CN104017032A - 鞣酸刺乌头碱及其制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鞣酸刺乌头碱的制备方法以及它的用途。所述制备方法包括制备粗制鞣酸刺乌头碱、萃取分离与干燥等步骤。本发明制备的鞣酸刺乌头碱在不同pH值条件下呈稳定状态，并且对蛋白有沉降作用，同时在Wistar大鼠体表创伤一期愈合实验中具有止血、抗炎、抗菌、镇痛综合性效果。它可用于体表局部溃烂、烧伤、刀伤及战争中战士伤口感染化脓等的外敷用药。本发明方法材料易得，操作及后处理简单，反应条件温和，耗时短，具有非常良好的应用前景。

Description

鞣酸刺乌头碱及其制备方法与用途

【技术领域】

本发明属于体表局部创伤治疗药物技术领域。更具体地，本发明涉及一种鞣酸刺乌头碱，还涉及鞣酸刺乌头碱的制备方法，还涉及鞣酸刺乌头碱的用途。

【背景技术】

鞣酸(Tannic acid)是一种由五倍子得到的鞣质，广泛存在于植物界的一类结构比较复杂的多元酚类化合物。它是由葡萄糖与没食子酸构成的酯类化合物，属于水解类鞣质。在我国，鞣酸资源丰富，已将这些资源广泛有效地用于医药、冶金、食品、染料、稀有金属提取、石油钻井、食品防腐、油脂抗氧化、饮料葡萄酒类澄清及三废处理等技术领域。它是传统中药，具有止血、抗炎、降火、涩肠、抗突变、抗癌、抗氧化、凝固蛋白的性质，尤其对腹泻引起的肠道感染、体外杀精有良好的治疗效果，同时可作为有效瘤抑制剂，也可用于处理或防治免疫力缺乏综合征。

刺乌头碱(lappaconitine)，又称高乌甲素、拉巴乌头碱，是一种从毛茛科植物高乌头Aconitum sinomontanum Nakai根中提取的二萜类生物碱。刺乌头碱具有镇痛、抗炎、麻醉作用。现代医学认为在局部疼痛过程中，中枢5-HT能神经***对参与刺乌头碱和N-脱乙酰刺乌头碱的镇痛作用有调节的功效。刺乌头碱是高乌头中生物碱的主要成分，动物实验和临床应用均表明，其对恶性肿瘤及其它顽固性疼痛的疗效显著，是优良的非成瘾性镇痛药，其镇痛强度是氨基比林的7倍，与***的镇痛效果相当，而且维持时间长，无致畸突变作用，也不会发生继续中毒，对患者肝肾功能无影响。此外，刺乌头碱还具有抗心律失常作用、抗炎作用，广泛用于癌痛和术后镇痛。现代研究发现，将刺乌头碱制成氢溴酸盐，其镇痛、消肿等效果良好，对胃癌、肝癌、肺癌、溃疡病、胃炎、乳癌、十二指肠溃疡等患者的临床治疗有较强的镇痛作用，另外还有局部麻醉、降温和消肿作用，无成瘾性、无致畸胎作用，也不会发生积蓄中毒，对患者肝肾功能、造血功能无影响。

已有文献报道鞣酸、刺乌头碱的生理功能。冉骥等人在CN1768747A、发明名称“鞣酸苦参碱制剂及其制备方法”中，说明了它们对细菌性痢疾及肠炎等有独特疗效，但没有说明由肠炎引起的疼痛治疗作用；彭东明等人在CN102399222A、发明名称“没食子酸苦参碱盐及其制剂的制备方法和用途”中没有说明消炎、镇痛方面的临床应用；付凤华等人在CN1515255A、发明名称“一种鞣酸小檗碱含片及其制备方法和用途”中，提出此药物可治疗局部口腔溃疡，而镇痛却不明显；叶利群、鲜红在题为“五倍子的药理研究及在治疗肛肠疾病中的应用”论文(《中国民族民间医药》，2010，14:49-53.)中，利用鞣酸可使蛋白质沉淀凝固，形成薄膜以治疗创面溃疡，有一定的疗效，但此药物的镇痛麻醉效果并不明显，长期使用可使毒性增强，引起肝脏、肾脏损害；李刚、丁晓蓉等人在题为“含漱治的功能成分和口腔护理效果临床评价”论文(《牙膏工业》，2005，04:44-48.)中提出鞣酸可以改善牙龈炎症状，有防止龋齿的功效，但长期大量使用会引起消化不良，甚至便秘症状；童强等人在题为“鞣酸对人食管癌细胞系EC9706的抑制作用”论文(《华中科技大学学报(医学版)》,2006，02:274-276.)中指出，鞣酸可抑制食道癌细胞DNA复制和蛋白合成，使癌细胞有丝***所需要原料合成减少，抑制肿瘤细胞生物大分子的合成，但癌痛效果并不明显；余伯阳等人在CN102250087Ａ、发明名称“几种四氢酸小檗碱类化合物的镇痛用途”中提出四氢酸小檗碱与***镇痛效果相当，但长期使用具有依赖性并且对肝脏、肾脏有一定损害；孙勇、邓迪哥在题为“凝血用壳聚糖的制备及其凝血作用探讨”论文(《武汉工业学院学报》，2001，04:25-27+36.)中提出壳聚糖具有凝血效果，但消炎、镇痛疗效不强；常忠祖在题为“痛风止痛方治疗痛风性关节炎60例临床观察”会议论文(甘肃省中医药学会2010年会员***暨学术年会论文汇编，甘肃省中医药学会，2010:2.)中报道了刺乌头碱对中枢5-HT神经***有作用，有镇痛、消肿作用，但消肿现象并不明显；杨扬等人在题为“高乌甲素预防丙泊酚静脉注射痛的效果”论文(《临床麻醉学杂志》，2005，10:727.)中提出刺乌头碱对人体静脉注射诱发的疼痛有缓解作用，但此药物若单独使用起效较慢，持续时间短，镇痛强度低。

从上述鞣酸、刺乌头碱相关报道中可以看出鞣酸和刺乌头碱单独使用生物利用率低，对患者恢复效果不明显。

本发明人利用刺乌头碱与鞣酸开发了一种体表局部创伤性药物，这种药物使用、携带方便，在止血、杀菌、抗炎、镇痛方面都具有良好效果，因此具有极好的应用前景。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种鞣酸刺乌头碱。

本发明的另一个目的是提供所述鞣酸刺乌头碱的制备方法。

本发明的另一个目的是提供所述鞣酸刺乌头碱的用途。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种鞣酸刺乌头碱的制备方法。该方法的步骤如下：

A、制备粗制鞣酸刺乌头碱

将1重量份鞣酸溶解于80～120重量份去离子水中，然后加入0.41～0.43重量份刺乌头碱，在温度34～36℃的条件下搅拌28～32min，得到含有沉淀的粗制鞣酸刺乌头碱溶液；

B、萃取分离

让步骤A得到的含有沉淀的粗制鞣酸刺乌头碱溶液在常温条件下进行分离，弃去上清液，得到的沉淀物再按照沉淀物与氯仿的重量比1:3～5在温度18～22℃的条件下用氯仿萃取2～4次，萃取液合并，将含有游离刺乌头碱萃余液弃去；

C、干燥

步骤B得到的合并萃取液在真空干燥箱内在温度32～36℃与真空度0.08～0.09MPa的条件下烘干45～55h，得到所述的鞣酸刺乌头碱化合物。

根据本发明的一种优选实施方式，在步骤B中，所述的分离是采用过滤法或离心分离法进行的分离。

本发明还涉及采用所述制备方法制备得到的鞣酸刺乌头碱。

本发明还涉及一种药物组合物。该药物组合物含有所述的鞣酸刺乌头碱与在药物上可以接受的载体，所述的鞣酸刺乌头碱与所述载体的重量比是8～80:50～150。

根据本发明的一种优选实施方式，所述的载体是一种或多种选自微晶纤维素、微粉硅胶、羧甲基淀粉、聚维酮、预胶化淀粉、硬脂酸镁、甘油、明胶、冰片或乳糖的载体。

根据本发明的另一种优选实施方式，该药物组合物为胶囊剂、片剂、栓剂或缓释片。

根据本发明的另一种优选实施方式，该药物组合物为胶囊时，它由80重量份所述的鞣酸刺乌头碱、100重量份微晶纤维素、0.8重量份微粉硅胶、13重量份羧甲基淀粉、20重量份浓度以重量计1～3％聚维酮乙醇溶液与6重量份预胶化淀粉组成。

根据本发明的另一种优选实施方式，该药物组合物为片剂时，它由80重量份所述的鞣酸刺乌头碱、100重量份微晶纤维素、20重量份浓度以重量计1～3％聚维酮乙醇溶液、28重量份羧甲基淀粉、13重量份淀粉与1.6重量份硬脂酸镁组成。

根据本发明的另一种优选实施方式，该药物组合物为栓剂时，它由8重量份所述的鞣酸刺乌头碱、76重量份甘油、24重量份明胶与0.5重量份冰片组成。

根据本发明的另一种优选实施方式，该药物组合物为缓释片剂时，它由80重量份所述的鞣酸刺乌头碱、12重量份羟丙基甲基纤维素、30重量份微晶纤维素、15重量份浓度以重量计1～3％聚维酮乙醇溶液、10重量份乳糖与2重量份硬脂酸镁组成。

下面将详细地描述本发明。

本发明涉及一种鞣酸刺乌头碱的制备方法。该方法的步骤如下：

A、制备粗制鞣酸刺乌头碱

将1重量份鞣酸溶解于80～120重量份去离子水中，然后加入0.41～0.43重量份刺乌头碱，在温度34～36℃的条件下搅拌28～32min，得到含有沉淀的粗制鞣酸刺乌头碱溶液。

在本发明中，使用的鞣酸是目前市场上销售的产品，例如由天津市大茂化学试剂厂生产的产品。使用的刺乌头碱也是目前市场上销售的产品，例如上海谱振生物科技有限公司、武汉宏信康精细化工有限公司销售的产品。

B、萃取分离

让步骤A得到的含有沉淀的粗制鞣酸刺乌头碱溶液在常温条件下进行分离，弃去上清液，得到的沉淀物再按照沉淀物与氯仿的重量比1:3～5在温度18～22℃的条件下用氯仿萃取2～4次，萃取液合并，将含有游离刺乌头碱萃余液弃去。

在这个步骤中，所述的粗制鞣酸刺乌头碱溶液采用常规过滤法或常规离心分离法进行分离，收集沉淀物。本发明使用的过滤设备或离心分离设备都是目前市场上销售的、在实验室或生产中普遍使用的设备。

在氯仿萃取时所使用的设备是目前市场上销售的产品，例如在实验室或生产中普遍使用的混合澄清萃取器。

C、干燥

步骤B得到的合并萃取液在真空干燥箱内在温度32～36℃与真空度0.08～0.09MPa的条件下烘干45～55h，得到所述的鞣酸刺乌头碱。

在干燥时所使用的真空干燥箱是目前市场上销售的产品，例如由天津市泰斯特仪器有限公司生产出来的DZ-1BC Ⅱ真空干燥箱。

采用下述方法对采用本发明方法所得到的鞣酸刺乌头碱进行鉴定：

一、DSC法

DSC(差式量热法)分析法是一种在程序控制温度下测量样品和参比物功率差与温度关系的技术，得到的DSC曲线可以表征其样品化合物。鞣酸、刺乌头碱与鞣酸刺乌头碱都有相应的DSC曲线。根据它们的DSC曲线熔融峰变化可以判断其变化。因此，采用DSC分析法测定了鞣酸、刺乌头碱与鞣酸刺乌头碱。

试验方法如下：称取3只等重坩埚(±0.02mg)，分别精密称取6.6mg刺乌头碱、5.4mg鞣酸、5.4mg本发明制备的鞣酸刺乌头碱化合物，置于3个坩埚内，以空白坩埚作参比；使用DMAQ800仪器，在起始温度0℃、升温速率10℃/min与50.0ml·min^-1高纯度氮气的同等条件和程序等速升温的条件下，得到它们各自图谱。其测定结果列于附图1中。由附图1可以清楚地知道，鞣酸熔融温度是106℃。刺乌头碱的熔融温度是230℃，而鞣酸刺乌头碱化合物熔融温度相对鞣酸偏移8～10℃，因此可以认为鞣酸刺乌头碱化合物是一种新化合物。

二、傅里叶变换红外光谱法

使用日本岛津公司IRAffinity^-1型傅里叶红外光谱仪，仪器扫描范围4000cm^-1-600cm^-1，扫描次数500次。采用常规方式测定鞣酸、刺乌头碱与本发明制备鞣酸刺乌头碱的傅里叶变换红外光谱图，其测定结果列于附图2中。由附图2可以清楚地知道，鞣酸刺乌头碱化合物在3262cm^-1处出现大的宽锋，可能存在羟基或仲氨基，如果是仲氨基的话，应该只有一个吸收峰，且峰型比羟基峰要尖锐，因此可排除是仲氨基。羰基振动峰由1701cm^-1蓝移至1716cm^-1，除了在此位置存在缔合酚羟基吸收外，邻位取代苯上的C-H振动峰由764.5cm^-1红移至760cm^-1，鞣酸溶于水后产生的羟基与刺乌头碱的羟基形成氢键，非水溶性基团刺乌头碱包裹沉淀水溶性基团鞣酸，形成了难溶的鞣酸刺乌头碱化合物。

三、紫外分光光度法

分别精密称取3.4mg刺乌头碱、10mg鞣酸、13.4mg本发明制备的鞣酸刺乌头碱化合物，置50ml容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，得到三种浓度1.176×10^-6mol·L^-1溶液。

使用UV-2450紫外风光光度仪在25℃条件下测定所述溶液的紫外分光光度曲线，其结果列于附图3。由附图3可以看出，三种物质吸收峰位置有所不同。刺乌头碱的波峰位于252nm以及308nm，鞣酸在276nm处出现最大吸收峰,而在鞣酸刺乌头碱化合物中刺乌头碱波峰由252nm红移至262nm，另一个波峰由308nm蓝移至296nm。其不同可能是由于鞣酸刺乌头碱化合物含有生色团或助色团造成的紫外光区吸收波长红移引起的，因此，可以判断刺乌头碱与鞣酸生成新的鞣酸刺乌头碱化合物。

四、刺乌头碱含量测定

精密称重10mg刺乌头碱，置于100ml容量瓶中，加氯仿溶解定容至刻度，得到100mg·L^-1标准储备液，分别精密确吸取储备液50、25、16.6、12.5、10、6.2ml于100ml容量瓶中，用氯仿定容，得到质量浓度50、25、16.7、12.5、10、6.3mg·L^-1的溶液。使用UV-2450紫外风光光度仪器仪器在25℃条件下测定在波长254.5nm处的吸光度。以刺乌头碱浓度(mg·L^-1)为纵坐标(Y)，吸光度为橫坐标(X)进行线性回归处理，得到回归方程A＝2.83*10^-3C-1.91*10^-2R²＝0.9995(n＝6)；线性关系良好，线性范围为6.3～50mg·L^-1。

精确称取10mg鞣酸刺乌头碱化合物，溶于适量氨水中(pH＝12.6)，将高乌甲素游离出来，转入分液漏斗，用氯仿萃取2次，定容至100ml容量瓶中。使用UV-2450紫外风光光度仪器仪器在25℃条件下测定在波长254.5nm处的测定吸光度，带入已建立刺乌头碱紫外分光光度标准曲线方程计算，刺乌头碱含量为30.19％。刺乌头碱质量为3.018mg，鞣酸为6.982mg，鞣酸与刺乌头碱摩尔比接近1:1。

由上述试验结果可以确定，采用本发明方法制备获得的产物是鞣酸与刺乌头碱按照摩尔比1:1.2组成的鞣酸刺乌头碱化合物。

鞣酸与刺乌头碱通过氢键生成鞣酸刺乌头碱新化合物；它在人工胃液、小肠和结肠液环境中蛋白的沉降能力分别为0.79mg、4.17mg及0.6mg；Wistar大鼠在体外凝血及局部创伤试验中，鞣酸刺乌头碱化合物对血液凝固及伤口愈合能力显著高于空白组(p*<0.01，p*<0.05)。鞣酸刺乌头碱化合物具有沉降蛋白功能，同时具有止血、消炎辅助镇痛的效果，可提高药物的生物应用价值及临床应用。

[有益效果]

本发明具有如下有益效果：

1、本发明由鞣酸与刺乌头碱合成稳定的鞣酸刺乌头碱化合物，它是一类创新型药物，与文献报道的单一型药物相比，具有明显的增效协同作用。

2、本发明鞣酸刺乌头碱化合物对创口愈合效果极显著(**P<0.01)，且大鼠服药的过程中无发炎症状且情绪稳定，并无嘶叫、磕牙现象；鞣酸在创口愈合初期表面形成凝胶状膜，无流血渗出，但随时间延长，愈合能力逐渐下降，伤口周围伴有炎症，并且大鼠出现不同程度的抖动、嘶叫、磕牙现象(*P<0.05)；空白组对伤口的愈合效果不明显。

3、本发明对蛋白质有一定沉淀效果，其栓剂可用于女性妇科疾病引起的糜烂、红肿症状有一定疗效；其片剂对体内局部溃烂引起的出血性疼痛有明显疗效。

4、本发明在体内释放出的鞣酸刺乌头碱，其药物制剂有抗肿瘤、抗心律失常、降血脂、中枢神经抑制、心血管疾病及全身或局部脏器发生的急性/慢性炎症的作用。

5、本发明操作过程中使用无水乙醇等溶剂，绿色环保，对产品无污染，可实现回收再利用，产品无溶剂残留。

6、本发明材料易得，提取时间短，操作及后处理简单，产品得率高，易于产业化生加工研发，具有广泛的应用价值。

【附图说明】

图1是刺乌头碱(a)、鞣酸(b)与鞣酸刺乌头碱化合物(c)的DSC曲线图；

图2是鞣酸与刺乌头碱物理混合物(a)、鞣酸刺乌头碱化合物(b)、刺乌头碱(c)和鞣酸(d)的傅里叶变换红外光谱图；

图3是鞣酸刺乌头碱化合物(a)、鞣酸(b)和刺乌头碱(c)的紫外分光光度曲线图；

图4是生理盐水、鞣酸、鞣酸刺乌头碱对大鼠创伤图；

【具体实施方式】

通过下述实施例将能够更好地理解本发明。

实施例1：制备鞣酸刺乌头碱

A、制备粗制鞣酸刺乌头碱

将1重量份由天津市大茂化学试剂厂生产的鞣酸溶解于80重量份去离子水中，然后加入0.42重量份由上海谱振生物科技有限公司销售的刺乌头碱，在温度35℃的条件下搅拌32min，得到含有沉淀的粗制鞣酸刺乌头碱溶液；

B、萃取分离

让步骤A得到的含有沉淀的粗制鞣酸刺乌头碱溶液在常温条件下使用常规过滤器进行过滤分离，弃去上清液，得到的沉淀物再使用萃取器按照沉淀物与氯仿的重量比1:3在温度19℃的条件下用氯仿萃取3次，萃取液合并，将含有游离刺乌头碱萃余液弃去；

C、干燥

步骤B得到的合并萃取液在由天津市泰斯特仪器有限公司以DZ-1BC Ⅱ真空干燥箱内温度在35℃与真空度0.04MPa的条件下烘干50h，得到所述的鞣酸刺乌头碱。

实施例2：制备鞣酸刺乌头碱

A、制备粗制鞣酸刺乌头碱

将1重量份由天津市大茂化学试剂厂生产的鞣酸溶解于100重量份去离子水中，然后加入0.43重量份由上海谱振生物科技有限公司销售的刺乌头碱，在温度34℃的条件下搅拌29min，得到含有沉淀的粗制鞣酸刺乌头碱溶液；

B、萃取分离

让步骤A得到的含有沉淀的粗制鞣酸刺乌头碱溶液在常温条件下使用常规离心机进行离心分离，弃去上清液，得到的沉淀物再使用萃取器按照沉淀物与氯仿的重量比1:4在温度18℃的条件下用氯仿萃取2次，萃取液合并，将含有游离刺乌头碱萃余液弃去；

C、干燥

步骤B得到的合并萃取液是由在由天津市泰斯特仪器有限公司销售的真空干燥箱内在温度34℃与真空度0.05MPa的条件下烘干55h，得到所述的鞣酸刺乌头碱。

实施例3：制备鞣酸刺乌头碱

A、制备粗制鞣酸刺乌头碱

将1重量份由天津市大茂化学试剂厂生产的鞣酸溶解于120重量份去离子水中，然后加入0.42重量份由武汉宏信康精细化工有限公司销售的刺乌头碱，在温度34℃的条件下搅拌30min，得到含有沉淀的粗制鞣酸刺乌头碱溶液；

B、萃取分离

让步骤A得到的含有沉淀的粗制鞣酸刺乌头碱溶液在常温条件下使用常规离心机进行离心分离，弃去上清液，得到的沉淀物再使用萃取器按照沉淀物与氯仿的重量比1:5在温度22℃的条件下用氯仿萃取3次，萃取液合并，将含有游离刺乌头碱萃余液弃去；

C、干燥

步骤B得到的合并萃取液在由天津市泰斯特仪器有限公司销售的DZ-1BC Ⅱ真空干燥箱内温度在32℃与真空度0.06MPa的条件下烘干52h，得到所述的鞣酸刺乌头碱。

实施例4：制备鞣酸刺乌头碱

A、制备粗制鞣酸刺乌头碱

将1重量份由天津市大茂化学试剂厂生产的鞣酸溶解于90重量份去离子水中，然后加入0.41重量份由武汉宏信康精细化工有限公司销售的刺乌头碱，在温度36℃的条件下搅拌28min，得到含有沉淀的粗制鞣酸刺乌头碱溶液；

B、萃取分离

让步骤A得到的含有沉淀的粗制鞣酸刺乌头碱溶液在常温条件下使用常规过滤器进行过滤分离，弃去上清液，得到的沉淀物再使用萃取器按照沉淀物与氯仿的重量比1:4在温度20℃的条件下用氯仿萃取4次，萃取液合并，将含有游离刺乌头碱萃余液弃去；

C、干燥

步骤B得到的合并萃取液由天津市泰斯特仪器有限公司销售的DZ-1BC Ⅱ真空干燥箱内温度在36℃与真空度0.05MPa的条件下烘干45h，得到所述的鞣酸刺乌头碱。

试验实施例1：稳定性考察

根据《中国药典2005版二部(附录XIXC新药稳定性试验指导原则)》及《化学药物稳定性研究技术指导原则》中对新药稳定性要求的相关内容，对采用本发明方法制备的鞣酸刺乌头碱化合物进行了稳定性考察。精密称取10mg采用本发明方法制备的鞣酸刺乌头碱化合物，分别用pH1.2盐酸、6.8、7.4磷酸缓冲液定容至50ml容量瓶中，即浓度为200mg·L^-1，在温度37℃与自然光条件下放置，分别在2、4、8、10与12h时取样，然后使用由岛津公司以UV-2450紫外风光光度仪在波长276nm处检测RSD(相对标准偏差)，其RSD为0.9％，人工小肠、结肠环境中鞣酸刺乌头碱化合物随时间延长浓度不断增大，药物相对稳定，RSD分别为1.4％和1.7％，参见表1中的结果。因此通过测定紫外吸收度的方法来进行药物定量分析是可行的。

表1：鞣酸高乌甲素在各释放介质中的稳定性测试结果(n＝3)

试验实施例2：鞣酸刺乌头碱对BSA(牛血清白蛋白)沉淀现象的观察

精密称取10mg采用本发明方法制备的鞣酸刺乌头碱化合物，溶于pH6.8或7.4磷酸缓冲液中，然后加入与其磷酸缓冲液等量的BSA溶液，在温度37℃与转速70r·min^-1的条件下在恒温振荡器中振动5h，再静置一夜。在第二天观察到明显蛋白质沉淀。由于在磷酸缓冲液中pH值小于蛋白质等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与鞣酸刺乌头碱化合物负离子发生沉淀，形成不溶的盐，并且随着时间迁移而发生变化，鞣酸在有氧环境中遇碱容易颜色加深。

试验实施例3：鞣酸刺乌头碱在人工胃液和人工结肠液中对蛋白质沉淀的影响

人工胃液(0.1M HCl)：精密称取12.5mg鞣酸刺乌头碱，定容置250ml容量瓶中，加0.1mol HCl溶解定溶至刻度，摇匀得到浓度50mg·L^-1的储备液。分别精确吸取6、8、10、12、14、16ml于50ml容量瓶中，配成系列浓度为6、8、10、12、14、16mg·L^-1的鞣酸刺乌头碱标准溶液，以浓度对吸光度值进行线性回归，在波长276nm处进行紫外扫描并绘制标准曲线。得到回归方程A＝2.76×10^-2C+1.43×10^-2R²＝0.9971(n＝7)

人工小肠、结肠液(PBS)：精密称取12.5mg鞣酸刺乌头碱，定容置250ml容量瓶中，加pH6.8、7.4磷酸缓冲液中定溶，摇匀得浓度50mg·L^-1的储备液。其余如“人工胃液”操作。得到回归方程A＝0.36×10^-2C+0.23×10^-2R²＝0.9901(n＝7)；A＝0.56×10^-2C-0.11×10^-2R²＝0.9955(n＝7)。

将采用本发明方法制备的鞣酸刺乌头碱化合物溶解于0.1M、pH1.2盐酸溶液中，配制浓度为50mg·L^-1过饱和溶液。精密吸取12ml这种溶液，定溶至50ml容量瓶中，得到浓度X₁＝12ug/ml，加入一定量牛血清蛋白放置摇床中(37℃，70r·min^-1)，第二天取上清液测定鞣酸刺乌头碱化合物浓度X₂＝7.26ug/ml，两浓度差为(X₁-X₂)4.74ug/ml，最终蛋白质的沉淀量为2.37×10^-4g。在276nm处进行紫外扫描并绘制标准曲线。人工小肠、结肠液与结肠方法同人工胃液。

实验证明鞣酸刺乌头碱化合物在酸性条件下沉淀蛋白质效果比碱性条件下明显。由于鞣酸刺乌头碱化合物在不同pH环境中均对蛋白质有沉淀作用，因此可推断出药物可能对体内局部溃烂引起的蛋白裸露具有沉淀收敛效果。

试验实施例4：大鼠血液凝血时间

1、凝血板法测定大鼠血液凝血时间

称取3mg采用本发明方法制备的鞣酸刺乌头碱化合物，称取3mg鞣酸，生理盐水空白样，放入凝血板坑内，加0.1ml氯化钙溶液，用大头针混匀，同时放入0.5ml抗凝血浆(37℃水浴锅内)，开始计时。每隔30s倾斜试管1次进行观察记录。鞣酸和鞣酸刺乌头碱化合物相对生理盐水凝血缩短率分别达到-19.97％，19.64％，具体参见表2。

表2：凝血板法时间测定()

与空白组比较：*P<0.05；n＝6

从表2中可以看出鞣酸刺乌头碱化合物可显著缩短大鼠凝血时间，与空白组比较差异显著*P<0.05，而鞣酸对大鼠凝血效果不明显*P>0.05。

2、血浆覆盖时间测定大鼠血液凝血时间

称量3mg采用本发明方法制备的鞣酸刺乌头碱化合物，称取3mg鞣酸，生理盐水空白样，放入试管内，加0.1ml氯化钙溶液摇匀，同时放入0.5ml抗凝血浆(37℃水浴锅内)，开始计时。每隔30s倾斜试管1次进行观察记录。鞣酸和鞣酸刺乌头碱化合物相对生理盐水凝血缩短率分别达到4％，25.88％，具体参见表3。

表3：血浆复钙时间测定()

与空白组比较：*P<0.05，**P<0.01；n＝6

从表3中可以看血浆复钙实验中鞣酸刺乌头碱化合物与空白组比较差异极显著P<0.01，鞣酸与空白组比较差异显著P<0.5，鞣酸刺乌头碱化合物和鞣酸都具有凝血效果，但是鞣酸刺乌头碱化合物效果明显。可能是由于鞣酸中存在大量络合基团，与血液中金属离子产生络合物使血液凝聚的原因。

从表2、3列出的数据可以得出，鞣酸在凝血板法试验中凝血时间缩短率为-19.97％，由于鞣酸氯化钙溶液难溶于血液且易受周围环境温度、玻片干净程度及末梢血是否混有组织液等因素的影响，因此凝血速度慢，凝血效果不明显。血浆覆盖试验与凝血板法相比，鞣酸刺乌头碱化合物凝血时间缩短率达25.88％，鞣酸凝血时间缩短率为4％，两种药物凝血时间敏感，血浆凝固较快，且在37℃下进行连续性地观察时，血液凝固终点清晰可见，从而可对模型试验作为验证。由上述试验可以看出鞣酸和鞣酸刺乌头碱化合物也具有凝血功效。

试验实施例5：Wistar大鼠体表局部创伤试验

选用9只Wistar大鼠，实验前禁食一夜。体重约300-500g，用***麻醉，固定在老鼠板上。背部剃毛面积8cm×5cm。酒精棉球消毒后用手术刀在鼠背部脊柱两侧按预先设计好的模型(皮肤切线伤模型)划出4.5cm长伤口，深至皮下，直至有组织液及血液从创口流出。分别用生理盐水(空白)、鞣酸阴性对照、鞣酸刺乌头碱化合物连续8天给药，观察现象，不同药物对大鼠创伤考察参见附图4。

在用药期间，每天测量大鼠伤口长度并观察大鼠的全身状况及局部反应用于组织病理学评价。表4与5给出体表局部创伤后给药刺激反应评价及创伤刺激强度评价标准。

表4：大鼠体表局部创伤后给药刺激反应评价表

表5：大鼠体表局部创伤刺激强度评价表

表6给出了不同药物组对大鼠创伤给药一天的体表刺激性反应结果及评价结果。表7列出不同药物组对伤口长度愈合程度变化影响结果。

表6：不同药物组对大鼠创伤给药一天的体表刺激性反应结果及评价

表6的结果清楚地表明，生理盐水组：如图4所示，第1-3天涂抹0.9％氯化钠溶液，伤口愈合现象不明显但出现不同程度的刺激性反应，第4-8天皮层表面苍白，但伤口周围有明显红肿、充血现象，涂抹时身体抖动明显，叫声凄惨，磕牙现象严重。如表5、6所示，对各项指标评分最后算出的体表局部创伤反应评价表的平均值分别为2和1.6，根据表6得出伤口愈合程度低。

鞣酸组：如图4所示，第1-3天涂抹鞣酸，伤口表面形成凝胶状膜且有不同程度的刺激性反应，第3-5天皮层表面苍白但伤口周围有明显红肿、充血现象，涂抹时身体抖动明显，叫声凄凉，有磕牙现象。第6-8天伤口长度明显缩小，周围炎症消失，如表5、6所示，对各项指标评分最后算出的体表局部创伤反应评价表的平均值分别为1.2和0.6，根据表6得出伤口愈合程度中等。

鞣酸刺乌头碱化合物组：如图4所示，第1-3天涂抹鞣酸刺乌头碱化合物，伤口长度明显缩小且无明显刺激性反应，从第4-8天皮层表面苍白伤，口无血液渗出，身体无抖动、磕牙现象。如表4和5所示对各项指标评分最后算出的体表局部创伤反应评价表的平均值分别为0.4和0.2，根据表6得出伤口愈合程度高。

表7：不同药物组对伤口长度愈合程度变化

同列之间用小写字母表示，同行之间用大写字母表示，*P<0.05，**P<0.01。

表7列出不同药物对伤口愈合程度影响结果表明，体表伤口长度模型4.5cm，愈合程度随时间变化不断增强。三组药物根据每天测量的伤口长度相互对比。空白组连续八天给药大鼠伤口愈合没有明显改变，鞣酸组与鞣酸刺乌头碱化合物组第三天与第二天相比伤口有明显愈合(*P<0.05)。空白组与鞣酸组在第二天到第四天伤口没有明显的差别影响，但鞣酸刺乌头碱化合物组与空白组、鞣酸组相比伤口愈合明显(**P<0.01)，从第五天到第八天相比，鞣酸组和鞣酸刺乌头碱化合物组对伤口愈合有明显差别。与空白组和鞣酸组相比，鞣酸刺乌头碱化合物组对伤口愈合程度高并且可有效地减少创口愈合时间。

综合数据表明局部创伤试验中鞣酸刺乌头碱化合物在创口表面吸收较快，由于刺乌头碱具有镇痛功效，给药期间，大鼠表现镇定，创面结痂、收缩明显，无发炎症状，对创口愈合效果极显著(**P<0.01)；鞣酸在创口愈合初期表面形成凝胶状膜，无流血渗出，但随时间延长，愈合能力逐渐下降伤口周围伴有炎症并且大鼠出现不同程度的抖动、嘶叫、磕牙现象(*P<0.05)；空白组对伤口的愈合效果不明显。鞣酸刺乌头碱化合物具有止血消炎功效，可有效地减少创口愈合时间。

因此，可以判断鞣酸刺乌头碱可促进伤口愈合，并有一定的消炎、镇痛功效，为临床使用提供依据。它可用于体表局部溃烂、烧伤、刀伤及战争中战士伤口感染化脓等的外敷用药。

Claims (10)

1.一种鞣酸刺乌头碱的制备方法，其特征在于该方法的步骤如下：

A、制备粗制鞣酸刺乌头碱

将1重量份鞣酸溶解于80～120重量份去离子水中，然后加入0.41～0.43重量份刺乌头碱，在温度34～36℃的条件下搅拌28～32min，得到含有沉淀的粗制鞣酸刺乌头碱溶液；

B、萃取分离

让步骤A得到的含有沉淀的粗制鞣酸刺乌头碱溶液在常温条件下进行分离，弃去上清液，得到的沉淀物再按照沉淀物与氯仿的重量比1:3～5在温度18～22℃的条件下用氯仿萃取2～4次，萃取液合并，将含有游离刺乌头碱萃余液弃去；

C、干燥

步骤B得到的合并萃取液在真空干燥箱内在温度32～36℃与真空度0.08～0.09MPa的条件下烘干45～55h，得到所述的鞣酸刺乌头碱化合物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤B中，所述的分离是采用过滤法或离心分离法进行的分离。

3.根据权利要求1所述制备方法所得到的鞣酸刺乌头碱。

4.一种药物组合物，其特征在于它含有权利要求3所述的鞣酸刺乌头碱与在药物上可以接受的载体，所述的鞣酸刺乌头碱与所述载体的重量比是8～80:50～150。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于所述的载体是一种或多种选自微晶纤维素、微粉硅胶、羧甲基淀粉、聚维酮、预胶化淀粉、硬脂酸镁、甘油、明胶、冰片或乳糖的载体。

6.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物为胶囊剂、片剂、栓剂或缓释片。

7.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物为胶囊时，它由80重量份所述的鞣酸刺乌头碱、100重量份微晶纤维素、0.8重量份微粉硅胶、13重量份羧甲基淀粉、20重量份浓度以重量计1～3％聚维酮乙醇溶液与6重量份预胶化淀粉组成。

8.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物为片剂时，它由80重量份所述的鞣酸刺乌头碱、100重量份微晶纤维素、20重量份浓度以重量计1～3％聚维酮乙醇溶液、28重量份羧甲基淀粉、13重量份淀粉与1.6重量份硬脂酸镁组成。

9.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物为栓剂时，它由8重量份所述的鞣酸刺乌头碱、76重量份甘油、24重量份明胶与0.5重量份冰片组成。

10.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物为缓释片剂时，它由80重量份所述的鞣酸刺乌头碱、12重量份羟丙基甲基纤维素、30重量份微晶纤维素、15重量份浓度以重量计1～3％聚维酮乙醇溶液、10重量份乳糖与2重量份硬脂酸镁组成。