一种中药复方的制备方法及在防治老年痴呆症中的应用
技术领域
本发明属中药制药技术领域,更具体涉及到一种中药复方的制备方法及在防治老年痴呆症中的应用。
背景技术
本发明是在“一种治疗脑动脉硬化的中药”(专利申请号:200410045091.7,公开号:CN1596960A)专利申请公开的组方基础之上,根据组方中各原料药所含活性物质的不同特性,采用不同的提取与制剂方法创立的一种新的工艺技术(简称新工艺),采用新工艺所制备的药物,其物质基础与原专利申请公开的制备方法(简称原工艺)所得基础物质相比有着实质性的差异,采用新工艺制备的药物不仅可以显著提高该复方对于脑动脉硬化所致各种病症的疗效,而且扩大了其在防治老年痴呆症中的应用。
原工艺是:将处方配比中的银杏叶、女贞子、丹参用70%的乙醇加热提取三次,第一次加1500ml,提取2小时,第二次加1200ml,提取1.5小时,第三次加1200ml,提取1小时,合并提取液,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,浓缩备用。醇提取后的药渣与处方配比中的制何首乌、杜仲、川牛膝、钩藤等四味,加水煎煮两次,第一次加水2400ml,第二次加水1800ml,每次2小时,合并煎液,滤过,滤液浓缩至相对密度为1.12(60~65℃)的清膏,清膏加乙醇使含醇量达60%,搅匀,静置,滤过,滤液减压回收乙醇至无乙醇味,与银杏叶、女贞子、丹参醇提浓缩液合并,上述浸膏采用常规方法制成口服液,或干燥成干浸膏后制成片剂、胶囊剂、颗粒剂。原申请专利“一种治疗脑动脉硬化的中药”的用途是用于治疗中老年人脑动脉硬化所致的头晕头痛、耳鸣耳聋、视物模糊、记忆力减退、失眠、腰膝酸软、肢体麻木等症。
本发明新工艺克服了原工艺的一些弊端。新工艺与原工艺比较,其主要特点在于:①将钩藤与银杏叶、女贞子、丹参一起共同用乙醇提取,充分利用钩藤原料中的总生物碱,同时避免钩藤碱的转化,以增强本复方治疗心脑血管疾病的疗效;②银杏叶、女贞子、丹参醇提后的药渣不再与其它原料药材一起水提,不仅节省提取、浓缩及醇沉液回收乙醇时的能耗,而且大大减少了醇沉时乙醇的用量;③对提取溶媒用量做了研究调整,最大限度地提取有效成分;④将本品制成硬胶囊、软胶囊、片剂或颗粒剂等固体制剂,解决钩藤总生物碱、银杏内酯、齐墩果酸、丹参酮、隐丹参酮等在水溶液中难溶或不溶的成分被沉淀析出,以及丹参素、丹酚酸等水溶性成分在水溶液中被降解的技术缺陷,从而提高药品质量与疗效。
发明人经实验研究证实原工艺存在如下弊端:①原料钩藤药材提取方法不适宜:原工艺将钩藤与何首乌、杜仲、川牛膝四味药材采用水提2次,滤取滤液,滤液浓缩后加乙醇醇沉,工艺结果不仅直接导致原料钩藤中的有效成分钩藤碱发生转化,而且将使钩藤总生物碱全部丢失。国内外科学工作者多年来的研究证实,钩藤的主要有效成分为钩藤总生物碱,其具有钙拮抗、一氧化氮合酶(NOS)抑制、调节去甲肾上腺素、多巴胺、5~羟色胺神经元***、抗血小板聚集和抗血栓、降血压等作用,其中最主要的成分是钩藤碱(rhynchophylline)和异钩藤碱(isorhynchophylline),分别占钩藤总生物碱的28.9%和14.7%以上,其均与本复方的主治功能与适应症相对应,但钩藤生物碱不溶于水,水煎煮的提取转移率在20%以下,且只能混悬或沉淀于水提物中,若再将提取液滤过后浓缩,钩藤生物碱将被滤除而损失怠尽;其次,煎煮钩藤时,祖国传统医药学都将其“后下”,以防止钩藤碱的转化,现代医药学也证实:钩藤碱在水溶液中较长时间加热煎煮的情况下,将转化为异钩藤碱。因此,钩藤须以乙醇提取为宜,原工艺以水为溶媒进行长时间提取存在技术弊端。②原工艺增加了不必要的工艺步骤,物料、能耗损失极大:银杏叶、女贞子、丹参经过70%的乙醇提取3次后,其有效成份如银杏叶黄酮、银杏内酯、齐墩果酸、丹参素、丹酚总酸、丹参酮、隐丹参酮等不论是水溶性还是脂溶性的活性成分都已经被基本提尽,其药渣中只残留部分大分子成分如淀粉、女贞子多糖、糖蛋白等物质,其中只有多糖成分具有一定的生理活性,将其药渣再与制何首乌等药味一起水提,虽然可以提取部分女贞子多糖成分,但将水提液经浓缩后再经60%乙醇醇沉,该部份多糖又被沉淀除去,将药渣再与其他原料合并加水提取,不仅大大增加醇沉时乙醇的用量,而且大大增加了提取、有机溶剂回收、浓缩时的能耗,也提高了药物服用量,而对提高药品质量和疗效毫无裨益。③原工艺提取溶媒量严重不足,活性成分转移率低下:银杏叶、女贞子、丹参三次醇提时乙醇用量分别为药材重量的4.2倍、3.3倍、3.3倍,药渣与何首乌等药味两次水提时加水量分别为药材重量的3.0倍、2.3倍,提取过程中溶媒量不能完全盖没药材面,提取效益低,有效成分转移率极低,且因提取时每一批次置露溶媒表面的药材不一致,致使每批次药品质量不均衡,严重影响药品质量与疗效。④原工艺主要采用口服液剂型,剂型选择不当:银杏叶中银杏内酯、女贞子中齐墩果酸、钩藤中的钩藤总生物碱、丹参中的丹参酮、隐丹参酮等主要有效成分均难溶于水或不溶于水,若制成水溶液制剂,上述成分除在工艺过程中大部份被损失外,残留的很小一部份成分也会在贮存过程中被沉淀析出,沉结于瓶底不仅严重影响外观质量,且严重影响药品疗效,既使在水溶液中添加增溶剂也不能有效解决上述问题,因此本复方不宜制成水溶液制剂。本发明通过技术改进,克服了原工艺制备方法方面存在的各种弊端,使其工艺更趋合理,对生产实践具有实用性、可操作性。
本发明复方药品的另一个特点是可用于老年痴呆症的防治。公开号CN1596960A专利申请“一种治疗脑动脉硬化的中药”所公开的用途为脑动脉硬化症的治疗,用于治疗中老年人脑动脉硬化所致的头晕头痛、耳鸣耳聋、视物模糊、记忆力减退、失眠,腰膝酸软,肢体麻木等症。上述主治适应症中,记忆力减退等患者认知反应能力方面的症状与老年血管性痴呆有一定相关性,但上述所有主治适应症均与老年痴呆症并无关联。本发明一种复方的制备方法与CN1596960A专利申请所公开的制备方法比较,本发明最大的特点在于提取与保留了可透过血脑屏障的钩藤碱、异钩藤碱、银杏内酯、二苯乙烯苷、丹参酮、隐丹参酮等脂溶性活性成分,实验表明其可应用于老年痴呆症的防治。
老年痴呆症(又称阿尔茨海默病,Alzheimerdisease,简称AD)与血管性痴呆(Vasculardementia,简称VD)是两种不同的疾病,老年痴呆症(AD)是由于神经元缠结与老年斑导致脑功能障碍而造成的老年性智能障碍性综合征,而血管性痴呆(VD)是由于血管因素病变直接导致大脑认知功能的病变与血管性因素所致的脑萎缩所导致的另一类型痴呆,两者在流行病学、发病机制、病理表现、临床表现、影像学检查、实验室检查、诊断标准与治疗方面均存在实质性差异,其主要不同点在于:
流行病学:在欧美国家,60岁以上老年人中6%~12%发生痴呆,85岁以上的老人则有20%~40%发生痴呆,其中半数以上为AD;在我国,通过由北京协和医院牵头,由全国6个城市10个中心的109名医师参加的对42890名老人进行的流行病学调查研究表明,我国北方地区65岁以上居民痴呆患病率为6.9%,其中AD为4.2%,VD为1.9%;我国南方地区65岁以上居民痴呆患病率为3.9%,其中AD为2.8%,VD为0.9%;我国老年痴呆患者中AD发病率约为VD的3倍。
发病机制:AD可分为家族性与散发性,家族性的AD为常染色体的显性遗传,21号染色体的APP基因、14号染色体的PS1以及1号染色体的PS2基因发生突变,为家族性AD的病因,散发性AD的发病在基因水平上现在肯定的有APOE基因。目前AD的发病假说较为流行的有:β-淀粉样蛋白假说、Tau蛋白假说、神经血管假说、氧化应激学说等。而VD是由于脑缺血、脑出血、低灌注、脑栓塞等各种血管性因素病变直接导致大脑相应的认知功能区域发生病变,是血管性因素导致毒素物质损伤脑组织所致。
病理方面:AD的主要病理改变为两种即神经炎性斑(NP)与神经元缠结(NFT),在AD患者的大脑皮质部分,海马区以及各种神经核和丘脑中存在大量的NP,认为NP的形成主要是由于Aβ淀粉样蛋白沉积;NFT的主要是在神经元的细胞体内形成,研究表明含有NFT的神经元细胞大多已成退行性的病变,神经元缠结的主要成分主要为P-tau蛋白。而VD的病理改变多种多样,比较常见的病理改变为多发性腔隙性病变与大面积的梗死病变以及动脉粥样硬化,常常伴有脑萎缩与脑室扩大的病理改变;脑梗死可发为多个病灶或者多个病灶,坏死组织液化后即被正常的脑组织吸收,从而形成了空隙,镜下可见胶质细胞增生;目前大多数学者倾向于白质与灰质的深部小血管病变是形成VD的主要病理原因。
临床表现:AD与VD两者都伴有认知功能障碍,其中AD以记忆障碍为主,发展具有明显的阶段性,并以颞叶、顶叶的退行性病变为主,早期大多表现为记忆障碍、语言理解障碍、顶叶失用所致的动作技巧下降、面容失认、阅读理解能力下降、视空间能力下降等,随着病变进一步的发展,出现前额叶受损所致的执行能力下降,其起病一般比较隐蔽,患者的发病年龄都偏大,病情的进展比较缓慢;而VD的表现在临床上因不同的病因与不同的病灶所表达出的症状不尽相同,记忆功能障碍在临床上可有可无,一般VD呈急性或者亚急性起病,患者发病的年龄也较AD相对偏小。
影像学检查:AD的MRI显示多为海马与颞叶、顶叶的皮质弥漫性萎缩,CT检查可显示脑室扩大与脑萎缩;而VD的MRI上的主要改变则为不同的病变血管所支配的相应脑组织的坏死,从而显示为相应部位的长T1与T2,脑部CT可回示不同部位的梗死灶以及白质疏松,表现为相应部位的低密度影。
实验室检查:AD患者早期发病时,其脑脊液中Tau蛋白以及静脉血中的Aβ1-42出现明显的升高;而VD患者在早期发病时,脑脊液中的Tau与静脉血中的Aβ1-42变化不明显。
诊断方面:AD的诊断目前主要依据临床表现和一定的辅助检查,诊断标准有《美国精神障碍诊断统计手册》与NINCDS-ADRDA两种诊断标准,在AD诊断标准的发展中都强调了客观证据的重要性,如分子生物学指标、影像学相应的改变以及基因水平的检测。VD的诊断标准各种各样,临床上采用的主要有NINDS-AIREN、美国加州的ADDTC、WHO疾病分类的ICD-10、美国精神疾病统计和诊断手册的DSM-IV等诊断标准。
因此,老年痴呆症(AD)与血管性痴呆(VD)是完全不同的两个概念,是两种完全不同的疾病,原专利申请并未涉及本复方对老年痴呆症(AD)的防治作用。
针对AD发病机理,目前市场上治疗老年痴呆症的药物主要有抑制Aβ形成和沉积的药物和胆碱酯酶抑制剂两大类,其次为谷氨酸受体拮抗剂、钙离子拮抗剂、清除自由基剂及抗氧化性药物、***等辅助性治疗药物,上述药物都只能部分缓解症状,存在治疗局限性,不能从整体上治疗疾病,且都有一定的毒副作用,多年来对抗老年痴呆症药物研发与临床使用经验使国内外研究人员均认识到,对AD的治疗需要做到早期诊断和多靶标治疗,我国传统的中医药由于具有多靶点、多途径的作用特点而日益引起研究人员的关注。
本复方正具备上述特点。本复方钩藤中钩藤总碱、银杏叶中银杏内酯、何首乌中二苯乙烯苷、丹参中丹参酮和隐丹参酮、杜仲中京尼平苷都被证实对AD具有良好的防治效果。如LeBarsP等研究发现,服用银杏叶提取物6个月后,对AD轻、中度患者的症状有缓解,且无明显不良反应;楚晋、叶翠飞等研究发现,二苯乙烯苷可降低β-淀粉样肽致痴呆模型小鼠脑皮层白细胞介素-6含量,升高海马和皮层胆碱乙酰转移酶及乙酰胆碱酯酶的活性,增加D-半乳糖致脑老化小鼠海马CA1区神经生长因子和神经营养因子-3的表达,减轻神经元退行性变化的程度,从而达到防治阿茨海默病的作用;Zhang等研究发现隐丹参酮可逆转由谷氨酸诱导的神经毒性,增加乳酸脱氢酶的释放和神经DNA的聚集,并且改变Bcl-2家族蛋白的表达而起神经保护作用,其能阻断PI3K的抑制剂LY294002使PI3K/Akt通路激活而保护大脑皮层神经;YuXY研究认为AD病人的脑内组织一般均会出现氨浓度水平不正常地升高,而隐丹参酮可通过血脑屏障而降低脑组织中的氨浓度从而用于包括AD在内的许多神经退行性疾病;Matsumi等对体外培养的海马神经元细胞研究证实,20umol/L与40umol/L的京尼平均能明显抑制Aβ引起的细胞毒性反应,并呈量效依赖性,从而保护易感细胞,由于京尼平可透过靶细胞膜,直接保护海马神经元免受Aβ的危害,京尼平还可拮抗创伤和东莨菪碱引起的小鼠记忆障碍,5mg/L的京尼平可诱导PC12h细胞轴突生长,其对PC12h细胞的神经营养作用机制可能是通过提高神经元型NO合酶活性,使NO生成增加从而激发有丝***原蛋白激酶(MAPK)级联反应的发生;近来研究表明,京尼平可能通过NO-cGMP-PKG信号通路传导使细胞外信号调节激酶磷酸化从而激发MAPR级联反应起作用;黄厚才等通过研究钩藤散对慢性铝中毒所致老年性痴呆小鼠模型自由基、抗氧化酶的的影响及作用机制,证明钩藤散能提高小鼠脑指数,降低死亡率,保持体重处于正常状况,增强抗氧化能力,抑制MAO-B活性,加强清除脂质过氧化物及其代谢废物的作用,减少LDH的漏出,维持NO于正常水平,从而保护细胞,抵抗痴呆。上述成分正是本复方中的主要有效成分,且每种成分对老年痴呆症的作用有着不尽相同的途径和靶点,多成分多靶点防治老年痴呆症正是本复方的特点,将其开发成防治老年痴呆症的药物具有现实意义。
发明内容:
本发明的目的在于提供一种用于防治老年痴呆症的中成药。
本发明的另一目的是提供一种用于防治老年痴呆症、并能提高脑动脉硬化症治疗效果的中成药的制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
一种中药复方的制备方法及在防治老年痴呆症中的应用,其特征在于其处方药材按重量份计为:银杏叶180份、制何首乌180份、女贞子90份、丹参90份、杜仲90份、川牛膝90份、钩藤60份。
一种中药复方的制备方法,其特征在于它包括下列步骤:
(1)取处方重量配比中的银杏叶、女贞子、丹参、钩藤加30~96%乙醇加热回流提取1~4次,加乙醇量为药材重量的3~18倍,每次回流时间为0.5~5小时,提取液回收乙醇并浓缩,得浸膏A;
(2)取处方重量配比中的制何首乌、杜仲、川牛膝加水加热煎煮提取1~4次,加水量为药材重量3~20倍,每次煎煮时间为0.5~4小时,煎煮液浓缩后加乙醇至含醇量达30~90%,常温或冷藏放置6~56小时使沉淀,滤取上清液减压回收乙醇并浓缩,得浸膏B;
(3)浸膏A和浸膏B合并干燥或分别单独进行干燥,得干浸膏,将干浸膏粉碎,得干浸膏粉;
(4)将(3)所得干浸膏粉加入药剂学上可接受的辅料及常规制剂方法制成硬胶囊剂、软胶囊剂、片剂、颗粒剂。
(5)原料药中的银杏叶也可以直接以市场上出售的银杏叶提取物用于制剂,银杏叶提取物的重量份为银杏叶重量份的0.5%~20%。
(6)制备方法中所述浓缩为减压浓缩、薄膜浓缩或真空薄膜浓缩中的一种;所述浸膏干燥为常压干燥、减压干燥、喷雾干燥或沸腾干燥中的一种。
以下采用本发明实施例1制备的药物(简称新工艺),以及以公开号CN1596960A专利申请所公开的制备工艺制备的药物(简称原工艺),通过两种药物活性成分含量的比较以及药效学实验研究证实本发明的有益效果。
1、两种药物活性成分的比较
分取银杏叶180g、制何首乌180g、女贞子90g、丹参90g、杜仲90g、川牛膝90g、钩藤60g,两份,分别按原工艺及新工艺提取并以适当方法检验:
(1)原工艺:取银杏叶、女贞子、丹参三味用70%的乙醇加热提取三次,第一次加1500ml,提取2小时,第二次加1200ml,提取1.5小时,第三次加1200ml,提取1小时,合并提取液,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,浓缩备用。醇提取后三味药材的药渣与制何首乌、杜仲、川牛膝、钩藤等四味,加水煎煮两次,第一次加水2400ml,第二次加水1800ml,每次2小时,合并煎液,滤过,滤液浓缩至相对密度为1.12(60~65℃)的清膏,清膏加乙醇使含醇量达60%,搅匀,静置,滤过,滤液减压回收乙醇至无乙醇味,与银杏叶、女贞子、丹参醇提浓缩液合并,继续浓缩至相对密度1.30(60~65℃),真空干燥,粉碎,得干浸膏粉127.3g。
(2)新工艺:取银杏叶、女贞子、丹参、钩藤四味加70%乙醇3360ml加热回流提取2次,每次1.5小时,提取液滤过,滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.30(60~65℃),得浸膏A;制何首乌、杜仲、川牛膝三味加水2880ml加热煎煮提取2次,每次1.5小时,煎煮液滤过,滤液浓缩至相对密度为1.12(60~65℃)的清膏,清膏加乙醇使含醇量达60%,搅匀,静置,滤过,滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度1.30(60~65℃),得浸膏B;合并浸膏A和浸膏B,真空干燥,得干浸膏,粉碎,得干浸膏粉97.5g。
(3)分取两种干浸膏粉,分别参照《中国药典》2010版、2005版一部各药材项下以及相关文献含量测定方法进行各活性成分的含量测定。结果:新工艺与原工艺所得活性物质在种类和含量上都有着实际差异:原工艺提取物中无法检测出钩藤碱,异钩藤碱含量也非常低微,其提取转移率仅为7.45%;银杏内酯、二苯乙烯苷等活性成份含量大相径庭,齐墩果酸、丹酚酸B含量也存大较大差异;新工艺活性成分转移率大为提高,而总固体物收率比原工艺所得固体物收率降低30.56%,活性成分纯度更高。因此按两种不同工艺提取制备的药物,实际是两种不同的药物,其活性成分组成、含量、比例都不同。两种工艺活性成分比较如表1所示:
表1 新工艺与原工艺活性成分的变化
2、治疗动脉硬化症的药效学比较研究
本复方原用途主要为脑动脉硬化症的防治。脑动脉硬化和全身各处的动脉粥样硬化大体相同,主要改变是动脉内膜深层的脂肪变性和胆固醇沉积,形成粥样硬化斑块及各种继发病变,发病机理极为复杂。实验采用高血压合并高血脂方法建立大鼠脑动脉硬化症模型,通过观察两种不同工艺制造的药物对脑动脉硬化症动物的脑指数、脑含水量、脑血管及脑组织病理形态学的变化来说明新工艺对于提高本复方治疗动脉硬化症的有益效果。
取体重200±20g清洁级SD大鼠100只,随机分为假手术对照组,溶剂对照组、原工艺组、新工艺组四组,每组25只。大鼠禁食(不禁水)12h,以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,假手术对照组行双侧肾动脉分离术,不狭窄,喂常用饲料;其它三组行双侧肾主动脉狭窄手术,使其狭窄约3/4,造成大鼠肾性高血压模型,并在手术1周后,灌胃给予温热至35℃的高脂乳剂10mL/kg(含7%胆固醇、15%猪油、2%胆酸钠和1%丙基硫氧嘧啶),每天1次,共14周,制成高血压合并高血脂的脑动脉硬化模型。
手术7周后,原工艺组与新工艺组均按2.44g生药/kg灌胃给药:分取新工艺、原工艺药物活性成分比较时所制得的提取物,分别添加适量可溶性淀粉制取含8g生药/g的药物粉末,分别按药物粉末0.305g/kg灌胃给药(相当于2.44g生药/kg),临用时以蒸馏水配成混悬液;假手术组与溶剂对照组灌胃给予等量蒸馏水。连续给药8周后观察大鼠行为、脑水肿、脑梗塞、组织形态学的变化,对数据进行显著性检验。
大鼠行为变化参考ZeaLonga的5分制评分标准进行行为评分:0分,正常,无异常症状;1分,不能完全伸展对侧前爪;2分,向外侧转圈;3分,向对侧倾倒;4分,不能自发行走,意识丧失。然后快速断头取鼠大脑,一部分(每组10只)分别称左右脑半球湿重,置160℃烤箱内24小时后称干重,按以下公式计算脑组织含水量:脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%;一部分(每组10只)在前连合平面切下厚约2mm冠状脑片,立刻置于2%TTC溶液中,37℃孵育30分钟,梗塞区呈现白色,非梗塞区呈现红色,用求积仪(C63图象分析***)测出各区面积,并计算梗塞区占全脑的百分比;另一部分(每组2~5只)作组织形态学观察:脑组织经固定后,冠状切取大脑,常规脱水,石蜡包埋制片,HE染色,光镜检验。
试验结果:(1)对大鼠行为的影响:假手术组大鼠无异常症状,行为评分为0;溶剂对照组,出现不能完全伸展对侧前爪或向外侧转圈或向对侧倾倒的神经损伤症状,行为评分为2.4±0.7;原工艺组药物可显著降低大鼠行为评分,行为评分为1.2±0.59,与溶剂对照组比较有显著性差异(P<0.001);新工艺组行为评分为0.65±0.41,显著低于溶剂对照组和原工艺组(P<0.001,P<0.05)。实验结果表明:原工艺组与新工艺组均可显著改善大鼠行为质量,同等生药剂量的新工艺组改善效果明显优于原工艺组,实验结果见表2。
注:与溶剂对照组比较***P<0.001,与原工艺组比较#P<0.05
(2)对脑组织含水量的影响:溶剂对照组的脑组织含水量非常显著高于假手术组(P<0.001),实验动物模型造型成功;原工艺组的脑组织含水量低于溶剂对照组(P<0.05);新工艺组的脑组织含水量显著低于溶剂对照组(P<0.001),低于原工艺组(P<0.05),与假手术组无显著性差异(P>0.05)。实验结果表明:原工艺组与新工艺组药物均可降低脑动物硬化大鼠脑组织含水量,减轻脑半球水肿程度,同等生药剂量的新工艺组效果优于原工艺组(P<0.05)。结果见表3。
注:与假手术组比较#P<0.05,###P<0.001;与溶剂对照组(模型组)比较*P<0.05,***P<0.001;与原工艺组比较△P<0.05。
(3)对脑梗塞体积的影响:假手术组脑组织无梗塞,溶剂对照组脑组织出现梗塞现象,梗塞体积占全脑的29.55%;与溶剂对照组相比,原工艺组可有效缩小脑组织梗塞面积(P<0.05),新工艺组可显著缩小脑组织梗塞体积(P<0.001),与溶剂对照组相比分别下降27.14%、48.83%。实验结果表明,同等生药剂量下新工艺组比原工艺组具有更好的脑梗塞治疗作用(P<0.01)。实验结果见表4。
注:与溶剂对照组比较,***P<0.001;与原工艺组比较比较,##P<0.01
(4)对组织形态学的影响:与假手术组比较,溶剂对照组大鼠的脑组织可见多处大面积局灶性组织变性或坏死,多数神经节出现明显的变性或坏死,脑组织中的动脉血管内膜的内皮细胞呈广泛性变性、坏死、脱落,管壁可见纤维帽样堆积物芽状突出和增生,表明脑组织缺血性病变和脑血管动脉硬化症状形成。与溶剂对照组比较,两个给药组的上述病变情况明显减轻,其中原工艺组少数神经节变性或坏死,神经细胞肿胀变圆,尼氏体减少、部分空泡变性;新工艺组出现胶质细胞增生(修复)、胶质小结形成、周围基本正常,大锥体细胞无变性,脑组织局灶性组织变性面积和数目与原工艺组比较明显减少或消失,神经节变性明显减少,血管内皮基本完整,管壁的纤维帽样增生也明显减少,血管内堆积物芽状突出和增生基本消失,表明用药后明显抑制了脑组织缺血性病变和脑血管动脉硬化症状的形成,且新工艺组脑脑组织缺血性病变和脑血管动脉硬化症状显著比原工艺组轻。
3、改善老年血管性精神退化症状的药效学比较研究
本复方可用于脑动脉硬化所致智力减退、血管性痴呆等老年血管性精神退化疾病的防治,实验以甲磺酸双氢麦角碱为阳性对照药,通过测定实验老鼠单胺氧化酶(MAO)活性、氧自由基(SOD)、NO水平和NOS活性,对两种工艺制备的药物对于改善这些症状的疗效进行比较研究。
取体重200±20g的SD大鼠50只,随机分为空白组、模型组、新工艺组、原工艺组、甲磺酸双氢麦角碱组(简称阳性对照组)5组。除空白组外,其它四组用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3ml/kg),永久性结扎双侧颈总动脉建立模型。
实验方法:除空白组和模型组外,各它三组大鼠在造模的同时给药,分别每日灌胃给予新工艺药物混悬液(2.44g生药/kg)、原工艺组药物混悬液(2.44g生药/kg)、甲磺酸双氢麦角碱0.5mg/kg,连续30天。实验结束测定脑组织MDA含量和SOD活性:取小鼠脑组织0.1ml研磨,再加0.9ml生理盐水充分研磨制成匀浆,4℃离心4500rpm15min,取上清液,分别采用硫代巴比妥酸法与黄嘌呤氧化酶法进行测定。同时测定NO、NOS含量:取小鼠脑组织1g与生理盐水按0.1g∶1ml比例匀浆,3000rpm离心10分钟,取上清液置于-20℃冰箱待测,参照试剂盒说明书严格进行。
实验结果:①三个用药组药物能够抑制MAO活性(与模型组比较P<0.001),减少单胺类神经递质的分解,促进学***和NOS活性持续性增高(P<0.001),提示NO的神经毒性参与了VD的形成,三组药物治疗后小鼠大脑皮层组织中的NOS的活性降低,使NO生成和释放含量明显减少,新工艺组药物作用优于原工艺组(P<0.05),与阳性对照组无显著性差异(P>0.05)。
单胺氧化酶(MAO)活性随年龄增长而增加,并引起脑内儿茶酚胺含量变化,促进生理活动失调,它与学习和注意力的关系极为密切,衰老及VD患者组织中MAO活性升高,氧化分解单胺类神经递质,影响学习和注意力,是老年神经变性疾病原因之一;氧自由基(SOD)在VD的病理变化过程中起着重要作用;一氧化氮(NO)是一种气体物质,其结构简单而又极不稳定,易扩散,反应性强,生物半衰期短,在中枢神经中弥散于各脑区,具有调节脑血流、参与突触可塑性、神经元毒性及炎症性损害等多种作用,与学习、记忆密切相关。
实验结果表明:本复方药物对于老年化精神退化、急慢性血管病后遗功能、智力减退、血管性痴呆具有良好的防治作用,新工艺组药物可有效提高本复方对上述症状的改善作用。如表5所示:
注:与空白组比较:***P<0.001;与模型组比较:#P<0.05;##P<0.01;###P<0.001;与阳性对照组比较:△P<0.05;与原工艺组比较:@P<0.05。
4、防治老年痴呆症的药效学实验研究
本发明工艺技术充分提取利用本复方药材中对于老年痴呆症具有防治作用的钩藤碱、异钩藤碱、二苯乙烯苷、丹参酮、异丹参酮、银杏内酯、京尼平等脂溶性高、易透过血脑屏障的活性成分,多靶点多途径地防治老年痴呆症,其作用通过D-半乳糖所致AD小鼠动物药效学实验得到证实。
D-半乳糖是目前公认的老年痴呆症(AD)小鼠造模方法,D-半乳糖可以诱发神经元退行性病变,造成亚急性痴呆模型;而β淀粉样蛋白(β-amyloidprotein,Aβ)的聚集和神经原纤维缠结是AD的主要病理变化,也是老年斑的核心成分,Aβ的聚集可以导致氧自由基的升高、炎症反应、细胞凋亡和神经***退行性病变,Aβ在老年痴呆的发病过程中起到至关重要的起始及枢纽作用。目前抑制Aβ的生成是治疗AD的主要方案。本研究以注射给予D-半乳糖构建AD小鼠模型,并通过小鼠水迷宫实验及测定小鼠脑组织Aβ含量变化来评价本专利制备方法制备的药物对AD的防治作用。
取鼠龄2~3个月、体重32±2g的昆明种小鼠60只,雌雄各半,按体重随机分为防治空白对照组、治疗空白对照组、防治模型对照组、治疗模型对照组、防治组、治疗组6组,每组10只小鼠;防治空白对照组及治疗空白对照组均给予生理盐水,其余4组每日注射D-半乳糖(120mg/kg)+亚硝酸钠(90mg/kg),连续2个月,建立模型。防治组在建模的同时灌胃给予新工艺组药物(2.44g生药/kg),每日一次,30天后取防治空白对照组、防治模型对照组与防治组小鼠进行小鼠水迷宫实验并以放射免疫法测定小鼠脑组织Aβ含量。其余3组动物在建模后,治疗空白对照组和治疗模型对照组给予生理盐水,治疗组按(2.44g生药/kg)剂量,灌胃给予新工艺组药物,每日一次,连续30天后进行小鼠水迷宫实验并以放射免疫法测定小鼠脑组织Aβ含量。
小鼠水迷宫实验:迷宫圆形直径80cm,高44cm,安全台直径8cm,高20cm,按照小鼠Morris水迷宫装置及跟踪***仪器说明书完成定向游泳实验,在安全台上停留超过2s为成功,每天训练2次,共4天,从入水到到达安全台的时间为逃避潜伏期,记录动物游泳轨迹。
放射免疫法测定小鼠脑组织Aβ含量:实验结束,断颈处死小鼠,分离脑组织,制备单细胞悬液,裂解细胞按照Aβ放射免疫试剂盒的说明操作检测各处理组中Aβ的含量。
对实验数据进行t检验,结果:①防治模型对照组与防治空白对照组对照比较,防治模型组的逃避潜伏时间出现显著性的延长(P<0.001),平台跨越次数极显著性减少(P<0.001),小鼠脑组织中Aβ的表达水平显著升高(P<0.001);防治组与防治模型组比较,小鼠的逃避潜伏时间和平台跨越次数均得到显著性的改善(P<0.01;P<0.01),脑组织中Aβ的表达水平也出现明显的下降(P<0.001)。②治疗模型对照组与治疗空白对照组对照比较,治疗模型组的逃避潜伏时间出现极显著性的延长(P<0.001),平台跨越次数极显著性的减少(P<0.001),小鼠脑组织中Aβ的表达水平显著升高(P<0.001);治疗组与治疗模型组比较,小鼠的逃避潜伏时间和平台跨越次数得到显著性的改善(P<0.05;P<0.05),脑组织中Aβ的表达水平也出现明显的下降(P<0.001)。结果表明本品可显著降低小鼠脑组织Aβ含量,对小鼠AD具有良好的防治作用。见表6、表7。
表6 防治组小鼠水迷宫实验及Aβ表达的影响结果比较
注:与空白对照组比较#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;与模型对照组比较*P<0.05,**P<0.01;***P<0.001。
表7 治疗组小鼠水迷宫实验及Aβ表达的影响结果比较
注:与空白对照组比较#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;与模型对照组比较*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
具体实施方式:
下面通过实施例来进一步阐述本发明药物的制备方法。但本发明不局限于这些实施例。
实施例1本复方硬胶囊剂的制备
取银杏叶180份、女贞子90份、丹参90份、钩藤60份加入药材原料重量8倍量、含醇量为70%的乙醇,加热回流提取2次,每次1.5小时,合并提取液,滤过,滤液回收乙醇并减压浓缩至相对密度1.20~1.35(60~65℃),得浸膏A。
取制何首乌180份、杜仲90份、川牛膝90份,加入药材原料重量8倍量的水加热煎煮提取2次,每次1.5小时,合并提取液,滤过,滤液减压浓缩至相对密度1.10~1.25(60~65℃)的浓缩液;浓缩液加乙醇使含醇量达60%,搅匀,静置8~24小时,滤过,滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度1.20~1.35(60~65℃),得浸膏B。
合并浸膏A与浸膏B,真空干燥,得干浸膏,取干浸膏粉碎成细粉,加入适量淀粉,混匀,以乙醇制成颗粒,干燥,20目筛整粒,加入适量二氧化硅及硬脂酸镁或滑石粉,混匀,充填胶囊,即得。
实施例2本复方颗粒剂的制备
取银杏叶180份、女贞子90份、丹参90份、钩藤60份加入药材原料重量6倍量、含醇量为85%的乙醇,加热回流提取2次,每次2小时,合并提取液,滤过,滤液回收乙醇并真空薄膜浓缩至相对密度1.10~1.20(60~65℃)的浸膏A。
取制何首乌180份、杜仲90份、川牛膝90份,加入药材原料重量10倍量的水加热煎煮提取3次,每次1小时,合并提取液,滤过,滤液真空薄膜浓缩至相对密度1.08~1.25的浓缩液;浓缩液加乙醇使含醇量达70%,搅匀,冷藏12~36小时,滤过,滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度1.10~1.20(60~65℃)的浸膏B。
合并浸膏A和浸膏B,喷雾干燥,得浸膏粉,取浸膏粉加入适量可溶性淀粉、甜菊糖,混匀,制成颗粒,干燥,16目筛整粒,分装,即得。
实施例3本复方片剂的制备
取银杏叶180份、女贞子90份、丹参90份、钩藤60份加入药材原料重量12倍量、含醇量为60%的乙醇,加热回流提取3次,每次1小时,合并提取液,滤过,滤液回收乙醇并薄膜浓缩至相对密度1.15~1.35(60~65℃)的稠浸膏,带式真空干燥,得干浸膏,干浸膏粉碎成细粉,得干浸膏粉A。
取制何首乌180份、杜仲90份、川牛膝90份,加入药材原料重量6倍量的水加热煎煮提取3次,每次1.5小时,合并提取液,滤过,滤液薄膜浓缩至相对密度1.10~1.25(60~65℃)的浓缩液;浓缩液加乙醇使含醇量达80%,搅匀,静置8~24小时,滤过,滤液减压回收乙醇并薄膜浓缩至相对密度1.1~1.35(60~65℃)的稠浸膏,带式真空干燥,得干浸膏,干浸膏粉碎成细粉,得干浸膏粉B。
取浸膏粉A与浸膏粉B,加入适量淀粉,混匀,制成颗粒,干燥,整粒,加入适量硬脂酸镁或滑石粉,压片,包衣,分装即得。
实施例4本复方软胶囊剂的制备
取女贞子90份、丹参90份、钩藤60份加入药材原料重量6倍量的乙醇,加热回流提取2次,每次3小时,合并提取液,滤过,滤液回收乙醇,浸膏真空干燥,得干浸膏,干浸膏粉碎成细粉,得浸膏粉A。
取制何首乌180份、杜仲90份、川牛膝90份,加入药材原料重量8倍量的水加热煎煮提取2次,每次2小时,合并提取液,滤过,滤液减压浓缩至相对密度1.10~1.25(60~65℃)的浓缩液;浓缩液加乙醇使含醇量达85%,搅匀,冷藏8~24小时,抽取上清液,上清液减压回收乙醇并浓缩至相对密度1.1~1.35(60~65℃)的稠浸膏,真空干燥,得干浸膏,干浸膏粉碎成细粉,得浸膏粉B。
取浸膏粉A、浸膏粉B和银杏叶提取物1.6份,混匀,加浸膏粉1.2倍量的大豆油和0.02倍量的蜂蜡,均质,混匀,灌装,压制成软胶囊,18~30℃干燥定型,用乙醇洗去软胶囊外表油层,18~30℃干燥,取出,即得。