CN104004690A - 一种硝化细菌及其培养方法 - Google Patents

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CN104004690A CN201410263301.3A CN201410263301A CN104004690A CN 104004690 A CN104004690 A CN 104004690A CN 201410263301 A CN201410263301 A CN 201410263301A CN 104004690 A CN104004690 A CN 104004690A
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nitrobacteria
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culturing
basic medium
nitrosomonas europaea
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梁运祥
吴定心
周闯
赵述淼
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Huazhong Agricultural University
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Abstract

本发明涉及一种硝化细菌及其培养方法。硝化细菌分类命名为欧洲亚硝化单胞菌AT7（NitrosomonaseuropaeaAT7）。硝化细菌培养方法包括下述步骤：A、准备硝化细菌基础培养基；B、配制含有悬浮填料的硝化细菌培养基；C、接种硝化细菌；D、培养，最后得到经培养的硝化细菌。本发明的优点是：与现有技术相比培养时间缩短了30%～58%；培养物菌浓度高达1×109个/mL以上，菌浓度提高10倍以上；实现间歇曝气培养，降低培养成本。另外，由于使用悬浮吸附物，在静水中使用时，能较长时间停留在上层水体中，效果会较游离菌或其他密度较大吸附材料更好。

Description

一种硝化细菌及其培养方法
技术领域
本发明涉及一种硝化细菌及其培养方法，特别涉及一种能提高硝化细菌生长速度，增加菌浓度，节约生产成本的培养基及培养条件，为一种硝化细菌的快速、高效培养方法。
背景技术
目前，水体氨氮污染的问题越来越受重视，水产养殖、富营养化湖泊治理、高氨氮工业废水处理等许多应用领域都迫切需要进行氨氮的去除。
水体氨氮的去除存在物化法和生物法两大类。物化法如氨氮吹脱法，该法需要使用大量强碱，且最终氨氮被排入空气中，不仅处理成本较高、存在二次污染，且仅能针对高浓度氨氮废水，而生物法，特别是利用硝化细菌除氨的方法由于其对氨氮较好的适应性、处理成本低、无二次污染等特点而应用范围更广、更受关注。
硝化细菌是一类在好氧条件下专一性将氨氮转化为硝态氮的化能自养微生物，其可细分为氨氧化细菌和亚硝酸氧化细菌两个生理类群。由于硝化细菌为化能自养菌，其具有以氨氮为唯一能源物质、严格好氧、生长速度慢、平均代时长的生理特性，导致其工业化生产周期长、曝气能耗大、生产成本高，严重限制其在水体氨氮污染治理方面的推广应用。
发明内容
本发明的目的在于，针对上述硝化细菌培养过程中存在的问题，提供一种硝化细菌及其培养方法，提出了能加快硝化细菌生长速度、缩短生产周期、降低能耗和生产成本的硝化细菌培养基及培养条件，为一种硝化细菌的快速、高效培养方法。
本发明的一种硝化细菌技术方案是：一种硝化细菌，分类命名为欧洲亚硝化单胞菌 AT7 （Nitrosomonas europaea AT7），保藏日期为： 2014年5月14日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏中心保藏编号为：CCTCC NO: M 2014202；所述欧洲亚硝化单胞菌AT7形态及16Sr RNA 基因特征包括：菌体扫描电镜呈椭圆形, 长0.8～1.2um,宽0.4～0.6um；所述欧洲亚硝化单胞菌 AT7 的16S rRNA 基因序列包含与Seq NO：1 序列相似性大于98%的序列。
所述的硝化细菌，该硝化细菌pH适应范围为pH=6.5～8.5；对氨氮耐受范围为0.1～800mg/L。
一种本发明的硝化细菌培养方法，所述硝化细菌分类命名为欧洲亚硝化单胞菌 AT7 （Nitrosomonas europaea AT7），该硝化细菌培养方法包括下述步骤：
A、准备硝化细菌基础培养基；
B、配制含有悬浮填料的硝化细菌培养基：
1）在硝化细菌基础培养基中添加能悬浮的固体吸附物，用于促进硝化细菌的附着、悬浮生长；
2）在硝化细菌基础培养基中添加混合金属盐促进剂，用于促进硝化细菌生长；
C、接种硝化细菌：将硝化细菌以v/v 计，按5%～20%接种到B步骤配制的硝化细菌培养基中；
D、培养：对C步骤接种的硝化细菌进行培养，在培养过程中添加碳酸钠溶液调节pH 7.5～8.0，控温28～35℃，并连续曝气或间歇曝气，当培养基中氨氮消耗完后，最后得到经培养的硝化细菌。
所述的硝化细菌培养方法，其基础培养基中添加的固体吸附物的量是基础培养基重量的0.1%～2%；固体吸附物粒径小于74μm，密度为0.98～1.02cm3/g。
所述的硝化细菌培养方法，其固体吸附物选自秸秆粉、木屑粉、玉米芯粉、聚己内酯，为其中的一种或两种或两种以上的混合物；所述秸秆粉为水稻的秸秆、和/或小麦的秸秆、和/或玉米的秸秆制成的粉状物。
所述硝化细菌培养方法，其基础培养基中添加的混合金属盐促进剂的量为0.5～10mL/L。
所述硝化细菌培养方法，其混合金属盐促进剂的主要组分及浓度以w/v计为：
浓度为0.1%～1%的有MnCl2·4H2O； Na2B4O7·10H2O；ZnSO4·7H2O；EDTA-Fe；
浓度为0.01%～0.1%的有CuSO4·5H2O；VOSO4·5H2O；CoSO4·7H2O ；NiSO4·6H2O；Na2MoO4·2H2O。
所述硝化细菌培养方法，其硝化细菌基础培养基主要组分和重量为： 0.5～2 g/L (NH4)2 SO4；  0.3 g/L NaCl；  0.03 g/L FeSO4·7H20；  0.03 g/L MgSO4·7H20；  0.265g/L NaH2PO4 2H20;   6.55g/L Na2HPO4 12H20。
所述硝化细菌培养方法，所述间接曝气为每曝气2～4h，静止1～2h。
本发明的显著效果主要有：
1）本发明方法使用悬浮有机吸附物以及混合金属盐促进剂使硝化细菌生长速度更快，能将硝化细菌的批次培养时间由10～12天缩短至5～7天，缩短30～58%；
 2）本发明方法可以使硝化细菌的菌浓度提高，批次培养后菌浓度高达109个/mL，较现有培养方法得到的菌液浓度提高了10倍以上；
3）本发明方法可以明显降低生产成本。一方面培养时间缩短，一方面由于添加悬浮有机固体吸附物，可以实现间歇曝气培养，使生产成本较之前长时间、持续通气培养方法明显减少；
4）由于使用悬浮吸附物，在静水中使用时，能较长时间停留在上层水体中，效果会较游离菌或其他密度较大吸附材料更好。
     附图说明
图1为欧洲亚硝化单胞菌 AT7 （Nitrosomonas europaea AT7）扫描电镜照片黑白图。
图2为图1的灰度图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明如下：
实施例1：是本发明一种硝化细菌的实施例，所述硝化细菌，其分类命名为欧洲亚硝化单胞菌 AT7 （Nitrosomonas europaea AT7），保藏日期为： 2014年5月14日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏中心保藏编号为：CCTCC NO: M 2014202；所述欧洲亚硝化单胞菌AT7形态及16Sr RNA 基因特征包括：菌体扫描电镜呈椭圆形, 长0.8～1.2um,宽0.4～0.6um；所述欧洲亚硝化单胞菌 AT7 的16S rRNA 基因序列包含与Seq NO：1 序列相似性大于98%的序列。该硝化细菌pH适应范围为pH=6.5～8.5；对氨氮耐受范围为0.1～800mg/L，其对低浓度氨氮有良好去除效果，所述低浓度氨氮一般为0.1～1mg/L。
实施例2：是本发明一种硝化细菌培养方法的基本实施例：所述硝化细菌，其分类命名为欧洲亚硝化单胞菌 AT7 （Nitrosomonas europaea AT7），该硝化细菌培养方法包括下述步骤：
A、准备硝化细菌基础培养基；
B、配制含有悬浮填料的硝化细菌培养基：
1）在硝化细菌基础培养基中添加能悬浮的固体吸附物，用于促进硝化细菌的附着、悬浮生长；
2）在硝化细菌基础培养基中添加混合金属盐促进剂，用于促进硝化细菌生长；
C、接种硝化细菌：将硝化细菌以v/v 计，按5%～20%接种到B步骤配制的硝化细菌培养基中；
D、培养：对C步骤接种的硝化细菌进行培养，在培养过程中添加碳酸钠溶液调节pH 7.5～8.0，控温28～35℃，并连续曝气或间歇曝气，培养时间为5～7天，当培养基中氨氮消耗完后，最后得到经培养的硝化细菌。
培养时间比现有技术培养方法缩短了30%～58%；经培养后的硝化细菌浓度高达1×109个/mL以上，较现有技术培养方法提高10倍以上。
本硝化细菌培养方法是高密度培养方法，所述悬浮填料优选为超微悬浮填料，一般为数十到一百范围纳米级悬浮填料。
实施例3：是在实施例2基础上硝化细菌培养方法的进一步优化的实施例：培养基中添加的固体吸附物的量是基础培养基重量的0.1%～2%；固体吸附物粒径小于74μm，密度为0.98～1.02cm3/g，与水相当，在水中静置12h而不完全沉降，通气或震荡即可迅速完全悬浮。所述固体吸附物选自秸秆粉、木屑粉、玉米芯粉、聚己内酯，为其中的一种或两种或两种以上的混合物；所述秸秆粉为水稻的秸秆、和/或小麦的秸秆、和/或玉米的秸秆制成的粉状物。基础培养基中添加的混合金属盐促进剂的量为0.5～10mL/L。混合金属盐促进剂的主要组分及浓度以w/v计为：
浓度为0.1%～1%的有MnCl2·4H2O； Na2B4O7·10H2O；ZnSO4·7H2O；EDTA-Fe；
浓度为0.01%～0.1%的有CuSO4·5H2O；VOSO4·5H2O；CoSO4·7H2O ；NiSO4·6H2O； Na2MoO4·2H2O。
所述硝化细菌基础培养基主要组分和重量为： 0.5～2.0 g/L (NH4)2 SO4；  0.3 g/L NaCl；  0.03 g/L FeSO4·7H20；  0.03 g/L MgSO4·7H20；  0.265g/L NaH2PO4 2H20;   6.55g/L Na2HPO4 12H20。
当采用间接曝气时，则每曝气2～4h，静止1～2h。
硝化细菌的批次培养时间的确定：以NH4-N和NO2-N的定性检测方法为准，从培养开始，每天定性检测NH4-N和NO2-N，至NH4-N定性检测显示NH4-N完全消耗完，NO2-N显示有高浓度积累时结束，期间为批次培养时间。
硝化细菌的菌浓度以Real-time PCR的方法进行测定，通过绝对定量PCR方法计算amoA基因拷贝数浓度N0 (copies/mL)，实际菌浓度为N1=N0/2.5 (个/mL)。
实施例4：为硝化细菌培养方法的优化的实施例。与实施例3不同的是：在B步骤中，配制硝化细菌培养基是：1）在硝化细菌基础培养基中添加能悬浮的固体吸附物的量是基础培养基重量的0.1%；固体吸附物粒径为74μm的水稻秸秆粉和玉米芯粉,并按质量比例为1:1混合；2）基础培养基中添加的混合金属盐促进剂的量为2mL/L；混合金属盐配方如下：0.1% MnCl2·4H2O；0.1% Na2B4O7·10H2O；0.1% ZnSO4·7H2O；0.05% CuSO4·5H2O；0.01% VOSO4·5H2O；0.01% CoSO4·7H2O；0.1% NiSO4·6H2O；1% EDTA-Fe；0.05% Na2MoO4·2H2O。按体积比10%接种硝化细菌种子液（种子液菌浓度为1×108个/mL），pH=7.5，培养温度28℃，间歇曝气为每曝气2h，静止1h，曝气阶段保证DO>4mg/L，NH4-N完全消耗完需要6天，与现有技术比，培养时间缩短45%，菌浓度为2.1×109个/mL，菌浓度较原始培养浓度1.4×108个/mL提高了15倍。
实施例5 ：为硝化细菌培养方法的优化的实施例。与实施例3不同的是：在B步骤中，配制硝化细菌培养基是：1）在硝化细菌基础培养基中添加超微能悬浮的固体吸附物的量是基础培养基重量的0.1%；固体吸附物粒径为37μm的小麦秸秆粉和木屑粉,并按质量比例为1:1混合；2）基础培养基中添加的混合金属盐促进剂的量为0.5mL/L；混合金属盐配方如下：1% MnCl2·4H2O； 1% Na2B4O7·10H2O； 1% ZnSO4·7H2O；0.05% CuSO4·5H2O；；0.01% VOSO4·5H2O；0.01% CoSO4·7H2O；0.1% NiSO4·6H2O；1% EDTA-Fe；0.1% Na2MoO4·2H2O；按体积比10%接种硝化细菌种子液（种子液菌浓度为1×108个/mL），pH=7.8，培养温度30℃，间歇曝气为每曝气4h，静止1h，曝气阶段保证DO>4mg/L，NH4-N完全消耗完需要5天，与现有技术比，培养时间缩短54%，菌浓度为2.8×109个/mL，菌浓度提高20倍。
实施例6 ：为硝化细菌培养方法的优化的实施例。与实施例3不同的是：在B步骤中，配制硝化细菌培养基是：1）在硝化细菌基础培养基中添加超微能悬浮的固体吸附物的量是基础培养基重量的1%；固体吸附物粒径为15μm的木屑粉和聚己内酯粉,并按质量比例为1:1混合；2）基础培养基中添加的混合金属盐促进剂的量为10mL/L；混合金属盐配方如下：0.1% MnCl2·4H2O；0.1% Na2B4O7·10H2O；0.1% ZnSO4·7H2O；0.1% CuSO4·5H2O；；0.1% VOSO4·5H2O；0.1% CoSO4·7H2O；0.1% NiSO4·6H2O；1% EDTA-Fe；0.05% Na2MoO4·2H2O。按体积比10%接种硝化细菌种子液（种子液菌浓度为1×108个/mL），pH=8，培养温度35℃，间歇曝气为每曝气3h，静止1h，曝气阶段保证DO>4mg/L，NH4-N完全消耗完需要7天，与现有技术比，培养时间缩短36%，菌浓度为3.5×109个/mL，菌浓度提高25倍。
本发明图1为欧洲亚硝化单胞菌 AT7 （Nitrosomonas europaea AT7）扫描电镜照片黑白图，图2为灰度图。
附录如下：
Seq NO:1
DNA
Nitrosomonas europaea AT7
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 上述实施例中，硝化细菌的批次培养时间的确定，以NH4-N和NO2-N的定性检测方法为准，从培养开始，每天定性检测NH4-N和NO2-N，至NH4-N定性检测显示NH4-N完全消耗完，NO2-N显示有高浓度积累时结束，期间为批次培养时间。
实施例中硝化细菌的菌浓度以Real-time PCR的方法进行测定，通过绝对定量PCR方法计算amoA基因拷贝数浓度N0 (copies/mL)，实际菌浓度为N1=N0/2.5 (个/mL)。
实施例中硝化细菌原始培养基及培养条件如下：0.5 g/L (NH4)2 SO4；0.3 g/L NaCl；0.03 g/L FeSO4·7H20；0.03 g/L MgSO4·7H20；0.265g/L NaH2PO4 2H20； 6.55g/L Na2HPO4 12H20。按体积比10%接种硝化细菌种子液（种子液菌浓度为1×108个/mL），pH=7.5～8.0，培养温度30℃，连续曝气培养DO > 4mg/L，NH4-N完全消耗完需要11天，菌浓度为1.4×108个/mL。
本发明的权利要求保护范围不限于上述实施例。

Claims (9)

1.一种硝化细菌，其特征在于，分类命名为欧洲亚硝化单胞菌 AT7 （Nitrosomonas europaea AT7），保藏日期为： 2014年5月14日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏中心保藏编号为：CCTCC NO: M 2014202；所述欧洲亚硝化单胞菌AT7形态及16Sr RNA 基因特征包括：菌体扫描电镜呈椭圆形, 长0.8～1.2um,宽0.4～0.6um；所述欧洲亚硝化单胞菌 AT7 的16S rRNA 基因序列包含与Seq NO：1 序列相似性大于98%的序列。
2.根据权利要求1所述的硝化细菌，其特征在于，该硝化细菌pH适应范围为pH=6.5～8.5；对氨氮耐受范围为0.1～800mg/L。
3.一种权利要求1所述的硝化细菌培养方法，其特征在于：硝化细菌分类命名为欧洲亚硝化单胞菌 AT7 （Nitrosomonas europaea AT7），硝化细菌培养方法包括下述步骤：
A、准备硝化细菌基础培养基；
B、配制含有悬浮填料的硝化细菌培养基：
1）在硝化细菌基础培养基中添加能悬浮的固体吸附物，用于促进硝化细菌的附着、悬浮生长；
2）在硝化细菌基础培养基中添加混合金属盐促进剂，用于促进硝化细菌生长；
C、接种硝化细菌：将硝化细菌以v/v 计，按5%～20%接种到B步骤配制的硝化细菌培养基中；
D、培养：对C步骤接种的硝化细菌进行培养，在培养过程中添加碳酸钠溶液调节pH 7.5～8.0，控温28～35℃，并连续曝气或间歇曝气，当培养基中氨氮消耗完后，最后得到经培养的硝化细菌。
4.根据权利要求3所述的硝化细菌培养方法，其特征在于，基础培养基中添加的固体吸附物的量是基础培养基重量的0.1%～2%；固体吸附物粒径小于74μm，密度为0.98～1.02cm3/g。
5.根据权利要求3所述的硝化细菌培养方法，其特征在于，所述固体吸附物选自秸秆粉、木屑粉、玉米芯粉、聚己内酯，为其中的一种或两种或两种以上的混合物；所述秸秆粉为水稻的秸秆、和/或小麦的秸秆、和/或玉米的秸秆制成的粉状物。
6.根据权利要求3所述硝化细菌培养方法，其特征在于，基础培养基中添加的混合金属盐促进剂的量为0.5～10mL/L。
7.根据权利要求3所述硝化细菌培养方法，其特征在于，混合金属盐促进剂的主要组分及浓度以w/v计为：
浓度为0.1%～1%的有MnCl2·4H2O； Na2B4O7·10H2O；ZnSO4·7H2O；EDTA-Fe；
浓度为0.01%～0.1%的有CuSO4·5H2O；VOSO4·5H2O；CoSO4·7H2O ；NiSO4·6H2O；Na2MoO4·2H2O。
8.根据权利要求3所述硝化细菌培养方法，其特征在于，所述硝化细菌基础培养基主要组分和重量为： 0.5～2 g/L (NH4)2 SO4；  0.3 g/L NaCl；  0.03 g/L FeSO4·7H20；  0.03 g/L MgSO4·7H20；  0.265g/L NaH2PO4 2H20;   6.55g/L Na2HPO4 12H20。
9.根据权利要求3所述硝化细菌培养方法，其特征在于，所述间接曝气为每曝气2～4h，静止1～2h。
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