CN104004813A - 一种香菇生物活性肽的制备 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种香菇生物活性肽的制备方法，具体步骤如下：1)香菇足粉中加入6～12倍质量的蒸馏水溶解；2)超声波破碎处理，每kg香菇足粉加入10～20万国际单位纤维素酶，调pH至4.0～5.0，温度40～50℃，水解60～120min；3)冷却至室温，氢氧化钠调pH9.5～10.5，5～15℃冷水浴提取20～40min，离心取上清液，减压浓缩，加无水乙醇至浓度为83％～85％。4℃下静置60～90min。离心，收集沉淀，烘干得香菇蛋白；4)将香菇蛋白溶于40～60倍质量的蒸馏水中，调pH至6.0～7.0，加入0.2％～0.4％复合蛋白酶水解，温度45～55℃，水解150～200min。灭酶，离心，收集滤液；5)用0.22μm的滤膜微滤，超滤，收集相对分子质量在5～10KD的肽段，真空冷冻干燥，得棕色香菇生物活性肽冻干粉末。本发明制得的香菇生物活性肽具有较好的体外抗氧化活性和醒酒活性。

Description

一种香菇生物活性肽的制备

技术领域

本发明涉及一种香菇生物活性肽的制备方法，属于现代食品加工生物技术领域。

背景技术

香菇属担子菌纲(Basidaiomycetes)、伞菌目(Agaricales)、口蘑科(Tricholomataceae)、香菇属(Lent inus)，学名Lentinus edodes，是我国久负盛名的珍贵食用菌。据分析，干香菇食用部分占72％，每100g食用部分中含水13g、脂肪1.8g、碳水化合物54g、粗纤维7.8g、灰分4.9g、钙124mg、磷415mg、铁25.3mg、维生素B10.07mg、维生素B21.13mg、尼克酸18.9mg。香菇中的氨基酸十分丰富，构成人体蛋白质的20种氨基酸，香菇就有18种，其中包含8种人体必需氨基酸，其营养价值是牛肉的4倍。香菇不仅营养丰富，而且具有很高的药用价值。自古以来就被认为是延年益寿的珍品，可治疗多种疾病。元代《日用草木》记载香菇有益气、治风破血的功能；清代黄富继的《本草求真》中也有“香菇味甘性平，能益气、助食及理小便失禁”的记述。现代研究证明：香菇中香菇多糖、香菇太生、香菇腺嘌呤、香菇生物活性肽等均具有一定的生理功能，如调节人体免疫力，抗肿瘤，降血压、降血脂，促进人体新陈代谢，提高机体免疫力，预防肥胖症、结肠癌、便秘、冠心病等疾病，香菇是不可多得的保健品之一。

氨基酸彼此以酰胺键相互连接形成的化合物称作肽，对生物体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物称为生物活性肽。相对于蛋白质而言，活性肽分子小，生物活性高，少量肽就可以发挥重要作用。目前，人们从动物、植物和微生物中分离得到了多种生物活性肽，这些活性肽有多种生理功能，如降血压、调节血糖、降血脂、抑制病毒、抗癌等。近年的研究证实，消化道可以完整的吸收小肽，小肠内存在一个寡肽的吸收通道，因此生物活性肽可以直接被人体吸收。与氨基酸相比，肽的吸收效率更高且不易饱和。常见的生物活性肽有大豆肽、谷胱甘肽、白蛋白肽、鱼肉肽、玉米肽、小麦肽、各种乳源肽。《玉米肽的醒酒活性体外试验及其醒酒机理研究》(《中国粮油学报》，2008年第23卷第5期，2008/9，P54-58，隋玉杰等)中针对玉米肽对ADH的激活率及对·OH的抑制率进行的研究探讨，并对玉米肽的醒酒机理进行深入报道。研究表明，体外测定玉米肽对ADH的激活率及对·OH的抑制率，两者基本上是正相关关系。而文中并未指出醒酒肽的相对分子质量，未进行其他抗氧化活性的研究以及未深入研究玉米肽对ALDH的影响。

香菇生物活性肽，又称香菇低聚肽。是以香菇足粉为原料，酶解后获得的低相对分子质量肽产物。低聚肽吸收速度快、耗能低、易于被人体消化、吸收和利用，具有抗氧化、抗疲劳、醒酒护肝等重要的生理活性。《复合酶法水解香菇工艺的研究》(《微生物学通报》，2012年第39卷第一期，2011/9，P62-67，陈海强等)中研究了复合酶法水解香菇的工艺条件，并计算出此法所得香菇水解液的水解度。《双酶法水解香菇蛋白的工艺研究》(《食品科技》，2003年第12期，2003/8，P14-16，闫欲晓等)中研究了纤维素酶和枯草杆菌中性蛋白酶共同水解香菇蛋白的工艺，确定了两种酶的水解条件。以上研究只是简单探索了香菇生物活性肽的水解工艺，得到香味浓郁的香菇蛋白水解液。并未对香菇生物活性肽进一步分离，研究其生物活性。

目前国内现有的专利200710061492.5“香菇抽提物的生产工艺”、200810013119.7“具有抗肿瘤活性的香菇发酵纯蛋白、提取方法及其制剂”、200810183845.3“从香菇足粉中综合提取多种生物活性成分的方法”、2009101937.7“一种香菇生物活性肽粉的制备方法”、201110230360.7“一种多肽菌菇精的制备方法”、201110314779.0“从香菇中提取具有抗氧化降血糖作用的活性蛋白的方法”等，大部分是将香菇粉用蛋白酶酶解的方法制备成香菇抽提物、调味剂或是含有香菇生物活性肽的饮品。制备具有生物活性的香菇蛋白，而很少将香菇生物活性肽提纯，并研究某一相对分子质量肽段的生物活性。中国专利申请201110155206.8“香菇生物活性肽的制备方法和用途”，公开了一种香菇生物活性肽的制备方法，包括前处理、酶解、脱色、超滤、干燥得到香菇生物活性肽。所制得香菇生物活性肽粉纯度为50％以上，具有抗疲劳作用。本发明采用超声波辅助纤维素酶解方法，首先提取香菇蛋白，并首次公开利用Protamex蛋白酶(诺维信公司购买)酶解香菇蛋白制取香菇生物活性肽的最佳工艺，通过对比不同相对分子质量肽段的抗氧化活性及不同浓度香菇生物活性肽的体外醒酒活性，挑选出活性最高肽段，制备出一种具有抗氧化活性及醒酒活性的香菇生物活性肽。

发明内容

本发明的目的在于针对之前发明的不足，提供一种以香菇足粉为原料，制备具有醒酒、抗氧化功能香菇生物活性肽的方法。本发明的香菇生物活性肽具有纯度高、相对分子质量已知、吸收利用率高等特点。

本发明制备方法的技术方案包括：超声波破碎技术辅助纤维素酶提取香菇内容物，乙醇沉淀香菇蛋白，用Protamex蛋白酶酶解制备香菇生物活性肽，纯化香菇生物活性肽，检测不同相对分子质量香菇生物活性肽的醒酒、抗氧化活性。最终制备高纯度、高活性，具有醒酒、抗氧化功能的香菇生物活性肽。

具体说，本发明研究一种香菇生物活性肽的制备方法，步骤如下：

1)溶解：称取一定量香菇足粉，加入6～12倍质量的蒸馏水溶解，并充分搅拌；

2)破壁：将香菇水溶液超声波破碎处理15～25min，按照每kg香菇足粉加入10～20万国际单位纤维素酶，调pH至4.0～5.0，加热温度至40～50℃，水解60～120min；

3)制取香菇蛋白：冷却至室温，加入氢氧化钠将pH调至9.5～10.5，在5～15℃冷水浴中提取20～40min，离心，取上清液，减压浓缩，加入无水乙醇至浓度为83％～85％沉淀，冰水浴。在4℃条件下静置60～90min。离心弃去上清液，收集沉淀，40～50℃烘干，得香菇蛋白；

4)酶解：将香菇蛋白溶于40～60倍蒸馏水中，调pH至6.0～7.0，加入0.2％～0.4％Protamex蛋白酶水解，温度保持在45～55℃，水解150～200min。灭酶后降至室温。离心，收集滤液；

5)获取香菇生物活性肽：用孔径大小为0.22tm的滤膜微滤，得浅黄色澄清液体，用不同滤膜超滤，收集相对分子质量在5～10KD的肽段，真空冷冻干燥，得棕色香菇生物活性肽冻干粉末。

其中，香菇足粉的水解度随着料液比的增加而增加，综合考虑水解程度及浓缩的方便，在一个特别优选的方案中，料液比为1∶6～1∶10(m/m)，首选，料液比为1∶8～1∶10(m/m)。

超声波在食品加工中的应用越来越广泛，在液体中它可以产生空化作用，由空化作用产生的冲击波和射流又可破坏细胞和细胞膜结构，从而增加细胞内容物通过细胞膜的穿透力和传输能力。可提高香菇蛋白质提取率。香菇细胞壁结构比较坚实，细胞内容物不易流出，通过超声方法可以增加内容物的流出，同时使用纤维素酶水解细胞壁组成物质，可以最大程度获得香菇蛋白，最终获得香菇醒酒活性肽。

在一个特别优选的实施方案中，将香菇水溶液超声处理15～20min，在处理后的溶液中按照每kg香菇足粉加入10～20万国际单位纤维素酶，调pH至4.5～5.0，加热温度至45～50℃，水解60～120min。

香菇蛋白可溶解于碱液中，碱液提取之后，还需将其沉淀出来。蛋白质的沉淀方法有酸沉淀法、硫酸铵沉淀法、乙醇沉淀法和丙酮沉淀法，其中乙醇沉淀法的安全性较好且成本较低，随着乙醇浓度的增大，沉淀的蛋白越多，但是多糖也被沉淀下来。当乙醇浓度大于80％后，蛋白沉淀量要大于多糖沉淀量，因此可选择83％～85％作为蛋白的沉淀浓度。

对于一些具有热敏性的原料，想要将其浓缩使溶液体积减小，一般采用减压浓缩的方法，减压浓缩的温度根据浓缩过程中溶液的沸腾情况而定，减压浓缩的时间根据所需要的溶液体积而定。

在一个特别优选的实施方案中，将水解液冷却至室温，加入氢氧化钠将pH调至9.5～10.0，在8～15℃冷水浴中提取20～40min，离心，取上清液；减压浓缩，减压浓缩的温度和时间无特定要求，要根据实验过程中液体的沸腾情况以及所需的液体量而定；加入无水乙醇至浓度为83％～85％沉淀，冰水浴。在4℃条件下静置60～90min。离心弃去上清液，收集沉淀，45～50℃烘干，得香菇蛋白。

本发明中对于制备香菇蛋白的烘干时间无特殊要求，香菇蛋白中含水量尽量少即可。

在一个特别优选的实施方案中，将香菇蛋白溶于40～60倍质量的蒸馏水中，调pH至6.5～7.0，酶量为0.3％～0.4％加入Protamex蛋白酶水解，温度保持在45～50℃，水解150～180min。灭酶，降至室温。离心，收集滤液。

用孔径大小为0.22μm的滤膜微滤，得浅黄色澄清液体，用不同孔径的滤膜超滤，收集相对分子质量在5～10KD的肽段，真空冷冻干燥，得香菇生物活性肽。

本发明中对离心步骤的转速不做要求，不过不要过高，避免温度升高影响香菇生物活性肽的生物活性。

本发明的香菇醒酒活性肽具有生物吸收快的有益效果。研究表明，人体摄入的蛋白主要是以多肽形式从肠道直接吸收。与蛋白质和氨基酸相比，小分子短肽的吸收效率更高且不易饱和，例如二肽和三肽的吸收速度高于同一组成的氨基酸。小肠粘膜上短肽载体的发现以直接证据证实了二肽和三肽能被完整吸收的观点。研究认为，动物体内对蛋白酶解产物的氨基酸吸收强度比相应游离氨基酸高70-80％。短肽载体的吸收能力可能高于各种氨基酸载体吸收能力的总和。现有技术制备的香菇生物活性肽可以将香菇蛋白水解成相对分子质量在5～10KD，有利于人体的吸收利用。

本发明的香菇生物活性肽，具有明显的抗氧化活性，显著提高ADH和ALDH激活率，可以提高酒精在体内的代谢速率，具有显著的醒酒效果。结合香菇生物活性肽醒酒活性及小分子活性肽的易被吸收利用率优势，是具有增强生物吸收和醒酒效果的新型醒酒剂。

附图说明

图1香菇生物活性肽的提取工艺图。

具体实施方式

以下结合图表和具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但不限制本发明的范围。

实施例1

溶解：称取5.0g香菇足粉置于反应器中，加入45g蒸馏水溶解并充分搅拌，得到香菇水溶液；

破壁：超声波破碎处理20min，加入500国际单位纤维素酶，调pH至4.5，加热温度至45℃，水解60min；

沉淀：冷却至室温，加入氢氧化钠将pH调至10，在10℃冷水浴中提取30min，离心，取上清液；在真空浓缩设备中减压浓缩，温度为44℃，90min；加入无水乙醇至浓度为83％沉淀，冰水浴。在4℃条件下静置60min。离心弃去上清液，收集沉淀，40℃烘干，得香菇蛋白：

酶解：将香菇蛋白溶于50倍蒸馏水中，单位为g。调pH至6.5，加入0.01g Protamex蛋白酶，温度保持在50℃，水解180min。95℃灭酶，降至室温；离心，收集滤液；

获取香菇生物活性肽：用孔径大小为0.22μm的滤膜微滤，得浅黄色澄清液体，用5KD和10KD滤膜超滤，收集相对分子质量在5～10KD的肽段，真空冷冻干燥，得香菇生物活性肽。

实施例2

溶解：称取10.0kg香菇足粉置于反应器中，加入100kg蒸馏水溶解并充分搅拌，得到香菇水溶液；

破壁：超声波破碎处理20min，加入200万国际单位纤维素酶，调pH至5.0，加热温度至50℃，水解90min；

沉淀：冷却至室温，加入氢氧化钠将pH调至10左右，在8℃冷水浴中提取40min，离心，取上清液；在真空浓缩设备中减压浓缩，温度为45℃，120min；加入无水乙醇至浓度为85％沉淀，冰水浴。在4℃条件下静置90min。离心弃去上清液，收集沉淀，45℃烘干，得香菇蛋白；

酶解：将香菇蛋白溶于60倍蒸馏水中，单位为g。调pH至6.5左右，加入40g Protamex蛋白酶，温度保持在55℃，水解200min。95℃灭酶15min，降至室温；离心，收集滤液；

获取香菇生物活性肽：用孔径大小为0.22μm的滤膜微滤，得浅黄色澄清液体，采用中空纤维超滤膜对滤液超滤，选用合适孔径大小的滤膜，收集相对分子质量在5～10KD的肽段，真空冷冻干燥，得香菇生物活性肽。

实施例3

通过查阅文献得出木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、Protamex蛋白酶、胰蛋白酶水解蛋白质的最佳实验条件，用以上四种酶分别水解等量的香菇足粉、伞粉、全粉，用甲醛滴定法检测每一种水解物的水解度，结果如表1所示。

表1四种酶对香菇伞粉、全粉、足粉水解度比较

注：Protamex蛋白酶从诺维信公司购买。

从表1中可以看出，本发明拟以香菇足粉为实验原料，从实验结果可以看出，以香菇为底物、不同酶水解度的排序为：碱性蛋白酶＞Protamex蛋白酶＞胰蛋白酶＞木瓜蛋白酶，根据体外抗氧化实验的结果确定最终选取酶的种类。

实施例4

用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、Protamex蛋白酶、胰蛋白酶水解香菇足粉、伞粉、全粉的水解产物为底物，分别检测其DPPH·清除率，从中得到不同酶解产物清除DPPH·效果，从中选取效果最好的部位作为实验材料继续探究香菇生物活性肽的抗氧化能力。结果如表2所示。

表2四种酶处理香菇伞粉、全粉、足粉酶解产物的DPPH·清除率比较

从表2中可以看出，由于不同酶的作用机理不同，其酶解产物清除DPPH·的能力亦不相同，酶、底物与产物清除DPPH·的能力三者之间没有明显的规律。对比底物为香菇足粉的酶解物的清除DPPH·的能力，易得Protamex蛋白酶＞碱性蛋白酶＞胰蛋白酶＞木瓜蛋白酶。综合实施例3实验结果，虽然Protamex蛋白酶水解香菇足粉的程度小于碱性蛋白酶，但Protamex蛋白酶酶解物的体外抗氧化活性好于碱性蛋白酶，因而最终采用Protamex蛋白酶。本发明公开了利用Protamex蛋白酶处理香菇足粉的最佳工艺，为生产香菇生物活性肽提供基础。

实施例5

通过超滤手段，将Protamex蛋白酶水解香菇足蛋白的水解产物分为＜3KD，3～5KD，5～10KD，10～30KD四段，用清除DPPH·法，羟基自由基法探究不同相对分子质量肽段的抗氧化活性。采用Valle&Hoch法、Blair&Bodley法分别研究不同浓度香菇生物活性肽对ADH、ALDH激活率的影响情况。

表3不同相对分子质量肽段抗氧化体外活性研究

表4不同浓度香菇生物活性肽ADH、ALDH激活率

通过表3可以得出，不同相对分子质量肽段的体外抗氧化活性有很大差别，相对分子质量为5～10KD的肽段DPPH·清除率、·OH清除率均很高，具有很好的体外抗氧化活性，相对分子质量为3～5KD的肽段活性次之，相对分子质量小的肽段活性高，但并不是随着相对分子质量减小活性升高，经试验证明，只有在5～10KD的肽段活性最高。由于＞30KD的肽段与DPPH试剂反应出现浑浊现象，因此其值为负。

通过表4可以看出，香菇生物活性肽为30mg/mL时，其对ADH激活率最高，随着浓度增加，激活率下降。对于ALDH的激活率实验，随着香菇生物活性肽的浓度越大，其对ALDH的激活率逐渐升高，浓度为180mg/mL时激活率最高。通过实验可以验证香菇生物活性肽确有体外醒酒活性。

Claims (8)

1.一种香菇生物活性肽制备的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

①溶解：称取一定量香菇足粉，加入6～12倍质量的蒸馏水溶解，并充分搅拌；

②破壁：将香菇水溶液超声波破碎处理15～25min，按照每kg香菇足粉加入10～20万国际单位纤维素酶，调pH至4.0～5.0，加热温度至40～50℃，水解60～120min；

③制取香菇蛋白：冷却至室温，加入氢氧化钠将pH调至9.5～10.5，在5～15℃冷水浴中提20～40min，离心，取上清液，减压浓缩，加入无水乙醇至浓度为83％～85％，沉淀，冰水浴，在4℃条件下静置60～90min，离心弃去上清液，收集沉淀，40～50℃烘干，得香菇蛋白；

④酶解：将香菇蛋白溶于40～60倍质量的蒸馏水中，调pH至6.0～7.0，加入0.2％～0.4％Protamex蛋白酶水解，温度保持在45～55℃，水解150～200min，灭酶后降至室温，离心，收集滤液；

⑤获取香菇生物活性肽：用孔径大小为0.22μm的滤膜微滤，得浅黄色澄清液体，用不同滤膜超滤，收集相对分子质量在5～10KD的肽段，真空冷冻干燥，得棕色香菇生物活性肽冻干粉末。

2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：步骤①在一个特别优选的方案中，料液比为1∶6～1∶10(m/m)。

3.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：步骤①在一个特别优选的方案中，料液比为1∶8～1∶10(m/m)。

4.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：步骤②采用超声波破碎辅助纤维素酶水解香菇水溶液，超声波破碎处理15～20min，按照每kg香菇足粉加入10～20万国际单位纤维素酶，调pH至4.5～5.0，加热温度至45～50℃，水解60～120min。

5.根据权利要求1的制备方法，其特征在于：步骤④中将香菇蛋白水溶液调pH至6.5～7.0，加入0.3％～0.4％Protamex蛋白酶水解，温度保持在45～50℃，水解150～180min。

6.一种香菇蛋白的制备方法，其特征在于：按照权利要求1所述步骤③制备香菇蛋白。

7.一种按照权利要求1所述的方法制取的香菇生物活性肽，其特征在于：该香菇生物活性肽具备体外抗氧化和醒酒活性。

8.一种按照权利要求1所述制备方法制作的香菇生物活性肽，其特征在于：此香菇生物活性肽可应用于抗氧化、醒酒功能食品或营养保健制品。