的(参见U.S.专利5,380,831和5,436,391)。植物种类的密码子使用表是公众可获得的(参见Ikemura1993In Plant Molecular Biology Labfax,Croy ed.,Bios Scientific Publishers Ltd,pp.37-48;Codon Usage Database at theKazusa DNA Research Institute,Japan)。
通过SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的突变获得的核酸序列是可以常规制备的，并且也在本发明的实施方式之内。本领域技术人员清楚一种或多种核苷酸的突变、缺失、***和/或取代可以被引入SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的DNA序列中。通常，突变是可以改变所产生的多肽的氨基酸序列的基因DNA序列方面的变化。
为了测试根据本发明的变体DNA序列的功能，将感兴趣的序列可操作地连接至可选择的或可筛选的标记物基因，并且在瞬时表达测试中用原生质体或在稳定转化的植物中确定报告基因的表达。本领域技术人员应当认识到能够驱动表达的DNA序列被构建为模块。因此，较短DNA片段的表达水平可以与最长片段的不同，并且可以彼此不同。本发明还涵盖编码本发明的补身醇合成酶蛋白的核酸序列的功能等价物，即在严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3核酸序列杂交的核苷酸序列。
严格杂交是在温度65℃下，最优选地在55℃下，在包含0.1%SDS的二倍浓缩的(2x)柠檬酸盐缓冲盐水(SSC)中进行的，接着在相同的温度下但是用具有降低的SSC浓度的缓冲液洗涤载体。这样的降低浓度的缓冲液通常为包含0.1%SDS的十分之一强度SSC(0.l×SSC)、优选包含0.1%SSC的0.2×SSC，最优选包含0.1%SDS的一半强度SSC(0.5×SSC)。来自其它生物体的补身醇合成酶蛋白的功能等效物可以通过用SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核酸序列杂交从其它生物体分离的基因组DNA而获得。
本领域技术人员应当知道鉴定其它生物体中的同源序列的方法和确定同源序列之间的序列同一性的百分数的方法(在本文定义部分中鉴定的)。然后，对这样的新鉴定的DNA分子可以测序，并且可以与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核酸序列进行比较，测试功能等效性。具有与核苷酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3至少75%、优选地80%、更优选地90%且最优选95%或更高的序列同一性的DNA分子在本发明的范围内。
本发明的一个相关实施方式提供与根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核酸序列互补的核酸序列，如抑制RNA，或在严格条件下与根据SEQ ID NO:1或SEQID NO:3的核苷酸序列的至少一部分杂交的核酸序列。
本发明的另一个实施方式提供改变宿主细胞中基因表达的方法。例如，在宿主细胞或宿主生物体中，本发明的多核苷酸可以在一些情形(例如，在被昆虫咬或蜇之后或当暴露于某一温度时)中增加或过表达或被诱导。
本发明的多核苷酸表达的改变也导致“异位表达”，这是在改变的生物体和对照生物体或野生型生物体中的不同表达模式。表达的改变是由本发明的多肽与外源性或内源性调节物的相互作用而出现，或者作为多肽的化学修饰结果而出现。该术语还指本发明的多核苷酸的表达模式的改变，其在低于检测水平或完全抑制的活性下被改变。
当编码本发明的补身醇合成酶的基因在强的组成性或组织特异性启动子的控制下时，出现过表达。例如，强的组成性启动子包括组成性35S或增强的35S花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子、玉米泛素启动子、稻米肌动蛋白启动子、emu启动子等。组织特异性启动子包括，而不限于叶优选的、毛状体特异性的、根优选的、表皮优选的或对生殖组织(如花粉)具有特异性的启动子，使得在组织特异性启动子的控制下补身醇合成酶基因仅仅在特定组织或器官中和/或在某个发育阶段期间表达。
由于补身醇合成酶蛋白的组成型表达可能对植物细胞有害，或者可导致产率较低，因此，这里本发明的一个实施方式提供诱导性启动子。诱导性启动子的实例包括创伤诱导性启动子、温度诱导性启动子(US5,447,858)、化学诱导性启动子、光诱导性启动子、缺氧状态诱导性启动子(ADH1S)、病原体诱导性启动子(EP759,085)或衰老诱导性启动子(US5,689,042)、或其它诱导性启动子。
在一个优选的实施方式中，使用昆虫-诱导性启动子，使得补身醇合成酶蛋白将仅仅在被害虫昆虫损伤的植物中产生。甚至更优选地，启动子是被大量害虫可诱导的。或者，宿主植物可以包括多于一个编码补身醇合成酶蛋白的基因，其各自处于不同害虫诱导性启动子控制下，以确保该补身醇合成酶蛋白是在不同害虫昆虫的攻击下产生的。这样的诱导性启动子的实例是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于马铃薯蛋白酶抑制因子(pinll)-启动子(Godard et al.2007PlantCell Reports26(12):2083)、烟草WIPK启动子(Seo et al.1999Plant Cell11:289)、LOX(例如在拟南芥、番茄、烟草中)、或者Wir1家族启动子(例如在小麦中；Yuanet al.2004J Plant Physiol161(1):79)。
在另一个优选的实施方式中，用于产生补身醇和/或至少一种补身醇衍生物的方法在体内进行。例如，当宿主细胞是天然能够产生FPP及其一种或多种立体异构体时，可以使用本发明的方法产生补身醇。或者，与未-工程化的宿主细胞相比，天然不会产生FPP或产生很低量的FPP的宿主细胞可以被工程化以产生FPP或提高FPP的量。或者，本领域技术人员应当认识到如何实现补身醇合成酶蛋白(即FPP)的底物的过表达以产生补身醇和/或补身醇衍生物。例如，可以用编码法呢基磷酸酯合成酶的外源性核苷酸转化宿主细胞，以在生物体中产生FPP。补身醇合成酶与法呢基二磷酸酯合成酶(FPS)和3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMGR)的共表达可以增加倍半萜烯前体向补身醇合成酶的变迁(flux)：FPS提供给补身醇的直接前体，即FPP，而HMGR被认为是甲瓦龙酸酯途径中最重要的限速步骤。
对于补身醇在体内的生成，可以用编码补身醇合成酶的核酸转化能够产生FPP的宿主细胞，所述补身醇合成酶具有氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID:4，或者具有在本发明多肽的全长上至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性，用这样方法使得能够在宿主细胞之内表达多肽。在允许产生补身醇和/或补身醇衍生物的条件下，进一步培养用本发明的多核苷酸转化的宿主细胞或生物体。例如，可以选择培养介质以能够培养和/或分化转化细胞，从而能够在细胞或得到的转化生物体中合成补身醇和/或补身醇衍生物。
补身醇转化成拒食剂补身醇衍生物如水蓼二醛或瓦尔伯醛或其它补身烷衍生物可以通过在体内共表达一种或多种细胞色素P450酶来实现。已知这些酶能够进行倍半萜烯主链的另外的羟基化和氧化。用于这种酶的基因可以从富含这样的衍生物的水蓼或缬草的组织中分离。
在一个实施方式中，几将编码核酸序列的几种补身醇合成酶在单一宿主中共表达，优选地在不同启动子的控制下共表达。或者，编码核酸序列的一些补身醇合成酶蛋白可以存在于单个转化载体上，或使用单独的载体同时共转化并选择包括两种嵌合基因的转化体(transformants)。相似地，一种或多种补身醇合成酶编码基因可以与其它嵌合基因一起在单个植物中表达，所述其它嵌合基因例如编码增强害虫抗性等的其它蛋白质的嵌合基因。
应当理解，不同的蛋白可以在相同的植物中表达，或者各自可以在单个植物中表达，然后通过单个植物彼此杂交在同一植物中结合。例如，在杂交种子生产中，每个亲本株可以表达单个蛋白。当亲本株杂交产生杂交物时，两种蛋白在杂交植物中结合。
编码补身醇合成酶蛋白的本发明的核酸序列可以***到表达载体中，和/或包含在***表达载体中的嵌合基因中，以在宿主细胞或宿主生物体中产生补身醇合成酶蛋白。用于将转基因***宿主细胞基因组中的载体是本领域所熟知的，并且包括质粒、病毒、粘粒和人工染色体。嵌合基因***其中的双元载体或共整合载体也用于转化宿主细胞。
本发明的一个实施方式提供重组表达载体，其包括可操作地连接至相关核酸序列(如例如启动子序列)的补身醇合成酶基因或嵌合基因的核酸序列的，所述嵌合基因补身醇合成酶基因的核酸序列。例如，包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核酸序列的嵌合基因可以是可操作地连接至适用于在植物细胞、细菌细胞或真菌细胞中表达的启动子序列，可选地连接至3'未翻译的核酸序列。
或者，启动子序列可以存在于载体中，以便待转录的核酸序列在启动子序列下游***载体中。载体通常工程化为具有复制起点、多个克隆位点和可选择的标记物。
供细菌、真菌、酵母菌和哺乳动物细胞宿主使用的表达载体描述在例如Pauwels et al.Cloning vectors,A Laboratory Manual,1985Elsevier,N.Y.andSambrook et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版，1989,Cold SpringHarbor Laboratory Press中。也可以使用来源于本发明的核酸序列的RNA，应用无细胞翻译***产生这里本发明的蛋白。
用于转化宿主细胞和嵌合基因的载体优选地***到核基因组中或细胞器(即,线粒体或质体)的基因组中，使得核酸序列的表达由启动子的活性驱动。参见Arabidopsis,A Laboratory Manual Eds.Weigel and Glazebrook,Cold Spring HarborLaboratory Press(2002)和Maniatis et al.,Molecular Cloning,Cold Spring HarborLaboratory Press(1982)。
在本文的本发明中，宿主细胞或宿主生物体可以是补身醇的非-生产者。载体如包含补身醇合成酶基因或嵌合基因(包含补身醇合成酶核苷酸序列)的表达载体可以被引入到这样的宿主细胞或宿主生物体中，使得当表达基因产物时，宿主细胞或宿主生物体能够产生补身醇和/或补身醇衍生物。在使进行补身醇合成酶基因表达的情况下，并且当接触FPP前体时，在细胞培养物中培养宿主细胞，从细胞培养物中回收补身醇和/或补身醇衍生物。
宿主细胞可以选自原核细胞或真核细胞。合适的原核细胞包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌如大肠杆菌和根瘤土壤杆菌。
或者，这里本发明的蛋白质可以在真核细胞中表达。例如，编码补身醇合成酶蛋白的核酸序列(或其片段)可用于转化真菌细胞、哺乳动物细胞、植物细胞或任选的非人类细胞。属于例如酵母菌属(例如酿酒酵母)、毕赤酵母属或克鲁维酵母属、或其它酵母属的酵母宿主细胞也可以用于表达本发明的蛋白。改变的细胞可以产生组织或整个生物体。合适的宿主可以包括藻或昆虫。
在一个优选的实施方式中，宿主包括植物。任何植物都可以是合适的宿主，包括双子叶植物(dicots)或单子叶植物(monocots)。适用于本发明的多肽表达的植物包括，但不限于农作物种类，其为害虫的天然宿主，如番茄、胡椒、茄子、莴苣、葵花、油菜籽、西兰花、花椰菜和卷心菜作物、黄瓜、甜瓜、西瓜、南瓜、倭瓜、花生、大豆、棉花、豆、鳄梨、木薯、马铃薯、甘薯和秋葵。农作物种类也包括玉米、大麦、珍珠稷、小麦、黑麦、高粱、稻米和牧草。
另外，植物宿主包括树种类、肉质果种类，如葡萄、桃、李子、草莓和芒果，以及观赏种类如木槿、猩猩木、百合、鸢尾、玫瑰和矮牵牛花。特别地优选的是属于茄科家族的植物，包括属于茄属、辣椒属、烟草属、牵牛花属等的植物。在一个优选的实施方式中，植物种类特别是茄属包括在例如番茄(S.lycopersicum)、茄子(S.melongena)、茄瓜(S.muricatum)等。
本领域技术人员知道修饰宿主细胞或非人类生物体的方法。细菌的转化是本领域已知的，并且可以例如使用电穿孔技术进行。对于在原核细胞中的表达，可以最佳化核酸序列的密码子用法。本领域技术人员已知在原核细胞中表达的其它最佳化包括例如除去内含子序列。本发明还涵盖遗传修饰酵母菌、真菌和优选植物细胞的方法。
用于遗传修饰植物的方法包括而不限于植物外植体的农杆菌介导的转化，和例如通过电穿孔或使用聚乙二醇向原生质体、花粉的直接基因转移，注射到生殖细胞、器官和不成熟的胚胎、质体、叶绿体中和线粒体转化，通过粒子轰击的基因转移。本领域技术人员已知的其它基因递送装置包括脂质和病毒载体、电穿孔、采用碳化硅晶丝搅拌和化学方法。
已经公布了用于转化双子叶植物的方法，例如用于烟草、番茄、马铃薯、胡椒、大豆、芸苔、棉花、西瓜、甜瓜、草莓、薄荷及其它双子叶植物。也已经报道了使用土壤杆菌属、粒子轰击和电穿孔进行单子叶植物的转化，例如用于玉米、大麦、稻米、燕麦、甘蔗、小麦、黑麦、高羊茅及其它单子叶植物。
土壤杆菌属-介导的转化是一种将本发明的核酸分子引入植物外植体的优选的方法。根瘤土壤杆菌harbors称为Ti质粒的天然载体，将其工程化以使其适用于将外源性核酸分子引入到植物基因组中。对于遗传转化，用土壤杆菌属细胞细胞的悬浮液培养植物来源的外直物，接着在包含仅仅促进转化细胞生长和再生的选择性试剂的培养基中培养该外直体。
在这点上，在这里本发明的一个优选的实施方式中，***根癌土壤杆菌中的、包括编码补身醇合成酶蛋白的核酸序列或包含编码补身醇合成酶蛋白的核酸序列的嵌合基因的T-DNA载体可用于稳定地转化植物细胞。用于土壤杆菌属-介导的转化的T-DNA载体的结构是本领域熟知的。在T-DNA载体内，可操作地连接启动子的、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的补身醇合成酶核酸序列或包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的补身醇合成酶核酸序列的嵌合基因位于T-DNA边界序列之间。
将编码补身醇合成酶的基因***到植物基因组中，使该基因的编码序列位于合适的3'端非翻译区(3'UTR)的上游。合适的3'端包括而不限于CaMV35S基因的、胭脂碱合成酶基因、章鱼碱合成酶基因等的那些。
每种方法都具有优点和缺点，因此，适用于一种生物体转化的一种特定的方法可能对于另一种生物体无效，但是本领域技术人员应当知悉其中转化方法用于特定生物体。用于选择和再生转化的植物的方案是本领域所熟知的，并且本领域技术人员应当选择合适的方案以高频率回收转化的植物。
在一个实施方式中，编码补身醇合成酶蛋白的核酸序列可以稳定地整合到植物细胞的核基因组中，使得这样的植物细胞可以诶培养且用于产生补身醇和/或补身醇衍生物。
本发明的一个可选的实施方式提供一种用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物能够产生补身醇和/或增加水平的补身醇，或者与相似遗传学背景的非转基因植物相比具有增强的抗虫性，所述方法包括下述步骤∶用核酸序列转化植物细胞，所述核酸序列编码具有补身醇合成酶活性的蛋白，并且包括氨基酸序列SEQID NO:2或SEQ ID NO:4、或与氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，或者用嵌合基因转化植物细胞，所述嵌合基因包括编码具有补身醇合成酶活性的蛋白的核酸序列，并且包括可操作地连接启动子的氨基酸序列SEQID NO:2或SEQ ID NO:4、或与氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，和再生植物。这里本发明的一个实施方式还提供遗传工程化的植物细胞及从该细胞再生的植物，所述植物细胞包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中给出的核酸序列，或者包括包含如在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中给出的核酸序列的嵌合基因。本发明的遗传工程化的植物包括具有产生补身醇和/或补身醇衍生物的能力的植物，或具有产生于相同遗传学背景的非遗传工程化植物相比增加水平的补身醇和/或补身醇衍生物的能力的植物。
可以使用南方墨点分析(Southern Blot analysis)或基于PCR的方法鉴定单本转化体植物。或者，可以通过包括例如气相色谱-质谱分析(GC-MS)的分析方法确定补身醇或补身醇衍生物。
得到的转化植物可以是杂交的或自交的，并且用于转化的植物种群的植物育种生产，所述转化的植物产生本发明的蛋白。
所述方法也可以包括步骤：针对一种或多种害虫的抗性，筛选转基因植物或来源于自交或杂交的转基因植物的植物，并且鉴定对于至少一种害虫具有增强的抗性的用于产生补身醇和/或补身醇衍生物植物，和/或坚定具有产生补身醇和/或补身醇衍生物的能力的植物，或者具有增强补身醇产生和/或补身醇衍生物的能力的植物。
本发明的一个相关实施方式还提供从转基因植物获得的组织培养物，使该培养物具有增强的补身醇补身醇衍生物的生成和分泌，特别是与相同遗传学背景的非转基因植物相比较，和用于从本发明的组织培养物中分离补身醇和/或补身醇衍生物的方法。
在叶子中（过）表达补身醇合成酶控制昆虫
本发明的一个实施方式是提供一种通过(过)表达编码补身醇合成酶的基因来提供和/或提高对害虫昆虫的抗性的方法。
“害虫抗性”为与野生型或对照植物相比，本发明的修饰的转基因植物承受一种或多种害虫攻击的能力增强。用于评价植物中害虫抗性的方法是本领域已知的。例如，可以在感染害虫或与害虫接触之后的一个或多个时间点，对疾病症状进行目测评级。或者，可以在确定中感染植物期间检测和可选地定量害虫。如果与对照中检测的昆虫数量相比，组织中检测到的害虫数量显著地降低，则修饰的植物显示出增强则抗虫性。优选地，当植物在害虫压力下生长时，与对照相比本发明的修饰的植物的平均产率显著提高(例如，至少1%、2%、5%、10%或更高)，这提供给害虫昆虫抗性增强的间接测量方式。应用统计分析来确定显著性差异的存在。
现在，已经充分描述了本发明，将其在下述实施例和权利要求书中举例说明，下述实施例和权利要求书不应当被看作是对进一步的限制。将这里引用的参考文献的全部内容通过参考并入。
实施例
实施例 1.补身醇合成酶基因的鉴定
来自缬草的补身醇合成酶(DS)基因的鉴定首先依靠从根组织制备mRNA。通过标准方案，使用从缬草根制备的RNA制备cDNA。接着，使用该cDNA作为产生萜烯合成酶基因片段的模板。基于30秒94℃、1分钟42℃和1分钟72℃的35个周期的程序，使用Super Taq聚合酶来使用正义引物1s(5'-GAY GAR AAY GGIAAR TTY AAR GA-3')和反义引物2as(5'-CC RTA IGC RTC RAA IGT RTCRTC-3')。将PCR片段连接到pGEM-T Easy载体中，并且转换至感受态大肠杆菌细胞。选出氨苄西林抗性菌落，生长过夜，并且通过标准方案分离质粒DNA。对包含正确***的质粒DNA测序，并且基于获得的序列引物设计5'和3'RACE PCR以获得全长序列。基于与基因的5和3'区相同的同源的两个DNA寡核苷酸(5'-ATGTCTACTGCATTAAACAG-3'和5'-TCTATACGGGGACGGGGTC-3')，扩增cDNA的完全编码区。补身醇合成酶基因的鉴定首先依靠从水蓼(water pepper)和春蓼(P.maculosa)获得454EST库。从来自两个种类的幼花得到优质的RNA，并测序。与春蓼相比，水蓼的序列质量的读取分布出现良好，并且初始比较筛选能够鉴定具有高得多的表观丰度的倍半萜烯合成酶。基于引物5'-ATGTCTACTGCCGTTAACG-3'和5'-CTAAATCGGAATGGGATCGGTG-3'克隆推定的补身醇合成酶(DS)基因，并且在酵母菌中表达和在本氏烟中瞬时表达。
实施例2.倍半萜烯合成酶在酵母菌中的表达
使用Hindlll和Notl限制性位点，将推定的全长补身醇合成酶基因克隆到具有TRP1选择标记物的pYES3/CT酵母菌表达载体(Invitrogen)中。将该载体转化到表达Arabidopsis ATR1NADPH-细胞色素P450还原酶的酵母菌株WAT11中。在转化之后，在补充有氨基酸、但省略对于转化体有营养缺陷性选择的L-色氨酸的合成葡萄糖基础培养基(0.67%的不含氨基酸的Difco酵母菌氮碱培养基，2%d-葡萄糖，2%琼脂)上选择包含补身醇合成酶的酵母菌克隆。
在5ml的合成半乳糖基础培养基(0.67%的不含氨基酸的Difco酵母菌氮碱培养基，2%d-半乳糖，氨基酸，但省略L-色氨酸)中，在30℃下，将起子酵母培养物培养过夜。将起子培养物在50ml的合成半乳糖基础培养基中稀释至OD600为0.05，并且在30℃下以200rpm培养。当OD600在0.8至1范围时，给培养物续加5ml的正十二烷，并且继续培养3天。收集正十二烷层，并且以1200rpm离心10分钟，三倍稀释在乙酸乙酯中，使用无水Na2S04干燥，然后用于GC-MS分析。
实施例3.土壤杆菌属的转化
双元载体的构建.
线粒体靶向∶将下述基因克隆到双元载体pBinplus中：
1)来自缬草DSval2.5(SEQ ID NO:1)的补身醇合成酶基因，其连接至在35S启动子的控制下靶向线粒体的啤酒酵母的Cox IV分泌信号(Kohler et al.1997PlantJ11:613；Gene ID:852688；SEQ ID NO:7)；
2)来自水蓼DSph1.5的补身醇合成酶基因(SEQ ID NO:3)，其连接至在菊花rbcS1启动子的控制下靶向线粒体的核苷酸序列SEQ ID NO:7(Outchkourov et al.Planta216:1003)。
3)编码氨基酸序列SEQ ID NO:6的来自A.thaliana(Genebank:NM117823，
1026bp)FPS1.5的法呢基二磷酸酯合成酶基因，其连接至在菊花rbcS1启动子控制下的线粒体靶向序列SEQ ID NO:7。
4)编码截短的氨基酸序列(aa165-592；SEQ ID NO:5)的来自A.thaliana(登记号码J04537，2195bp)HMGR1.1的3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶基因。
质体靶向。或者，将用于靶向质体的下述构建物克隆到pBinplus载体中：
1)来自水蓼DSph1.4的补身醇合成酶基因(SEQ ID NO:3)，其连接至在Rbsc启动子的控制下编码菊花小亚基蛋白(Wong et al.1992Plant Mol Biol20:81-93；SEQ ID NO:8)的分泌信号的核苷酸序列；
2)编码SEQ ID NO:7核酸的来自A.thaliana(genebank:NM_117823,1026bp)FPS1.4的法呢基二磷酸酯合成酶基因，连接至如在SEQ ID NO:8中给出的质体靶向序列的核苷酸序列；
3)编码截短的氨基酸序列(aa165-592；SEQ ID NO:6)的来自A.thaliana(登记号码J04537，2195bp)HMGR1.1的3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶基因。
细胞质靶向。最后，将没有编码细胞器靶向肽序列的各个下述基因DSph1.1、FPS1.1和HMGR1.1克隆到pBinplus载体中。通过电穿孔将双元载体引入到Agl-1根癌土壤杆菌菌株中。Agl-1系菌株包含去臂的(disarmed)Ti质粒，其提供vir基因功能且harbors染色体标记物利福平和羧苄西林(Hellens et al.2000Trends inPlant Science5:446)。
实施例4.在本氏烟的叶子中的瞬时表达
在含有卡那霉素(50mg/L)和利福平(34mg/L)的LB培养基中，在28℃下以220rpm培养土壤杆菌属菌株24小时。通过以4,000g且在20℃下离心收集细胞，然后再悬浮在包含10mM的MgCI2和100μM的乙酰丁香酮(4'-羟基-3',5'-二甲氧基苯，Sigma)中至最终OD600为0.5，接着在室温下且以50rpm培养150分钟。对于共浸润，混合等体积的土壤杆菌属菌株。在28℃(16h)/25℃(8h)下，在具有16h光照的温室中，在土壤上由种子培养本氏烟植物。使用1ml_注射器将菌株混合物浸润到四周龄的本氏烟植物叶子中。将细菌慢慢地注射到叶子的背面(abaxialside)。培养该植物，并且在浸润5天之后收集浸润的叶子。
通过急冻、在液氮中研磨来自植物的500mg浸润的叶子，并且用2ml二氯甲烷提取。通过简单的涡流和超声处理5分钟制备提取物，将该提取物以1,200rpm离心10分钟，并且将该溶液的澄清部分转移到新小瓶中。最后，通过蒸发溶剂至约0.5mL体积浓缩该提取物，并且使用无水Na2S04脱水。通过GC-MS(AgilentGC-MS,Agilent technologies)进行样品分析。程序设定为5分钟/300℃，升温10℃/s，溶剂延迟12.5分钟。
实施例5.GC-MS分析
使用装有30m×0.25mm、0.25mm膜厚度的柱(ZB-5,Phenomenex)的气相色谱仪(ZB-5，Phenomenex)分离来自1μL样品的分析物，使用氦气作为载体气体，流速1ml/min。以不分流模式使用注射器，进口温度设定为250℃。在1分钟之后，45℃的初始烘箱温度以10℃/分钟的速率升高至300，并保持在300℃下5分钟。将GC偶联至质量-选择性检测器(模型5972A,Hewlett-Packard)。通过比较质谱和保留时间(rt)与包括例如补身醇的可靠的标准品的质谱和保留时间鉴定化合物。
实施例6.使用DSval和DSph体内产生补身醇
来自缬草(Val)的补身醇合成酶(DS)mRNA编码556个氨基酸残基的蛋白(图1)，而来自水蓼(Ph)的DS mRNA编码来自559个氨基酸残基的蛋白(图2)。两个基因都显示出很小的序列同源性(41%同一性)，参见图3。
通过在如上所述的酵母菌转化实验和GC-MS分析中的酵母菌表达确定两种补身醇合成酶的活性。用包含两种补身醇合成酶基因的质粒转化的酵母细胞培养物的提取物显示存在主要的峰，鉴定为补身醇(图4；rt=17.17分钟)。而且，两个基因也都在本氏烟叶子中瞬时表达。来自缬草的补身醇合成酶处于35S启动子的控制下(图5)且靶向至线粒体，来自水蓼的补身醇合成酶处于Rbcs启动子的控制下且靶向至质体或细胞质(图6)。用可以极大地提高表达的法呢基二磷酸酯合成酶(FPS)和3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMGR)共浸润两种DS基因。结果表明两种酶对浸润的叶子中补身醇的表达(rt=17.44min)。在本氏烟中，天然基因在没有加入靶向物的细胞质中的表达获得了补身醇的最有效表达。
实施例7.DSval和DSph的序列同一性
使用公众在National Institute of Health,USA的网址从National Center forBiotechnology Information(NCBI)可获得的BLASTN，确定核苷酸序列同一性。使用来自缬草(1680bp)和来自水蓼(1672bp)的补身醇合成酶的核酸序列进行BLAST研究。分析显示与来自白杨的大根香叶烯合成酶(E-值为0.80)具有相对低的序列同一性。发现水蓼补身醇合成酶或缬草补身醇合成酶与葡萄大根香叶烯合成酶之间在核苷酸水平方面的序列同一性分别为52%或58%。
用NCBI非重复数据库比较水蓼补身醇合成酶(559aa)的翻译序列(BLASTP)与来自缬草的大根香叶烯合成酶，得到E-值2.90E-152。水蓼补身醇合成酶与缬草cadenine合成酶、瓦伦烯合成酶和大根香叶烯合成酶之间的序列同一性分别为50%、47%和42%。缬草(556aa)和V.vinifera大根香叶烯合成酶之间的序列同一性为51%。

Claims (23)

1.一种分离的多肽，所述多肽具有补身醇合成酶活性，并且包括氨基酸序列SEQID NO:2、与氨基酸序列SEQ ID NO:2具有至少70%同一性的氨基酸序列、氨基酸序列SEQ ID NO:4、或与氨基酸序列SEQ ID NO:4具有至少70%同一性的氨基酸序列。
2.一种分离的核酸序列，所述核酸序列编码根据权利要求1所述的多肽。
3.根据权利要求2所述的分离的核酸序列，所述核酸序列包括核苷酸序列SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3。
4.根据权利要求2至3所述的分离的核酸序列，所述核酸序列源自缬草或水蓼。
5.一种嵌合基因，所述嵌合基因包括根据权利要求2至4中任一项所述的核酸序列。
6.一种表达载体，所述表达载体包括根据权利要求2至4中任一项所述的核酸序列或根据权利要求5所述的嵌合基因。
7.根据权利要求6所述的表达载体，所述表达载体包括根据权利要求2至4中任一项所述的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至少一个控制转录、翻译起始或终止的调节序列。
8.根据权利要求6至7中任一项所述的表达载体，其中根据权利要求2至4中任一项所述的核酸序列或根据权利要求5所述的嵌合基因进一步包括靶向序列，优选地，其中所述靶向序列编码转运肽，所述转运肽将如权利要求1中定义的多肽靶向至植物细胞的质体，更优选地其中所述质体为叶绿体。
9.根据权利要求8所述的表达载体，其中所述靶向序列编码转运肽，所述转运肽将如权利要求1中定义的多肽靶向至植物细胞的线粒体。
10.宿主细胞，所述宿主细胞包括根据权利要求2至4中任一项所述的分离的核酸序列、根据权利要求5所述的嵌合基因、和/或根据权利要求6至9中任一项所述的表达载体，优选地，其中所述细胞为原核细胞或真核细胞，如哺乳动物细胞、细菌细胞、真菌细胞或植物细胞。
11.转基因生物体，所述转基因生物体包括根据权利要求2至4中任一项所述的分离的核酸序列、根据权利要求5所述的嵌合基因、和/或根据权利要求6至9中任一项所述的表达载体，优选地，其中所述生物体为植物，优选农作物。
12.根据权利要求1所述的分离的多肽、根据权利要求2至4中任一项所述的分离的核酸序列、根据权利要求5所述的嵌合基因、根据权利要求6至9中任一项所述的表达载体、根据权利要求10所述的宿主细胞、或根据权利要求11所述的转基因生物体在用于产生补身醇和/或至少一种补身醇衍生物中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其中产生的所述补身醇被转化成至少一种补身醇衍生物。
14.根据权利要求12或13中任一项所述的用途，用于提供具有杀真菌剂、杀虫剂、拒食剂、芳香剂和/或食物味道改变的性质的细胞或生物体。
15.一种用于产生补身醇和/或至少一种补身醇衍生物的方法，包括步骤∶
a)在允许将法呢基二磷酸酯(FPP)转化成补身醇的条件下，用根据权利要求1所述的FPP前体；
b)分离补身醇；和
c)可选地，用至少一种酶接触在步骤(a)、(b)中产生的补身醇，所述酶将所述补身醇转化为至少一种补身醇衍生物。
16.根据权利要求15所述的方法，包括在步骤(a)之前：
用根据权利要求2至4中任一项所述的分离的核酸序列、根据权利要求5所述的嵌合基因、或根据权利要求6至9中任一项所述的表达载体转染和/或转化能够产生所述FPP前体的细胞，以提供能够产生补身醇的细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(a)是通过在允许产生补身醇和/或补身醇衍生物的条件下培养所述细胞进行的。
18.根据权利要求16至17中任一项所述的方法，其中所述细胞选自由真核细胞和原核细胞组成的组中，如植物细胞、细菌细胞或真菌细胞。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，进一步包括羟基化和/或氧化补身醇以产生至少一种补身醇衍生物，所述至少一种补身醇衍生物具有杀真菌剂、杀虫剂、拒食剂、芳香剂和/或食物味道改变的性质。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中所述补身醇衍生物选自包括补身-8-醇、补身-8,11-二醇、补身-8-烯-7-酮、毛喉萜、肉桂二醛、(+)-折叶苔醇、(-)-尤维丁、(+)-异水蓼醇醛、(-)-水蓼二醛、(-)-乌干达二醛、(-)-瓦尔伯醛、龙涎香、补身醛、补身酸、异辛辣木素、肉桂酸内酯、康佛托林、密叶辛木素、补身二醇和水蓼二醛酸的组中。
21.一种用于产生具有补身醇合成酶活性的多肽的方法，包括步骤：
a)用根据权利要求2至4中任一项所述的核酸、根据权利要求5所述的嵌合基因、或根据权利要求6至9中任一项所述的表达载体转化或转染宿主细胞或非人类生物体；
b)在允许产生多肽的条件下培养所述宿主细胞或生物体。
22.一种用于产生能够产生补身醇的转基因植物的方法，包括步骤：
a)用根据权利要求2至4中任一项所述的核酸、根据权利要求5所述的嵌合基因、或根据权利要求6至9中任一项所述的表达载体转化或转染植物或植物细胞；
b)由转化的或转染的植物或植物细胞再生转基因植物。
23.根据权利要求22所述的方法，进一步包括步骤∶
c)筛选所述转基因植物或通过自交或杂交由所述转基因植物衍生的植物，以用于产生补身醇和鉴定产生补身醇的转基因植物。
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