CN104004833A - 基于丝瓜转录组序列开发的est-ssr核心引物组及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一套基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组，包括50对引物，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1～100所示。本发明的50对EST-SSR核心引物具有多态性丰富、扩增稳定、重复性好、便于统计等优点，同时由于这些引物均来自丝瓜表达基因，能够反映基因组中功能序列的变异，从而能够更好的区分丝瓜遗传种质的多样性。本核心引物组可用于丝瓜品种鉴定、品种遗传系谱分析和种质资源遗传多样性分析等领域，有利于保护育种者、生产者和消费者的合法权益，促进丝瓜遗传育种和丝瓜生产的健康发展。
Description
技术领域
本发明涉及EST-SSR核心引物组，具体涉及一套基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组及其应用。
背景技术
丝瓜为葫芦科(Cucurbitaceae)丝瓜属(Luffa spp.)一年生攀援性草本植物，其作为一种重要的蔬菜作物在我国的南北各地均有广泛的种植面积。丝瓜除作为蔬菜外，还是一种重要的药用植物。现代药理学证明，丝瓜中含有生物碱类、黄酮类、固醇类、糖苷类等多种有效成分，具有抗真菌、抗细菌、消炎等作用。最近的研究结果证明，丝瓜种子中含有核糖体失活蛋白，能够抑制艾滋病病毒的生长，因此是潜在治疗艾滋病的药物。
近年来，随着人们对营养保健的日益重视，丝瓜作为一种药膳兼用及高温季节市场供应蔬菜，深受人们喜爱，需求量不断增大，栽培面积呈扩大趋势。我国研究者从20世纪60年代起开始丝瓜遗传育种、杂种优势及遗传特性等方面的研究，取得了一定进展，培育了一批优良新品种。由于丝瓜的基础理论研究薄弱，目前在丝瓜育种及品种保护方面存在两个突出问题：一、如何对丝瓜种质资源的遗传多样性进行准确鉴定，从而高效的指导育种家进行亲本的选配；二、如何准确、快速进行丝瓜品种的鉴定，从而更好的推动丝瓜品种审定、品种保护、真假品种辨别、品种的产权纠纷的解决等方面的发展。
基于个体间DNA序列多态性的分子标记技术具有测试周期短、潜在标记数量多、不受环境影响和季节限制、没有组织特异性、准确性高、利于高通量测试分析等优势，已被广泛用于种质资源遗传多样性分析、新品种鉴定、种子纯度检测中。在丝瓜中，已有一些研究者利用分子标记对丝瓜种质资源进行了遗传多样性分析，但是一般都是采用的RAPD、ISSR、SRAP等随机引物标记。这些标记均是基于无基因组(或转录组)序列信息开发的标记技术，尽管有一定的实用性，但是标记的随机性强、稳定性差，从而影响了实验结果的准确性。
EST-SSR是基于EST序列或cDNA数据开发的一种SSR分子标记。由于其来自表达基因，因而除具备传统基因组来源SSR标记的所有优势外，还具有信息含量高(反映表达基因信息)、开发费用低、通用性好等优点，从而强化了该标记在遗传研究中的应用。目前，该标记在遗传多样性分析、品种鉴定、遗传图谱构建、基因(QTL)定位等研究领域得到了较好的应用。目前，在玉米、小麦、谷子等作物中为提高SSR技术的检测效率，开展了核心引物组的相关研究，取得了较好的效果。核心引物组指均匀覆盖全基因组、多态性高、稳定性强、重复性好的一套引物，利用其进行遗传多样性分析、品种鉴定具有快速、简便、准确性高的优点。目前，丝瓜尚无基于基因组或者转录组序列开发的特异性分子标记，因此，开发丝瓜EST-SSR核心引物组，已成为丝瓜育种、生产和品种保护领域中迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一套基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组。
本发明的另一个目的在于提供上述的基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组在丝瓜种质资源遗传多样性分析、丝瓜品种遗传系谱或丝瓜品种鉴定中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组，其包括50对引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1～100所示。
利用上述基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组进行丝瓜种质资源遗传多样性分析、丝瓜品种遗传系谱或丝瓜品种鉴定的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测丝瓜样品基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的待测样品DNA为模板，利用序列表SEQ ID NO.1～100所示引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(3)将步骤(2)的PCR扩增产物采用采用6％变性聚丙烯酞胺凝胶电泳检测，银染显色，统计检测结果；
(4)利用步骤(3)的统计结果进行丝瓜种质资源遗传多样性分析、丝瓜品种遗传系谱或丝瓜品种鉴定。
所述PCR扩增反应体系(20μL)包括：2μL10×buffer；0.5μL Taq酶(2U·μL-1)；0.4μL dNTP(10mmol·L-1)；上、下游引物各0.1μL(50pmoL·μL-1)；1μL模板DNA(50ng·μL-1)；15.9μL ddH2O。PCR程序为Touch-down PCR：94℃预变性3min；94℃30S，65℃(－1℃/cycle)1min，72℃1min，15个循环；94℃30S，50℃1min，72℃1min，25个循环；72℃终延伸10min。
所述丝瓜种质资源遗传多样性分析或丝瓜品种遗传系谱分析方法为：使用NTSYS-pc2.l0e软件进行基于UPGMA法的聚类分析；使用POPGENE软件计算各引物的等位基因数(Na)、基因多样性(h)和Shannon值(I)。
所述丝瓜品种鉴定方法为：统计每个品种在引物中的扩增情况，构建DNA指纹图谱，一一比较各引物位点差异，差异引物数≥2，判定两个品种为不同品种；差异引物数＝1，判定两个品种为近似品种；差异引物数＝0，判定两个品种为相同品种。
本发明的有益效果是：本发明的50对EST-SSR核心引物具有多态性丰富、扩增稳定、重复性好、便于统计等优点，同时由于这些引物均来自丝瓜表达基因，能够反映基因组中功能序列的变异，从而能够更好的区分丝瓜遗传种质的多样性。本核心引物组可用于丝瓜品种鉴定、品种遗传系谱分析和种质资源遗传多样性分析等领域，有利于保护育种者、生产者和消费者的合法权益，促进丝瓜遗传育种和丝瓜生产的健康发展。
附图说明
图1为依据50对丝瓜EST-SSR核心引物组对46份丝瓜材料聚类分析。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例
一、丝瓜EST-SSR核心引物组的开发
1、材料
从本单位保存的丝瓜种质资源中筛选出46份核心种质资源材料(表1)用于丝瓜EST-SSR核心引物组的评价和资源遗传多样性的鉴定。46份丝瓜资源材料中包括36份有棱丝瓜，10份普通丝瓜；其中25份材料来自中国，8份材料来自泰国，7份材料来自马来西亚，另有6份材料未知来源。
表1本发明中用于丝瓜资源遗传多样性分析材料信息
注：-代表未知来源。
2、丝瓜基因组DNA的提取
采用改良的简易SDS法提取丝瓜叶片基因组DNA，步骤如下：
(1)取适量新鲜叶片，放入2ml离心管中，加入液氮，用微量研磨棒或十字型螺丝刀将叶片捣磨成粉末，加入600微升1.5％SDS微量抽提液(0.5％SDS，250mmol/L NaCL，25mmol/LEDTA，200mmol/L Tris-HCL缓冲液，pH7.5)；
(2)将样品管置于65℃水浴锅中孵育30分钟，每隔5-10分钟颠倒混匀一次；
(3)取出样品，冷却至室温，加入等体积(600-700微升)的氯仿/异戊醇/乙醇(76：4：20)，振荡10分钟，充分混匀；
(4)将样品管12000rpm离心12分钟，小心将上清液转移到另一1.5ml离心管中；
(5)加入等体积异丙醇或两倍体积无水乙醇沉淀，静置3-5分钟，12000rpm离心5分钟；
(6)去上清，用0.5ml70％的乙醇漂洗沉淀，风干，溶于50-100μl TE中。
3、PCR扩增
PCR的反应体系(20μL)包括：2μL10×buffer，0.5μL Taq酶(2U·μL-1)，0.4μL dNTP(10mmol·L-1)，上、下游引物各0.1μL(50pmoL·μL-1)，1μL模板DNA(50ng·μL-1)，15.9μL ddH2O。
PCR程序为Touch-down PCR：94℃预变性3min；94℃30S，65℃(-1℃/cycle)1min，72℃1min，15个循环；94℃30S，50℃1min，72℃1min，25个循环；72℃终延伸10min。
4、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
(1)试剂的配置
1×6％丙烯酰胺贮存液(100mL)：5.7g丙烯酰胺，0.3g Bis，12g尿素，10mL10×TBE，加ddH2O定容至100mL；灌胶前，每10mL胶液，加入10％过硫酸铵70μL，TEMED3μL。
染色液(1×)：0.1％AgNO3
显影液(1×)：0.5g NaOH，0.019g四硼酸钠，0.4mL甲醛(用前加)，ddH2O定容至100ml。
(2)聚丙烯酰胺凝胶的制备
首先将玻璃板底端开口用琼脂糖凝胶封口，待其凝固，将配制好的1×6％丙烯酰胺溶液搅匀，将玻璃板与桌面成30°左右的角，缓缓注胶，避免气泡的产生。注满后放平玻璃板使其与桌面成10°左右的角，***合适的梳子。待其凝固0.5h以后，小心拔出梳子。用蒸馏水反复冲洗点样孔，清除多余没有凝固的物质。
(3)电泳
将玻璃板固定在垂直电泳槽上，加入适量的1×TBE缓冲液。PCR结束后，取出样品，每管加入3μL含溴酚兰和二甲苯青两种指示剂的载样缓冲液。用微量进样器取出3μL样品上样。
(4)银染法染色
电泳完毕后，将玻璃板从电泳槽上拆下，取出凝胶，在蒸馏水中漂洗两次，每次约1min。然后转入染色液中，在摇床上轻摇，染色10min。染色结束后，将凝胶转移到蒸馏水中漂洗两次，每次约1min。然后转入显影液中显色，着色之后转入清水中保存，凝胶成像，记录结果。
5、EST-SSR引物开发和筛选
利用MIcroSAtellite identification tool(MISA，http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)软件从拼接好的丝瓜Unigene中扫描SSR位点，筛选标准为2个碱基至少重复六次，3个碱基至少重复五次，4，5，6个碱基至少重复四次才被识别为SSR位点。共获得SSR位点12,932个，利用Primer premier6.0(PREMIER Biosoft International，Palo Alto，CA)对这些候选位点进行引物设计，成功设计了8,523对引物。合成其中的641个引物，利用有棱丝瓜材料S1174，普通丝瓜材料93075及二者杂交的F1杂种检测引物的多态性。
6、数据分析
使用NTSYS-pc2.l0e软件进行基于UPGMA法的聚类分析，使用POPGENE软件计算各引物的等位基因数(Na)、基因多样性(h)和Shannon值(I)。
7、核心EST-SSR引物组的确定
选其中641对标记进行合成，并在有棱丝瓜品种S1174和普通丝瓜品种93075及二者杂交的F1中进行筛选验证，结果表明，494对标记有扩增产物，201对标记在在两亲本间表现多态性，其中共显性的标记有126对。根据我们构建的遗传连锁图谱，从126对共显性的引物对中，筛选出50对扩增稳定、均匀分布各连锁群的引物作为核心EST-SSR引物组，见表2。
表2丝瓜50对核心EST-SSR引物组
8、丝瓜EST-SSR核心引物组的有效性检验
利用50对核心EST-SSR引物组对从国内外收集的46份丝瓜种质资源材料(见表1)进行多样性分析。聚类分析结果见图1，结果表明：36份有棱丝瓜聚为一类，10份普通丝瓜聚为一类。其中，36份有棱丝瓜有按照来源地进行聚类的趋势，双青、灌村丝瓜、中清丝瓜、S1174、S095、S155、113005、万宝丝瓜、满绿丝瓜、S177、中绿丝瓜、鹤山大肉丝瓜、113012、113024、113025被聚为一大类，这些材料均来自中国广东省；另一大类中除了雅岗丝瓜和秀田沙皮来自中国广东省外，其余的I-01、BridgeGourd、M18、V-1052、V-1052、BlackHank、Abacus、Huaykeaw、Luffa833、I-23、RidgeGourd均来自东南亚国家马来西亚和泰国；其他组中除了Grand Prize和Wister Chaichan来自马来西亚和泰国外，其余材料113003、113008、连州香丝瓜、梅州大肉丝瓜、华冠丝瓜S087、113073均来自中国广东。10份普通丝瓜中来自泰国的MinQty、LEELA和未知来源的材料A1206与其他7份材料距离较远，其他7份材料中除S15来自泰国外，其他材料均来自中国。有棱丝瓜和普通丝瓜种间遗传差异很大，而种内遗传差异很小。已有一些研究报道表明，有棱丝瓜和普通丝瓜种内遗传变异狭窄，但是利用本发明中的50对核心EST-SSR引物组能够将46份资源材料作很好的区分，这说明本发明所述的核心引物组可用于丝瓜品种鉴定、丝瓜品种遗传系谱分析和丝瓜种质资源遗传多样性分析。
<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所
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<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
aaggaggagg aagagttcgc 20
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<400> 56
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<213> 人工序列
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aaattcgcca taagtggtcg 20
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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ctctccctgt ttccttctcc 20
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 68
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<400> 99
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 100
atggaagcac ccattttgag 20
Claims (10)
1.基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组，其特征在于：所述引物组包括50对引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1～100所示。
2.根据权利要求1所述的基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组在丝瓜种质资源遗传多样性分析中的应用。
3.根据权利要求1所述的基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组在丝瓜品种遗传系谱中的应用。
4.根据权利要求1所述的基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组在丝瓜品种鉴定中的应用。
5.利用权利要求1所述基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组进行丝瓜种质资源遗传多样性分析、丝瓜品种遗传系谱或丝瓜品种鉴定的方法，包括如下步骤：
（1）提取待测丝瓜样品基因组DNA；
（2）以步骤（1）提取的待测样品DNA为模板，利用序列表SEQ ID NO.1～100所示引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
（3）将步骤（2）的PCR扩增产物采用凝胶电泳检测，统计检测结果；
（4）利用步骤（3）的统计结果进行丝瓜种质资源遗传多样性分析、丝瓜品种遗传系谱或丝瓜品种鉴定。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述丝瓜种质资源遗传多样性分析或丝瓜品种遗传系谱分析方法为：使用NTSYS-pc 2.l0e软件进行基于UPGMA法的聚类分析；使用POPGENE软件计算各引物的等位基因数(Na)、 基因多样性（h）和Shannon值(I)。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述丝瓜品种鉴定方法为：统计每个品种在引物中的扩增情况，构建DNA指纹图谱，一一比较各引物位点差异，差异引物数≥2，判定两个品种为不同品种；差异引物数=1，判定两个品种为近似品种；差异引物数=0，判定两个品种为相同品种。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（3）采用6%变性聚丙烯酞胺凝胶电泳检测，银染显色。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，20 μL PCR扩增反应体系包括：2 μL 10×buffer；0.5 μL Taq酶（2U · μL-1）；0.4 μL dNTP（10mmol · L-1）；上、下游引物各0.1 μL（50 pmoL ·μL-1）；1 μL模板DNA（50 ng · μL-1）；15.9μL ddH2O。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序为Touch-down PCR：94℃预变性3min；94℃ 30S，65℃（－1℃/cycle） 1min，72℃ 1min，15个循环；94℃ 30S，50℃ 1min，72℃ 1min，25个循环；72℃终延伸10min。
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