CN104007093B - 一种快速定量计算植物固有抗干旱能力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速定量计算植物固有抗干旱能力的方法，包括以下步骤：将待测植物叶片清理后放入水中浸泡，30分钟后取出叶片并将表面的水吸干；用IMAGING-PAM调制式叶绿素荧光仪测定0水平荧光时叶片的初始荧光（Fo）和PSⅡ最大光化学量子产量（Fv/Fm），重复3次；随后，让上述叶片失水，每隔1小时重复上述操作。将饱水0小时的测得结果作为参照，计算各测定时刻的相对Fo和相对Fv/Fm，分别相加得到饱水后前5个小时累积相对Fo（T_RSF）和累积相对Fv/Fm（T_RPF）。比较T_RSF和T_RPF数值大小，定量不同植物固有的抗干旱能力<i>。</i>本发明具有精确度高，操作简便快捷、速度快等优点，可用于耐旱品种的选育。

Description

一种快速定量计算植物固有抗干旱能力的方法

技术领域

本发明涉及标准的失水模式下，一种快速定量计算植物固有的抗干旱能力的方法，属于抗旱选种、农业工程和农作物信息检测技术领域。

背景技术

植物的生长发育离不开光合作用，光合作用是生物界所有物质代谢和能量代谢的基础，包括一系列光物理、光化学和生物化学转变的复杂过程，在光合作用的原初反应，将吸收光能传递、转换为电能的过程中，有一部分光能损耗是以较长的荧光方式释放的。

自然条件下的叶绿素荧光和光合作用有着十分密切的关系。一方面，当植物被暴露在过强的光照条件下，荧光起着十分重要的保护作用，避免叶绿体吸收光能超过光合作用的消化能力，将强光灼伤的损失降低到最小；另一方面，一般来说，自然条件下叶绿素荧光和光合速率是相互负关联的，光合速率高，荧光弱；反之，当光合强度下降时，则荧光的发射就增强。

叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用过程中光***对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作用，与“表观性"的气体交换指标相比，叶绿素荧光参数更具有反映“内在性”的特点。

研究表明植物体内发出的叶绿素荧光信号包含了十分丰富的光合作用信息，其特性与植物的营养和受胁迫程度密切相关，可以快速、灵敏和无损地探测植物在胁迫下光合作用的真实行为。通过植物光合过程中荧光特性的探测可以了解植物受胁迫的状况。

由于叶绿素荧光技术具有灵敏、简便、快速和无损伤检测等优点，目前叶绿素荧光技术广泛应用于植物生理学、植物育种、园艺学、农艺学、林学、生态学、农用化学、海洋与湖沼学、微藻生物技术和环境保护等领域。其中在植物生理学上的研究主要有以下几个方面：光照(光强和光质)，养分胁迫，温度，水分，CO₂和盐度胁迫等影响因子对其叶绿素荧光参数的影响。在测定植物叶绿素荧光参数时，使用IMAGING-PAM调制式叶绿素荧光仪一次可测多点、多个参数，比普通的叶绿素荧光仪方便快速。

光合作用受多种因素的影响，水分胁迫是其中一个重要因素。在水分胁迫条件下，植物叶片光合能力降低。目前，测定植物的抗干旱能力是通过测定已处于干旱条件下的、包括叶绿素荧光参数等的植物生理生化参数来表征抗干旱能力的，这需要一个复杂的实验设计和较长的时间，而且不同植物的测定值不具有可比性。使得测定的叶绿素荧光参数等只能定性地反映植物即时的抗逆性，而对于固有的抗干旱能力则无法定量。为了消去植物的叶绿素荧光参数受到先前干旱逆境胁迫状态的影响，本发明建立植物的饱水状态和标准的失水模式，在动态失水过程中，测定叶绿素荧光对失水速率的响应情况，进而定量判断植物固有的抗干旱能力。

对现行专利《一种定量检测植物抗干旱能力的方法》(专利号：201310701096.X)，主要从叶片相对紧张度角度反映植物的抗干旱能力；使用LCR测试仪(HIOKI3532-50，日本日置)、水势仪(WaterPotentialSystem，WESCOR，USA)测定植物叶片紧张度时，由于需要稳定及平衡，致使测定时间较长、对植物水分变化状况响应较慢。本发明从光响应角度反映植物的抗干旱胁迫能力，使用IMAGING-PAM调制式叶绿素荧光仪测定叶绿素荧光参数，测定时稳定、所需时间短，一次可测多点、多个参数，可以快速、稳定地响应植物失水情况，进而诊断抗干旱能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速定量计算植物固有抗干旱能力的方法，以更方便地获取植物固有的抗干旱能力，为植物耐旱性鉴定、耐旱品种的选育提供科学数据。

为了解决以上技术问题，本发明通过建立植物的饱水状态和标准的失水模式，在动态失水过程中，利用叶绿素荧光参数对失水速率的响应情况，无损快速定量计算植物固有的抗干旱能力；而且在0水平荧光时，不需要暗处理，直接测定叶绿素初始荧光值及光***Ⅱ(PSⅡ)最大光化学量子产量两项参数；采用的具体技术方案如下：

一种快速定量计算植物固有抗干旱能力的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一，取带有叶片的待测植物的新鲜枝条，并用湿布包住植株枝干基部，以减缓水分散发；

步骤二，立即返回实验室，清理叶片表面灰尘后，将新鲜枝条的叶片采摘下来，放入装有水的盆中浸泡30分钟；

步骤三，叶片浸泡30分钟后，成饱水状态，取出浸泡后的饱水叶片，用面巾纸将叶片表面上的水快速轻轻吸干；

步骤四，取上述经过步骤三处理的饱水叶片，用德国HeinzWalzGmbH公司生产的IMAGING-PAM调制式叶绿素荧光仪，于实验室内测定0水平荧光时植物叶片初始荧光值(Fo)和PSⅡ最大光化学量子产量值(Fv/Fm)；每片植物叶片重复测定3次；

步骤五，随后，将所述饱水叶片，放在干燥通风的桌面上让其失水；每隔1个小时用IMAGING-PAM调制式叶绿素荧光仪，测定光照强度为0时即0水平荧光时该叶片初始荧光值(Fo)和PSⅡ最大光化学量子产量值(Fv/Fm)；

步骤六，将饱水0小时即饱水后未失水时测得的结果作为参照，计算各个测定时刻的相对初始荧光值和相对最大光化学量子产量值；

饱水后不同失水时刻相对初始荧光值的计算按公式为R_SFi＝SF_i/SF₀，其中SF_i为饱水后i失水时刻叶绿素初始荧光值Fo，i分别为0，1，2，3，4，5小时；

饱水后不同失水时刻相对最大光化学量子产量值的计算按公式为R_PFi＝PF_i/PF₀，其中PF_i为饱水后i失水时刻PSⅡ最大光化学量子产量值Fv/Fm，i分别为0，1，2，3，4，5小时；

步骤七，将饱水后前5个小时待测植物叶片的相对初始荧光值相加得到待测植物叶片的累积相对初始荧光值T_RSF；即T_RSF＝∑R_SFi＝R_SF0+R_SF1+R_SF2+R_SF3+R_SF4+R_SF5；将饱水后前5个小时待测植物叶片的相对最大光化学量子产量值相加得到待测植物叶片的累积相对最大光化学量子产量值T_RPF,即T_RPF＝∑R_PFi＝R_PF0+R_PF1+R_PF2+R_PF3+R_PF4+R_PF5；

步骤八，分别比较待测植物叶片的累积相对初始荧光值T_RSF和累积相对最大光化学量子产量值T_RPF数值大小，从而定量计算出不同植物固有的抗干旱能力。

本发明的基本原理为：自然条件下，植物受到先前干旱逆境胁迫的影响，叶绿素荧光参数等植物的生理生化参数只能定性地反映植物即时的抗逆性。本发明设定植物的饱水状态和标准的失水模式，可消除外界环境的影响；利用IMAGING-PAM调制式叶绿素荧光仪通过测定叶绿素荧光参数，响应植物叶片的失水速率，以定量植物固有的抗干旱能力。

本发明具有有益效果。本发明精确度高，操作简便快捷、速度快，能快速定量地反映植物固有的抗干旱能力，不受自然环境的限制。既可以对不同品种植物的抗干旱能力进行比较，也可以对同一品种植物不同苗龄的抗旱能力进行比较，简便快速，为耐旱品种的选育及精确灌溉提供科学数据。

虽然现行方法《一种定量检测植物抗干旱能力的方法》(专利号：201310701096.X)也能定量测定植物抗干旱能力，但是，该现有技术相比本发明存在缺陷，主要表现在以下几个方面：

1、植物叶片细胞膨胀、收缩存在一定的时间，现有技术用叶片紧张度反映的植物抗干旱能力具有延迟性，增加了测定时间。而本发明则不需要考虑细胞水分状况发生变化时对紧张度产生的影响，荧光信息反应及时。

2、现有技术测量植物组织水势值时，先将叶片打孔，属于有损检测；本发明直接测定叶片叶绿素荧光参数，对植物不会产生损坏。

3、现有技术实验所用仪器测定时间较长：测量叶片生理电容，为了减小误差、增加精确度，每个时刻的测量值需要10分钟；而测量组织水势，每个测定点先平衡6分钟，每次3个重复，共需要20分钟。本发明使用IMAGING-PAM调制式叶绿素荧光仪测定叶绿素荧光参数时，一次可测多点、多个参数，重复测定3次，大概2分钟，快速便捷。

4、现行方法涉及参数包括环境温度，不同的环境温度会影响测定结果。而本发明不需要考虑环境温度的影响。

5、现行方法为了计算出叶片的紧张度，以反映植物的抗干旱能力，将叶片溶质设定为蔗糖C₁₂H₂₂O₁₁，这样就限定了公式中的a和M的值。实际上一方面所有植物叶片溶质的主要成分并一定是蔗糖；另一方面，不同植物在不同的生长环境下，叶片的蔗糖含量不同。而本发明则不需要考虑植物种类和环境因素的影响，可以直接定量计算植物固有的抗干旱能力。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明的技术方案做进一步详细说明。

实施例1

第一步，实验前，于江苏大学校园内采摘长势较为一致的构树植物的新鲜枝条，并用湿布包住植株枝干基部，以减缓水分散发。

第二步，迅速返回实验室，清理叶片表面灰尘后，将6片大小一致的构树新鲜叶片采摘下来，放入装有水的盆中浸泡30分钟。

第三步，叶片浸泡30分钟后，成饱水状态，取出浸泡后的饱水叶片，用干毛巾及面巾纸等将叶片表面上的水快速轻轻吸干后，放在干燥通风的桌面上。

第四步，取上述经过步骤三处理的饱水叶片用IMAGING-PAM调制式叶绿素荧光仪测定0水平荧光时构树叶片的初始荧光值(Fo)和PSⅡ最大光化学量子产量值(Fv/Fm)，重复测定3次，平均值作为此时刻的测量值。

第五步，每隔1个小时重复第四步进行测定其它时刻的叶绿素荧光参数指标。

第六步，将饱水0小时测得的结果作为参照，计算各个测定时刻的相对初始荧光值和相对最大光化学量子产量值。饱水后不同失水时刻相对初始荧光值的计算按公式：R_SFi＝SF_i/SF₀，其中SF_i为饱水后i失水时刻叶绿素初始荧光值Fo，i分别为0，1，2，3，4，5小时；饱水后不同失水时刻相对最大光化学量子产量值的计算按公式：R_PFi＝PF_i/PF₀，其中PF_i为饱水后i失水时刻PSⅡ最大光化学量子产量值Fv/Fm，i分别为0，1，2，3，4，5小时。

第七步，将饱水后前5个小时待测构树叶片的相对初始荧光值相加得到累积相对初始荧光值T_RSF。即T_RSF＝∑R_SFi＝R_SF0+R_SF1+R_SF2+R_SF3+R_SF4+R_SF5。将饱水后前5个小时待测构树叶片的相对最大光化学量子产量值相加得到累积相对最大光化学量子产量值T_RPF。即T_RPF＝∑R_PFi＝R_PF0+R_PF1+R_PF2+R_PF3+R_PF4+R_PF5。

第八步，分别比较待测构树叶片的累积相对初始荧光值T_RSF和累积相对最大光化学量子产量值T_RPF数值大小，量化计算构树固有的抗干旱能力。

实施例2

第一步，实验前，于江苏大学校园内采摘长势较为一致桑树叶片6片，并装入保鲜袋中。

第二步，迅速返回实验室，将采摘的新鲜叶片放入装有水的盆中浸泡30分钟。

第三步，30分钟后取出浸泡的叶片，用干毛巾及面巾纸等将叶片表面的水吸干后，放在干燥通风的桌面上。

第四步，取上述经过步骤三处理的饱水叶片用IMAGING-PAM调制式叶绿素荧光仪测定0水平荧光时桑树叶片的初始荧光值(Fo)和PSⅡ最大光化学量子产量值(Fv/Fm)，重复测定3次，平均值作为此时刻的测量值。

第五步，每隔1个小时重复第四步进行测定其它时刻的叶绿素荧光参数指标。

第六步，将饱水0小时测得的结果作为参照，计算各个测定时刻的相对初始荧光值和相对最大光化学量子产量值。饱水后不同失水时刻相对初始荧光值的计算按公式：R_SFi＝SF_i/SF₀，其中SF_i为饱水后i失水时刻叶绿素初始荧光值Fo，i分别为0，1，2，3，4，5小时；饱水后不同失水时刻相对最大光化学量子产量值的计算按公式：R_PFi＝PF_i/PF₀，其中PF_i为饱水后i失水时刻PSⅡ最大光化学量子产量值Fv/Fm，i分别为0，1，2，3，4，5小时。

第七步，将饱水后前5个小时待测桑树叶片的相对初始荧光值相加得到累积相对初始荧光值T_RSF。即T_RSF＝∑R_SFi＝R_SF0+R_SF1+R_SF2+R_SF3+R_SF4+R_SF5。将饱水后前5个小时待测桑树叶片的相对最大光化学量子产量值相加得到累积相对最大光化学量子产量值T_RPF。即T_RPF＝∑R_PFi＝R_PF0+R_PF1+R_PF2+R_PF3+R_PF4+R_PF5。

第八步，分别比较待测桑树叶片的累积相对初始荧光值T_RSF和累积相对最大光化学量子产量值T_RPF数值大小，量化计算桑树固有的抗干旱能力。

本发明的实施效果如下：

表1是不同时刻构树、桑树叶片初始荧光值、PSⅡ最大光化学量子产量值。从表1中可以看出，构树叶片初始荧光值小于桑树，说明构树反应中心的开放程度低于桑树，且两种植物叶片初始荧光值的变化呈相反趋势；构树的PSⅡ最大光化学量子产量值大于桑树，两种植物的PSⅡ最大光化学量子产量值的变化呈相反趋势。表2是不同时刻构树、桑树叶片的相对初始荧光值及相对最大光化学量子产量值。将每个时刻叶片的相对初始荧光值及相对最大光化学量子产量值相加，得到两种植物叶片的的累积相对初始荧光值T_RSF及累积相对最大光化学量子产量值T_RPF。

表1不同时刻构树、桑树初始荧光值及最大光化学量子产量值

初始荧光值越大表明植物受到逆境越大，植物抗逆能力也就越弱。根据T_RSF＝∑R_SFi和T_RPF＝∑R_PFi，得到待测植物叶片的累积相对初始荧光值T_RSF及累积相对最大光化学量子产量值T_RPF，结果如表2所示。从表2可以看出构树叶片的相对初始荧光值之和是5.496、桑树为7.65，说明构树的抗干旱能力大于桑树。PSⅡ最大光化学量子产量值越大表明植物受逆境影响较小，植物抗逆能力越强。表2中构树叶片的相对最大光化学量子产量值是6.576、桑树为5.359，同样说明构树的抗干旱能力大于桑树。从这里可以看出本发明可以由累积相对初始荧光值T_RSF及累积相对最大光化学量子产量值T_RPF的数值来判断植物固有的抗干旱能力。这个结果与现行专利《一种定量检测植物抗干旱能力的方法》(专利号：201310701096.X)测定结果一致，现行专利完成每个时间段的测定需要30分钟，本发明使用IMAGING-PAM调制式叶绿素荧光仪完成每个时间段的测定大概需要2分钟，快速准确定量植物固有的抗干旱能力。

表2不同时刻构树、桑树的相对初始荧光和相对最大光化学量子产量值

Claims (1)

1.一种快速定量计算植物固有抗干旱能力的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一，取带有叶片的待测植物的新鲜枝条，并用湿布包住植株枝干基部，以减缓水分散发；

步骤二，立即返回实验室，清理叶片表面灰尘后，将新鲜枝条的叶片采摘下来，放入装有水的盆中浸泡30分钟；

步骤三，叶片浸泡30分钟后，成饱水状态，取出浸泡后的饱水叶片，用面巾纸将叶片表面上的水快速轻轻吸干；

步骤四，取上述经过步骤三处理的饱水叶片，用德国HeinzWalzGmbH公司生产的IMAGING-PAM调制式叶绿素荧光仪，于实验室内测定0水平荧光时植物叶片初始荧光值和PSⅡ最大光化学量子产量值；每片植物叶片重复测定3次；

步骤五，随后，将所述饱水叶片，放在干燥通风的桌面上让其失水；每隔1个小时用IMAGING-PAM调制式叶绿素荧光仪，测定光照强度为0时即0水平荧光时该叶片初始荧光值和PSⅡ最大光化学量子产量值；

步骤六，将饱水0小时即饱水后未失水时测得的结果作为参照，计算各个测定时刻的相对初始荧光值和相对最大光化学量子产量值；

饱水后不同失水时刻相对初始荧光值的计算按公式为R_SFi＝SF_i/SF₀，其中SF_i为饱水后i失水时刻叶绿素初始荧光值Fo，i分别为0，1，2，3，4，5小时；

饱水后不同失水时刻相对最大光化学量子产量值的计算按公式为R_PFi＝PF_i/PF₀，其中PF_i为饱水后i失水时刻PSⅡ最大光化学量子产量值Fv/Fm，i分别为0，1，2，3，4，5小时；

步骤七，将饱水后前5个小时待测植物叶片的相对初始荧光值相加得到待测植物叶片的累积相对初始荧光值T_RSF；即T_RSF＝∑R_SFi＝R_SF0+R_SF1+R_SF2+R_SF3+R_SF4+R_SF5；将饱水后前5个小时待测植物叶片的相对最大光化学量子产量值相加得到待测植物叶片的累积相对最大光化学量子产量值T_RPF,即T_RPF＝∑R_PFi＝R_PF0+R_PF1+R_PF2+R_PF3+R_PF4+R_PF5；

步骤八，分别比较待测植物叶片的累积相对初始荧光值T_RSF和累积相对最大光化学量子产量值T_RPF数值大小，从而定量计算出不同植物固有的抗干旱能力。