CN104034823B - 一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分指纹图谱的检测方法，包括主要步骤为：供试品溶液及对照品溶液的制备、测定，并获得供试品溶液和对照品溶液的液相色谱图进行比较后，根据相对保留时间，确定供试品溶液中2种吲哚类生物碱成分，根据色谱峰面积，采用外标法确定供试品溶液中2种吲哚类生物碱成分的含量。本发明可以对蟾酥中2种主要的吲哚类生物碱成分同时进行有效的定性和定量分析，方法简便、可行、准确，测定方法的精密度、重复性、稳定性良好，能够有效地控制蟾酥质量，并为蟾酥的临床用药提供参考。

Description

一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法

技术领域

本发明涉及中药成分分析检测技术领域，具体涉及一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法。

背景技术

2010版《中国药典(一部)》收载蟾酥作为蟾蜍科动物中华大蟾蜍BufobufogargarizansCantor或黑眶蟾蜍BufomelanostictusSchneider的耳后腺及皮肤腺分泌的白色浆液经加工干燥后制得的药材。其性状呈扁圆形团块状或片状，团块状者质坚，不易折断，断面呈棕褐色，角质状，微有光泽；片状者质脆，易碎，断面红棕色，半透明。蟾酥味初甜而后有持久的麻辣感，粉末嗅之作嚏。具有解毒，止痛，开窍醒神的功效，主治痈疽疔疮，咽喉肿痛，中暑神昏，腹痛吐泻等疾病，具有非常良好的疗效。

蟾酥中化学成分复杂，主要成分有蟾蜍甾二烯类、强心甾烯蟾毒类、吲哚碱类、甾醇类以及肾上腺素、多糖、蛋白质、氨基酸和有机酸等。其中，吲哚碱类成分，也称为吲哚类生物碱成分，是蟾酥中非常重要的一类化学成分，具有非常好的提高机体免疫力，并具有一定的抗肿瘤能力。目前，蟾酥中所含的吲哚碱类成分主要有5-羟色胺和5-羟色胺衍生物，其中5-羟色胺和蟾毒色胺作为蟾酥中所含的吲哚类生物碱中两种重要组成成分，非常需要进行定性定量分析。

目前，对于蟾酥中吲哚类生物碱成分，《中国药典》仅通过对二甲氨基苯甲醛显色法进行鉴别，现有技术未收载同时检测5-羟色胺和蟾毒色胺的定量方法及其相关条件。因此，有必要采用优化的前处理及检测条件，建立蟾酥中吲哚类生物碱成分：5-羟色胺和蟾毒色胺的的测定方法，此方法弥补了生物碱类成分依靠显色反应鉴别的专属性不足的缺点，可更全面、有效的控制蟾酥的质量。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法，采用优化条件的前处理和检测方法对2种吲哚类生物碱成分：5-羟色胺和蟾毒色胺的同时进行定性定量分析，进而反映蟾酥药材的内在质量，为蟾酥药材判断真伪、评价优劣、考察稳定性和一致性提供依据。

为实现上述目的，本发明首先提供一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法，包括以下步骤：

较佳的，所述蟾酥药材中吲哚类生物碱成分为5-羟色胺和蟾毒色胺。

1)供试品溶液的制备：将蟾酥细粉加入乙醇水溶液，超声提取后，冷却、摇匀；离心，吸取上清液加热蒸干，加入溶剂溶解并定容，过滤膜，取续滤液作为供试品溶液；

较佳的，所述乙醇水溶液为50％乙醇水溶液。具体的，所述50％乙醇水溶液为体积百分数为50％的乙醇。

进一步的，加入的50％乙醇水溶液为蟾酥细粉的100-800倍量。优选的，所述加入的50％乙醇水溶液为蟾酥细粉的200倍量。

具体的，所述加入的50％乙醇水溶液为蟾酥细粉的100-800倍量是指，每0.1g的蟾酥细粉中加入50％乙醇水溶液10-80ml。优选的，当所述蟾酥细粉的重量为0.1g时，所述50％乙醇水溶液的加入量为20ml。

较佳的，所述蟾酥细粉加入乙醇水溶液后，需精密称重。

较佳的，所述超声提取、冷却后，需再称重，并用50％乙醇水溶液补足失重。

较佳的，所述超声提取时间为20-60min。优选的，所述超声提取时间为20min。

较佳的，所述离心时间为20min；所述离心转速为4000rpm。

较佳的，所述吸取上清液加热蒸干是指：将精密吸取的一定体积的上清液置于蒸发皿中，放入恒温水浴中加热、蒸至近干。进一步的，所述吸取上清液的体积为3ml。

较佳的，所述溶解并定容时使用的溶剂为20％乙醇水溶液。具体的，所述20％乙醇水溶液为体积百分数为20％的乙醇。进一步的，所述加入20％乙醇水溶液的定容体积为10ml。

较佳的，所述滤膜为0.45μm滤膜。

所述续滤液是指：过滤膜时，初滤液后的溶液即为续滤液。

2)对照品溶液的制备：将5-羟色胺和蟾毒色胺对照品加入溶剂溶解并定容，摇匀，得到混合对照品溶液；

较佳的，所述对照品溶液中5-羟色胺的CAS号为50-67-9；蟾毒色胺的CAS号为487-93-4。

较佳的，所述对照品溶液中各成分的含量范围为：5-羟色胺120.0-1800.0μg/ml、蟾毒色胺14.4-216.0μg/ml。

优选的，所述对照品溶液中各成分的含量范围为：5-羟色胺120.0μg/ml、蟾毒色胺14.4μg/ml。

较佳的，所述溶解并定容时使用的溶剂为20％乙醇水溶液。具体的，所述20％乙醇水溶液为体积百分数为20％的乙醇。

3)定性检测：采用高效液相色谱法分别测定供试品溶液和对照品溶液，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照品溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间，确定供试品溶液中2种吲哚类生物碱成分；

4)定量检测：采用高效液相色谱法分别测定供试品溶液和对照品溶液，根据色谱峰面积，采用外标法确定供试品溶液中2种吲哚类生物碱成分的含量。

较佳的，所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：AlltimaC₁₈(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；柱温：25-35℃，优选25℃；检测波长：275nm；流速：0.7-0.8ml/min，优选0.7ml/min；进样量：10μl；流动相：乙腈-0.5％磷酸二氢钾缓冲溶液(磷酸调缓冲溶液pH至3.2)，其中，A相为乙腈，B相为0.5％磷酸二氢钾缓冲溶液；分析时间：25min；等度洗脱。

进一步的，所述等度洗脱在0-25min，以流动相A相：B相体积比为5：95进行洗脱。

进一步的，所述0.5％磷酸二氢钾缓冲溶液为重量百分数为0.5％的磷酸二氢钾缓冲水溶液。

较佳的，所述外标法是指：分别移取一系列不同体积的步骤B)所述混合对照品溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，获得混合对照品溶液中吲哚类生物碱2种主要活性成分含量与峰面积的线性关系，以每一种活性成分色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到各标准工作曲线的回归方程。再将供试品溶液采用高效液相色谱仪检测，将获得的供试品溶液中2种吲哚类生物碱成分的色谱峰面积，分别代入所述各标准工作曲线的回归方程中，可得到相应吲哚类生物碱成分的含量。

优选的，所述混合对照品溶液的移取体积为1μl、2μl、4μl、8μl、10μl、15μl。

如上所述，本发明的一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法，针对吲哚类生物碱极性较大，在一般色谱柱上几乎无保留且分离度差的特点，经过对色谱柱筛选以及流动相***、样品制备、分析等条件的优化考察，采用优化反应条件的前处理和高效液相分析方法建立了蟾酥中2种吲哚类生物碱成分的同时、简单、准确的定量定性检测方法。其中，本发明采用流动相：乙腈--0.5％磷酸二氢钾缓冲溶液(磷酸调缓冲溶液pH至3.2)，无需复杂的梯度洗脱程序，在简单的等度洗脱条件下就能使被分离化合物保持较好的分离度和峰形，进行同步测定。本发明通过对吲哚类生物碱2种成分的定量分析，定量分析结果中2种成分的回归方程的相关系数R²均大于0.9997，回收率均大于99％，RSD均小于2.0％，测定方法的精密度、重复性、稳定性良好。本发明的定性定量分析方法同步、简便、可行、准确，能够有效地控制蟾酥质量，并为蟾酥的临床用药提供参考。

附图说明

图1显示为本发明的不同提取方法比较液相色谱图1A、1B、1C

图2显示为本发明的不同缓冲盐浓度比较液相色谱图2A、2B、2C

图3显示为本发明的不同缓冲液pH值比较液相色谱图3A、3B、3C

图4显示为本发明的不同色谱柱比较液相色谱图4A、4B、4C

图5显示为本发明的不同流速、柱温比较液相色谱图5A、5B、5C

图6显示为本发明的吲哚类生物碱中2种成分的对照品液相色谱图，其中，I：5-羟色胺、II：蟾毒色胺

图7显示为本发明的吲哚类生物碱中2种成分的混合样品液相色谱图，其中，I：5-羟色胺、II：蟾毒色胺

图8显示为本发明的吲哚类生物碱中5-羟色胺的回归方程和线性范围示意图

图9显示为本发明的吲哚类生物碱中蟾毒色胺的回归方程和线性范围示意图

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

以下实施例使用的材料、试剂和仪器如下：

1、材料、试剂

蟾酥(上海华宇药业有限公司)；乙醇(分析纯，上海豪申化学试剂有限公司)；磷酸(色谱级，TEDIA公司)；磷酸二氢钾(优级纯，上海凌峰化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，TEDIA公司)；5-羟色胺、蟾毒色胺(HPLC纯度≥98％、批号20130630，上海克里克生物医药科技有限公司)；

2、仪器

具塞锥形瓶、移液管及其相关玻璃器皿(上海禾汽玻璃有限公司)；50ml圆底蒸发皿(上海喜泊达玻璃仪器有限公司)；HSS型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；滤膜(0.45μm，上海安谱科学仪器有限公司)；TDL-40型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；色谱柱：NucleosilC₁₈(德国MACHEREY－NAGEL公司)、AllitmaC₁₈(250mm×4.6mm，5μm)(美国GRACE公司)、WatersSymmetryC₁₈(美国沃特世科技有限公司)；SB-5200超声萃取仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Agilent1260液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)。

实施例1蟾酥药材中2种吲哚类生物碱成分的测定

1实验部分

1.1样品前处理

供试品溶液的制备：精密称定0.1g的蟾酥细粉，精密加入50％乙醇水溶液，称定重量，超声提取，冷却后，再称定重量，用50％乙醇水溶液补足失重，摇匀。采用离心机离心，离心时间为20min、离心转速为4000rpm。再精密吸取3ml的上清液置于蒸发皿中加热、蒸至近干。加入20％乙醇水溶液溶解并定容至10ml，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：分别精密称取5-羟色胺和蟾毒色胺对照品适量，加20％乙醇水溶液溶解并定容，摇匀，得到混合对照品溶液；其中，各成分的含量范围为：5-羟色胺120.0-1800.0μg/ml、蟾毒色胺14.4-216.0μg/ml。

1.2色谱条件

高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：AlltimaC₁₈(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；柱温：25-35℃，优选25℃；检测波长：275nm；流速：0.7-0.8ml/min，优选0.7ml/min；进样量：10μl；流动相：乙腈-0.5％磷酸二氢钾缓冲溶液(磷酸调缓冲溶液pH至3.2)，其中，A相为乙腈，B相为0.5％磷酸二氢钾缓冲溶液；分析时间：25min；等度洗脱。

等度洗脱在0-25min，以流动相A相：B相体积比为5：95进行洗脱。

1.3测定

采用外标法，分别吸取体积为1μl、2μl、4μl、8μl、10μl、15μl的混合对照品溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，绘制标准曲线。再吸取体积为10μl的供试品溶液，采用高效液相色谱仪进样分析。将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照品溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间，确定供试品溶液中2种吲哚类生物碱成分；根据色谱峰面积，计算获得供试品溶液中2种吲哚类生物碱成分的含量。

2结果与讨论

2.1前处理条件的优化

2.1.1提取方法的选择

分别比较了热回流、超声和冷浸提取法，其中，采用热回流提取方法提取1小时；采用超声提取方法超声20min；采用冷浸提取法冷浸过夜提取。蟾酥药材在不同提取方法下采用相同的HPLC检测条件测定结果见图1、表1。

表1三种提取方法对2种成分的色谱峰面积的影响结果

提取方法	5-羟色胺(A)	蟾毒色胺(A)
			冷浸	1735	176
热回流	1798	185
			超声	1781	178

由图1、表1可知，在提取充分的条件下，三种提取方法得到的色图谱中两种成分的峰面积无明显差异(RSD<3.0％)，由于冷浸法和热回流法提取后的溶液中均有不同程度的粉末结块现象，超声提取后蟾酥粉末在溶液中分散均匀，且操作简便、迅速，因此选择提取方式为超声提取。

2.1.2提取溶剂的选择

采用相同前处理和高效液相色谱测定方法，分别比较提取溶剂对吲哚类生物碱的提取效果，提取溶剂具体结果见表2。通过2个含量测定指标性成分的峰面积比较结果表明，80％乙醇提取效率最低，50％乙醇提取效率最高，同时20％乙醇、30％乙醇提取液较浑浊，造成后续操作中过0.45μm滤膜困难，因此选择50％乙醇为提取溶剂。

表2不同提取溶剂对2种成分的色谱峰面积的影响结果

提取溶剂	5-羟色胺(A)	蟾毒色胺(A)
			20％乙醇	1554	152
30％乙醇	1577	157
			50％乙醇	1781	178
50％甲醇	1695	167
			70％乙醇	1572	157
80％乙醇	964	86

2.1.3超声时间及溶剂体积的选择

采用相同前处理和高效液相色谱测定方法，比较了不同超声提取时间、提取溶剂体积对提取效率的影响，以2个含量测定指标性成分的峰面积为指标进行比较，具体测定结果见表3、4。结果表明，提取时间、溶剂体积对提取效率物无显著影响，超声20min即可提取完全；100倍溶剂提取液离心后较浑浊，不利于后续操作，200倍溶剂即可提取完全，因此选择溶剂体积为200倍。

表3不同超声时间对2种成分的色谱峰面积的影响结果

超声时间	5-羟色胺(A)	蟾毒色胺(A)
			20min	1716	170
30min	1681	168
			45min	1734	172
60min	1745	173

表4不同溶剂体积对2种成分的色谱峰面积的影响结果

溶剂体积	5-羟色胺(A)	蟾毒色胺(A)
			100倍	846	69
200倍	885	72
			400倍	860	71
800倍	868	71

由上述实验结果可见，蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的供试品前处理的优选条件为：取一定量的蟾酥细粉精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入200倍量的50％乙醇，称定重量，超声提取20min，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足失重，摇匀；离心20min(4000rpm)取3ml上清液加热蒸干，加入20％乙醇溶解并定容至10ml，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得。

2.2色谱条件的优化

2.2.1缓冲液浓度的选择

采用相同前处理和高效液相色谱测定方法，分别比较不同浓度的磷酸二氢钾缓冲溶液对分离效果的影响，具体结果见图2。由图2可知，磷酸二氢钾缓冲溶液浓度为40mM(即mmol)时，色谱峰展宽得到改善，并且60mM与40mM相比，差异不大，从保护色谱柱角度考虑，应选择较低浓度的缓冲盐；由于《中国药典》收载“蟾酥含量测定方法”使用流动相为乙腈-0.5％磷酸二氢钾，与40mM磷酸二氢钾浓度相近，因此选择磷酸二氢钾缓冲溶液浓度为0.5％，即1L水中加入5.0g磷酸二氢钾，即重量百分数为0.5％磷酸二氢钾缓冲溶液。

2.2.2缓冲液pH值的选择

采用相同前处理和高效液相色谱测定方法，分别比较不同pH的磷酸二氢钾缓冲溶液对分离效果的影响，具体结果见图3。由图3可知，调pH＝3.2时，色谱峰展宽得到改善，且调pH＝2.8与3.2相比，差异不大，因此选择磷酸调缓冲溶液pH为3.2的0.5％磷酸二氢钾缓冲溶液。

2.2.3流动相及其梯度洗脱条件的选择

通过上述对缓冲溶液中浓度及pH值的选择，本发明中采用的流动相***：乙腈-0.5％磷酸二氢钾缓冲溶液(磷酸调pH＝3.2)，并在特定的等度洗脱条件下能使被分离化合物保持较好的分离度和峰形，可以一次样品制备并一次进样分析，能够对吲哚类生物碱成分进行高效的定性定量分析。

2.2.4色谱柱的选择

采用相同前处理和高效液相色谱测定方法，为了进一步改善色谱峰的拖尾问题，分别比较了以NucleosilC₁₈、AllitmaC₁₈、WatersC₁₈三款色谱柱对吲哚类生物碱成分分离效果的影响，具体结果见图4。结果表明，AlltimaC₁₈色谱柱能较好地改善色谱变宽及拖尾情况，因此选择AlltimaC₁₈色谱柱进行分析。

2.2.5流速、柱温的选择

采用相同前处理和高效液相色谱测定方法，分别比较了不同柱温25-35℃、流速0.7-0.8ml/min对化合物分离效果的影响，具体结果见图5。由图5可知，发现当流速选择为0.7ml/min，柱温选择为25℃时，待测定成分的色谱峰能够有效分离，2个色谱峰的分离度均大于1.5，且对色谱柱的消耗最少，能够获得最优化的分离效果。

由上述实验结果可见，测定2种吲哚类生物碱成分含量的优化色谱条件为：AlltimaC₁₈(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；流动相为乙腈-0.5％磷酸二氢钾缓冲溶液(磷酸调缓冲溶液pH至3.2)；等度洗脱；柱温25℃；检测波长275nm；流速0.7ml/min；进样量：10μl；分析时间25min。

2.3方法的精密度、重复性、稳定性

2.3.1精密度

精密吸取同一供试品溶液，在上述2.2确认的HPLC优化条件下连续进样分析6次，测定峰面积，精密度具体结果见表5。结果表明，5-羟色胺、蟾毒色胺的色谱峰面积RSD小于0.64％，说明该方法精密度良好。

表52种吲哚类生物碱成分精密度考察结果

项目	5-羟色胺(A)	蟾毒色胺(A)
			1	1450.7	146.8
2	1452.1	146.8
			3	1456.4	147.0
4	1452.3	146.6
			5	1452.5	146.2
6	1454.0	144.5
			平均值	1453.0	146.3
RSD(％)	0.14	0.64

2.3.2重复性

取同一批蟾酥药材粉末6份，按上述2.1供试品溶液前处理优化条件操作，在上述2.2色谱条件下连续进样分析6次，测定峰面积，重复性具体结果见表6。结果表明，5-羟色胺、蟾毒色胺的峰面积RSD小于2.16％，说明该方法重复性良好。

表62种吲哚类生物碱成分重复性考察结果

称样量(g)	5-羟色胺(A)	蟾毒色胺(A)
			0.1002	1484.0	148.8
0.1003	1471.2	148.0
			0.1005	1476.6	148.4
0.1003	1490.1	153.6
			0.1002	1452.3	145.7
0.1003	1453.7	144.3
			平均值	1471.3	148.1
RSD(％)	1.06	2.16

2.3.3稳定性

精密吸取同一供试品溶液，根据上述2.1和2.2确认的优化条件，分别于0、2、4、8、12、24h进样分析，测定峰面积，具体结果见表7。稳定性考察结果表明，5-羟色胺、蟾毒色胺的相对峰面积RSD小于0.18％，说明该方法在24h内稳定性良好。

表72种吲哚类生物碱成分稳定性考察结果

时间	5-羟色胺(A)	蟾毒色胺(A)
			0h	1471.4	147.3
2h	1466.2	147.4
			4h	1464.9	147.3
8h	1467.5	147.6
			12h	1470.3	147.4
24h	1470.1	147.0
			平均值	1468.4	147.3
RSD(％)	0.18	0.13

2.42种吲哚类生物碱成分含量测定方法的线性关系

精密称取对照品溶液适量，加20％乙醇溶解并定容至刻度，制备成含有不同质量浓度成分的混合对照品溶液，其中，混合对照品溶液中各成分含量为：5-羟色胺120.0μg/ml、蟾毒色胺14.4μg/ml。分别精密吸取混合对照品溶液1μl、2μl、4μl、8μl、10μl、15μl进样，测定并计算获得各成分的标准回归方程、相关系数和线性范围。具体结果见图8-9、表8。

表82种吲哚类生物碱成分的回归方程和线性范围

化合物	标准曲线	R2	线性范围(μg)
				5-羟色胺	y＝1928.1770x-8.5860	1.0000	0.12～1.8
蟾毒色胺	y＝1586.9509x-5.5306	0.9997	0.0144～0.216

根据图8-9、表8可知，标准回归方程以色谱峰面积为纵坐标(Y)，化合物质量为横坐标(X)，同时，2种成分在一定线性范围内均呈良好的线性关系，其标准回归方程的相关系数均大于0.9997。

2.52种吲哚类生物碱成分含量测定方法的回收率

精密称取6份已知浓度的蟾酥样品适量，分别准确加入一定含量的5-羟色胺、蟾毒色胺对照品，按2.1和2.2的优化条件处理并测定，结果见表9。由表9可知，2种成分的含量测定方法的平均回收率均大于99％，RSD均小于2.0％，其测定结果的回收率良好。

表92种吲哚类生物碱成分加样回收率结果

2.6实际样品中2种吲哚类生物碱成分含量的测定

通过对供试品溶液前处理和色谱条件的优化，以及方法学考察，我们建立了蟾酥药材中2种吲哚类生物碱成分的测定方法。取10批蟾酥药材按上述2.1中供试品前处理的优化条件制备样品，按上述2.2中HPLC优化色谱条件进行测定，测定10批蟾酥样品中2种吲哚类生物碱成分的含量。蟾酥药材供试品及2个混合对照品成分的比较色谱图见图6-7。由图6-7可知，根据相对保留时间，确定供试品溶液中2种吲哚类生物碱成分；并采用外标法，通过对照品溶液与供试品溶液中2种吲哚类生物碱成分的色谱峰面积，计算获得供试品溶液中2种吲哚类生物碱成分的含量。具体结果见表10。

表1010批蟾酥样品中2种吲哚类生物碱成分的含量比较

由表10可知，蟾酥药材中2种吲哚类生物碱成分含量差异显著，其中，根据测定，5-羟色胺的含量范围为3.55％～5.08％；蟾毒色胺的含量范围为0.32％～0.39％。并且，10批蟾酥药材中2种吲哚类生物碱成分中，5-羟色胺的含量平均值为4.476％；蟾毒色胺的含量平均值为0.364％，均落在实际测定范围内，符合实际测定情况。

综上所述，本发明的一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法，可以对蟾酥中2种主要的吲哚类生物碱成分同时进行有效的定性和定量分析，方法简便、可行、准确，能够有效地控制蟾酥质量，并为蟾酥的临床用药提供参考。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (5)

1.一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法，包括以下步骤：

1)供试品溶液的制备：将蟾酥细粉加入乙醇水溶液，超声提取后，冷却、摇匀；离心，吸取上清液加热蒸干，加入溶剂溶解并定容，过滤膜，取续滤液作为供试品溶液；

所述加入的乙醇水溶液为50％乙醇水溶液，为蟾酥细粉的100-800倍量；所述超声提取时间为20-60min；

2)对照品溶液的制备：将5-羟色胺和蟾毒色胺对照品加入溶剂溶解并定容，摇匀，得到混合对照品溶液；

所述步骤1)或2)中，所述溶解并定容时使用的溶剂为20％乙醇水溶液；

3)定性检测：采用高效液相色谱法分别测定供试品溶液和对照品溶液，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照品溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间，确定供试品溶液中2种吲哚类生物碱成分；

4)定量检测：采用高效液相色谱法分别测定供试品溶液和对照品溶液，根据色谱峰面积，采用外标法确定供试品溶液中2种吲哚类生物碱成分的含量；

所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：AlltimaC₁₈色谱柱；柱温：25-35℃；检测波长：275nm；流速：0.7-0.8ml/min；进样量：10μl；流动相：乙腈-0.5％磷酸二氢钾缓冲溶液、磷酸调缓冲溶液pH至3.2，其中，A相为乙腈，B相为0.5％磷酸二氢钾水溶液；分析时间：25min；等度洗脱；

所述等度洗脱在0-25min，以流动相A相：B相体积比为5：95进行洗脱。

2.根据权利要求1所述的一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述加入的50％乙醇为蟾酥细粉的200倍量；所述超声提取时间为20min。

3.根据权利要求1所述的一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述离心时间为20min；所述离心转速为4000rpm。

4.根据权利要求1所述的一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述蟾酥细粉加入乙醇水溶液后，需精密称重；所述超声提取、冷却后，需再称重，并用50％乙醇水溶液补足失重。

5.根据权利要求1所述的一种蟾酥药材中吲哚类生物碱成分的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述对照品溶液中各成分的含量范围为：5-羟色胺120.0-1800.0μg/ml、蟾毒色胺14.4-216.0μg/ml。