CN104017375A - 一种魔芋甘露聚糖-鱼明胶复合物及其制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种魔芋甘露聚糖-鱼明胶复合物，该复合物由魔芋葡甘露聚糖经酶法降解后，与明胶通过酶法交联和物理交联两种方式聚合而成，属于天然高分子改性领域。本发明利用了魔芋葡甘露聚糖的多种优良物化性能，赋予了明胶更好的黏性与稳定性，可在医药制剂中用于制作胶囊壳，也可将其应用于食品加工。
Description
技术领域
本发明属于天然高分子改性领域，具体涉及一种魔芋甘露聚糖-鱼明胶交联复合物及其制备方法和用途。
背景技术
明胶是一种天然高分子材料，是由胶原热变性或者经物理、化学降解得到的。明胶具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且还具有溶胶-凝胶的可逆转换性、极好的成膜性等特性，因而将其广泛用于食品加工和药物制剂胶囊壳的制备。然而，近年来，由于牛、猪等动物所携带传播的各种传染病如疯牛病、***在全球范围内肆虐，有不少国家减少或禁止了牛、猪来源的明胶及其食品的生产、使用和进口；另一方面，由于宗教信仰，***消费者排斥和拒绝使用以猪皮或牛股生产的明胶及其食品。因此开发和挖掘新型的明胶资源具有显著的意义。
鱼明胶是利用非哺乳动物水生鱼类的皮为原料经提取制成的明胶，产品色浅，清澈透明，无气味，味道中性。与牛骨、猪皮明胶相比具有低抗原性、低致敏性和溶解性好等优点，是第一代明胶产品的最佳原料。
魔芋葡甘露聚糖是由葡萄糖和甘露糖聚合而形成的杂多糖，由于魔芋葡甘露聚糖具有很高的持水性、膨胀性和粘稠性，因此使用纤维素酶降解可得到水溶性较好和生物活性更高的甘露低聚糖。魔芋甘露低聚糖不仅没有毒副作用和免疫原性，而且在生物体内还具有降低血脂、平稳血糖等生物活性。
通常，蛋白质和多糖是共存于食品乳化体系中最重要的两类生物大分子，是影响食品结构和质构的主要因素。蛋白质因能在液液或气液界面上形成吸附层来降低界面张力而多在胶体体系中充当乳化剂，多糖则由于其良好的增稠和持水特性而常用做稳定剂，由此赋予了体系不同于两者单独存在时的功能表现。共价键结合的蛋白质与多糖形成接枝物，既保留了蛋白质的表面活性又具有多糖的亲水性能，与蛋白质多糖弱相互作用形成的混合物对比，对环境条件具有较高的适应性。
近年来，积极寻找有效的蛋白质-糖接枝反应的方法，成为国内外研究小组的热门课题。管军军研究了微波辐射加热方式对大豆分离蛋白-多糖接枝反应的影响，发现微波加热能够显著促进大豆分离蛋白与乳糖、可溶性淀粉之间的接枝反应，且其共价复合物的功能特性较大豆分离蛋白相比有显著的提高。齐军茹通过加入极性有机溶剂降低反应体系的水分活度，建立了液相体系中大豆酸沉蛋白-葡聚糖之间的 Maillard 反应模型，产物的功能性质与干热反应的蛋白质-多糖复合物所表现出来的优越功能性质相当。王金水使用超声波处理技术促进了小麦蛋白与***胶、麦芽糊精在水溶液中的接枝反应，接枝物的溶解性和热稳定性得到明显的提高。许彩虹使用高压反应釜装置探讨了大豆 7S 球蛋白与葡聚糖在压力作用下的接枝反应，在提高接枝程度的同时，低压能够显著抑制反应中的褐变程度，即减少了高级阶段有色物质的生成。管永光将脉冲电场处理技术引入到蛋白质-多糖的接枝反应中，并对其接枝物理化性质和功能性质进行探讨，高强度电场能够显著促进蛋白质-多糖共价复合物的生成，这为低温条件下制备蛋白质-多糖接枝物提供了一定参考。
CN101906213A公开了一种新型的蛋白质糖基化接枝方法，包括如下步骤：(1)在拥挤试剂中加入缓冲溶液，搅拌，得到溶液；(2)将蛋白和葡聚糖加入步骤(1)得到的溶液中，搅拌2h后，加入NaN3，在5℃放置24h，再在50-70℃搅拌12-48h后，迅速冷却至低于25℃，得到糖基化蛋白产物。
CN101785522A公开了一种植物蛋白与多糖接枝聚合的方法，包括(1)植物蛋白与多糖接枝共聚：将植物蛋白溶解后，加入多糖得到混合溶液，植物蛋白与多糖的质量比为0.1-10:1；(2)将混合溶液搅拌2-3小时后，通过频率为500-2000赫兹，15-45KV的脉冲电场，脉冲处理时间为480-2000μｓ，得到共聚物；(3)将共聚物浓缩后喷雾干燥。
上述现有技术公开的多是植物蛋白与多糖进行接枝，但对于动物蛋白与多糖进行接枝的报道却较为少见，并且，现有技术所述制备方法还存在反应时间长、反应程度不可控、反应中间体有毒副作用等的问题。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题是提供了一种新的以酶法交联和物理共混两种方式，催化鱼明胶和魔芋甘露聚糖交联得到蛋白质接枝多糖复合物的制备方法及其用途。
本发明解决其技术问题采用的以下技术方案：
a. 取适量魔芋葡甘露聚糖加入溶有纤维素酶的醋酸钠-醋酸缓冲溶液（pH=5），混合均匀，在40℃的恒温水浴中机械搅拌一段时间，反应结束后将混合溶液加热煮沸一段时间，使纤维素酶失活；
b. 将步骤a中灭酶后的溶液静置冷却，通过超滤膜提纯纯化。将滤液转移至烧杯，加入2倍体积的无水乙醇，经沉淀、过滤和反复洗涤后，收集固体残留物，在40℃的恒温干燥箱内干燥，即得降解后的魔芋甘露聚糖粉末，并将其均分为若干等份；
c. 取鱼明胶1份和魔芋甘露聚糖若干份加入适量纯化水中配置一定浓度的鱼明胶/魔芋甘露聚糖混合水溶液，60℃加热使其完全溶解。随后向其中加入一定量的转谷氨酰胺酶，在一定温度条件下搅拌反应一段时间。停止反应后，加热至80~100℃灭酶；
d. 每隔30分钟向步骤c中的混合溶液继续添加一份魔芋甘露聚糖溶液，直至剩余份数的魔芋甘露聚糖全部加入完后，最后再反应30分钟；
e. 将d中反应液通过超滤膜提纯纯化后，将滤液转移至烧杯，加入2倍体积的乙醇，经沉淀、过滤和反复洗涤后，冷冻干燥制得魔芋甘露聚糖-鱼明胶复合物成品。
在制备魔芋甘露聚糖-鱼明胶复合物过程中，由于魔芋葡甘露聚糖分子链上包含带有酰胺键的侧链，因此在转谷氨酰胺酶的催化下，明胶的末端氨基可以与魔芋甘露聚糖的酰胺键发生接枝反应。另外，由于转谷氨酰胺酶在步骤c中被灭活，因此在随后继续向反应溶液中加入魔芋甘露聚糖，明胶与多糖间不会再发生化学交联反应，而是通过分子间作用力和氢键，使两种天然高分子间的分子链相互缠绕或包埋而进行得物理共混。这样不仅可以通过交联来提高明胶的粘度，而且还可以通过调整反应物的投料比与反应程度来获得交联度适宜的复合物。
进一步，按上述方案所述的魔芋甘露聚糖降解反应中加入的纤维素酶的量为原料魔芋葡甘露聚糖底物浓度的5~15%，降解时间为3~5h。
所述的鱼明胶和魔芋甘露聚糖的质量比为1.0：（0.5-2.0）。
所述的降解后的魔芋甘露聚糖均分为4等份。
所述的转谷氨酰胺酶和鱼明胶的质量比为（0.05-0.25）：1.0。
所述的鱼明胶与魔芋甘露聚糖的酶法交联反应温度优选为40℃，反应时间为0.5~2.0小时。
按上述方案，反应步骤e中所述的超滤膜为分子截留量为3万分子量的聚砜超滤膜，工作条件为：温度10~40℃，压力为0.06~0.1MPa，物料流速为250~300L/h。
按上述方案，制成的魔芋甘露聚糖-明胶复合物可以应用于食品加工和医药、食品与保健品的胶囊制剂中。
本发明的创新与进步之处在于：
一、本发明以转谷氨酰胺酶为催化剂交联明胶与葡甘露聚糖，解决了传统采用化学交联剂进行酰胺化反应存在的反应时间长，成本较高，反应中间体有毒副作用的问题。相比，酶催化反应条件温和，环境友好，工艺简单；
二、本发明通过采用化学酶法交联和物理共混交联两种交联方式，并在两种方法中对多糖的加入量进行调整，从而可以对复合物的交联度实现有效控制，进而能够针对复合物的不同用途，选择性地调控反应程度及交联度；
三、本发明所述的鱼明胶接枝魔芋葡甘露聚糖可直接应用于绿色食品、功能食品及医药领域中。其在体内的降解产物，不仅无任何毒副作用，还可以为人体同时提供蛋白质与多糖两种机体所需的营养物质与能量来源。并且，其中的魔芋葡甘露聚糖对人体还有许多优良的生理功能作用，例如降血脂、平稳血糖和抗脂肪肝等，是一种对于三高患者来说特别理想的营养保健物质。另外，一方面鱼明胶本身具有特殊的保健作用和低热量、抗衰老抗氧化等优点，另一方面它作为一种被清真级食品认可的产品，还可以满足特殊人群的要求。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本申请之发明，但实施例不应视作对本发明权利的限定。
实施例1：
a. 称取20g魔芋葡甘露聚糖加入100mL溶有1.0g的纤维素酶的醋酸钠-醋酸缓冲溶液（pH=5），混合均匀，在40℃的恒温水浴中机械搅拌5h，反应结束后将混合溶液加热煮沸10min，使生物酶失活。
b. 将步骤a中灭酶后的溶液静置冷却后，通过超滤膜提纯纯化。将滤液转移至烧杯，加入2倍体积的无水乙醇，经沉淀、过滤和反复洗涤后，收集固体残留物，在40℃的恒温干燥箱内干燥，即得降解后的魔芋甘露低聚糖粉末，并将其均分为4等份。
c. 取鱼明胶40g和魔芋甘露低聚糖1份，加入适量纯化水中配置质量分数为15%的明胶-魔芋甘露低聚糖混合溶液，60℃加热使其完全溶解。随后向其中加入5g的转谷氨酰胺酶，40℃下搅拌反应1小时。停止反应后，加热至100℃灭酶。
d. 每隔30分钟向步骤c中的混合溶液继续添加一份魔芋甘露聚糖溶液，直至剩余3份魔芋甘露聚糖全部加入完后，最后再搅拌反应30分钟。
e. 将d中反应液通过截留量为3万分子量的超滤膜提纯纯化，工作条件为：温度25℃，压力为0.06MPa，物料流速为250L/h将滤液转移至烧杯，加入2倍体积的无水乙醇，经沉淀、过滤和反复洗涤后，冷冻干燥制得鱼明胶-魔芋葡甘露聚糖复合物成品。
实施例2：
a. 称取200g魔芋葡甘露聚糖加入1000mL溶有15g的纤维素酶的醋酸钠-醋酸缓冲溶液（pH=5），混合均匀，在40℃的恒温水浴中机械搅拌5h，反应结束后将混合溶液加热煮沸15min，使生物酶失活。
b. 将步骤a中灭酶后的溶液静置冷却后，通过超滤膜提纯纯化。将滤液转移至烧杯，加入2倍体积的无水乙醇，经沉淀、过滤和反复洗涤后，收集固体残留物，在40℃的恒温干燥箱内干燥，即得降解后的魔芋甘露低聚糖粉末140g，并将其均分为4等份。
c. 取明胶200g和魔芋甘露低聚糖2份，加入适量纯化水中配置质量分数为25%的明胶-魔芋甘露低聚糖混合溶液，60℃加热使其完全溶解。随后向其中加入8.5g的转谷氨酰胺酶，40℃下搅拌反应1.5小时。停止反应后，加热至100℃灭酶。
d. 向步骤c中的混合溶液继续添加一份魔芋甘露聚糖溶液，反应30分钟后再添加一份魔芋甘露聚糖溶液，最后再搅拌30分钟后反应停止。
e. 将d中反应液通过截留量为3万分子量的超滤膜提纯纯化，工作条件为：温度40℃，压力为0.1MPa，物料流速为300L/h将滤液转移至烧杯，加入2倍体积的无水乙醇，经沉淀、过滤和反复洗涤后，冷冻干燥制得明胶-魔芋葡甘露聚糖复合物成品。
实施例3：
a. 称取1kg魔芋葡甘露聚糖加入5L溶有70g的纤维素酶的醋酸钠-醋酸缓冲溶液（pH=5），混合均匀，在40℃的恒温水浴中机械搅拌5h，反应结束后将混合溶液加热煮沸30min，使生物酶失活。
b. 将步骤a中灭酶后的溶液静置冷却后，通过超滤膜提纯纯化。将滤液转移至烧杯，加入2倍体积的无水乙醇，经沉淀、过滤和反复洗涤后，收集固体残留物，在40℃的恒温干燥箱内干燥，即得降解后的魔芋甘露低聚糖粉末0.68kg，并将其均分为4等份。
c. 取明胶0.65kg和魔芋甘露低聚糖3份，加入适量纯化水中配置质量分数为40%的明胶-魔芋甘露低聚糖混合溶液，60℃加热使其完全溶解。随后向其中加入76.5g的转谷氨酰胺酶，40℃下搅拌反应2小时。停止反应后，加热至100℃灭酶。
d. 向步骤c中的混合溶液继续添加一份魔芋甘露聚糖溶液，搅拌30分钟后停止反应。
e. 将d中反应液通过截留量为3万分子量的超滤膜提纯纯化，工作条件为：温度40℃，压力为0.1MPa，物料流速为300L/h将滤液转移至烧杯，加入2倍体积的无水乙醇，经沉淀、过滤和反复洗涤后，冷冻干燥制得明胶-魔芋葡甘露聚糖复合物成品。
实施例4：
将上述各实施例制备的魔芋甘露聚糖-明胶复合物，利用红外光谱分析法进行结构确证。
将降解后的魔芋甘露聚糖及魔芋甘露聚糖-明胶复合物研磨粉碎后在恒温干燥箱内60℃烘干24h以上。然后与溴化钾粉末混合压片制成薄膜圆片，使用傅里叶变换红外光谱仪在400-4000cm-1波长范围内对几种薄膜圆片样品进行扫描，获得样品的红外图谱。
通过实施例1-3中魔芋甘露聚糖-鱼明胶的红外图谱与降解后的魔芋甘露聚糖的吸收峰对比，可以发现在1649cm-1（C=O伸缩峰）和1546cm-1（N-H弯曲峰）处出现了两个新的吸收峰，它们分别归属于酰胺I带和酰胺II带，说明明胶成功地接枝到了魔芋甘露聚糖上。同时，从红外图谱可以发现在酶法交联反应结束后，继续添加魔芋甘露聚糖与鱼明胶进行物理共混，其对于魔芋甘露聚糖-明胶复合物的结构并无明显影响，只是有部分特征吸收峰发生了较小位移。此外，对比实施例1、2、3中不同的魔芋甘露聚糖-明胶复合物的吸收峰可以发现，酶法交联的反应程度不同，其酰胺峰的强度也有显著差异，从而也可以间接反映出交联程度的高低差别。
Claims (9)
1.一种魔芋甘露聚糖-鱼明胶复合物，其特征在于，是由鱼明胶和魔芋甘露聚糖交联聚合而成。
2.根据权利要求1所述的一种魔芋甘露聚糖-鱼明胶复合物，其特征在于制备方法主要包括以下步骤：
a. 取适量魔芋葡甘露聚糖加入溶有纤维素酶的醋酸钠-醋酸缓冲溶液（pH=5），混合均匀，在40℃的恒温水浴中机械搅拌一段时间，反应结束后将混合溶液加热煮沸一段时间，使纤维素酶失活；
b. 将步骤a中灭酶后的溶液静置冷却，通过超滤膜提纯纯化；将滤液转移至烧杯，加入2倍体积的无水乙醇，经沉淀、过滤和反复洗涤后，收集固体残留物，在40℃的恒温干燥箱内干燥，即得降解后的魔芋甘露聚糖粉末，并将其均分为若干等份；
c. 取鱼明胶1份和魔芋甘露聚糖若干份加入适量纯化水中配置一定浓度的鱼明胶/魔芋甘露聚糖混合水溶液，60℃加热使其完全溶解，随后向其中加入一定量的转谷氨酰胺酶，在一定温度条件下搅拌反应一段时间，停止反应后，加热至80~100℃灭酶；
d. 每隔30分钟向步骤c中的混合溶液继续添加一份魔芋甘露聚糖溶液，直至剩余份数的魔芋甘露聚糖全部加入完后，最后再反应30分钟；
e. 将d中反应液通过超滤膜提纯纯化后，将滤液转移至烧杯，加入2倍体积的乙醇，经沉淀、过滤和反复洗涤后，冷冻干燥制得魔芋甘露聚糖-鱼明胶复合物成品。
3.根据权利要求2中所述的魔芋甘露聚糖-鱼明胶复合物的制备方法，其特征在于：降解反应中加入的纤维素酶的量为原料魔芋葡甘露聚糖底物浓度的5~15%，降解时间为3~5h。
4.根据权利要求2中所述的魔芋甘露聚糖-鱼明胶复合物的制备方法，其特征在于：鱼明胶和魔芋甘露聚糖的质量比为1.0：（0.5-2.0）。
5.根据权利要求2和4中所述的魔芋甘露聚糖-鱼明胶复合物的制备方法，其特征在于：降解后的魔芋甘露聚糖均分为4等份。
6.根据权利要求2中所述的魔芋甘露聚糖-鱼明胶复合物的制备方法，其特征在于：加入的转谷氨酰胺酶和鱼明胶的质量比为（0.05-0.15）：1.0。
7.根据权利要求2中所述的魔芋甘露聚糖-鱼明胶复合物的制备方法，其特征在于：鱼明胶与魔芋甘露聚糖的酶法交联反应温度优选为40℃，反应时间为0.5~2.0小时。
8.根据权利要求2中所述的魔芋甘露聚糖-鱼明胶复合物的制备方法，其特征在于：反应步骤e中所述的超滤膜为分子截留量为3万分子量的聚砜超滤膜，工作条件为：温度10~40℃，压力为0.06~0.1MPa，物料流速为250~300L/h。
9.权利要求1-8中任意一项权利要求所述的魔芋甘露聚糖-明胶复合物可以应用于食品加工和医药、食品与保健品的胶囊制剂中。
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