CN1040203A

CN1040203A - 抗聚集肽

Info

Publication number: CN1040203A
Application number: CN 89104419
Authority: CN
Inventors: 法迪亚·埃尔-费海尔·阿里; 詹姆斯·马丁·沙曼伦; 罗纳德·约翰·谢布斯基
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1988-05-09
Filing date: 1989-05-09
Publication date: 1990-03-07
Also published as: ZA893375B

Abstract

本发明涉及能有效地抑制血小板聚集的化合物，能产生如此作用的药物组合物，抑制哺乳动物形成血小板聚集和血块的方法以及抑制在纤维蛋白溶解疗法后的血管的再阻塞的方法。

Description

本发明涉及抑制血小板聚集的新型肽，含有该肽的药剂组合物，以及使用该肽的方法。特别是发明了将本发明的肽与血纤维蛋白溶解剂结合使用的方法。

血栓是引发凝结级联反应过程的结果，它由绊在血纤维蛋白聚合网上的血小板聚集体所组成。该过程通常由于组织损伤而引发，并产生减慢或阻止管中血液流动的影响。与组织损伤没有直接关系的病原因子，如动脉粥样化血小板，血组织的炎症（静脉炎）和败血症，也可引发血栓的形成。在某些情况下，血栓的不正常形成，随之血液流动减慢，可能产生病态的后果，如中风、肺栓塞和心脏病。

凝结级联反应是一个多因子过程，在该过程的倒数第二步骤中产生蛋白水解酶，凝血酶，这些酶在两个特别的Arg-Gly基上水解血纤维蛋白原形成两个更小的纤维蛋白肽和纤维蛋白单体。通过除去纤维蛋白肽，两个互补的结合部位暴露出来，每个纤维蛋白单体都能结合两个其它的单体而形成聚合网。血小板同样被凝血酶激活，并能结合血纤维蛋白原和纤维蛋白单体。通过释放其它的聚集激活剂，这些血小板进一步放大该过程。由于纤维蛋白的聚合，血液中聚集的沉淀物则形成所谓的软凝块。纤维蛋白稳定因子（FSF）是一种同样由凝血酶激活的酶，它催化共价交联的形成而形成最终的硬凝块。

血小板在血栓形成中起主要作用。血栓形成主要通过称为GPIIb-IIIa的血小板接受体复合物的传递。Von Willebrand因子（一种血浆蛋白）和血纤维蛋白原能够结合，并在相邻的血小板上交联GpIIb-IIIa接受体，因此影响血小板的聚集。纤维结合素，Vitronectin，和血栓凝血酶均为已被证明能与GPIIb-IIIa结合的蛋白质，在血浆中发现纤维结合素作为一种细胞内基质中结构蛋白质，在结构蛋白质和GPIIb-IIIa之间的结合可能起着引起血小板粘接在损伤的组织壁上。

纤维结合素和Vitronectin是结构蛋白质类中的几种，该结构蛋白质能扩大细胞附着功能的范围，这些蛋白质中的某些蛋白质（特别是纤维结合素）的细胞附着部位中的氨基酸序列已经阐明了作为引发结合所必需的结构部分的序列为Arg-Gly-Asp（单字母氨基酸密码为RGD）。参见Ruoslahti等，Science，238，491-7（1987）。现已发现具有细胞附着性质的多肽能由人的血浆纤维结合素制备（Pierschbacher等，美国专利4，589，881（1986）和Rouslahti等，Wo 84/00540（1984））。当采用溶液化形式固定固体支撑物和抑制这些细胞对纤维结合素的附着时，对于正常的鼠肾（NRK）来说，同样包含有这种顺序的低肽已表明具有细胞附着性能，参见Rouslahti等，美国专利4，578，079（1986）和Rouslahti等，美国专利4，614，517（1986）。

为了使GPIIb-IIIa结合到血纤维蛋白原上，纤维结合素和Von Willebrand因子上血小板的激活作用是必需的。尽管准确的机制还不清楚，但是血小板的ADP或凝血酶的刺激作用似乎改变接受体复合物和促进结合。对于血小板聚集来说这种接受体的重要性已被采用掩蔽该接受体的方法所证实。于是，Coller等（Blood，66，1456-9（1985））证明了这种复合物的抗体能抑制在狗体上用ADP诱导产生的血小板的聚集。Nievelstein等（Thromb and Hemostasvs，58，2133（1987））报告了-RGDS-肽能抑制诱导血小板聚集和粘接成纤维结合素的凝血酶，并可通过GPIIb-IIIa复合物发生相互作用。Zimmerman等，美国专利4，683，291（1987），已经发现含有Arg和Lys及一种-RGD-顺序的肽能抑制形成血小板与血纤维蛋白原的结合和抑制血小板的聚集。

现在的抗血栓形成疗法是使用调节血小板或内皮细胞花生四烯酸盐-***素体系的制剂，如前列环素类似物，环裂氧合酶抑制剂，凝血恶烷合成物抑制剂和凝血恶烷接受体拮抗物，及抗凝血剂，如肝素，这些制剂抑制血小板聚集的两个能独立阶段的一个或二个。反映化学刺激素，如ADP（腺苷二磷酸），胶原蛋白，肾上腺素或凝血酶的初次阶段引起血小板初步激活。接着进行第二阶段，该阶段由血小板自身引发，其特征在于凝血恶烷A₂（TxA₂）的合成和从血小板贮存粒剂中释放出另外的ADP。这些介质进一步激活其它的血小板。

前列环素，也称为***素I₂（PGI₂），是由排列在血液组织壁上的内皮细胞自然形成的。PGI₂提高了血小板的CAMP，这导致GPIIb-IIIa接受体调节能力降低，因此抑制了无伤血组织中传递血小板聚集和血小板激活的血纤维蛋白原，PGI₂和稳定的PGI₂类似物抑制血小板聚集的初级阶段和第二阶段。然而，如此类似物的使用与血压的不良变化相联系，参见Aiken等，Prostaglandins，19，629-43（1980）。

环裂氧合酶为负责前裂腺素的合成酶，如PGI₂和PGH₂。PGH₂通过凝血恶烷合成酶进一步转变成TxA₂。TxA₂为一种血小板聚集的强激活剂。环裂氧合酶抑制剂和凝血恶烷合成酶抑制剂起着阻断TxA₂生成的作用，而通过结合TxA₂接受体，TxA₂拮抗物阻断TxA₂的作用。所有这些疗法仅作用于血小板激活作用的第二阶段。由于环裂氧合酶抑制剂抑制PGI₂的合成，环裂氧合酶抑制剂存在另外的缺点，它稍微排除PGI₂生成的正抗聚集作用。环裂氧合酶抑制剂的使用与溃疡病有关。

肝素是一种与凝血酶原结合的粘多糖，且在凝结级联反应中有一定的其它因子。它通过凝血酶阻止血纤维蛋白原的激活和通过凝血酶阻止GPIIb-IIIa接受体的激活而产生作用。这仅抑制血小板聚集的初始阶段，通过其它方式如胶原蛋白，ADP和肾上腺素对血小板的激活的影响很小。

因此环裂氧合酶抑制剂***素类似物和肝素都能通过间接抑制血小板或纤维蛋白原激活的初始阶段和第二阶段而非直接抑制血小板聚集。因此需要选择能直接消除血小板聚集的治疗药物，而不管它影响血小板激活的初始阶段和第二阶段。

动脉闭塞和深静脉血栓形成的疗法的最近进展是使用纤维蛋白溶解剂溶解血栓或栓子以便恢复或改善血液流动。纤维蛋白溶解剂为蛋白质水解酶，它在特别部位水解纤维蛋白而***成纤维蛋白网，纤维蛋白***成低肽有增溶血栓或栓子的作用。在本公开文本中，组织血纤维蛋白溶酶原激活剂（tpA），尿激酶（UR）和前尿激酶（PUK）（为人体源）及链激酶（SK）（为细菌源）作为纤维蛋白溶解剂。在体内它们的作用是激活在血液中的蛋白质水解的血纤维蛋白溶酶原而形成血纤维蛋白溶酶，血纤维蛋白溶酶实际上是纤维蛋白溶解剂。当然，tpA和SK普通用于纤维蛋白溶解疗法，然而如此疗法的复发问题是由于第二阶段的血栓的形成而血管再阻塞。

纤维蛋白溶解疗法普遍用于在形成血栓的血管中再次建立流动。这对于经常马上引起阻滞的血栓的溶解来说是有用的，然而，纤维蛋白溶解疗法不能使引起血栓引发的因子逆转。由于这种原因，抗凝血剂（如肝素）常用于防止再阻塞。事实上，甚至在再次灌注了高剂量的肝素后，动脉高度狭窄的病人还是处于再次形成血栓的极端危险之中，参见Gold等，Circ，73，347-52（1986）。另外，SK和tpA的使用与血小板聚集过多有关，参见Ohlstein等，Thromb Res.，4，575-85（1987）。用高剂量tpA治疗与***出血有关，该疗法没有推荐用于防止再阻塞，因此，在纤维蛋白溶解疗法之后，需要有一种防止再次形成血栓的方法。

最近的TxA₂拮抗剂表明有希望在再次灌注后抑制再阻塞和降低纤维蛋白溶解所需的tPA剂量，参见未审定的美国专利申请号917，122。Yasuda等（Clin.Res.，34，2（1986））已经证明在用TPA溶解血栓后由纤维蛋白富集血小板血栓的再阻塞可通过鼠对狗的GPIIb-IIIa单克隆抗体得到抑制。

本发明的目的是提供一种抑制血小板聚集和血栓形成的方法，该方法是使用结合在血小板GPIIb-IIIa接受体上的肽或多肽。用这种方法能抑制激活的血小板与Von Willebrand因子，纤维结合素和纤维蛋白原/纤维蛋白的结合能力。这种抗聚集活化方式是独特的，它不仅仅依赖于抑制聚集过程的刺激，而且它干扰众所周知的具有刺激的最后阶段。因为是通过非类似的方法进行另外的抗血栓形成/抗促凝，所以如此肽或多肽被称为“抗纤维变性”以区别于现在的机械和结构的方法。

本发明的一个方面为（Ⅰ）或（Ⅱ）式化合物或它们的药理可接受盐：

其中：

A为Arg，HArg，（Me₂）Arg，（Et₂）Arg，Ala，Gly，His，Abu或它们的α-R′取代衍生物，或Pro;

B为Arg，HArg，（Me₂）Arg，（Et₂）Arg或它们的α-R′取代衍生物。

C为一种从Tyr，（Alk）Tyr，Phe，（4′W）Phe，HPhe，Phg，Trp，His，Ser，（Alk）Ser，Thr，（Alk）Thr，Cys，（Alk）Cys，Pen，（Alk）Pen，Ala，Val，Nva，Met，Leu，Ile，Nle或Nal中选择出来的右旋或左旋氨基酸;

W为卤素或Alk;

Y为NR₁R₂或OR₃;

R₁和R₂彼此独立地为H，Alk或（CH₂）_PPh;

R₃为Alk，（CH₂）_PPh，当B为HArg，（Me₂）Arg;（Et₂）Arg）或Arg，HArg，（Me₂）Arg或（Et₂）Arg的α-R′取代衍生物时，R₃为H;

X为R₄R₅N;

R₄为H或Alk;

R₅为H，Alk，HCo，AlkCO，PhCH₂或Ph（CH₂）_qCO，

R′为Alk或PhCH₂;

q，m和n为0或1;以及

P为0，1，2或3。

（Ⅱ）

其中，

A′为一种从Arg，HArg，（Me₂）Arg，（Et₂）Arg，Ala，Gly，His，Abu，Lys或它的α-R′取代衍生物，或Pro中选择出来的右旋或左旋氨基酸;

B′为一种从Arg，HArg，（Me₂）Arg，（Et₂）Arg，Lys或它们的α-R′取代衍生物中选择出来的右旋或左旋氨基酸;

C′为一种从Tyr，（Alk）Tyr，Phe，（4′W）Phe，Hphe，Phg，Trp，His，Ser，（Alk）Ser，Thr，（Alk）Thr，（Alk）Cys，（Alk）Pen，Ala，Val，Nva，Met，Leu，Ile，Nle或Nal，或它们的α-R′取代衍生物中选择出来的右旋或左旋氨基酸;

W为卤素或Alk;

Y为NR₁R₂或OR₃;

R₁和R₂彼此独立地为H，Alk或（CH₂）_PPh;

R₃为Alk，（CH₂）_PPh，当B为HArg，（Me₂）Arg，（Et₂）Arg或Arg，HArg，（Me₂）Arg或（Et₂）Arg的α-R′取代衍生物时，R₃为H;

X为R₄R₅N或H;

R₄为H或Alk;

R₅为H，Alk，HCO，AlkCO，PhCH₂或Ph（CH₂）_qCO;

R′为Alk或PhCH₂;

Z₁为Cys，Pen或APmp的右旋或左旋异构体;

Z₂为Cys，Pen或Apmp的右旋或左旋异构体;

q，m和n独立地为0或1;以及

p为0，1，2或3。

本发明也为一种抑制血小板聚集和血块形成的药理可接受的组合物，该组合物由一种抗纤维变性肽和一种药用载体组成。

另外，本发明还涉及一种治疗哺乳动物血栓形成或栓塞及抑制哺乳动物血小板聚集或血块形成的方法，它包括内服有效剂量的式（Ⅰ）或式（Ⅱ）抗纤维变性肽。

本发明的化合物，以及可通过同样机理起作用的其它化合物在纤维蛋白溶解疗法中防止血栓形成也是特别有用的。因此，另一方面，本发明的目的是提供一种在血栓溶解后抑制哺乳动物的动脉或静脉的再阻塞的方法，它包括内服有效剂量的纤维蛋白溶解剂和抗纤维变性肽。结合已知的纤维蛋白溶解酶，如链激酶（SK），尿激酶（UK），前尿激酶（PUK）和组织血纤维蛋白溶酶原激活剂（tpA）和它们的变异体或突变体，上述的肽对抑制血栓的再次形成是有用的。另外，某些含有氨基酸序列-RGD-的其它肽和多肽也可用于本发明，特别是某些Von Willebrand因子，人血浆纤维蛋白原和人血浆纤维结合素的碎片或衍生物。

本发明也包括一种影响血栓溶解和再注入及抑制哺乳动物动脉或静脉再阻塞的药剂组合物，它包括药剂载体上的纤维蛋白溶解剂和抗纤维变性肽。

最后，本发明为实现血栓疗法而采用一套工具。它包括：在一个容器中纤维蛋白溶解剂，在第二个容器中抗纤维变性肽。

图1表明在体内肽AC-RGDS-NH₂对tpA促进人血块溶解没有影响，曲线表明4小时血块溶解的百分数为组织血纤维蛋白溶酶原激活剂（tpA）浓度增加的函数。方块表示在控制时期（EC₅₀＝31.5±9.9μg/ml）tpA（MT2N3）诱导溶解，圆圈表示在有tpA和1mM Ac-RGDS-NH₂（EC₅₀＝31.9±8.6μg/ml）存在下的溶解。

图2表明以0.1ml/min速度输入400mM AC-RGDS-NH₂抑制体内血小板聚集，血小板聚集/血栓形成由血液流动的减慢来表示。箭头表示输液的开始和结束。SL（解除振动）表明血栓的机械不沉淀。上面曲线（a）表明冠状动脉血压（mmHg）为时间的函数，并表明AC-RGDS-NH₂的加入对血压没有影响。中间曲线（b）表明阶段冠状血流（ml/min）的变化为时间的函数，并表明在加入了肽后抑制了血栓的形成。下面曲线（c）表明平均冠状血流（ml/min）为时间的函数，并表明在加入了肽后抑制血栓的形成。

图3表明在体内抑制用冠状血栓形成模型产生的血小板聚集所需剂量的关系。曲线表明平均冠状血液流动为时间的函数，箭头表示AC-RGDS-NH₂加入的开始和结束，血栓的形成通过血液流动的减慢来表示，SL（解除振动）表示血栓的机械不沉淀，X表示血栓自发溶解。上面曲线表示完全抑制了血栓形成（400mM，以0.052ml/min速度加入）。中间曲线表示血栓自发溶解的中等抑制（在0.026ml/min下400mM），下面曲线（C）表示延长时间至完全阻塞的部分抑制（在0.013ml/min下400mM），这需要血栓机械不沉淀。

现已发现某些肽能抑制血小板的聚集。如此肽被认为能与血小板上的接受体相互作用，特别是通过GPIIb-IIIa复合物，它能够结合在内源的结构蛋白质（如纤维结合素和Vitronectin）的广泛范围上。因此，血组织内膜的损伤，破裂或紊乱暴露出了细胞外基质隐蔽的结构蛋白质，能够证明血小板可通过GPIIb-IIIa接受体结合在组织壁上。此外，现已表明纤维蛋白原/纤维蛋白和Von Willebrand因子能与血小板上的GPIIb-IIIa接受体复合物发生相互作用。通过GPIIb-IIIa接受体的多价结合促进血小板的聚集，隐藏这些蛋白质的结合部位将干扰血小板接受体和纤维蛋白质，Von Willebranel因子及纤维结合素间粘着相互作用。纤维结合素的活性片断的分析表明了含氨基酸序列Arg-Gly-Asp（RGD）的纤维结合素的结合部位。此外，它还表明含有这种序列的肽能够抑制细胞对纤维结合素的附着，并抑制Von Willebrands因子和纤维蛋白原结合在血小板上。因此，天然存在多肽片断和这些片断的衍生物能抑制血小板聚集。单克隆抗体的F（ab′）₂片断（Coller等，Blood，66，1456-9（1985））和人血浆纤维结合素的肽片断（Rouslahti等，PCT WO 84/00540（1984）和Pierschbacher等，美国专利4，589，881（1986））能够与GPIIb-IIIa接受体结合。

本发明公开了由序列Gly-Asp构成的肽，该肽能与血小板GPIIb-IIIa接受体结合，因此能抑制血小板聚集。本发明的一个方面是通过选择合适的邻近氨基酸和在这种序列中取代Arg改变RGD序列的构象以便促进肽与血小板的结合。本发明的另一个方面是通过乙酰化或烷基化保护肽的末端氨和修改作为酰胺、取代酰胺或酯的末端羧基。这些修改增强了肽对蛋白质水解酶的稳定性和将它们从以前使用的增强细胞粘接的化合物中分辨出来（Rouslahti等，美国专利4，578，079（1986）和Rouslahti等，美国专利4，614，517（1986））和抑制血小板聚集（Zimmerman等，美国专利4，683，291（1987））。本发明的某些肽含有分子内二硫键，该键既能增强它们的代谢的稳定性又能增强它们的生物活性。

本发明的化合物为式（Ⅰ）和（Ⅱ）的三，四，五，六和七肽或其药理可接受的盐：

其中：

A为Arg，HArg，（Me₂）Arg，（Et₂）Arg，Ala，Gly，His，Abu或它的α-R′取代衍生物，或Pro;

B为Arg，HArg，（Me₂）Arg，（Et₂）Arg或它的α-R′取代衍生物;

C为从Tyr，（Alk）Tyr，Phe，（4′W）Phe，Hphe，Phg，Trp，His，Ser，（Alk）Ser，Thr，（Alk）Thr，Cys，（Alk）Cys，Pen，（Alk）Pen，Ala，Val，Nva，Met，Leu，Ile，Nle或Nal中选择出来的左旋或右旋氨基酸;

W为卤素或Alk;

Y为NR₁R₂或OR₃;

R₁和R₂为彼此独立的H，Alk或（CH₂）_PPh;

X为R₄R₅N;

R₄为H或Alk;

R₅为H，Alk，HCO，AlkCO，PhCH₂或Ph（CH₂）_qCO;

R′为Alk或PhCH₂;

q，m和n为0或1;以及

p为0，1，2或3。

合适的A为Gly或Arg，当m为1时，合适的n为0，

合适的B为HArg或Arg和HArg的α-R′取代衍生物，优选的B为MeArg，

合适的C为Ser，（Me）Ser，Thr，Tyr，Phe，Val或Nal。当n为1时，合适的m为0;

本发明的化合物也为式（Ⅱ）的五，六和七肽或其药理可接受的盐：

（Ⅱ）

其中：

B′为一种从Arg，HArg，（Me₂）Arg，（Et₂）Arg，Lys或它的α-R′取代衍生物中选择出来的右旋或左旋氨基酸;

C′为一种从Tyr，（Alk）Tyr，Phe，（4′W）Phe，HPhe，Phg，Trp，His，Ser，（Alk）Ser，Thr，（Alk）Thr，（Alk）Cys，（Alk）Pen，Ala，Val，Nva，Met，Leu，Ile，Nle或Nal，或它的α-R′取代衍生物中选择出来的右旋或左旋氨基酸;

W为卤素或Alk;

Y为NR₁R₂或OR₃;

R₁和R₂彼此独立地为H，Alk或（CH₂）_PPh;

X为R₄R₅N或H;

R₄为H或Alk;

R₅为H，Alk，HCO，AlkCO，PhCH₂或Ph（CH₂）_qCO;

R′为Alk或PhCH₂;

Z₁为Cys，Pen或APmp的右旋或左旋异构体;

Z₂为Cys，Pen或APmp的右旋或左旋异构体;

q，m和n独立地为0或1;以及

P为0，1，2或3。

合适的A′为Gly或Arg，当m为1时，n优选为0。

合适的B′为HArg或Arg及HArg的α-R′取代衍生物，B′优选为MeArg。

合适的C′为Ser，（Me）Ser，Thr，Tyr，Phe或Nal。当n为1时，m宜为0。

Z₂优选为APmp，Cys或Pen的左旋异构体。

优选的m和n均为0。

于此描述的在式中X的意思是欲表示肽的末端氨基，而区别于常规。当X为H时，Z₁应为脱氨基酸，例如，当Z₁为Cys和X为H时，相应于脱氨基半胱氨酸的残基为3-巯基丙酸。

本发明的具体化合物为：

N^α-Ac-Cyclo（S，S） Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S） Cys-Arg-Gly-Asp-（D，L）APmp-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S） Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂;

Cyclo（S，S）Mpr-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Pen-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-（Me）Ser-Cys-NH₂;

Cyclo（S，S）Mpr-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

Cyclo（S，S）Mpr-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Arg-Gly-Asp-D-Pen-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Lys-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-HArg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NHEt

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-D-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Tyr-Cys-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Pen-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Pen-Arg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-D-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Sar-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Arg（Et₂）-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-D-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N^α-Ac-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂;

N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NH₂;

N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-Tyr-NH₂;

N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-NH₂;

N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-D-Ser-NH₂;

N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-Val-NH₂;

N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-Nal-NH₂;

N^α-Ac-Arg-Arg-Gly-Asp-Phe-NH₂;

N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-NH-CH₂-CH₂-C₆H₅

N^α-Ac-MeArg-Gly-Asp-Phe-NH₂;

N^αAc-HArg-Gly-Asp-Ser-NH₂;

N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NHEt;

N^α-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂;

N^α-Formyl-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂;或

Gly-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂;

在该技术领域中常用的名称在此用于描述肽。

三字母单字母

氨基酸三字母符号单字母符号氨基酸

符号符号

丙氨酸 Ala A 异亮氨酸 Ile I

精氨酸 Arg R 亮氨酸 Leu L

天冬酰胺 Asn N 赖氨酸 Lys K

天冬氨酸 Asp D 蛋氨酸 Met M

Asn和/或Asp Asx B 苯丙氨酸 Phe F

半胱氨酸 Cys C 脯氨酸 Pro P

谷氨酸胺 Gln Q 丝氨酸 Ser S

谷氨酸 Glu E 苏氨酸 Thr T

Gln和/或Glu Glx Z 色氨酸 Trp W

甘氨酸 Gly G 酪氨酸 Tyr Y

组氨酸 His H 缬氨酸 Val V

根据习惯表示，氨基末端位于左边，羟基末端位于右边。除非另有说明，所有的手性氨基酸（AA）都被假定为左旋绝对构型。Pen表示L-青霉胺或β，β-二甲基半胱氨酸，APmp表示2-氨基-3，3-环戊亚甲基-3-巯基丙酸，Mpa表示3-巯基丙酸，Pmp表示3，3-环戊亚甲基-3-巯基丙酸，Mdp表示3-巯基-3-甲基丁酸，HArg表示高精氨酸，（Me₂）Arg表示N′，N′-二甲基精氨酸，（Et₂）Arg表示N′N-二乙基精氨酸，Nva表示正缬氨酸，Nle表示正亮氨酸，α-MeAsp表示N^α-甲基天冬氨酸，Nal表示，β-2-萘基丙氨酸，Phg表示苯基甘氨酸，Hphe表示高苯基丙氨酸，Trp表示色氨酸，Abu表示2-氨基丁酸，（Alk）Tyr表示O-C_1-4烷基-酪氨酸，（Alk）Ser表示O-C_1-4烷基-丝氨酸，（Alk）Thr表示O-C_1-4烷基-苏氨酸，（Alk）Cys表示S-C_1-4烷基半胱氨酸，（Alk）Pen表示S-C_1-4烷基青霉胺，（4′W）Phe表示在苯环的4位上用W取代的苯丙氨酸，Boc表示t-丁基氧羰基，Fmoc表示芴基甲氧羰基，Ph表示苯基，cbz表示碳苄氧基，Brz表示O-溴苄基氧羰基，Clz表示O-氯苄氧羰基，Bzl表示苄基，4-MBzl表示4-甲基苄基，Ac表示乙酰基，Alk表示C_1-4的烷基，Ph表示苯基，Chx表示环己基，DCC表示二环己基碳化二亚胺，DmAp表示二甲基氨基吡啶，HOBT表示1-烃基苯并***，THF表示四氢呋喃，DMF表示二甲基甲酰胺，HF表示氢氟酸，TFA表示三氟乙酸。应用于此的1-4个碳原子的烷基意味着包括甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基和异丁基。

本发明的氨基酸的α-R′取代衍生物（可用（α-R′）AA表示）表示在α-氨基上用R′单取代的氨基酸，其中R′为Alk或苄基。R′优选为甲基。N^α-甲基精氨酸和N^α-甲基甘氨酸分别为（α-Me）Arg和（α-Me）Gly，为了与以前通用符号一致也用MeArg和Sar（肌氨酸）表示。所有其它N-α-取代氨基酸在它们的表示符号中将带有α-标志。因此，可在硫醇，胍基或羟基上烷基化的氨基酸，如Tyr，Ser，Thr，Cys或Pen由于没有该符号而辨别出来。所以，（α-Me）Ser为N^α-甲基丝氨酸，（Me）Ser为O-甲基丝氨酸，（α-Me，Et）Ser为N^α-甲基，O-乙基丝氨酸以及（α-Me，Et₂）Arg为N^α-甲基-N′，N″-二乙基精氨酸。

用MerriJield的固相技术（J.Am.Chem.Soc，85，2149（1964））制备肽的方法为优选的，尽管用已知的溶液方法也是可以成功的。也可结合使用固相和溶液合成方法，如在聚集合成中，通过固相合成可制备二，三，四或五肽的片段，通过溶液合成或结合或进一步变更。Ali等在J.Med.Chem，29，984（1986）和J.Med.Chem，30，2291（1987）上发表了使用一般合成肽的方法制备本发明的大多数肽，在此提出该方法作为参考。

正如肽技术中所知的，每一种氨基酸或肽都应适当保护。例如，Boc，Cbz或Fmoc基团可用来保护氨基，特别是α-氨基。Boc基团通常最好用来保护α-氨基。苄基或合适的取代苄基用于保护半胱氨酸的巯基或氨基酸中的其它硫羟基，或丝氨酸及苏氨酸的羟基。甲苯磺酰基用来保护His的咪唑基，甲苯磺酰基或硝基用来保护Arg的胍基氮。合适的取代苄氧羰基或苄基可用于保护Tyr，Ser，或Thr的羟基或赖氨酸的ε-氨基。邻苯二甲酰胺基可用于保护赖氨酸的ε-氨基。保护基团苄氧羰基或苄基的合适的取代基为用氯、溴、硝基或甲基取代的邻和/或对取代物，并用来改变保护基团的反应性。半胱氨酸和其它的含硫氨基酸也可通过用硫代烷基或硫代芳基形成二硫化物得到保护。除了Boc基外，最常用的保护基团是通过中等酸处理而不能除去的那些基团，这些保护基团可通过已知的方法如催化氢化，在液态氮中的钠或HF处理而除去。

如果使用固相方法，则从羧基末端开始朝肽的氨基末端进行顺序合成肽。固相合成开始于被保护的氨基酸的C末端共价地连接在合适的树脂上，如二苯甲基胺树脂（BHA），甲基二苯甲基胺树脂（MBHA）或氯甲基酯（CMR），如在美国专利4，244，946中所公开的。如果产物肽的羧基末端为羧酰胺则使用BHA或MBHA支撑树脂，如果产物肽的羟基末端为羟基则一般用CMR支撑，尽管这也可能被用来生产羧酰胺或酯。

一旦第一保护的氨基酸（AA）偶联在所希望的树脂上，则通过中等酸处理而水解氨基，第二保护的AA的自由羧基偶合在此氨基上，该过程可按顺序完成，没有中间体的离析，直至形成所希望的肽。然后按顺序将完成的肽从支撑的树脂上释放和/或裂解出来。

用含水乙醇中的碱处理CMR支撑的肽将肽从树脂中分离出来并产生了作为一种羧酸的羧基末端氨基酸。用含水乙醇中的氨或烷基胺处理CMR支撑的肽从而在羧基末端产生了羧酰胺或烷基羧酰胺。

如果希望生成酯，则可用适宜的醇，如甲基，乙基，丙基，丁基或苄基醇处理CMR树脂，在三乙胺存在下将肽从树脂中分离出来并直接生成酯。

本发明的肽的酯也可通过常用的方法从羧酸前体中制备，特别地，在酸催化存在下用醇处理羧酸，另一方面，羧酸可转换成一种活性酰基中间体，如酰基卤，用醇处理时优选在碱存在下进行。

不用天冬氨酸的侧链羧基的酯化来生成肽的C-末端酯的方法稍微复杂，但这在肽合成中已是熟知的。例如，合成开始于通过溶液合成将C末端的氨基酸或二肽的酯偶联至一种合适的侧链被保护的天冬氨基酸残基上，然后有选择性地脱保护基和侧链羧基偶合至氯甲基酯（CMR）上。释放氨基并使用固相肽合成，当肽的羧基末端仍为酯时，接着使用HF从树脂中***合成所希望的侧链羧酸。同样，如果合成顺序开始于合适的被保护的氨基酸或二肽的烷基酰胺，则可得到相应的肽的C-末端烷基酰胺。

在这样的方法中，为了生成酯和取代的酰胺，用于天冬氨酸的4-羧基的合适的保护基团为苄酯和卤素或烷基-取代的苄基酯。当用Boc基，苄基酯保护氨基时，保护基团可选择性地通过氢化除去，并偶联在CMR支撑体上。

如果在氨基酸（或二肽）上有苄基或取代苄基保护基团（如用于羟基，硫醇或氨基）并被偶联在天冬氨酸上且优先于与树脂的连接，则t-丁基酯或其它酸不稳定基团适合于保护天冬氨酸的侧链羧基。假若这样，则可用碱不稳定基保护天冬氨酸的氨基，如芴基甲氧基羰基部分（Fmoc）。在溶液相天冬氨酸偶联氨基酸（或二肽后），通过中等酸水解完成t-丁基酯的选择性的再保护，并且用常用方法将侧链羧基偶合至树脂上。然后为了接着固相肽合成，则用中等碱除去芴基甲氧基羰基。

将肽从支撑树脂中分离出来的优选方法是在合适的阳离子清除剂（如苯甲醚或二甲氧基苯）下用无水HF处理树脂支撑的肽。该方法同时除去所有的保护基团（除了保护硫的硫代烷基）并且将肽从树脂中分离出来，用该方法从CMR中水解出的肽为羧酸，从BHA树脂中分离得到羧基酰胺。

通过烷基化或乙酰化达到肽的末端氨基的改变，这在该技术领域中已是公知的。这种改变可在氨基酸上完成并优先于与肽的结合，或在肽上完成，该过程是在肽被合成和末端氨基被释放出来后，但在除去保护基团以前。

典型地，在叔胺存在下，使用相应烷基酸的酰基卤或酐，在自由氨基上完成乙酰化。在中等还原剂如氰基氢硼化锂或钠存在下，用合适的脂肪族醛或酮通过氨基的还原烷基化，而最方便地完成单烷基化。在碱存在下，用大量的烷基卤处理氨基而完成二烃基化。

使用常用方法形成酰胺键达到肽的溶液合成，典型地，可选择地在催化剂如1-羟基苄基***（HOBT）和二甲基氨基吡啶（DMAP）存在下，使用合适的碳化二亚胺偶联剂，如N，N′-二环己基碳化二亚胺（DCC），将具有自由羧基的被保护的BOC-氨基酸偶联至被保护的具有自由氨基的氨基酸上。其它方法也是合适的，如生成活化酯，酐或酰基卤，被保护的BOC-氨基酸的自由羧基，按着可选择地在碱存在下与被保护的氨基酸的自由胺反应。例如，在碱（如N-甲基吗啉，DMAP或三烷基胺）存在下，在无水溶剂（如二氯甲烷，四氢呋喃（THF））中用异丁基氯仿处理形成“活化酐”，接着将它与第二被保护的氨基酸或肽反应。由这些方法生成的肽可用通用的方法有选择性地在胺基或羧基末端上选择性地脱除被保护基，并使用相似的方法与其它肽或氨基酸进行偶联。

本发明的氨基酸的α-R′取代衍生物，包括Arg，HArg，（Me₂）Arg，（Et₂）Arg，Ala，Gly，His，Abu，Tyr，（Alk）Tyr，Phe，（4′W）Phe，HPhe，Trp，Ser，（Alk）Ser，Thr，（Alk）Thr，Cys，（Alk）Cys，Pen，（Alk）Pen，Ala，Val，Nva，Met，Leu，Ile，Nle和Nal的衍生物可用化学技术领域通用方法制备。正如在此之前所定义的R′为Alk或苄基。制备这些衍生物的有代表性的方法已公开于美国专利4，687，758;Cheung等，Can.J.Chem.，55，906（1977）;Freidinger等，J.Org.Chem，48，77（1982）;和Shuman等，Petides：Proceedings of the 7th American Peptide Symposium，Rich，D，Gross，E，Eds，Pierce Chemical CO.，Rockford，Ill，617（1981），之中，在此提出这些资料作为参考。典型地，碱如氢化钠或氢化钾存在下，用合适的烷基卤如甲基或乙基碘与Cbz-或Boc-氨基酸的DMF/THF溶液缩合。冠醚（如18-冠醚-6）与氢化钾一起加入可促进反应。通常在该过程或接着的过程中，如果氨基酸具有功能基团如羟基，巯基，氨基，胍基，吲哚基或咪唑基，则正如在此之前所描述的，这些基团将被保护起来。因此用氢化钠和甲基碘的THF/DMF溶液于0℃下处理Boc-Tyr（Bzl）并在室温下搅拌24小时生成Boc-（α-Me）Tyr（Bzl）。

另一方面，在还原剂如氰基氢硼化钠存在下，氨基酸的自由胺与合适的醛或苯甲醛反应产生单烷基化，此方法对于制备α-苄基氨基酸特别有用。α-苄基化氨基酸也可用作制备α-甲基氨基酸的中间体。例如，用下述三步制备α-甲基精氨酸;1）.在甲醇溶液中将Arg（Tos）与苯甲醛和氰基氢硼化钠反应生成（α-Bzl）Arg（Tos）;2）.用甲醛/甲酸溶液还原苄基化产物生成（α-Bzl，α-Me）Arg（Tos）;3）.通过催化氢化（在冰乙酸/HCl中的5%Pd/C）释放出苄基生成MeArg（Tos）。

氨基酸的α-R′取代衍生物也可通过由Fmoc或Cbz-氨基酸制备的恶唑烷酮的还原来制备。典型地，在有甲苯磺酸存在下，于甲苯溶液中将Fmoc或Cbz-氨基酸与合适的醛如乙醛或苯甲醛一起加热生成2-取代5-氧代-恶唑烷。用三乙基硅烷和TFA的氯仿溶液还原该恶唑烷直接得到Cbz-或Fmoc-α取代氨基酸。当使用甲醛时，恶唑烷酮的2位未被取代以及生成α-甲基氨基酸，这在本领域中已是熟知的。

本发明的优选的一组化合物为式（Ⅱ）所描述的那些化合物。这些化合物包括两个具有硫羟基的氨基酸，该硫羟基参与生成二硫键形成环状结构。如此结构由相应的线性肽（Ⅲ）制得，

（Ⅲ）

其中：A′，B′，Asp，C′，Z₁，Z₂，m，n，p，q，w，x，y，R′，R₁，R₂，R₃，R₄和R₅如上文定义，如前面所描述的选择性保护化学反应中心。T¹和T²为可移除基团，如硫代烷基，硫代芳基，取代苄基或氢。合适的可移除基团为氢，硫代乙基，苄基和4-甲基苄基。

可通过两种通用方法中的一种来形成二硫键。如果线性肽的含硫氨基酸的保护基不同，用如此方法可形成单巯基，可通过催化第二个含硫氨基酸的保护基团的亲核置换的碱产生成环作用。特别有用的可移除的保护基团为硫代烷基或硫代芳基。该方法的实例为用硫代乙基保护一含硫氨基酸，用取代苄基保护第二个含硫氨基酸。用HF脱去该肽的保护基而从第一氨基酸中除去苄基，而留下被保护的第二氨基酸为一种乙基二硫化物。在Ph值大约为7到8时，搅拌巯基/二硫化物的稀溶液，进行硫代乙基的置换和线性肽成环。

如果相应的式（Ⅲ）的线性肽完全脱保护基生成二巯基，则可使用任何一种已知的能将二巯基转换成二硫化合物的氧化剂。这种氧化剂的实例为一种碱金属的铁氰化物，特别是铁***或铁***，氧气，二碘甲烷或碘。该反应在合适的惰性溶剂（如含水甲醇或水），于大约0至40℃温度下和在高稀释下进行。通常PH值保持在7至8左右。当肽还连接在支撑树脂上或当其它功能基团还被保护时，成环作用可在肽上完成，但优选的是在脱除保护基的自由肽上完成。

用标准方法，在合适的溶剂中由母体化合物和过量的酸（如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、马来酸、琥珀酸或甲磺酸）制备肽的酸加成盐。乙酸盐特别有用。某些化合物生成合格的内盐或两性离子。用含有合适阳离子的过量的碱性试剂，如氢氧化物，碳酸盐，或醇盐处理母体化合物制备阳离子盐。Na⁺，K⁺，Ca⁺⁺和NH+₄阳离子为药理可接受盐中的阳离子的例子。

本发明提供了一种抗纤维变性的组合物，该组合物由一种根据式（Ⅰ）或（Ⅱ）的肽和一种药用载体组成。肽的药剂组合物的制备如上文所述，纤维结合素，纤维蛋白原或Von Willebrand因子的其它肽或多肽衍生物可配制成溶液或冻干成为肠胃外服法的粉末。在使用之前，通过加入合适的稀释剂或其它药用载体，将粉末进行再配制。该液体配方通常为一种缓冲物，等渗的水溶液。合适稀释剂为正常等渗的盐溶液，标准的在水中5%葡萄糖或乙酸钠或铵的缓冲溶液。如此配方特别适合于肠胃外给药，但也可用于口服或用于吹入法，在吸入器或喷雾器中含有一定剂量。在配方中需要加入赋形剂如聚乙烯基吡咯烷酮，明胶，羟基纤维素，亚拉伯胶，聚乙二醇，甘露醇，氯化钠或枸橼酸钠。

另外，为了口服这些肽可用胶囊包，制成片剂或在乳剂或糖浆中制备。可加入药用的固体或液体载体增强或稳定组合物，或便于制备组合物。固体载体包括淀粉，乳糖，硫酸钙二水合物，石膏粉，硬脂酸镁或硬脂酸，滑石，果胶，亚拉伯胶，琼脂或明胶。液体载体包括糖浆，花生油，橄榄油，盐水和水。载体也可包括一种持续释放剂（如单硬脂酸甘油酯和二硬脂酸甘油酯），单独的或与蜡一起。固体载体的用量可变，但优先为每剂量单位大约20mg至1g。药剂可按通用的药学工艺制备，当必要时，对于片剂型，可用碾磨、混合、制粒和加压，对于硬明胶囊型，可用碾磨、混合和填充。当使用液体载体时，制剂将以糖浆，酏剂，乳剂或含水的或不含水的悬浮液形式出现。如此液体制剂可直接口服或装填于软明胶囊中。

为了颊服，本发明的肽也可与赋形剂如可可豆油、甘油、明胶或聚乙二醇结合形成栓剂。

本发明也提供了一种抑制哺乳动物特别是人体的血小板聚集和血块形成（在它需要时），它包括内服有效剂量的抗纤维变性肽和药用的载体。如此疗法的适应症包括心肌梗塞形成，深静脉血栓形成，肺栓塞，分割性无尾症，中风和其它与梗塞有关的病。聚集过多的慢性或急性状态，如分散于血管内的凝固（DIC），败血症，外科的或传染的休克，手术后和分娩后的外伤，心肺分流外科，不一致血液的转输，意外的胎盘，血栓形成的血小板减少紫癜（TTP），蛇毒和免疫病都可能对如此治疗敏感。病人不是口服就是肠胃外服抗纤维变性肽，用这种方法血浆中药的浓度应足以抑制血小板聚集。含该肽的药剂组合物的服用剂量大约为0.2至50mg/Kg，其用法应与病人的状况符合。急性疗法肠胃外给药为优选。对于聚集过多的持续状态，静脉内注射肽的5%葡萄糖水或生理盐水溶液最为有效，尽管肌内药团注射也是有效的。

对于慢性的，但非危急的血小板聚集状态，胶囊或片剂的口服或药团的肌内注射都是合适的。每天服肽一至四次，剂量大约为0.4至50mg/Kg，从而达到每天总剂量大约为0.4至200mg/Kg/天。

另外，本发明提供了一种在纤维蛋白溶解疗法之后抑制动脉或静脉再阻塞的方法，它包括在它需要的时候给哺乳动物内服有效剂量的抗纤维变性肽和纤维蛋白溶解剂。现已发现在纤维蛋白溶解疗法中服用抗纤维变性肽既能完全防止再阻塞又能延长再阻塞时间。当在纤维蛋白溶解疗法后抑制血管的再阻塞的方法使用该肽，本发明的意图是不仅包括上述的肽，而且包括其它肽，多肽和肽及多肽的断片或衍生物，它们具有氨基酸序列-RGD-并能结合在GPIIb-IIIa接受体上。因此抗纤维变性化合物为纤维结合素，纤维蛋白原和Von Willebrand因子的断片和衍生物。通过重组DNA方法或通过固相肽合成或通过惯用的溶液合成或溶液合成制备这些肽/多肽在本领域已是熟知的。已经公开了制备纤维结合素片断的方法（Rouslahti等，WO 84/00540;Pierschbacher等，美国专利4，589，881;和Rouslahti等，美国专利4，661，111），在此提出作为参考。通过酰胺化、酯化、烷基化、乙酰化使用这种方法制备的肽进一步转化，或偶联至其它的天然的或非天然的氨基酸。用这种方法制备的肽/多肽可用上述方法配制成肠胃外给药或口服药。

用于本发明中的纤维蛋白溶解剂是指任意化合物，不管是天然的还是合成的产物，它们直接或间接引起纤维血块的溶解。纤维蛋白溶酶原激活剂为一组已知的纤维蛋白溶解剂，例如，实用纤维蛋白溶酶原激活剂包括：尿激酶（UK），前尿激酶（PUK），链激酶（SK），组织血纤维蛋白溶酶原激活剂（tpA）和它的变异体或突变体，它们保持了纤维蛋白溶酶原激活剂的活性，如变异体，在变异体中增加，除去或取代了一个或多个氨基酸，或在变异体中增加，除去或改变一个或多个或功能性范围，如通过纤维蛋白结合纤维蛋白溶酶原激活剂的活性位置，如，tpA，该纤维蛋白结合在其它纤维蛋白溶酶原激活剂的范围上，如尿激酶的一个或多个Kringle范围，或用结合在分子如抗纤维蛋白IgG的Fab片断上的其它纤维蛋白。另外作为例证的变异体包括tpA分子，在变异体中的一或多个糖基化基位点发生了变化。优选的纤维蛋白溶酶原激活剂为tpA的变异体，在生长因子区域内变异体的主氨基酸序列发生变化以便增加纤维蛋白溶酶原激活剂的血浆半衰期。现已发现了tpA生长因子变异体，例如，Robinson等EP-A-297589和Browne等EP-A-240334以及由British Biotechnology Ltd.联系为Smithkline Beckman Corporation Docket Number SKB 14422，于1988年6月24日提交的英国专利申请，在此提出这些资料作为参考，尽管在上文中已经全部提到。纤维蛋白溶解剂可从天然源中分离出来，但通常用传统的遗传工程方法制备。

现已公开了tpA，SK，UK和PUK的实用配方，如：未审定的美国专利申请890，432，德国专利申请号3032606，欧洲专利申请号83103629.8和美国专利4568543，在此提出这些专利作为参考。特别的纤维蛋白溶解剂可在水溶液，缓冲溶液，等渗溶液中配制，如乙酸或己二酸的钠或铵盐缓冲液在PH为3.5至5.5。也可加入另外的赋形剂如聚乙烯吡咯烷酮，明胶，氧化纤维素，亚拉伯胶，聚乙烯，乙二醇，甘露糖醇和氯化钠。如此组合物能被冻干。

可在同一容器中配制既抗纤维变性又能使纤维蛋白溶解的药剂组合物，但最好在不同的容器中配制。当两种制剂都以溶液形式提供时，为同时服用或串列安排使用将它们装在灌输/注射装置中。

如此疗法的适应症包括心肌梗塞，深静脉血栓，肺栓塞，中风或其它与梗塞有关的疾病。抗纤维变性肽的服用可在tpA或其它纤维蛋白溶解剂胃肠外给药之前，同时或之后进行。在建立起再灌注而最大地抑制治疗后的再阻塞后希望用抗纤维变性肽连续治疗一段时间。tpA，SK，UK和PUK的有效剂量为0.5至5mg/Kg，抗纤维变性肽的有效剂量为0.1至25mg/Kg。

为了同时或不同时方便地服用抑制剂和纤维蛋白溶解剂，准备了一用具包，它包括单独的瓶子、袋子、装有上述肠胃外给药的有效量抑制剂和上述肠胃外给药的有效量tpA或其它纤维蛋白溶解剂的玻璃瓶或其它容器，并将它们放于一单独的箱子如盒子或纸匣中。如此用具还包括：如两种药剂在各自的容器中或在同一的容器中，任意的冻干的固体，以及为了再配制溶液的容器。这种变化还包括：为再配制所需的溶液和单独箱子的两个室中冻干的固体，在使用之前能够进行掺合。这样安排的话，纤维蛋白溶解和抗纤维变性肽可分开包装在两个容器中，或作为粉末一起冻干并放在单独的容器中。

当两种制剂都以溶液形式提供时，为同时服用或串列安排使用将它们装在灌输/注射装置中。例如，血小板聚集抑制剂可用静脉注射形式，或连在一起的灌输袋，通过管与装入纤维蛋白溶解剂的第二个灌输袋连接。使用这种装置时，在纤维蛋白溶解剂灌输后，病人能得到最初药团类抗纤维变性抑制剂的注射或灌输。

通过下列实验评价肽的药物活性：

与纤维蛋白溶解疗法的作用-预制的人血块的溶解。

在体外人血块溶解实验常用来评价抗纤维变性肽对诱导纤维蛋白溶解的tpA的作用。将来源于美国红十字会的的过时的含枸橼酸盐的人血浆在1300×g下离心20分20分钟除去残留的血细胞。将由血浆¹²⁵I-纤维蛋白原氯化钙和凝血酶组成的溶液置于6mn组织培养平皿上，于37℃下保温15至18小时。第二天早上，冲洗每一井获得血块，用含有肝素和白蛋白的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水溶液洗涤血块两次。然后将血块加到1.0ml的用于制备血块的同样的血浆中。加入tpA至玻璃管中其浓度范围为7至250ng/ml（最终浓度）。在37℃下轻轻旋转玻璃管保温4小时。在4小时终点，取出25μl并计数测量从血块中释出的¹²⁵I。所有试样一式三份。

本实验的结果用图1的曲线表示，该结果表明肽Ac-RGDS-NH₂与诱导血块溶解的tpA没有相互作用。

抑制血小板聚集的体内实验

根据Aiken等在Prostaglandins，19，629-43（1980）中叙述的方法，通过记录输入了的肽麻醉的狗的全身和血液动力学效应可验证体内血栓形成的抑制。简言之，将一小的Lexan

圆柱放在机械损伤的右边弯曲的冠状动脉中以形成一个固定区域的80-90%的阻塞。在这些条件下，血小板粘连在露置的内皮下胶原蛋白上并聚集在阻塞位置上。在血流的2～3分钟内估计聚集会逐渐减少。直到用机械的方法将血栓从被阻塞的血管腔内取出，冠状血流才能恢复。这一过程可通过控制实验期而每2-3分钟重复一次。

用Ac-RGDS-NH₂进行这样的实验，其结果以图2（a-c）加以说明。上面的图（a），测量动脉血压（mmHg），中间的图（b），测量期的冠状血流量（ml/min）和下面的图（c），测量冠状血流量平均值。在控制期间，血流量降低（图（b）和图（c））直到血块被振荡松动（SL）。箭头表示开始冠状输入Ac-RGDS-NH₂（在0.1ml/mM下的400mM）。这种输入导致完全抑制血栓的形成直到停止输入为止（第二个箭头）。停止输入后由于血栓的出现又导致血流量降低。

抗聚集活性的剂量关系的实验是通过当改变抗纤维变性肽的输入速度而观察对平均冠状血流（ml/mM）的作用。对于Ac-RGDS-NH₂来说，其实验用图3表示。上面曲线（a）表示血栓形成的完全抑制（在0.052ml/min下400mM）。中间曲线（b）表示血栓自发消散的中等抑制（在0.026ml/min下400mM）。下面曲线（c）表示延长时间至完全阻塞的部分抑制（在0.013ml/min下400mM），这需要血栓振荡松动（SL）。用箭头表示输入的再开始和结束。

血小板聚集的抑制

从成年的初次用以进行实验的杂种狗上收集血液含枸橼酸盐以防止凝固）。通过在室温下在150×g离心10分钟制备血小板富集的血浆（PRP）。通过在800×g的PRP离心10分钟制备洗涤过的血小板。用没有Ca²⁺的泰克缓冲液（pH6.5）洗涤所得的细胞碎片两次，然后再悬浮于在3×10⁵Cells/ml下含有1.8mM Ca²⁺的泰克缓冲液中。在所有的血小板聚集实验中，先于激动剂加入前三分钟加入肽。最终激动剂浓度为0.1单位/ml凝血酶和2μM ADP（σ）。用Chrono-Log Lumi-Aggregometer检验聚集作用。在激动剂加入5分钟后，透光率被用于计算百分聚集数。根据下面公式：聚集%＝〔（90-CR）÷（90-10）〕×100其中CR为图的读数，90为基线，和10为PRP的空白读数。通过绘制〔聚集抑制%〕对〔肽浓度〕曲线来确定IC₅₀′的值。在200μM下进行肽的实验，并以2为因子来连续稀释，从而确定一条合适的剂量反应曲线。

为了评价肽对血浆蛋白酶的稳定性，在激动剂加入之前在PRP中培养3小时（而不是3分钟）。

下表说明了本发明的肽对血小板聚集的活性：

抗聚集活性

实施例结构活性% 抗聚集活性

在PRP IC₅₀，IC₅₀，

中3小 μM μM

PRP/ WP/

时后 ADP凝血酶

1 cyclo Ac-Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂100 1.1 NT

2 cyclo Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-D,L-APmp-NH₂100 1.53 NT

3 cyclo Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂100 32.7 54.3

4 cyclo Mpr-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂NT 10.9 NT

5 cyclo Ac-Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Pen-NH₂NT 1.3 NT

6 cyclo Ac-Cys-MeArg-Gly-Asp-(α-Me)Ser-Pen-NH₂79.96 NT

7 cyclo Mpr-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂NT 1.2 NT

8 cyclo Ac-Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-NH₂NT 0.91 NT

10 cyclo Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂NT 4.12 NT

11 cyclo Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-D-Pen-NH₂NT 20.3 NT

12 cyclo Ac-Cys-Lys-Gly-Asp-Pen-NH₂NT 55.3 NT

13 cyclo Ac-Cys-HArg-Gly-Asp-Pen-NH₂NT 3.85 NT

14 cyclo Ac-Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂NT 0.26 NT

15 Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NHEt NT ＞200 NT

16 cyclo Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NHEt NT 9.5 NT

17 cyclo Ac-Cys-D-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂NT 4.10 NT

18 cyclo Ac-Cys-MeArg-Gly-Asp-Tyr-Cys-NH₂NT 1.49 NT

24 cyclo Ac-Cys-（Et₂）Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂NT 81.7 NT

26 Ac-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂100 7.4 28.2

27 Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NH₂0 91.3 67.2

28 Ac-Arg-Gly-Asp-Tyr-NH₂98 101.5 137

29 Ac-Arg-Gly-Asp-NH₂54.2 137.8 356

30 Ac-Arg-Gly-Asp-D-Ser-NH₂33.3 138.8 ＞200

31 Ac-Arg-Gly-Asp-Val-NH₂91.7 55.5 NT

32 Ac-Arg-Gly-Asp-Nal-NH₂100 40.5 NT

33 Ac-Arg-Arg-Gly-Asp-Phe-NH₂5.9 112.7 NT

34 Ac-Arg-Gly-Asp-NHCH₂CH₂Ph 100 75.9 NT

35 Ac-MeArg-Gly-Asp-Phe-NH₂100 10.8 NT

36 Ac-HArg-Gly-Asp-Ser-NH₂33.3 68.2 NT

37 MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂NT 66.3 NT

38 HCO-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂NT 6.9 NT

39 Gly-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂NT 12.0 NT

PRP＝血小板富集血浆

WP＝洗涤过的血小板

下面的实施例并不是要限制本发明范围，只是提供说明如何制造和使用本发明化合物。

实施例

在下面的实施例中，全部温度都是摄氏温度。氨基酸分析是在Dionex autoion 100上进行。肽含量分析基于氨基酸分析。质谱在VG Zab质谱仪上用快原子轰击进行。EM薄层硅胶板（0.25mm）用于薄层色谱。ODS指的是十八烷基甲硅烷基硅胶色谱载体。用于代表洗脱组合物的缩写是：B：丁醇，A：乙酸，W：水，E：乙酸乙酯，IP：异丙醇，P：吡啶和CA：氯乙酸。HPLC是在Beckman 344梯度色谱***上用CRIB纪录积分仪或者是同溶剂方式或者是梯度洗脱方式进行的。这儿简要地说明：肽的纯度基于HPLC的积分法。用Ali等在美国专利4，687，758（1987）上公开的方法制备MeArg。

实施例1

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂

合成被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Cys（SEt）-MeArg（Tos）-Gly-Asp（OChx）-Ser（Bzl）-Cys（4-MBzL）-MBHA，是用固相方法在4-甲基二苯甲基胺树脂上，在自动化Beckman 990 MP合成器上以1.0m mol规模进行。在全部氨基酸的氨基上用t-丁氧基羰基保护，并且用Ali等在J.Med.Chem.，29，984（1986）和J.Med.Chem.，30，2291（1987）中所表示的方法，顺序地用N，N-二环己基碳化二亚胺/1-羟基苯并***（DCC/HOBt）进行偶联。在最后的氨基酸偶联到肽上后，用乙酸酐（10当量）和二异丙基乙胺（10当量）在二甲基甲酰胺的混合物中，将该肽乙酰化。在0℃，60分钟内在苯甲醚（3.0ml）的存在下，用无水HF（30ml）脱去侧链保护基，同时从树脂上将该肽断裂出来。在真空蒸发HF后，用无水***洗涤残余物，用50%乙酸提取粗肽，并用去离子水稀释粗肽到21。用浓氢氧化铵调节水溶液pH为7.5。在这种弱硷性条件下从半胱氨酸中除去4个MBZL基团产生游离硫醇，进行第二个半胱氨酸的巯基乙基保护基的亲核取代，然后该肽分子内环化。例如，氮或氩惰性气体明鼓泡形式通过溶液赶出生成的乙硫醇。环化过程发生在24-48小时。然后该反应液通过预先用水平衡的十八烷基硅烷（ODS）反相色谱柱。用15%乙腈/水-0.1%TFA溶液洗脱该肽，得678.6mg（98%粗产率）。用中压ODS反相柱和5%乙腈/水-0.1%TFA溶液洗脱剂的色谱法进行该肽的纯化。标题化合物在二个馏分中洗脱，得222.3mg，具有＞98%纯度。

物理数据：

M.F.：C₂₄H₄₀N₁₀O₁₀S₂

M.W.：692.231

FAB：（M+H）⁺693.5，（M-H）^-692.0

AAA：Asp（1.07）;Ser（1.00）;Gly（1.00）;Cys（2.37）

肽含量：67.7%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.42;

（B∶A∶W∶P，15∶3∶8∶10），R_f＝0.36.

2.HPLC：Altex Ultrasphere ODS，4.5mm×25cm，

在220nm检测。

同溶剂洗脱：2%乙腈/H₂O-0.1%TFA，

K¹＝0.2

分步梯度淋洗：被用于以H₂O-0.1%TFA平衡的柱，5%乙腈/水-0.1%TFA（5分钟内），50%（20分钟内），K¹＝1.5

以Boc-Thr（Bzl）取代上面序列中的Boc-Ser（Bzl）生成N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Thr-Cys-NH₂.

以Boc-D-（Me）Cys取代上面序列中的Boc-Ser（Bzl）生成N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-D-（Me）Cys-Cys-NH₂.

以Boc-Val取代上面序列中的Boc-Ser（Bzl）生成N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Val-Cys-NH₂.

以Boc-NVa取代上面序列中的Boc-Ser（BzL）生成N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Nva-Cys-NH₂.

以Boc-Phg取代上面序列中的Boc-Ser（BzL）生成N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Phg-Cys-NH₂.

以Boc-HPhe取代上面序列中的Boc-Ser（BzL）生成N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Hphe-Cys-NH₂.

实施例2

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Arg-Gly-Asp-（D，L）APmp-NH₂

用与例1相同的方式，在0.5mmol规模上，制备、断裂、环化和离析被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Cys（SEt）-Arg（Tos）-Gly-Asp（OChx）-APmp（4-MBzL）-MBHA.用快速色谱法纯化该肽，其中用中压ODS反相柱和15%乙腈/水-0.1%TFA洗脱液洗脱。标题化合物在三个组份中洗脱，给出150.9mg（45.8%），其纯度＞96%。

物理数据

M.F.：C₂₅H₄₁N₉O₈S₂;M.W.：659.4

FAB：（M+H）⁺660

AAA：Asp（1.00），Gly（1.00），Arg（0.91）

肽含量：60.6%

色谱数据

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.67;

（B∶A∶W∶P，15∶3∶8∶10），R_f＝0.5.

2.HPLC：Altex Ultrasphere

ODS，4.5mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：10%乙腈/H₂O-0.1%TFA，K¹＝3.24

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，12-50%A（20分钟内），K¹＝1.97。

以Boc-MeArg（Tos）取代上面序列中的Boc-Arg（Tos）生成N^α-Ac-cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-（D，L）-APmp-NH₂.

实施例3

制备N^α-Ac-cyclo（S，S）Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂

用与实施例1同样的方式，在1.0mmol的规模上，合成、断裂和环化被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Cys（SEt）-Arg（Tos）-Gly-Asp（OBzL）-Ser（BzL）-Cys（4-MBzL）-MBHA.冷冻干燥，给出530mg（78%）。用快速色谱法纯化，其中用中压ODS反相柱和1%乙腈/水-0.1%TFA洗脱剂。得61mg标题肽，纯度为90%。

物理数据

M.F.：C₂₃H₃₈N₁₀O₁₀S₂

M.W.：678.75

FAB：（M+H）⁺679

AAA：Asp（1.00）;Ser（0.98）;Gly（0.97）;Arg（0.90）;Cys（1.75）.

肽含量：86.3%。

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.32;

（B∶W∶IP;CA，6.5∶2∶1.5∶0.3），R_f＝0.06.

2.HPLC：Vydac 218 TP ODS柱，4.6mm×25cm

在220nm处检测。

梯度：A：乙腈 B：H₂O-0.1%TFA，0-50%（在35分钟内），K¹＝6.4。

以Boc-Tyr（BrZ）取代上面序列中的Ser（BzL）生成N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Arg-Gly-Asp-Tyr-Cys-NH₂.

以Boc-Phe取代上面序列中的Boc-Ser（BzL）生成N^α-Ac-Cyclo（S，S）-Cys-Arg-Gly-Asp-Phe-Cys-NH₂.

以Boc-Met取代上面序列中的Boc-Ser（Bzl）生成N^α-Ac-Cyclo（s，s）Cys-Arg-Gly-Asp-Met-Cys-NHz

以Boc-NLe取代上面序列中的Boc-Ser（BzL）生成N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Arg-Gly-Asp-NLe-Cys-NH₂.

以Boc-Nal取代上面序列中的Boc-Ser（BzL）生成N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Arg-Gly-Asp-Nal-Cys-NH₂.

以Boc-ILe取代上面序列中的Boc-Ser（BzL）生成N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Arg-Gly-Asp-ILe-Cys-NH₂.

实施例4

制备Cyclo（S，S）Mpr-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂：

用与实施例1同样的方式，在1.0mmol的规模上，制备、断裂、环化和离析出被保护的肽-树脂中间体，Mpr（4-MBzL）-Arg（Tos）-Gly-Asp（OChx）-Ser（BzL）-Cys（SEt）-MBHA.用快速色谱法纯化该肽，其中用中压ODS反相柱和3.5%乙腈/水-0.1%TFA的洗脱剂。得489mg（79%）纯度为96%的标题化合物。

物理数据：

M.F.：C₂₁H₃₅N₉O₉S₂

M.W.：621.208

FAB：（M+H）⁺622.1;（M-H）^-620.7

AAA：Asp（1.00），Ser（0.97），Gly（1.00），Cys（0.57），Arg（1.03）

肽含量：73.88%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.42

（B∶A∶W∶P，15∶3∶8∶10），R_f＝0.41

2.HPLC：Altex Ultrasphere

ODS，4.5mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：4%乙腈/H₂O-0.1%TFA，K¹＝3.6

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，3-50%（在20分钟内），K¹＝3.3

实施例5

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Pen-NH₂：

用与实施例1相同的方式，在1.0mmol的规模上，制备、断裂、环化和离析出被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Cys（SEt）-MeArg（Tos）-Gly-Asp（Ochx）-Ser（BzL）-Pen（4-MBzL）-MBHA，给出542mg（75%）。用中压ODS柱和6%乙腈/水-0.1%TFA洗脱剂的快速色谱法纯化，给出47.5mg纯度为94%的标题化合物。

物理数据：

M.F.：C₂₆H₄₄N₁₀O₁₀S₂

M.W.：720.27

FAB：（M+H）⁺721.3

AAA：Asp（1.00），Ser（0.96），Gly（1.00），MeArg（0.89）

肽含量：78.12%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.42

（B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10），R_f＝0.41

2.HPLC：Altex Ultrasphere

ODS，4.5mm×25cm在220nm处检测

同溶剂：6%乙腈/水-0.1%TFA，K¹＝5.66

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，0-50%A（在20分钟内），K¹＝3.19

实施例6

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-MeSer-Cys-NH₂：

用与实施例1相同的方式，在0.5mmol的规模上，制备、断裂、环化和离析被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Cys（SEt）-MeArg（Tos）-Gly-Asp（Ochx）-（^α-Me）Ser（BzL）-Cys（4-MBzL）-MBHA.用10%乙腈/水-0.1%TFA，从反相ODS柱中洗脱该肽，给出47mg。用制备HPLC进一步纯化，其中用同溶剂条件（5.5%乙腈/水-0.1%TFA）、Altex Ultras-phere ODS，5μ，10mm×25cm柱和220nm的检测波长。给出10.6mg纯度大于96%的肽。

物理数据：

M.F.：C₂₆H₄₂N₁₀O₁₀S₂

M.W.：706.237

FAB：（M+H）⁺707.5（M-H）^-705.5

AAA：Asp（1.06），Gly（1.00）

肽含量：55.85%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.41

（B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10），R_f＝0.49

2.HPLC：Altex Ultrasphere

ODS，4.5mm×25cm在220nm处检测。

同溶剂：4.5%乙腈/水-0.1%TFA，K¹＝8.95

梯度：A：乙腈，B：H₂O%-0.1%TFA，0-50%A（20分钟内），K¹＝5.97

实施例7

制备Cyclo（S，S）Mpr-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂：

用与实施例1相同的方法，在1.0mmol规模上，制备、断裂、环化和离析被保护的肽-树脂中间体，Mpr（4-MBzL）-MeArg（Tos）-Gly-Asp（Ochx）-Ser（O-BzL）-Cys（SEt）-MBHA.用5%乙腈/水-0.1%TFA，从柱中洗涤该肽，得256.5mg（40%）标题化合物。用0.2M乙酸洗脱，用Sephadex

G-15硅胶过滤进行纯化。用制备HPLC进一步纯化，其中梯度条件：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，5-30%（在10分钟内），在Altex Ultrasphere

ODS，5μ，10mm×25cm，用220nm检测，给出纯度＞98%化合物。

物理数据：

M.F.：C₂₂H₃₇N₉O₉S₂

M.W.：635.22

FAB：（M+H）⁺636.2

AAA：Asp（1.00），Ser（0.84），Gly（1.04），Cys（1.48）

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1）R_f＝0.39

（B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10）R_f＝0.49

2.HPLC：Altex Ultrasphere

ODS，4.5mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：5%乙腈/水-0.1%TFA，K¹＝5.93

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，0-50%A（在20分钟内），K¹＝7.86

实施例8

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-NH₂：

用与实施例1相同的方法，在1.0mmol规模上，制备、断裂、环化和离析被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Cys（4-MBzL）-MeArg（Tos）-Gly-Asp（Ochx）-Cys（SEt）-MBHA.用5%乙腈/水-0.1%TFA，从ODS反相柱中洗脱，得780mg标题肽。用0.2M乙酸洗脱，用Sphadex G-15硅胶过滤进行纯化。用制备HPLC进一步纯化，其中用同溶剂条件：5%乙腈/水-0.1%TFA，在Altex Ultrasphere

ODS柱上，5μ，10mm×25cm，在220nm处检测，得纯度＞98%的标题化合物。

物理数据：

M.F.：C₁₂H₃₅N₉O₈S₂

M.W.：605.21

FAB：（M+H）⁺606.2;（M-H）^-604

AAA：Asp（1.00），Gly（1.13），Cys（2.04）

肽含量：77.33%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.43

（B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10），R_f＝0.56

2.HPLC：Altex Ultrasphere ODS，4.5mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：5%乙腈/水-0.1%TFA，K¹＝4.76

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，0-50%A（在20分钟内），K¹＝7.18

实施例9

制备Cyclo（S，S）Mpr-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂：

用与实施例1相同的方法，在1.0mmol的规模上，制备、断裂和离析被保护的肽-树脂中间体，Mpr（4-MBzL）-MeArg（Tos）-Gly-Asp（Ochx）-Pen（4-MBzL）-MBHA，用0.01MK₃Fe（CN）₆溶液环化该肽。用10%乙腈/水-0.1%TFA，于ODS反相柱上色谱分离该肽，得365mg（63%）标题化合物。用0.2M乙酸洗脱，并用Sephadex G-15硅胶过滤纯化，得纯度＞96%标题化合物。

物理数据：

M.F.：C₂₁H₃₆N₈O₇S₂

M.W.：576.22

FAB：（M+H）⁺577.2;（M-H）^-575.3

AAA：Asp（1.00），Gly（1.15），Mpr+Pen（1.55）

肽含量：65.77%。

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.58

（B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10），R_f＝0.5

2.HPLC：Altex Ultrasphere

ODS，4.5mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：10%乙腈/水-0.1%TFA，K¹＝6.11

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，0-50%（在20分钟内），K¹＝10.93

实施例10

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂：

用与实施例1相同的方法，在1.0mmol的规模上，制备、断裂、环化和离析所保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Cys（SEt）-Arg（Tos）-Gly-Asp（OBzL）-Pen（4-MBzL）-MBHA，给出400mg（65%）。用（B∶A∶W，4∶1∶5），并用Sephadex

G-25分配色谱纯化，得纯度＞97%的标题化合物。

物理数据：

M.F.：C₂₂H₃₇N₉O₈S₂

M.W.：619.711

FAB：（M+H）⁺620.2，（M-H）^-618.7

AAA：Asp（1.00），Gly（1.01），Cys（1.00），Arg（0.67）

肽含量：95.6%

色谱数据：

1.TLC（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.37

（B∶W∶I∶C，65∶20∶15∶3），R_f＝0.097

2.HPLC：Vydac 218 TP ODS柱，4.6mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：6%乙腈/水-0.1%TFA，K¹＝2.2

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，0-50%A（在15分钟内），K¹＝3.7

实施例11

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Arg-Gly-Asp-D-Pen-NH₂：

用与实施例1相同的方法，在1.5mmol的规模上，制备、断裂、环化和离析出被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Cys（SEt）-Arg（Tos）-Gly-Asp（OBzL）-D-Pen（4-MBzL）-MBHA。用快速色谱法纯化该肽，其中用中压ODS反相柱和15%甲醇/水-0.1%TFA的洗脱剂。得50mg（5.4%）纯度大于96%的标题化合物。

物理数据：

M.F.：C₂₂H₃₇N₉O₈S₂

M.W.：619.711

FAB：（M+H）⁺620.2（M-H）^-618.8

AAA：Asp（1.00），Gly（1.03），Arg（0.88）

肽含量：54%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.42

（B∶W∶I∶C，65∶20∶15∶3），R_f＝0.11

2.HPLC：Vydac 218 TP ODS柱，4.6mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：5%乙腈/水-0.1%TFA，K¹＝2.7

梯度：A：乙腈/H₂O-0.1%TFA，0-50%A（在15分钟内），K¹＝3.3

实施例12

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Lys-Gly-Asp-Pen-NH₂：

用与实施例1相同的方式，在2.0mmol的规模上，制备、断裂、环化和离析被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Cys（SEt）-Lys（Clz）-Gly-Asp（OBzL）-Pen（4-MBzL）-MBHA。粗肽通过Amberlite

XAD-2柱，用50%乙腈/水-0.1%TFA洗脱。用快速色谱法纯化，其中用中压ODS反相柱，用5%乙腈/水-0.1%TFA洗脱。得180mg（15%）纯度＞97%的标题化合物。

物理数据：

M.F.：C₂₂H₃₇N₇O₈S₂

M.W.：591.698

FAB：（M+H）⁺592.3，（M-H）^-591

AAA：Asp（1.00），Gly（1.13），Lys（1.09），Cys（2.25）

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.38

2.HPLC：Vydac 218 TP ODS柱，4.6mm×25cm，在220nm检测。

同溶剂：3%乙腈/水-0.1%TFA，K¹＝3.5

梯度：A：乙腈;B：H₂O-0.1%TFA，0-50%A（在15分钟内），K¹＝2.9

实施例13

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-HArg-Gly-Asp-Pen-NH₂：

将肽N^α-Ac-Cys-Lys-Gly-Asp-Pen-NH₂（100mg，0.17mmol）加到O-甲基异脲硫酸氢盐（290mg，1.7mmol）的2.5MNaOH溶液中，并调节pH至11。室温静置过夜后，将反应混合物经过Amberlite XAD-2柱，用50%乙腈/水-0.1%TFA洗脱。用快速色谱法纯化，其中用中压ODS反相柱和10%乙腈/水-0.1%TFA洗脱，得40mg（37%）纯度为95%的标题肽。

物理数据：

M.F.：C₂₃H₃₉N₉O₈S₂

M.W.：633.74

FAB：（M+H）⁺634.2，（M-H）^-632.3

AAA：Asp（1.00），Gly（1.16），Cys（2.45）

肽含量：68.9%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.44

（B∶W∶I∶C，65∶20∶15∶3），R_f＝0.19

2.HPLC：Vydac 218 TP ODS柱，4.5mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：4%乙腈/H₂O-0.1%TFA，K¹＝2.0

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，0-50%A（在15分钟内），K¹＝3.2

实施例14

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂：

用与实施例1相同的方式，在1.0mmol的规模上，制备、断裂、环化和离析出被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Cys（SEt）-MeArg（Tos）-Gly-Asp（OBzL）-Pen（4-MBzL）-MBHA.用快速色谱法纯化，其中用中压ODS反相柱和用5%乙腈/水-0.1%TFA洗脱剂。得209mg（35%）纯度为95%的标题化合物。

物理数据：

M.F.：C₂₃H₃₉N₉O₈S₂

M.W.：633.738

FAB：（M+H）⁺634.7

AAA：Asp（1.00），Gly（0.98），Cys（1.06）

肽含量：66%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.62

（B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10），R_f＝0.39

2.HPLC：Altex Ultrasphere ODS，4.5mm×25cm，在220nm处检验。同溶剂：5%乙腈/H₂O-0.1%TFA，K¹＝2.39

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，5-50%（在20分钟内），K¹＝4.16

实施例15

制备N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NHEt

a）.制备Boc-Ser（BzL）-NHEt

在-15℃将氯甲酸异丁酯（2.7mL，20.8mmol）加到Boc-Ser（BzL）（6.0mg，20.3mmol）和N-甲基吗啉（2.3mL，20.9mmol）的50mL THF的溶液中。搅拌溶液几分钟，气体乙胺以鼓泡通过混合物。该混合物在-15℃搅拌30分钟。然后过滤，并将滤液浓缩至干。生成的残余物溶于乙酸乙酯（100mL）中，连续地用1M HCl（2×50mL），水（50mL），10%Na₂CO₃（2×50mL）和盐水（50mL）洗涤。有机层在无水硫酸钠上干燥、过滤和浓缩，得6.0mg白色粉末。用NMR数据证实该结构。

b）.制备Boc-Asp（OBzL）-Ser（BzL）-NHEt

室温下40分钟内用无水TFA（10mL/mg）脱去实施例15（a）化合物的Boc保护基团。除去TFA，用重量法测定残余物TFA。用实施例12（a）的步骤，从Boc-Asp（OBzL）（5.82g，18mmol），Boc-Ser（BzL）NHEt（10.4g，18mmol），N-甲基吗啉（8mL，73mmol）和氯甲酸异丁酯（2.4mL，18mmol）中，制备二肽。给出玻璃状物质。用NMR证实该结构。

c）.制备Boc-Asp-Ser（BzL）-NHEt

将5%Pd/BaSO₄（2.0g）加到4.0g15（b）的乙酸乙酯（100mL）和甲醇（25mL）溶液中，并将该混合物于Parr Shaker上在45psi氢压力下氢解30分钟。过滤该混合物，浓缩滤液，得3.18g白色玻璃状物质。用NMR证实本结构。

d）.制备Boc-Asp（O-苄基树脂）-Ser（BzL）-NHEt

用4-吡咯烷吡啶（0.15g，1mmol）和DCC（620mg，3mmol）于二氯甲烷中，将实施例15（c）（1.31g，3mmol）的化合物偶联到羟甲基树脂上（1%交联，1g，1mmol）。

e）.制备Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NHEt

肽-树脂中间体，Ac-Arg-Gly-Asp（OBzL-树脂）-Ser（BzL）-NHEt的制备是从实施例15（d）的化合物得来。用实施例1所述的方法，通过顺序地偶联Boc-Gly和Boc-Arg（Tos），从树脂上断裂和脱去保护基即可。用反相ODS硅胶柱和5%乙腈/水-0.1%TFA洗脱剂的快速色谱法纯化该肽，得173mg纯度＞95%标题肽。

物理数据：

M.F.：C₁₉H₃₄N₈O₈

M.W.：502.53

FAB：（M+H）⁺503.0

AAA：Asp（1.08），Gly（1.00），Ser（1.02），Arg（1.07）

肽含量：76.36%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.38

（B∶W∶IP∶CA，6.5∶2∶1.5∶0.3），R_f＝0.08

2.HPLC：Vydac 218 TP ODS，4.6mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：5%乙腈/H₂O-0.1%TFA，K¹＝0.4

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，0-10%A（在10分钟内），K¹＝3.5

用相同的步骤，以二-n-丁胺取代乙胺给出N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-N（C₄H₉）₂.

实施例16

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NHEt

a）.制备Boc-Pen（4-MBzL）-NHEt

用与实施例15（a）相同的方法，用Boc-Pen（4-MBzL）制备保护的标题氨基酸。

b）.制备Fmoc-Asp（O-tBut）-Pen（4-MBzL）-NHEt

根据实施例15（b）的步骤，制备标题化合物。

c）.制备Fmoc-AsP（O-苄基-树脂）-Pen（4-MBzL）NHEt

用无水TFA于室温搅拌40分钟脱去实施例16（b）化合物的Boc保护基团。除去TFA，用重量法测定残余物TFA。生成的残余物在乙酸乙酯/己烷中重结晶，得1.88g（2.5mmol）TFA盐。然后用4-吡咯烷吡啶（催化剂量）和DCC（2.5mmol）在二氯甲烷中，将它偶联到羟甲基树脂上（1%交联，1.82g，1.0mmol）。

d）.制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NHEt

被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Cys（SEt）-Arg（Tos）-Gly-Asp（O-BzL-树脂）-Pen-NHEt，是从实施例16（c）的化合物得到。它是用Boc-Gly，Boc-Arg（Tos），Boc-Cys（SEt）顺序地偶联，并用20%哌啶于DMF中脱去保护的Fmoc基团后再乙酰后制得。然后相似于实施例1的方法，断裂、环化和离析。用中压ODS反相柱和用15%乙腈/水-0.1%TFA洗脱剂的快速色谱法纯化，得307mg（48%）纯度为97%的标题肽。

物理数据：

M.F.：C₂₄H₄₁N₉O₈S₂

M.W.：647.77

FAB：（M+H）⁺648.3，（M-H）^-646.7

AAA：Asp（1.00），Gly（1.04），Arg（1.03）

肽含量：69.5%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.53

（B∶W∶I∶C，65∶20∶15∶3），R_f＝0.16

2.HPLC：Vydac 218 TP ODS柱，4.5mm×25cm在220nm处检测。

同溶剂：9%乙腈/H₂O-0.1%TFA，K¹＝1.6

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，

0-50%A（在15分钟内），K¹＝3.9

实施例17

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-D-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂：

用与实施例1相同的方法，在1.0mmol的规模上，制备、断裂、环化和离析被保护的肽-树脂中间体，N^a-Ac-Cys（SEt）-D-Arg（Tos）-Gly-Asp（OBzL）-Pen（4-MBzL）-MBHA.用中压ODS反相柱和6%乙腈/水-0.1%TFA洗脱剂的快速色谱法纯化，得300mg（50%）纯度为95%的标题化合物。

物理数据：

M.F.：C₂₂H₃₇N₉O₈S₂

M.W.：619.73

FAB：（M+H）⁺620.4，（M-H）^-619

AAA：Asp（1.00），Gly（1.03），Cys（2.42），Arg（1.01）.

肽含量：71.1%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.31

（B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10），R_f＝0.54

2.HPLC：Altex Ultrasphere

ODS，4.5mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：6%乙腈/H₂O-0.1%TFA，K¹＝5.2

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，5-50%（在20分钟内），K¹＝3.9

实施例18

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Tyr-Cys-NH₂：

用与实施例1相同的方法，在1.0mmol规模上，制备、断裂、环化和离析被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Cys（SEt）-MeArg（Tos）-Gly-Asp（OBzL）-Tyr（BrZ）-Cys（4-MBzL）-MBHA.用中压ODS反相柱和11%乙腈/水-0.1%TFA洗脱剂的快速色谱法纯化，得350mg（45%）标题化合物。用Sepha-dex

G-15硅胶过滤，用0.2M乙酸洗脱进一步纯化，得纯度为95%标题肽。

物理数据：

M.F.：C₃₀H₄₄N₁₀O₁₀S₂

M.W.：768.27

FAB：（M+H）⁺769.3，（M-H）^-767.8

AAA：Asp（1.00），Gly（1.00），Cys（1.91），Tyr（1.02）

肽含量：82.75%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.65

（B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10），R_f＝0.78

2.HPLC：Altex Ultrasphere ODS，4.5mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：9%乙腈/H₂O-0.1%TFA，K¹＝6.4

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，5-50%A（在20分钟内），K¹＝5.5

实施例19

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Pen-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂

用与实施例1相同的方法，在1.0mmol规模上，制备、断裂和离析被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Pen（4-MBzL）-MeArg（Tos）-Gly-Asp（Ochx）-Pen（4-MBzL）-MBHA.用0.01%K₃Fe（CN）₆溶液将肽环化。用10%乙腈/水-0.1%TFA从ODS反相柱中洗脱肽，得395mg（60%）标题化合物。用0.2M乙酸洗脱，用Sephadex G-1.5硅胶过滤进一步纯化，得纯度为95%的标题化合物。

物理数据：

M.F.：C₂₅H₄₃N₉O₈S₂

M.W.：661.27

FAB：（M+H）⁺662.3，（M-H）^-660.1

AAA：Asp（1.00），Gly（1.03）

肽含量：43.7%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.6

（B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10），R_f＝0.56

2.HPLC：Altex Ultrasphere

ODS，4.5mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：10%乙腈/水-0.1%TFA，K¹＝4.4

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，1-50%（在20分钟内），K¹＝6.8

实施例20

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Pen-Arg-Gly-Asp-Cys-NH₂：

用与实施例1相同的方法，在1.0mmol规模上，制备、断裂、环化和离析被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Pen（4-MBzL）-Arg（Tos）-Gly-Asp（Ochx）-Cys（SEt）-MBHA.用5%乙腈/水-0.1%TFA从ODS反相柱中洗脱该肽，得400mg（65%）标题化合物。用0.2M乙酸溶液洗脱，用Sephadex

G-15硅胶过滤进一步纯化，得纯度为95%标题肽。

物理数据：

M.F.：C₂₂H₃₇N₉O₈S₂

M.W.：619.22

FAB：（M+H）⁺620.2，（M-H）^-618.9

AAA：Asp（1.00），Gly（1.07），Arg（0.85）

肽含量：62.4%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.61

（B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10），R_f＝0.69

2.HPLC：Altex Ultrasphere ODS，4.5mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：3%乙腈/H₂O-0.1%TFA，K¹＝8.4

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，1-50%A（在20分钟内），K¹＝5.8

实施例21

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-D-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂：

用与实施例1相同的方法，在1.0mmol规模上，制备、断裂、环化和离析被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Cys（SEt）-D-Arg（Tos）-Gly-Asp（Ochx）-Ser（BzL）-Cys（4-MBzL）-MBHA.用5%乙腈/水-0.1%TFA从柱中洗脱该肽，得370mg（55%）标题化合物。用0.2M乙酸洗脱，用Sephadex G-15硅胶过滤进一步纯化，得纯度为95%的标题肽。

物理数据：

M.F.：C₂₃H₃₈N₁₀O₁₀S₂

M.W.：678.22

FAB：（M+H）⁺679.2，（M-H）^-677.2

AAA：Asp（1.00），Gly（1.13），Ser（0.86），Cys（2.02），Arg（1.21）

肽含量：45.5%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.47

（B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10），R_f＝0.62

2.HPLC：Altex Ultrasphere

ODS，4.5mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：3%乙腈/H₂O-0.1%TFA，K¹＝3.6

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，1-50%A（在20分钟内），K¹＝5.3

实施例22

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Sar-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂：

用与实施例1相同的方法，在1.0mmol的规模上，制备、断裂、环化和离析被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Cys（SEt）-Sar-Arg（Tos）-Gly-Asp（Ochx）-Pen（4-MBzL）-MBHA.用7%乙腈/水-0.1%TFA从柱中洗脱该肽，得600mg（87%）标题化合物。用0.2M乙酸洗脱，用Sephadex

G-15硅胶过滤进一步纯化，得纯度为95%的标题肽。

物理数据：

M.F.：C₂₅H₄₂N₁₀O₉S₂

M.W.：690.26

FAB：（M+H）⁺691.2，（M-H）^-689

AAA：Asp（1.00），Gly（1.14），Arg（1.04）

肽含量：78.8%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.53

（B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10），R_f＝0.67

2.HPLC：Altex Ultrasphere ODS，4.5mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：7%乙腈/H₂O-0.1%TFA，K¹＝4.2

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，1-50%A（在20分钟内），K¹＝6.5

实施例23

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-NH₂：

用与实施例1相同的方法，在1.0mmol规模上，制备、断裂、环化和离析被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Cys（SEt）-Arg（Tos）-Gly-Asp（Ochx）-Cys（4-MBzL）-MBHA.用3%乙腈/水-0.1%TFA，从ODS反相柱中洗脱该肽，得280mg（47%）标题化合物。进一步用0.2M乙酸洗脱，用Sephadex

G-15硅胶过滤纯化，得纯度为95%的标题肽。

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.49

（B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10），R_f＝0.45

2.HPLC：Altex Ultrasphere

ODS，4.5mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：3%乙腈/H₂O-0.1%TFA，K¹＝2.7

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，1-50%A（在20分钟内），K¹＝5.0

实施例24

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-（Et₂）Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂

用与实施例1相同的方式，在1.0mmol的规模上，制备、断裂、环化和离析被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Cys（SEt）-（Et₂）Arg-Gly-Asp（Ochx）-Pen-MBHA.用9%乙腈/水-0.1%TFA，从柱中洗脱该肽，得590mg（87%）标题肽。进一步用0.2M乙酸洗脱，用Sephadex G-15硅胶过滤纯化，得纯度为95%的标题肽。

物理数据：

M.F.：C₂₆H₄₅N₉O₈S₂

M.W.：675.82

FAB：（M+H）⁺676.4

AAA：Asp（1.00），Gly（1.12）

肽含量：51.77%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.45

（B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10），R_f＝0.64

2.HPLC：Altex Ultrasphere

ODS，4.6mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：9%乙腈/H₂O-0.1%TFA，K¹＝3.2

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，5-50%A（在20分钟内），K¹＝4.2

实施例25

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-D-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂

用与实施例1相同的方式，在1.0mmol的规模上，制备、断裂、环化和离析被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Cys（SEt）-D-MeArg（Tos）-Gly-Asp（Ochx）-Pen-MBHA.用美国专利4，678，758所述的L-异构体的同样方法，制备Boc-D-MeArg（Tos）。用7%乙腈/水-0.1%TFA，从柱中洗脱该肽，得450mg（71%）标题肽。进一步用0.2M乙酸洗脱，用Sephadex G-15硅胶过滤纯化，得标题肽。

实施例26

制备N^α-Ac-N^α-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂

用实施例1中所述的在0.5mmol规模上的固相法制备被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-MeArg（Tos）-Gly-Asp（OBzL）-Ser-（BzL）-BHA.用HF断键和用无水***洗涤后，用冰醋酸提出肽，并冰冻干燥得75.8mg（31%）。用0.2M乙酸洗脱，用Sephadex

G-15硅胶过滤纯化。标题化合物洗脱三个馏份，得60.6mg，纯度＞96%。

物理数据：

M.F.：C₁₈H₃₂N₈O₈

M.W.：488.501

FAB：（M+H）⁺489.5

AAA：Asp（1.00），Ser（0.48），Gly（1.09）

色谱数据：

TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.25;

（B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10），R_f＝0.31

实施例27

制备N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NH₂

用与实施例26相同的方法，在0.5mmol的规模上，制备、断裂和离析被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Arg（Tos）-Gly-Asp（OBzL）-BHA.用B∶A∶W，4∶1∶5以逆流分布法（CCD）纯化该肽。240mg转移物产生80.8mg四个馏份。

物理数据：

M.F.：C₁₇H₃₀N₈O₈

M.W.：474.474

FAB：（M+H）⁺475

AAA：Asp（0.99），Ser（0.24），Gly（1.03），Arg（1.00）

色谱数据：

TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.2;

（B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10），R_f＝0.49

实施例28

制备N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-Tyr-NH₂

用与实施例27相同的方法，在0.5mmol的规模上，制备、断裂和离析被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Arg（Tos）-Gly-Asp（OBzL）-Tyr（BrZ）-BHA。用0.2M乙酸洗脱，用Sephadex G-15硅胶过滤纯化该肽。得142.1mg标题肽。

物理数据：

M.F.：C₂₃H₂₄N₈O₈

M.W.：550.57

FAB：（M+H）⁺551

AAA：Asp（1.00），Gly（1.02），Tyr（1.00），Arg（0.90）

色谱数据：

TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.41;

（B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10），R_f＝0.4

实施例29

制备N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-NH₂

用与实施例27相同的方法，在0.5mmol的规模上，制备、断裂和离析被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Arg（NO₂）-Gly-Asp（OBzL）-BHA.用B∶A∶W，4∶1∶5，通过CCD的方法来纯化，得98.6mg的四个馏份。用0.2M乙酸洗脱，用Sephadex

G-15硅胶过滤进一步纯化该肽，给出65.7mg的几个馏份。

物理数据：

M.F.：C₁₄H₂₅N₇O₆

M.W.：387.389

FAB：（M+H）⁺388

AAA：Asp（1.00），Gly（1.13），Arg（0.93）

色谱数据：

TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.2

（B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10），R_f＝0.44

实施例30

制备N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-D-Ser-NH₂

用与实施例27相同的方法，在1.0mmol的规模上，制备、断裂和离析被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Arg（Tos）-Gly-Asp（OBzL）-D-Ser（BzL）-BHA.用中压ODS反相柱和0.5%乙腈/水-0.1%TFA洗脱剂进行快速色谱纯化，得337mg纯度为95%的标题肽。

物理数据：

M.F.：C₁₇H₃₀N₈O₈

M.W.：474.474

FAB：（M+H）⁺475.3;（M-H）^-473.5

AAA：Asp（1.00），Ser（0.99），Gly（0.96），Arg（1.01）

肽含量：44.8%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.3

2.HPLC：Vydac 218 TP ODS柱，4.6mm×25cm，在220nm处检测。

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，0-

50%A（在30分钟内），K¹＝3.4

实施例31

制备N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-Val-NH₂

类似于实施例27的方法，在1.0mmol的规模上，制备、断裂和离析被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Arg（Tos）-Gly-Asp（OBzL）-Val-MBHA.用中压ODS反相柱和用15%甲醇/水-0.1TFA洗脱剂的快速色谱法纯化。得125mg纯度＞95%的标题肽。

物理数据：

M.F.：C₁₉H₃₄N₈O₇

M.W.：486.528

FAB：（M+H）⁺487.3;（M-H）^-485.9

AAA：Asp（1.00），Gly（0.99），Val（1.06），Arg（0.96）

肽含量：79.6%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.43

（B∶W∶IP∶CA，6.5∶2∶1.5∶0.3），R_f＝0.11

2.HPLC：Vydac 218 TP ODS柱，4.6mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：5%乙腈/H₂O-0.1%TFA，K¹＝1.3

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，6-50%A（在15分钟内），K¹＝0.84

实施例32

制备N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-Nal-NH₂

用与实施例27相同的方法，在1.0mmol的规模上，制备、断裂和离析被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Arg（Tos）-Gly-AsP（OBzL）-Nal-MBHA.用中压ODS反相柱和40%甲醇/水-0.1%TFA的色谱法纯化。得57mg纯度＞98%的标题肽。

物理数据：

M.F.：C₂₇H₃₆N₈O₇

M.W.：584.632

FAB：（M+H）⁺585.3;（M-H）^-583.9

AAA：Asp（1.00），Gly（0.99），Arg和Nal存在，但共同洗脱。

肽含量：81.3%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.60

（B∶W∶IP∶CA，6.5∶2∶1.5∶0.3），R_f＝0.23

2.HPLC：Vydac 218 TP ODS柱，4.6mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：18%乙腈/H₂O-0.1%TFA，K¹＝1.2

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，15-50%A（在15分钟内），K¹＝2.1

用Boc-（Me）Thr取代这一步骤中的Boc-Nal给出N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-（Me）Thr-NH₂.

用Boc-Nva取代这一步骤中的Boc-Nal给出N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-Nva-NH₂.

用Boc-Nle取代这一步骤中的Boc-Nal给出N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-Nle-NH₂.

实施例33

制备N^α-Ac-Arg-Arg-Gly-Asp-Phe-NH₂

用与实施例27相同的方法，在1.0mmol的规模上，制备、断裂和离析被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Arg（Tos）-Arg（Tos）-Gly-Asp（Ochx）-Phe-BHA.用中压ODS反相柱和8%乙腈/水-0.1%TFA洗脱剂的快速色谱法纯化。得303.4mg纯度为98%的标题肽。

物理数据：

M.F.：C₂₉H₄₆N₁₂O₈

M.W.：690.356

FAB：（M+H）⁺691，（M-H）^-690

AAA：Asp（1.00），Gly（1.00），Phe（0.91），Arg（1.89）

肽含量：56.3%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.4

（B∶A∶W∶P，15∶3∶8∶10），R_f＝0.4

2.HPLC：Ultrasphere ODS，4.6mm×25cm，

在220nm处检测。

同溶剂：10%乙腈/H₂O-0.1%TFA，K¹＝2.78

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，10-50%（在20分钟内），K¹＝2.8

用Boc-HArg（TOS）取代上面合成序列中添加到树脂上的第五个残基的Boc-Arg（Tos）和用Boc-（4′-Me）Phe取代第一

个残基上的Boc-Phe给出N^α-Ac-HArg-Arg-Gly-Asp-（4′-Me）Phe-NH₂.

用Boc-（Et₂）₂Arg取代上面合成序列中添加到树脂上的第五个残基和用Boc-His（Tos）取代第一个残基上的Boc-Phe给出N^α-Ac-（Et₂）Arg-Arg-Gly-Asp-His-NH₂.

用Boc-Ala取代上面合成序列中添加到树脂上的第五个残基Boc-Arg（Tos）和用Boc-Ile取代第一个残基Boc-Phe给出N^α-Ac-Ala-Arg-Gly-Asp-Ile-NH₂.

实施例34

制备N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-NH-CH₂-CH₂-C₆H₅

a）.制备Boc-Asp（OBzL）-NH-（CH₂）₂C₆H₅

在-15℃，将氯甲酸异丁酯（15.5mmol）加到氩气流的Boc-Asp（OBzL）（5.0g，15.5mmol）和N-甲基吗啉（15.5mmol）的50mL无水THF的搅拌溶液中。几分钟后加入苯乙胺（2.0mL，15.5mmol）的15mL无水THF溶液，混合物在-15℃维持15分钟，并热至室温。再搅拌2小时后，过滤反应混合物，在真空下将滤液浓缩至干。所生成的残余物溶于乙酸乙酯（100mL），连续地用1MHCl（2×50mL），水（50mL），10%Na₂CO₃（2×50mL）和盐水（50mL）洗涤。有机层在无水硫酸钠上干燥，过滤和浓缩，得5.59mg（85%）无定形白色固体。

b）.制备Boc-Gly-Asp（OBzL）-NH-（CH₂）₂-C₆H₅

室温30分钟，用无水TFA（10mL/g）处理除去实施例12（a）（4.18g，12.8mmol）化合物的Boc-保护基。在真空下除去TFA，用重量法测定残余物TFA。用12（a）的方法，将Boc-Gly（2.24mg，12.8mmol）偶联到游离胺上。用3∶1乙酸乙酯-己烷混合物洗脱硅胶柱的色谱法纯化，得3.35g（54%）浅黄色玻璃状物质。

c）.制备Boc-Arg（Tos）-Gly-Asp（OBzL）-NH-（CH₂）₂C₆H₅

除去实施例12（b）化合物中的Boc-保护基团（2.61g，6.8mmol），并用实施例12（b）的方法，将生成的二肽偶联到Boc-Arg（Tos）（3.4g，6.8mmol）上。用乙酸乙酯-异丙醇混合物1∶1作洗脱剂的硅胶柱的快速色谱法纯化，得3.41g（63%）白色玻璃状物质。

d）制备Ac-Arg（Tos）-Gly-Asp（OBzL）NH-（CH₂）₂C₆H₅

用实施例12（b）所述的方法，脱去实施例12（c）化合物的保护基。游离碱（2.92g，4.2mmol）和醋酸酐（2.0ml，21.2mmol）溶于30mlDMF中，并用二异丙基乙胺0.73ml（4.2mmol）处理。反应混合物搅拌30分钟，并在真空下浓缩至干。用1∶1乙酸乙酯-异丙醇混合物洗脱，用硅胶柱的快速色谱法提纯，得2.94g（95%）白色玻璃状物质。

（e）制备 Ac-Arg-Gly-Asp-NH-（CH₂）₂C₆H₅

在0℃，30分钟内用无水HF（25ml）处理实施例12（d）（2.5g）被保护肽和苯甲醚（2.5ml）。HF蒸出后，用1M乙酸（3×50ml）处理肽-苯甲醚混合物，并用无水***（3×100ml）洗涤水溶液。水提物冷冻干燥得1.52g。用40%甲醇/水-0.1%TFA洗脱的ODS柱，进行快速色谱法纯化。得326mg97%纯度标题肽。

物理数据：

M.F.：C₂₂H₃₃N₇O₆

M.W.：491.547

FAB：（M+H）⁺492.1;（M-H）^-490.6

AAA：Asp（0.51），Gly（0.99），Arg（1.00）

肽含量：81.2%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.58;（B∶W∶IP∶CA，6.5∶2∶1.5∶0.3），R_f＝0.17

2.HPLC：Vydac 218 TP ODS柱，4.6mm×25cm，220nm检测

同溶剂：12%乙腈/水-0.1%TFA。K¹＝2.3

梯度：A：乙腈 B：水-0.1%TFA在15分钟内10～50%A，K¹＝2.2

用同样步骤，用苯胺取代苯乙胺，给出N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-NHC₆H₅

实施例35

制备N^α-Ac-MeArg-Gly-Asp-Phe-NH₂

用与实施例26同样的方法，制备、从树脂中断裂、离析被保护肽-树脂中间体，N^α-Ac-MeArg（Tos）-Gly-Asp-Phe-BHA，得标题肽。

物理数据：

M.F.：C₂₄H₃₆N₈O₇

M.W.：548.270

FAB：（M+H）⁺549.2，（M-H）^-547.8

AAA：Asp（1.00），Gly（1.00），Phe（1.05），MeArg（1.18）

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.52

（B∶A∶W∶P，15∶3∶8∶10），R_f＝0.46

2.HPLC：Ultrasphere

，DDS，4.6mm×25cm，在220nm检测

同溶剂：10%乙腈/水-0.1%TFA，K¹＝3.43

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA在20分钟内10-50%A。K¹＝3.6

实施例36

制备N^α-Ac-HArg-Gly-Asp-Ser-NH₂

用与实施例26相同的方法，制备、从树脂中裂解和离析被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Lys（Clz）-Gly-Asp（OBzL）-Ser（BzL）-BHA，得N^α-Ac-Lys-Gly-Asp-Ser-NH₂.将溶于0.1M NaOH（1ml，用4M NaOH调PH至11）中的O-甲基异脲硫酸氢盐（0.34g，1.97mmol）溶液加到溶于2mL碳酸盐缓冲溶液（pH＝10.5）的二肽（100mg，0.197mmol）的溶液中。室温下静置过夜后反应进行二次色谱（Sephadex G-10，在水中溶胀，用0.1M水合乙酸洗脱），并将纯化的肽冷冻干燥，得48mg的标题肽。

物理数据：

M.F.：C₁₈H₃₂N₈O₈

M.W.：488.50

FAB：（M+H）⁺489.2，（M-H）^-487.7

AAA：Asp（1.00），Ser（0.97），Gly（0.99），Cys（0.21），HArg（0.88）

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.33

（B∶W∶IP∶CA，6.5∶2∶1.5∶0.3），R_f＝0.04

2.HPLC：Altex Ultrasphere

ODS，4.5mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：3%乙腈/H₂O-0.1%TFA，K¹＝0.8

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，0-50%（在15分钟内），K¹＝2.1

实施例37

制备N^α-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂

用与实施例26相同的方法（删去乙酰化步骤）制备和从树脂中断裂被保护的肽-树脂中间体，MeArg（Tos）-Gly-Asp（OBzL）-Ser（BzL）-BHA.用与实施例26相同的方法，纯化游离肽，产生标题肽。

物理数据：

M.F.：C₁₆H₃₀N₈O₇

M.W.：446.22

FAB：（M+H）⁺447.2，（M-H）^-445.6

AAA：Asp（1.00），Ser（0.95），Gly（1.00），MeArg（1.00）

肽含量：76.74%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.26

（B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10），R_f＝0.31

2.HPLC：Ultrasphere

ODS，4.6mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：H₂O-0.1%TFA，K¹＝0.66

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，0-50%A（在20分钟内），K¹＝0.64

实施例38

制备N^α-甲酰基-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂

用通常的方法，在0.5mmol的规模上，制备被保护的肽-树脂中间体，MeArg（Tos）-Gly-Asp（OBzL）-Ser（BzL）-BHA.用HF脱去末端氨基酸基团保护基后，用乙酸酐（1mL）的甲酸（98%，7mL）的混合物处理树脂-支撑肽。从树脂中连续断裂得标题肽。

物理数据：

M.F.：C₁₇H₃₀N₈O₈

M.W.：474.219

AAA：Asp（1.00），Ser（0.97），Gly（0.98）

肽含量：78.15%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.37

（B∶A∶W∶P，15∶5∶10∶10）R_f＝0.34

2.HPLC：Ultrasphere

ODS，4.6mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：1%乙腈/H₂O-0.1%TFA，K¹＝2.02，2.69（顺式/反式N-甲酰基异构体）

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，0-50%A（在20分钟内），K¹＝2.17

实施例39

制备Gly-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂

如实施例26的方法，从树脂中制备和断裂被保护的肽-树脂中间体，Boc-Gly-MeArg（Tos）-Asp（Ochx）-Ser（BzL）-BHA.用中压ODS反相柱和1%乙腈/水-0.1%TFA洗脱剂的闪烁色谱法纯化游离肽。在四个馏份中得406mg（80%）纯度＞95%的标题肽。

物理数据：

M.F.：C₁₈H₃₃N₉O₈

M.W.：503.245

FAB：（M+H）⁺504，（M-H）^-502

AAA：Asp（1.00），Ser（0.94），Gly（1.96），N-MeArg（0.98）

肽含量：69.97%

色谱数据：

1.TLC：（B∶A∶W∶E，1∶1∶1∶1），R_f＝0.29

2.HPLC：Altex Ultrasphere

ODS，4.5mm×25cm，在220nm处检测。

同溶剂：1%乙腈/H₂O-0.1%TFA，K¹＝1.07

梯度：A：乙腈，B：H₂O-0.1%TFA，0-50%A（在20分钟内），K¹＝2.35

实施例40

制备Ala-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂

用与实施例26相同的方法（省去乙酰化步骤），制备被保护的肽-树脂中间体，Ala-MeArg（Tos）-Gly-Asp（OBzL）-Ser（BzL）-BHA.用常规方法以HF从树脂中断裂线型肽，得标题肽。

实施例41

制备N^α-Ac-Ala-Arg-Gly-Asp-OCH₃

用铯盐方法将Boc-Asp-OMe偶联到氯甲基树脂上，得Boc-Asp（O-苄基树脂）-OMe，其中天冬氨酸通过其侧链羧基连在树脂上。每一个被保护氨基酸的三个当量（Boc-Gly，Boc-Arg（Tos）和Boc-Ala）溶于二甲基甲酰胺中，并连续地用等摩尔的二环己基碳二亚胺和1-羟基苯并***进行偶联。偶联的程度测定用定性茚三酮分析方法。必要时，反复偶联。用1∶1三氟乙酸/二氯甲烷处理除去Boc基团，并用二氯甲烷洗涤后，用5%二异丙基乙胺/二氯甲烷产生游离胺。最后偶联和除去Boc基团之后，肽/树脂用二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤干燥。用醋酸酐（10等份）和二异丙基胺（10等份）的混合物乙酰化肽。在苯甲醚的存在下，在0℃用HF处理1小时。从树脂中断裂出脱去保护基的肽。在0℃用蒸发方法除去HF，用***（4×，丢弃）洗涤残余物。并用反相HPLC纯化，生产出标题化合物。

实施例42

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Abu-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂

用与实施例3相同的方法，制备、断裂、环化和离析被保护的肽-树脂中间体，N^α-Ac-Cys（SEt）-Abu-Arg（Tos）-Gly-Asp（OBzL）-Pen（4-MBzL）-MBHA.用中压ODS反相柱的快速色谱法纯化肽，得标题化合物。

用Boc-（Et₂）Arg取代上面合成序列中的第五个残基上的Boc-Abu得N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-（Et₂）Arg-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂.

用Boc-（α-Me）Ala取代上面合成序列中的第五个残基上的Boc-Abu得N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-（α-Me）Ala-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂.

实施例43

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-OCH₃

a）.制备NH₂-Asp（O-苄基-树脂）-Cys（4-MBzL）-OCH₃

在DMF中，H₂N-Cys（4-MBzL）-OMe与3当量Fmoc-Asp（4-tBuo）、3当量1-HOBT和3当量二环己基碳化二亚胺偶联。3小时后，在真空下蒸发DMF，并用乙酸乙酯把肽研制成粉和过滤。用5%碳酸氢钠水溶液和水洗涤滤液。有机相在硫酸镁上干燥、过滤，并在真空下除去溶剂。用硅胶色谱法进一步纯化被保护的二肽。

在0℃下，用50%TFA/二氯甲烷处理Fmoc-Asp（4-tBuo）-Cys（4-MBzL）-OMe1小时，并在真空下蒸发溶剂。该残余物再溶于二氯甲烷、用水洗涤三次，在MgSO₄上短暂干燥有机层。过滤、蒸出溶剂，得Fmoc-Asp-Cys（4-MBzL）-OMe.

用Gisin等人，Helv.Chim.Acta，56，1476（1973）提出的铯盐方法，将二肽的游离羧酸偶联到氯甲基树脂上。用20%哌啶的DMF溶液（3×10毫升）处理支撑肽的树脂。用DMF洗涤树脂三次，得支撑二肽的标题树脂。

b）制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-OCH₃

在实施例43（a）中生成的支撑二肽的树脂，顺序地偶联到Boc-Gly，Boc-MeArg（Tos）和Boc-Cys（SEt）上，乙酰化，用实例1的步骤从树脂上断裂和环化。用反相HPLC来纯化标题肽。

除了起始物质用H₂N-Cys（4-MBzL）-OEt和（α-Me）HArg（Tos）取代上面合成序列以外，使用类似步骤，可以给出N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-（α-Me）HArg-Gly-Asp-Cys-OEt.

实施例44

制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-NHEt：

a）制备H₂N-Cys（4-MBzL）-NHEt

Boc-Cys（4-MBzL）-OCH₃溶于甲醇，冷却到0℃加入1体积乙胺（预冷至0℃）。反应混合物盖紧，并在室温下搅拌八天。反应物再冷至10℃，放空，在真空下除去溶剂。残余物溶于二氯甲烷，用1体积TFA处理，并在室温搅拌1小时。用硅胶色谱法纯化标题乙酰胺。

b）制备H₂N-Asp（O-苄基-树脂）-Cys（4-MBzl）-NHEt

以实施例44（a）的乙酰胺取代在21（a）步骤中的H₂N-（4-MBzL）Cys-OMe，偶联到Fmoc-Asp（4-tBuo），连在氯甲基树脂上，放出游离胺，生成标题化合物。

c）制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-NHEt

实施例44（b）中的支撑二肽树脂，顺序地偶联到Boc-Gly，Boc-MeArg（Tos）和Boc-Cys（SEt）上，乙酰化，用实施例1的步骤从树脂中断裂和环化。用反相HPLC纯化标题五肽。

除了以异丙胺代替乙胺和开始步骤用Boc-Pen（4-MBzl）-OCH₃以外，使用同样步骤，得N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NHC₃H₇.

实施例45

用适当被保护氨基酸取代实施例4或11中上面合成序列，得如下的线性肽：

a）N^α-Ac-Pro-Arg-Gly-Asp-NH₂;

b）N^α-Ac-MeArg-Gly-Asp-Nle-NH₂;

c）N^α-Ac-MeArg-Gly-Asp-Met-NH₂;

d）N^α-Ac-HArg-Gly-Asp-Leu-NH₂;

e）N^α-Ac-MeArg-Gly-Asp-Trp-NH₂;

f）N^α-Ac-MeArg-Arg-Gly-Asp-Thr-NH₂;

g）N^α-Ac-Ala-MeArg-Gly-Asp-（Me）Ser-NH₂;

h）N^α-Ac-Arg-（Et₂）Arg-Gly-Asp-Ala-NH₂;

i）N^α-Ac-Abu-MeArg-Gly-Asp-D-Phe-NH₂;

j）N^α-Ac-MeArg-Gly-Asp-D-（Et）Tyr-NH₂;

k）N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-HPhe-NH₂;和

l）N^α-Ac-MeArg-Gly-Asp-（Me）Cys-NH₂.

实施例46

依据实施例1或20，将适当被保护氨基酸取代上面合成序列，得下述的环肽：

a）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

b）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-Cys-HArg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

c）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-D，L-APmp-Arg-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

d）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-Cys-MeArg-Arg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

e）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-Pen-Pro-Arg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

f）Cyclo（S，S）-Mpa-Arg-（Et₂）Arg-Gly-Asp-（4′-Cl）Phe-D，L-APmp-NH₂

g）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-Pen-Ala-MeArg-Gly-Asp-Trp-Cys-NH₂

h）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-Cys-HArg-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-NH₂;

i）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-Cys-MeArg-Gly-Asp-（Me）Thr-Cys-NH₂;

j）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-Cys-HArg-Gly-Asp-（Et）Tyr-D，L-APmp-NH₂;

k）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-D，L-APmp-Arg-Gly-Asp-Leu-Cys-NH₂;

l）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-Cys-Arg-Gly-Asp-His-Pen-NH₂;和

m）Cyclo（S，S）-Mpa-Arg-Gly-Asp-（Me）Ser-Cys-NH₂.

实施例47

制备Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂

用实施例14的方法（省掉乙酰化步骤），制备标题化合物。

实施例48

制备N^α-Phco-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂.

实施例47（0.5mmol）的化合物在二氯甲烷中搅拌，在0℃用三乙胺（1mmol）处理。加苯甲酰氯（0.6mmol），反应物温热到室温。3小时后，用冰水和二氯甲烷稀释反应物。有机层分离，用水和5%碳酸氢钠洗涤，在MgSO₄干燥。蒸出溶剂，用中压ODS反应柱，将残余物进行色谱分析，得标题化合物。

除了以苯乙酰氯取代外，用同样步骤，得N^α-PhCH₂CO-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂

实施例49

制备Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-OH

用15（C）步骤，用4-吡咯烷吡啶（0.15g，1mmol）和DCC（620mg，3mmol）的二氯甲烷溶液，将Boc-Pen（4-MBzl）偶联到羟甲基树脂上（1%交联，1g，1mmol）。用实施例1的步骤，偶联Boc-Asp（OBzl），Boc-Gly，Boc-MeArg（Tos）和Boc-Cys（SEt）;乙酰化，用HF处理和环化，得标题化合物。

实施例50

用上面详细的合成方法，制备下列化合物：

a）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-Cys-（α-Et）HArg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

b）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-Cys-（α-Bzl）Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

c）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-D，L-APmp-MeArg-Gly-Asp-Trp-Cys-NH₂;

d）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-Pen-D-HArg-Gly-Asp-D-Tyr-Cys-NH₂;

e）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-Pen-D-（α-Et）Arg-Gly-Asp-（Et）Ser-Cys-NH₂：

f）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-Cys-D-MeArg-Gly-Asp-D-Phe-Cys-NH₂;

g）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-Cys-D-（α-Et）Arg-Arg-Gly-Asp-D-Cys-NH₂;

h）Cyclo（S，S）-Mpr-D-（α-Me）His-Arg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

i）Cyclo（S，S）-Pmp-D-Ala-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

j）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-Pen-（α-Me，Et₂）Arg-MeArg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

k）N^α-HCO-Cyclo（S，S）-Cys-（α-Me）Ala-Arg-Gly-Asp-（Me）Pen-Cys-NH₂;

l）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-Cys-（Me₂）Arg-MeArg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

m）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-Cys-（α-Et）Gly-HArg-Gly-Asp-D-Cys-NH₂.

n）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-D-Cys-His-（α-Me）HArg-Gly-Asp-Cys-NH₂;和

o）N^α-Ac-Cyclo（S，S）-D-Pen-（α-Me）Abu-Arg-Gly-Asp-D-Pen-NH₂.

实施例51

用上面详述的合成方法，制备如下化合物

a）N^α-Ac-His-MeArg-Gly-Asp-D-Ala-NH₂;

b）N^α-Ac-（Me₂）Arg-Arg-Gly-Asp-D-Tyr-NH₂;

c）N^α-Ac-（α-Me，Me₂）Arg-Gly-Asp-Nal-NH₂;

d）N^α-Ac-（α-Me）HArg-Gly-Asp-（Et）Pen-NH₂;

e）N^α-Ac-（α-Bzl）Arg-Gly-Asp-D-Thr-NH₂;和

f）N^α-PhCO-MeArg-Gly-Asp-D-Leu-NH₂.

实施例52

肠胃外剂量单位组合物：

含实施例1或2的50mg肽的无菌干粉制剂的制备方法如下：20mg肽溶于15ml的蒸馏水中。溶液在无菌条件下过滤进入25ml多剂量的安瓿中，并冷冻却干燥。粉末溶解于20ml5%葡萄糖水溶液（D5W，可再制成静脉或肌内注射液。剂量由注射体积所决定。以后的稀释可通过把这个剂量单位所测定的体积加到另一个D5W的体积中配制用于注射，或者测定的剂量可加到另一种装置中，以配制这种药液，比如在瓶中或袋中，供IV点滴输液用，或供别的注射-输液方法用。

实施例53

口服剂量单位组合物

口服的胶囊是用75mg乳糖和5mg硬脂酸镁与50mg的肽混合研磨而制成。所得粉末过筛，装入有硬凝胶的胶囊中。

实施例54

口服剂量单位组合物

口服的片剂是用20mg蔗糖、150mg硫酸钙二水合物和肽与10%明胶溶液混合，制粒而制成。湿粒过筛、干燥，与10mg淀粉、5mg滑石粉和3mg硬酯酸混合，挤压成片。

上述的说明充分地公开如何制备和使用本发明。然而本发明并不限于在此所述的简明最佳实施例，而是包括在权利要求范围内所有的改进实例。

Claims

1、一种制备式(Ⅰ)化合物或其药物可接受盐的方法

其中：

A为Arg，HArg，(Me₂)Arg，(Et₂)Arg，Ala，Gly，His，Abu或一种它们的α-R′取代衍生物，或Pro；

B为Arg，HArg，(Me₂)Arg，(Et₂)Arg，或一和它们的α-R′取代衍生物；

C为一种从Tyr，(Alk)Tyr，phe，(4′W)phe，HPhe，phg，Trp，His，Ser，(Alk)Ser，Thr，(Alk)Thr，Cys，(Alk)Cys，Pen，(Alk)Pen，Ala，Val，Nva，Met，Leu，Ile，Nle或Nal中选出的右旋或左旋氨基酸；

W为卤素或Alk；

Y为NR₁R₂或OR₃；

R₁和R₂彼此独立地为H；Alk或(CH₂)_pPH；

R₃为Alk，(CH₂)_pPH，或当B为HArg，(Me₂)Arg，(Et₂)Arg或一种Arg，HArg，(Me₂)Arg或(Et₂)Arg的α-R′取代衍生物时，R₃为H；

X为R₄R₅N；

R₄为H或Alk；

R₅为H，Alk，HCO，AlkCO，phCH₂或ph(CH₂)_qCO；

R′为Alk或phCH₂；

q，m和n为0或1；以及

p为0，1，2或3：

该方法包括，

a).偶联被保护的氨基酸形成一种合适的被保护的下式化合物：

其中：

X、A、B、C，m和n为权利要求1所定义；[Y″]为氯甲基，二苯甲基胺或甲基二苯甲基胺树脂，或Y为上述式(Ⅰ)所定义；

b).如果必要的话，脱保护，将肽从树脂中分离；以及

c).选择制成它的药物可接受的盐。

2、一种制备式（Ⅱ）化合物或其药物可接受盐的方法：

其中：

A′为一种从Arg，HArg，（Me₂）Arg，（Et₂）Arg，Ala，Gly，His，Abu，Lys或它们的α-R′取代衍生物;或Pro中选择出来的右旋或左旋氨基酸;

W为卤素或Alk;

Y为NR₁R₂或OR₃;

R₁和R₂彼此独立地为H，Alk或（CH₂）_pPh;

R₃为Alk，（CH₂）_pPh，或当B为HArg，（Me₂）Arg，（Et₂）Arg或Arg，HArg，（Me₂）Arg及（Et₂）Arg的α-R′取代衍生物时，R₃为H;

X为R₄R₅N或H;

R₄为H或Alk;

R₅为H，Alk，HCO，AlkCO，PhCH₂或Ph（CH₂）_qCO，

R¹为Alk或PhCH₂;

Z₁为Cys，Pen或APmp的右旋或左旋异构体;

Z₂为Cys，Pen或APmp的右旋或左旋异构体;

q，m和n独立地为0，1;以及

P为0，1，2或3;

该方法包括：

a）.ⅰ.用碱环化一种选择保护的下式化合物：

其中：

X，Z₁，A′，B′，C′，Z₂，m和n为上述式（Ⅱ）所定义;以及

T¹和T²为H或一种可除去的基团;

〔Y″〕为氯甲基，二苯甲基胺或甲基二苯甲基胺树脂;或Y为上述式（Ⅱ）所定义;

ⅱ.除去任何保护基团，若有必要，将肽从树脂中断裂出来，以及

ⅲ.选择制成它的药理可接受盐;或者

b）.ⅰ.选择保护的下式化合物的氧化环化：

其中：

X，Z₁，A′，B′，C′，Z₂，Y，m和n为上述式（Ⅱ）所定义;

〔Y″〕为氯甲基、二苯甲基胺或甲基二苯甲基胺树脂，Y为上述式（Ⅱ）所定义;

ⅱ.除去任何保护基团，若有必要，将肽从树脂上断裂下来，以及

ⅲ.选择制成它的药理可接受盐。

3、根据权利要求1或2的方法，其中〔Y″〕为二苯甲基胺或甲基二苯甲基胺树脂。

4、根据权利要求1或2的方法，其中用HF除去保护基团。

5、根据权利要求2的方法，该方法包括氧化环化，其中氧化剂为碱金属的铁氰化物，氧气，碘或二碘甲烷。

6、根据权利要求2的方法，该方法包括碱催化环化，其中T¹和T²中的一个为H，T¹或T²中的另一个为烷基或芳硫基。

7、根据权利要求1的方法，其中C为Ser，（Me）Ser，Thr，Tyr，Phe，Nal或Val。

8、根据权利要求2的方法，其中C′为Ser，（Me）Ser，Thr，Tyr，Phe或Nal。

9、根据权利要求1-8的任一权利要求的方法，其中A或A′为Gly或Arg。

10、根据权利要求1-9的任一权利要求的方法，其中B′或B为HArg或一种Arg或HArg的α-R′取代衍生物，其中不是m为0就是n为0。

11、根据权利要求2的方法，其中m和n为0。

12、根据权利要求1-11的任一权利要求的方法，其中B或B′为MeArg。

13、根据权利要求1的方法，制备的化合物为：

N^α-Ac-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂;

N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NH₂;

N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-Tyr-NH₂;

N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-NH₂;

N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-D-Ser-NH₂;

N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-Val-NH₂;

N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-Nal-NH₂;

N^α-Ac-Arg-Arg-Gly-Asp-Phe-NH₂;

N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-NH-CH₂-CH₂-C₆H₅;

N^α-Ac-MeArg-Gly-Asp-Phe-NH₂;

N^α-Ac-HArg-Gly-Asp-Ser-NH₂;

N^α-Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NHEt;

N^α-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂;

N^α-Formyl-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂;或

Gly-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂;

或它们的药物可接受的盐。

14、根据权利要求2的方法，制备的化合物为：

N^α-Ac-Cyclo（S，S） Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S） Cys-Arg-Gly-Asp-（D，L）APmp-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S） Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂;

Cyclo（S，S）Mpr-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Pen-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-（Me）Ser-Cys-NH₂;

Cyclo（S，S）Mpr-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

Cyclo（S，S）Mpr-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Arg-Gly-Asp-D-Pen-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Lys-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-HArg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NHEt;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-D-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Tyr-Cys-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Pen-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Pen-Arg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-D-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Sar-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Arg（Et₂）-Gly-Asp-Pen-NH₂;或

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-D-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

或它们的药物可接受的盐。

15、根据权利要求1的方法，制备

N^α-Ac-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂。

16、根据权利要求2的方法，制备

N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂，

它包括：

a）.用碱环化一种选择保护的下式化合物

其中：

T₁和T₂为H或一种可移除的基团;或者

b）.氧化环化下式化合物：

17、一种制备N^α-Ac-Cyclo（S，S）Cys-Sar-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂的方法，它包括：

a）.用碱环化一种选择保护的下式化合物：

其中：

T₁和T₂为H或一种可替换的基团;或者

b）.氧化环化下式化合物：

18、一种制备药物组合物的方法，它包括将一种权利要求1所定义的式Ⅰ化合物，或权利要求2所定义的式Ⅱ化合物，或其药物可接受的盐，和一种药用载体进行配制。

19、一种制备药剂组合物的方法，它包括将一种权利要求1所定义的式Ⅰ化合物，或权利要求2所定义的式Ⅱ化合物，或其药物可接受的盐，一种纤维蛋白溶解剂和一种药用载体进行配制。

20、一种制备药物组合物的方法，其中纤维蛋白溶解酶为链激酶，尿激酶，前尿激酶或tpA，或它们的突变物或衍生物。

21、一种下式化合物：

X-（A）_m-B-Gly-Asp-（C）_n-〔Y′〕

其中：

X，A，B，C，m和n为权利要求1所定义;〔Y′〕为氯甲基、二苯甲基胺或甲基二苯甲基胺树脂。

22、一种下式化合物：

其中：

X，Z₁，A′，B′，C′，Z₂，m和n为权利要求2所定义;

T¹和T²为H或可移除的基团;

〔Y″〕为氯甲基，二苯甲基胺或甲基二苯甲基胺树脂，或Y为权利要求2所定义。

23、一种制备下式化合物的方法：

其中：

X，Z₁，A′，B′，C′，Z₂，m和n为权利要求3所定义;以及

T¹和T²为H或可移除的基团;

〔Y″〕为氯甲基，二苯甲基胺或甲基二苯甲基胺树脂，或者Y为权利要求2所定义，它包括偶联合适的被保护氨基酸。

24、权利要求1所定义的式（Ⅰ）化合物或权利要求2所定义的式（Ⅱ）化合物用作一种抑制血块形成或血小板聚集的药物。

25、权利要求1所定义的式（Ⅰ）化合物或权利要求2所定义的式（Ⅱ）化合物和一种纤维蛋白溶解剂用作一种纤维蛋白溶解疗法的药物。