CN104017862A - 一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒 - Google Patents
一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒，包括SEQIDNO.1～24。3.本发明针对G6PD基因6个高频突变位点，提供了一种准确及特异性好、检出率高、成本低及推广性好，且能区分杂、纯合突变的快速的G6PD缺陷症基因突变检测试剂盒，在基因水平上为G6PD缺乏症的及早诊断和预防提供快速可靠的分子诊断依据,能在最短时间内使患者确诊，及时对症处理，避免病情进一步恶化，不仅对降低G6PD缺乏症的危害，减少家庭的经济和精神负担具有重要的社会与经济意义，同时具有较高的临床推广应用价值及广泛的市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及诊断试剂盒，用于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变的体外诊断。
背景技术
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphatedehy Drogenase,G6PD)缺陷症是一种常见的X连锁不完全显性遗传病，也是人类最常见的酶缺陷病之一。G6PD缺陷症在我国发病率约为4％～15％，个别地区高达40％以上，常见于我国西南(重庆、四川及贵州)和华南数省(广东、广西及海南等)。
G6PD是存在于所有细胞和组织中的磷酸戊糖旁路代谢的起始酶，它提供戊糖用于核酸合成，提供还原型辅酶II(NADPH)用于各种生物合成及维持血红蛋白和红细胞膜的稳定性。G6PD缺乏不仅影响NADPH的生物合成，防碍过氧化氢和成熟红细胞的其他化合物的解毒作用；G6PD缺乏症患者可由多种诱因如误食蚕豆、氧化性药物、感染性疾病等均可诱发急性溶血，严重威胁人类健康。G6PD缺陷症患者临床表现变化大。患者在无诱因诱导情况下与常人无异，一旦经接触诱因常会导致急性溶血，起病急促，进展迅速，从无症状到新生儿黄疽、药物或感染造成的急性溶血、蚕豆病和重症慢性非球形细胞血溶性贫血，严重者导致新生儿期重症核黄疽，如不及时对症处理常会导致多种严重的并发症，造成永久性神经***的损伤甚至死亡，极大威胁人民生命健康。
我国G6PD缺陷症的辅助诊断经历了酶活性测定与基因分析等多种诊断方法。由于酶学法检测影响因素众多，准确性低，尤其对于G6PD缺乏症基因携带者的“杂合子”女性患者(其酶活性变化范围很大：既可表现为正常，也可低至半合子水平)酶活性检测很难检出，也是G6PD缺乏症目前实验室漏检的主要原因。由于已明确G6PD基因突变是G6PD缺陷症的分子基础，使得基因水平诊断成为G6PD缺陷症临床确诊的最直接手段。
目前已存在一些获得认可且已推广的方法。其中部分已有的一些方法如单链构象多态性分析法(SSCP)，变性梯度凝胶电泳法(DGGE)，温度梯度凝胶电泳(TGGE)、高效液相色谱分析法(DHPLC)、DNA直接测序等，检测准确度虽高，但由于费用昂贵、手续复杂、耗时长等因素，限制了其在临床推广使用；而其他一些获得认可方法，如等位基因特异性扩增法(ARMS-PCR)、PCR错配限制性酶切法、等位基因寡核苷酸探针杂交(ASO)法，也仍存在要么效率低下、漏检率或假阳性率高；要么检测位点过少，无法区分杂合或纯合突变等诸多的缺限，导致许多G6PD缺陷症患者得不到及时诊断或误诊，限制了临床上的及时救治，错过了早期干预的时机。
发明内容
本发明针对目前葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变的检测现状，提供一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒，能够一次区分G6PD基因中6个高频突变位点中的正常与突变DNA，以及突变DNA中的纯合突变与杂合突变状况，达到准确，快速，廉价的诊断目的。
本发明的目的是通过以下措施实现的：
一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒，包括SEQ IDNO.1～24。所述序列分别针对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症(G6PD)致病相关的六个主要高频原发突变位点G1388A、G1376T、A95G、C1004T、C1024T、G871A，针对每一个突变位点分别采用四条引物-两条外引物和两条内引物，两条外引物扩增的片段作为PCR体系的内对照，排除体系自身原因造成的误诊，两条内引物分别反向扩增突变及正常的等位基因，能够一次鉴定区分G6PD基因中正常与突变DNA，以及突变DNA中的纯合突变与杂合突变状况。
本发明试剂盒的诊断原理如图1所示，P1和P2为扩增含有突变点基因片段的外引物，S1和S2为两条特异性引物即内引物，分别与DNA双链的两条单链互补，其3′端正好与SNP位点重合，由引物的3′端控制着引物的延伸反应，根据延伸产物的长度确定SNP类型，并通过在引物的3′端区域引入一个人为不匹配碱基来提高延伸反应的特异性。野生型(W)基因只能与相匹配的特异性引物S2发生延伸反应。特异性引物S1由于其3′末端碱基与模板不配对，故不发生延伸反应，因此PCR扩增后的产物只有DNA片段P1P2和P1S2；同理，突变型(M)基因仅与其配对的特异性引物S1发生延伸反应，特异性引物S2由于其3′末端碱基与模板不配对，故不发生延伸反应.因此PCR扩增后的产物只有DNA片段P1P2和S1P2。
为了进一步简化检测程序，降低检测成本，并保证检测的准确性和特异性，SEQ ID NO.1～4与SEQ ID NO.13～16，SEQ ID NO.5～8与SEQ ID NO.17～20，SEQ ID NO.9～12与SEQ ID NO.21～24分别在同一反应体系。成功构建了多重四引物扩增受阻突变体系PCR技术(Mutiplex Tetra-primer-ARMS-PCR，MT-ARMS-PCR)，能在单管内进行将多种单个突变位点的检测，极大简化检测程序，降低检测成本，方便实用。同一样本仅进行三管PCR检测，即可快速、准确、高特异性的得到G6PD缺陷症6个高频位点突变的基因检测结果。
上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症体外诊断试剂盒，SEQ ID NO.9：SEQ IDNO.10：SEQ ID NO.11：SEQ ID NO.12：SEQ ID NO.21：SEQ ID NO.22：SEQ ID NO.23：SEQ ID NO.24＝2～10∶2～10∶2～10∶2～10∶2～10∶2～10∶2～10∶2～10，SEQ IDNO.5：SEQ ID NO.6：SEQ ID NO.7：SEQ ID NO.8：SEQ ID NO.17：SEQ ID NO.18：SEQ ID NO.19：SEQ ID NO.20＝2～10∶2～10∶2～10∶2～10∶2～10∶2～10∶2～10∶2～10，SEQ ID NO.1：SEQ ID NO.2：SEQ ID NO.3：SEQ ID NO.4：SEQ ID NO.13：SEQ ID NO.14：SEQ ID NO.15：SEQ ID NO.16＝7∶7∶7∶7∶12.5∶12.5∶5∶5，以摩尔比计。本试剂盒特定调整外引物与内引物用量，其效果在于有效的平衡外侧与内侧PCR产物扩增效率，提高结果的特异性，便于扩增结果的准确判读。
为了更简单方便的得到更清晰易辨的检测结果，上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒的使用方法是将三组引物分别与DNA扩增模板、DNA聚合酶、dNTP混合后在95℃保温10min，然后按95℃30s、55℃～65℃30s、72℃30s的条件进行35个PCR扩增循环，在72℃保温10min进行成像或测序检测。优选为95℃30s、63℃30s、72℃30s。
有益效果
1.使用本发明的试剂盒，可直接通过PCR扩增条带的长度，一次性鉴定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症G6PD基因中6个高频突变位点中正常与突变DNA，以及其DNA突变是纯合突变或杂合突变。
2.本发明可进行6个单管PCR或三管双重同时扩增，一次电泳得到检测结果，所需仪器简单，具有操作简单、观察简单、耗费低廉、检测快速而准确的优势，适合临床推广普及，产业化应用。
3.本发明针对G6PD基因6种高频突变位点，开发出一种准确及特异性好、检出率高、成本低及推广性好，且能区分杂、纯合突变的快速的G6PD缺陷症基因突变检测试剂盒，在基因水平上为G6PD缺乏症的及早诊断和预防提供快速可靠的分子诊断依据，能在最短时间内使患者确诊，及时对症处理，避免病情进一步恶化，不仅对降低G6PD缺乏症的危害，减少家庭的经济和精神负担具有重要的社会与经济意义，同时具有较高的临床推广应用价值及广泛的市场前景。
附图说明
图1本发明试剂盒的检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变的原理；
图2实施例1①PCR扩增产物成像结果；
图3实施例1②PCR扩增产物成像结果；
图4实施例1③PCR扩增产物成像结果；
图5实施例1④PCR扩增产物成像结果；
图6实施例1⑤PCR扩增产物成像结果；
图7实施例1⑥PCR扩增产物成像结果
图8为实施例1①G1388A位点无突变的局部测序图；
图9为实施例1①G1388A位点为纯合突变的局部测序图，在图中显示为G突变为A：
图10为实施例1①G1388A位点为杂合突变的局部测序图，在图中显示为G突变为A；
图11为实施例1②G1376T位点无突变的局部测序图
图12为实施例1②G1376T位点为纯合突变的局部测序图，在图中显示为G突变为T
图13为实施例1②G1376T位点为杂合突变的局部测序图，在图中显示为G突变为T
图14为实施例1③A95G位点无突变的局部测序图
图15为实施例1③A95G位点为纯合突变的局部测序图，在图中显示为A突变为G：
图16为实施例1③A95G位点为杂合突变的局部测序图，在图中显示为A突变为G：
图17为实施例1④C1004T位点无突变的局部测序图
图18为实施例1④C1004T位点为纯合突变的局部测序图，在图中显示为C突变为T
图19为实施例1④C1004T位点为杂合突变的局部测序图，在图中显示为C突变为T
图20为实施例1⑤C1024T位点无突变的局部测序图
图21为实施例1⑤C1024T位点为纯合突变的局部测序图，在图中显示为C突变为T；
图22为实施例1⑤C1024T位点为杂合突变的局部测序图，在图中显示为C突变为T；
图23为实施例1⑥G871A位点无突变的局部测序图
图24为实施例1⑥G871A位点为纯合突变的局部测序图，在图中显示为G突变为A：
图25为实施例1⑥G871A位点为杂合突变的局部测序图，在图中显示为G突变为A：
图26多重扩增同时检测A95G和G871A两个位点的PCR扩增产物成像结果；
图27多重扩增同时检测G1376T和C1024T两个位点的PCR扩增产物成像结果；图28多重扩增同时检测G1388A和C1004T两个位点的PCR扩增产物成像结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
1.样本：人全血提取的DNA(50～100ng/u1)。样本1和2为正常对照，是指扩增模板来源于无下述6个高频突变的正常人血DNA；样本3和4为纯合突变体，是指扩增模板来源于有下述6个高频突变的G6PD缺陷症病人全血DNA，且突变为纯合子突变；样本5和6为杂合突变，是指扩增模板来源于有下述6个高频突变的G6PD缺陷症病人全血DNA，且突变为杂合子突变。
2.试剂：Hot Start Green Master Mix，2×：包含2×Green Go TaqReaction Buffer(pH8.5)、400μM dATP、400μM GATP、400μM dCTP、400μM dTTP、4mM MgCl2、Nuclease-Free Water、DNA聚合酶。
3.T-ARMS-PCR反应体系及扩增程序
①G1388A采用以下引物、体系及程序对各样本进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳成像结果如图2所示。
内引物：S1：GACGAGCTCCGTGAGGCCTGTCA(SEQ ID NO.1)
S2：TGGTGCAGCAGTGGGGTGAAAAGAC(SEQ I D NO.2)
外引物：P1：GCCCTACAGAGAAGGAGCAGTGTGGAG(SEQ ID NO.3)
P2：CTTTCCTCACCTGCCATAAATATAGGGGAT(SEQ ID NO.4)
反应体系
PCR扩增程序
②G1376T采用以下引物、体系及程序对各样本进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳成像结果如图3所示。
内引物：S1：TATGTCCCCTCAGCGACGAGCTTCG(SEQ ID NO.5)
S2：TGGGGTGAAAATACGCCAGGCCTTAA(SEQ ID NO.6)
外引物：P1：CCCTACAGAGAAGGAGCAGTGTGGAGGGT(SEQ ID NO.7)
P2：GCTGGAGAGTGACGGGTGGAGGAGA(SEQ ID NO.8)
反应体系
PCR扩增程序
③A95G采用以下引物、体系及程序对各样本进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳成像结果如图4所示。
内引物：S1：GATGCCTTCCATCAGTCGGATACCCA(SEQ ID NO.9)
S2：CGATGCACCCATGATGATGAATAGGC(SEQ I D NO.1O)
外引物：P1：GAGCCAGCAGTTTCTAACCCATCAACCACT(SEQ I D NO.11)
P2：TGGGGCCCTGCAACAATTAGTTGGAAA(SEQ ID NO.12)
反应体系
PCR扩增程序
④C1004T采用以下引物、体系及程序对各样本进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳成像结果如图5所示。
内引物：S1：GTGCCCCGCGGGTCCACCACAGT(SEQ ID NO.13)
S2：CACATAGAGGACGACGGCTGCAAAAGGGG(SEQ I D NO.14)
外引物：P1：TCAGAGGTGCAGGCCAACAATGTGGTCCTG(SEQ I D NO.15)
P2：CTCAGCACCAGCTCTCTCAGGGTGTGGACC(SEQ ID NO.16)
反应体系
PCR扩增程序
⑤C1024T采用以下引物、体系及程序对各样本进行PCR扩增，成像结果如图6所示
内引物：S1：GCCACTTTTGCAGCCGTCGGCC(SEQ ID NO.17)
S2：CCATCCCACCTCTCATTCTCCACATATAA(SEQ I D NO.18)
外引物：P1：ATCTCAGAGGTGCAGGCCAACAATGT(SEQ ID NO.19)
P2：CACATCATGGAACTGCAGCCTCACCT(SEQ ID NO.20)
反应体系
PCR扩增程序
⑥G871A采用以下引物、体系及程序对各样本进行PCR扩增，成像结果如图7所示
内引物：S1：CCCTTGGCTTTCTCTCAGGTCACGG(SEQ ID NO.21)
S2：GCCTGCACCTCTGAGATGCATTTCAAAAT(SEQ I D NO.22)
外引物：P1：AGTCATCCCTGCACCCCAACTCAACA(SEQ ID NO.23)
P2：TCCCACCTCTCATTCTCCACATAGAGGAC(SEQ ID NO.24)
反应体系
PCR扩增程序
4.用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物
制备2.5％琼脂糖凝胶(含Goldview)后，各取7ul PCR产物点样。稳压120V，35min，条件下电泳，完毕后在凝胶成像仪中观察结果并照相。
5.实验结果
①G1388A位点引物T-ARMS-PCR结果
P1、P2、S1、S2特异性的将正常对照标本扩增出387bp、332bp两条带，G1388A位点纯合突变的标本扩增出387bp、102bp两条带，杂合突变的标本扩增出387bp、332bp、102bp三条带，如图2所示。(M为500bp DNA Ladder；1和2为正常对照；3和4为纯合突变；5和6为杂合突变)
②G1376T位点引物T-ARMS-PCR结果
P1、P2、S1、S2特异性的将正常对照标本扩增出474bp、204bp两条带，G1376T位点纯合突变的标本扩增出474bp、320bp两条带，杂合突变的标本扩增出474bp、320bp、204bp三条带，如图3所示(M为500bp DNA Ladder；1和2为正常对照；3和4为纯合突变；5和6为杂合突变)
③A95G位点引物T-ARMS-PCR结果
P1、P2、S1、S2特异性的将正常对照标本扩增出391bp，138bp两条带，A95G位点纯合突变的标本扩增出391bp，304bp两条带，杂合突变的标本扩增出391bp，304bp，138bp三条带，如图4所示(M为1000bp DNALadder；1和2为正常对照；3和4为纯合突变；5和6为杂合突变)
④C1004T位点引物T-ARMS-PCR结果
P1、P2、S1、S2特异性的将正常对照标本扩增出284bp、147bp两条带，C1004T位点纯合突变的标本扩增出284bp、188bp两条带，杂合突变的标本扩增出284bp、188bp、147bp三条带，如图5所示。(M为500bp DNALadder；1和2为正常对照；3和4为纯合突变；5和6为杂合突变)
⑤C1024T位点引物T-ARMS-PCR结果
P1、P2、S1、S2特异性的将正常对照标本扩增出385bp、264bp两条带，C1024T位点纯合突变的标本扩增出385bp、170bp两条带，杂合突变的标本扩增出385bp、265bp、170bp三条带，如图6所示。(M为500bp DNA Ladder；1和2为正常对照；3和4为纯合突变；5和6为杂合突变)
⑥G871A位点引物T-ARMS-PCR结果
P1、P2、S1、S2特异性的将正常对照标本扩增出248bp、203bp两条带，G871A位点纯合突变的标本扩增出248bp、98bp两条带，杂合突变的标本扩增出248bp、203bp、98bp三条带，如图7所示。(M为500bp DNA Ladder；1和2为正常对照；3和4为纯合突变；5和6为杂合突变)
实施例2
1.采用表1的反应体系，以及扩增程序对各样本进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳成像成像结果如图26所示。样本1-1为正常DNA，样本1-2为A95G突变DNA，样本1-3为G871A突变的G6PD缺陷症病人全血DNA，样本1-4为A95G和G871A共同突变的G6PD缺陷症病人全血DNA。
表1
PCR扩增程序
实验结果：从图26中可以看到，样本1-1扩增出391bp、138bp、248bp、203bp，样本1-1为正常DNA；样本1-2扩增出391bp、304bp、248bp、203bp条带，样本1-2确发生A95G突变、G871A未突变；样本1-3扩增出391bp、138bp、248bp、98bp的条带，样本1-3确发生G871A突变，A95G未突变；样本1-4扩增出391bp、304bp、248bp、98bp的条带，样本1-4确发生G871A和A95G突变。
2.采用表2的反应体系，以及扩增程序对各样本进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳成像结果如图27所示。样本2-1为正常DNA，样本2-2为G1376T突变的G6PD缺陷症病人全血DNA，样本2-3为C1024T突变的G6PD缺陷症病人全血DNA，样本2-4为G1376T和C1024T共同突变的G6PD缺陷症病人全血DNA。
表2
PCR扩增程序
实验结果：从图27中可以看到，样本2-1扩增出474bp、204bp、385bp、264bp的条带，样本2-1为正常DNA；样本2-2扩增出474bp、320bp、385bp、264bp的条带，样本2-2确发生G1376T突变，C1024T未突变；样本2-3扩增出474bp、204bp、385bp、170bp的条带，样本2-3确发生C1024T突变，G1376T未突变；样本2-4扩增出474bp、320bp、385bp、170bp，样本2-4确发生C1024T突变和G1376T突变。
3.采用表3的反应体系，以及扩增程序对各样本进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳成像结果如图28所示。样本3-1为正常DNA，样本3-2为G1388A突变的G6PD缺陷症病人全血DNA，样本3-3为C1004T突变的G6PD缺陷症病人全血DNA，样本3-4为G1388A和C1004T共同突变的G6PD缺陷症病人全血DNA。
表3
PCR扩增程序
实验结果：从图28中可以看到，样本3-1扩增出387bp、332bp、284bp、147bp的条带，样本3-1为正常DNA；样本3-2扩增出387bp、102bp、284bp、147bp的条带，样本3-2确发生G1388A突变，C1004T未突变；样本3-3扩增出387bp、332bp、284bp、188bp的条带，样本3-3确发生C1004T突变，G1388A未突变；样本3-4扩增出387bp、102bp、284bp、188bp的条带，样本3-4确发生C1004T突变和引388A突变。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆医学大学附属儿童医院，黄轶
<120>一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒
<160>
<210> 1
<211> 23
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 1
gacgagctcc gtgaggcctg tca 23
<210> 2
<211> 25
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 2
tggtgcagca gtggggtgaa aagac 25
<210> 3
<211> 27
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 3
gccctacaga gaaggagcag tgtggag 27
<210> 4
<211> 30
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 4
ctttcctcac ctgccataaa tataggggat 30
<210> 5
<211> 25
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 5
tatgtcccct cagcgacgag cttcg 25
<210> 6
<211> 26
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 6
tggggtgaaa atacgccagg ccttaa 26
<210> 7
<211> 29
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 7
ccctacagag aaggagcagt gtggagggt 29
<210>8
<211> 25
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 8
gctggagagt gacgggtgga ggaga 25
<210> 9
<211> 26
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 9
gatgccttcc atcagtcgga taccca 26
<210>10
<211> 26
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 10
cgatgcaccc atgatgatga ataggc 26
<210>11
<211> 30
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 11
gagccagcag tttctaaccc atcaaccact 30
<210>12
<211> 27
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 12
tggggccctg caacaattag ttggaaa 27
<210>13
<211> 23
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 13
gtgccccgcg ggtccaccac agt 23
<210>14
<211> 29
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 14
cacatagagg acgacggctg caaaagggg 29
<210>15
<211> 30
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 15
tcagaggtgc aggccaacaa tgtggtcctg 30
<210>16
<211> 30
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 16
ctcagcacca gctctctcag ggtgtggacc 30
<210>17
<211> 22
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 17
gccacttttg cagccgtcgg cc 22
<210>18
<211> 29
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 18
ccatcccacc tctcattctc cacatataa 29
<210>19
<211> 26
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 19
atctcagagg tgcaggccaa caatgt 26
<210>20
<211> 26
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 20
cacatcatgg aactgcagcc tcacct 26
<210>21
<211> 25
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 21
cccttggctt tctctcaggt cacgg 25
<210>22
<211> 29
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 22
gcctgcacct ctgagatgca tttcaaaat 29
<210>23
<211> 26
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 23
agtcatccct gcaccccaac tcaaca 26
<210>24
<211> 29
<212>
<213> Artificial(人工序列)
<400> 24
tcccacctct cattctccac atagaggac 29
Claims (4)
1.一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒，包括SEQ ID NO.1～24。
2.如权利要求1所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒，SEQ ID NO.1～4与SEQ ID NO.13～16，SEQ ID NO.5～8与SEQ ID NO.17～20，SEQ ID NO.9～12与SEQ ID NO.21～24分别在同一反应体系。
3.如权利要求2所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒，SEQ ID NO.9：SEQ ID NO.10：SEQ ID NO.11：SEQ ID NO.12：SEQ ID NO.21：SEQ ID NO.22：SEQ ID NO.23：SEQ ID NO.24=2～10:2～10:2～10:2～10:2～10:2～10:2～10:2～10，SEQ ID NO.5：SEQ ID NO.6：SEQ ID NO.7：SEQ ID NO.8：SEQ ID NO.17：SEQ ID NO.18：SEQ ID NO.19：SEQ ID NO.20=2～10:2～10:2～10:2～10:2～10:2～10:2～10:2～10，SEQ ID NO.1：SEQ ID NO.2：SEQ ID NO.3：SEQ ID NO.4：SEQ ID NO.13：SEQ ID NO.14：SEQ ID NO.15：SEQ ID NO.16=7:7:7:7:12.5:12.5:5:5，以摩尔比计。
4.如权利要求1～3所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒使用方法，将所述SEQ ID NO.1～24分别与DNA扩增模板、DNA聚合酶、dNTP混合后在95℃保温10min，然后按95℃30s、55℃～65℃30s、72℃30s的条件进行35个PCR扩增循环，在72℃保温10min进行成像电泳分析。
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Cited By (5)
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|---|---|---|---|---|
| CN104450925A (zh) * | 2014-12-16 | 2015-03-25 | 亚能生物技术（深圳）有限公司 | 检测g6pd缺乏症基因突变的引物、探针及试剂盒 |
| CN105734116A (zh) * | 2014-12-08 | 2016-07-06 | 常州金麦格生物技术有限公司 | 多重核酸位点检测方法 |
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102174657A (zh) * | 2011-03-22 | 2011-09-07 | 危梅娟 | 诊断g6pd缺乏症的核酸杂交膜条、pcr引物及试剂盒 |
| CN102586422A (zh) * | 2011-12-27 | 2012-07-18 | 盛司潼 | 一种对6磷酸葡萄糖脱氢酶基因进行测序的方法及试剂盒 |
| CN102899411A (zh) * | 2012-09-26 | 2013-01-30 | 广东凯普生物科技股份有限公司 | G6pd缺乏症基因检测试剂盒 |
-
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102174657A (zh) * | 2011-03-22 | 2011-09-07 | 危梅娟 | 诊断g6pd缺乏症的核酸杂交膜条、pcr引物及试剂盒 |
| CN102586422A (zh) * | 2011-12-27 | 2012-07-18 | 盛司潼 | 一种对6磷酸葡萄糖脱氢酶基因进行测序的方法及试剂盒 |
| CN102899411A (zh) * | 2012-09-26 | 2013-01-30 | 广东凯普生物科技股份有限公司 | G6pd缺乏症基因检测试剂盒 |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105734116A (zh) * | 2014-12-08 | 2016-07-06 | 常州金麦格生物技术有限公司 | 多重核酸位点检测方法 |
| CN104450925A (zh) * | 2014-12-16 | 2015-03-25 | 亚能生物技术（深圳）有限公司 | 检测g6pd缺乏症基因突变的引物、探针及试剂盒 |
| CN110358821A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-10-22 | 上海艾迪康医学检验所有限公司 | 检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症g6pd基因突变的引物、试剂盒和方法 |
| CN111118141A (zh) * | 2020-01-15 | 2020-05-08 | 浙江迪谱诊断技术有限公司 | 一种用于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（g6pd）基因突变检测的引物序列及试剂盒 |
| CN111118141B (zh) * | 2020-01-15 | 2023-09-01 | 浙江迪谱诊断技术有限公司 | 一种用于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（g6pd）基因突变检测的引物序列及试剂盒 |
| CN112442532A (zh) * | 2020-08-27 | 2021-03-05 | 深圳市卫生健康发展研究中心 | 同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的引物组及试剂盒 |
| CN112442532B (zh) * | 2020-08-27 | 2023-09-26 | 深圳市卫生健康发展研究中心 | 同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的引物组及试剂盒 |
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