CN104000824B - 苯并五元杂环类化合物在制备抗hiv-1病毒药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了苯并五元杂环类化合物在制备抗HIV-1病毒药物中的应用，该化合物的通式为或

Description

苯并五元杂环类化合物在制备抗HIV-1病毒药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种化合物的新应用，特别涉及苯并五元杂环类化合物在制备抗HIV-1病毒药物中的应用。

背景技术

HIV-1病毒最初发现于1981年在美国发现，由一系列不明原因的，以细胞免疫缺陷为特征的综合征出现以后，研究人员开始了对其致病源的寻找。1983年法国研究小组从一淋巴肿大综合征病人的***中，分离出HIV-1病毒。它是一种感染人类免疫***细胞的慢病毒，该病毒破坏人体的免疫力，导致免疫***失去抵抗力，而导致各种疾病以及癌症得以在人体内生存，从而导致获得性免疫缺陷综合症——艾滋病。目前，由于对艾滋病教育的普及不充分，全球的HIV感染仍呈上升趋势，尤其在中国更是进入了快速增长期。尽快阻止艾滋病在我国的流行已成了一件刻不容缓的大事。因此，继续扩大我们对HIV-1致病机制的认识，开发出更有效，更经济，更少副作用的抗病毒药物以完全清除残余的HIV-1复制，以及开发出强有力而又长效的抗HIV-1的疫苗以保护易感人群，仍将是我们能否最终战胜艾滋病的关键。

具有如下通式的苯并五元杂环类化合物：

或

式Ⅰ中：

R₁为H、C1～C4的烷烃基，或含连接有苯环的磺基，位于苯环的1或2号位；R₂为H、C1～C4的烷烃基，或带有五元环的碳酰胺基；R₁、R₂不同时为H、C1～C4；

X为S或O；

式Ⅱ中：

式Ⅱ中：

为单键或者双键；

X₁为N、S或O；X₂为S或O；

R₁为带有五元环的碳酰胺基或连接有苯环的磺基，位于苯环的1或2号位；R₂为H、甲基、乙基，当为双键时，R₂为O；当X₁为N时，R₃为H或连接有苯环的3°胺基，如（3-（{[（2-氯-6-氟苯基）甲基]（甲基）氨基}甲基）-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-2-酮，6-(6-methoxy-3,4-dihydroquinolin-1(2H)-ylsulfonyl)benzo[d]oxazol-2(3H)-one）、（5-溴-2-乙氧基-N-（2-甲基-1,3-苯并恶唑-5-基）苯-1-磺酰胺，5-bromo-2-ethoxy-N-(2-methylbenzo[d]oxazol-5-yl)benzenesulfonamide）、（N-（1,3-苯并噻唑-2-基）-1-（呋喃-2-基甲基）-5-氧代吡咯烷-3-甲酰胺，2-((5-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)thio)-N-(furan-2-ylmethyl)propanamide）、（6-（6-甲氧基-1,2,3,4-四氢喹啉-1-磺酰基）-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-2-酮，3-(((2-chloro-6-fluorobenzyl)(methyl)amino)methyl)benzo[d]oxazol-2(3H)-one）或（2-{[5-（2氢-1，1,3-苯并二氧戊环-5-基）-1,3,4-恶二唑-2-基]硫基}-N-（呋喃-2-基甲基）丙酰胺，N-(benzo[d]thiazol-2-yl)-1-(furan-2-ylmethyl)-5-oxopyrrolidine-3-carboxamide）可购自Enamine公司或在其基础上进行人工合成，目前没有报道该类化合物用于抗病毒实验或其他类似的功效。

发明内容

本发明的目的在于提供苯并五元杂环类化合物在制备抗HIV-1病毒药物中应用。

本发明所使用的苯并五元杂环类化合物具有如下通式：

或

式Ⅰ中：

R₁为H、C1～C4的烷烃基，或含连接有苯环的磺基，位于苯环的1或2号位；R₂为H、C1～C4的烷烃基，或带有五元环的碳酰胺基；R₁、R₂不同时为H、C1～C4；

X为S或O；

式Ⅱ中：

为单键或者双键；

X₁为N、S或O；X₂为S或O；

优选的，上述苯并五元杂环类化合物的R₁为带有五元环的碳酰胺基或连接有苯环的磺基，位于苯环的1或2号位；R₂为H、甲基、乙基，当为双键时，R₂为O；当X₁为N时，R₃为H或连接有苯环的3°胺基。

优选的，上述苯并五元杂环类化合物的式Ⅰ或式Ⅱ中，连接有苯环的磺基为：

或，式中，R为甲基或乙基；

式Ⅲ中的位于苯环的4或5号位；Y为卤素，位于苯环的1～3号位；

式Ⅳ中，位于苯环的1～3号位

优选的，上述苯并五元杂环类化合物的式Ⅰ或式Ⅱ中，连接有苯环的磺基为：

或。

优选的，上述苯并五元杂环类化合物的带有五元环的碳酰胺基为：

或，；

式中，n为1～3的整数，R为C1～C3的烷基，X₃为N、S或O。

优选的，上述苯并五元杂环类化合物的X₃为O，n=1。

优选的，上述苯并五元杂环类化合物的R₃为，式中，Y₁、Y₂为卤素，R₁’～独R₃’立为C1～C3的链烃基。

优选的，上述苯并五元杂环类化合物选自、、、或。

发明人利用Vif-APOBEC3G的相互作用，证实上述通式的苯并五元杂环类化合物，特别是证实本发明苯并五元杂环类化合物能够抑制Vif蛋白降解A3G的活性，导致筛选***中绿色荧光蛋白的表达量将回升。通过在人的原代CD4+T淋巴细胞以及H9、SupT1等CD4+T淋巴细胞系中进行野生型HIV-1病毒的感染实验证实，本发明苯并五元杂环类化合物具有较好的抗病毒作用，为进一步的抗病毒药物研发提供的强有力的理论基础和实践基础，具有重要的研发价值和开发意义。

附图说明

图1:细胞筛选模型的构建原理；

图2：本发明苯并五元杂环类化合物具有抑制Vif活性的作用；

图3：本发明苯并五元杂环类化合物在表达A3G蛋白的H9细胞和不表达A3G蛋白的SupT1细胞中抑制野生型HIV-1的复制效果。

具体实施方式

Vif是HIV的必需蛋白之一，其主要功能是拮抗宿主中天然的抗病毒因子APOBEC3G。APOBEC3G是HIV-1病毒的一大威胁，它存在于HIV-1天然的宿主细胞（如CD4+T细胞和巨噬细胞）中，能被包裹入HIV-1病毒颗粒，在HIV-1逆转录过程中发挥其极强的抗病毒作用。为此，HIV-1自身编码了Vif蛋白来特异性对抗APOBEC3G的抗病毒活性，它可将APOBEC3G导入泛素***并将其降解（图1A）。因此，如何灭活Vif，是研发抗HIV-1病毒药物的一个十分重要的靶标。

根据Vif拮抗APOBEC3G的分子机理，筛选出若干可让HIV的Vif无法降解APOBEC3G的小分子药物。为此我们将建立一种简便的活细胞筛选***，如图1B所示，将表达APOBEC3G-GFP融合蛋白和表达Vif的质粒共转染到细胞中。以APOBEC3G-GFP融合蛋白是否被降解为指标。只要某种化合物在Vif存在的情况下还能使APOBEC3G-GFP融合蛋白不被降解（即GFP荧光还在），该化合物就是Vif的抑制剂。通过对Vif靶标的进一步鉴定，确认化合物是作用于宿主细胞还是作用在病毒蛋白的Vif上。

为了更好地理解本发明的实质，下面结合实验和结果来说明本发明苯并五元杂环类化合物在制备抗HIV-1病毒药物中应用。

以下实验中，方便起见，化合物1～5分别指代：

2-{[5-（2氢-1，1,3-苯并二氧戊环-5-基）-1,3,4-恶二唑-2-基]硫基}-N-（呋喃-2-基甲基）丙酰胺（化合物1）、

6-（6-甲氧基-1,2,3,4-四氢喹啉-1-磺酰基）-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-2-酮（化合物2）、

5-溴-2-乙氧基-N-（2-甲基-1,3-苯并恶唑-5-基）苯-1-磺酰胺（化合物3）、

3-（{[（2-氯-6-氟苯基）甲基]（甲基）氨基}甲基）-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-2-酮（化合物4）、

N-（1,3-苯并噻唑-2-基）-1-（呋喃-2-基甲基）-5-氧代吡咯烷-3-甲酰胺（化合物5）。

实验一

1)取生长良好的人肾上细胞株239t细胞，接种于96孔透明平底板中，每孔5×10⁴细胞。使用的培养基是完全培养基：高糖DMEM，10%胎牛血清以及1%双抗，培养条件是5%二氧化碳、37℃；

2)24h贴壁后，共转染PEGFP-A3G和pcDNA3.1-Vif两种质粒。转染采用脂质体包裹转染，试剂使用lipo2000，转染液20μl；

3)转染4h后，加入待筛选的化合物，每孔2μl，终浓度为50μM；

4)培养48h后，检测绿色荧光蛋白GFP的表达情况。如果出现绿色荧光蛋白GFP表达上升的情形，该化合物可能成为抗病毒候选药物。

实验结果如图2所示，从实验结果可以看出，本发明苯并五元杂环类化合物均具有抑制Vif活性的作用。

实验二

Vif蛋白在HIV-1病毒复制过程中具有重要作用，vif缺陷的HIV病毒不能在CD4+T细胞、巨噬细胞内复制，即不能在上述“非允许”细胞内复制；而含有vif基因的野生株病毒可在上述细胞内复制。Vif缺失株病毒进入某些靶细胞后可进行反转录，但不能合成前病毒DNA。研究显示HIV复制处决于一种细胞抑制因子的出现或缺失，这种内源性的抑制因子是APOBEC3G，它属于细胞内RNA编辑酶，能使mRNA中的胞嘧啶脱氨基形成尿嘧啶，导致G和A突变体的累积，进而是病毒DNA降解，vif通过与APOBEC3G结合形成复合物阻断APOBEC3G的抑制活性。在APOBEC3G存在的细胞系如H9细胞中，APOBEC3G与vif蛋白结合通过泛素化***降解，如果化合物能够抑制APOBEC3G被vif蛋白降解，宿主细胞将不能够被HIV-1感染；而在APOBEC3G不存在的情细胞系如SupT1细胞中，HIV-1蛋白可以正常感染该宿主细胞；那么这个化合物将有可能成为抗HIV-1Vif蛋白的化合物。

APOBEC3G是细胞的自我保护机制，但vif是HIV-1病毒对抗APOBEC3G功能的蛋白，导致HIV-1病毒逃避细胞内自我清除过程。利用HIV-1的允许细胞和不允许细胞中的抗病毒实验的效果比较，从而能进一步在野生型病毒实验中确定靶标化合物可以拮抗HIV-1的Vif蛋白，抑制HIV-1病毒的复制。

1)取生长良好的淋巴细胞系H9和Supt1，细胞用量为2×10^5/孔，分别感染包装好的HIV-1病毒上清，病毒用量为10ng/1×10⁶细胞；（感染时使用促感染试剂polybrene）；

2)感染3h后换液，使用PBS清洗三次，弃上清，使用1640培养基（10%胎牛血清，1%双抗）培养，培养基每孔200μl，化合物每孔2μl（终浓度50μM）；

3)使用2%TritonX-100处理收样的上清，收培养了4day的细胞上清，测P24Elisa。

实验结果如图3所示。从实验结果可以看出，本发明苯并五元杂环类化合物在H9细胞中具有良好的抗HIV-1病毒作用，而在SupT1细胞中没有效果。

实验三

1)取生长良好的淋巴细胞系H9，细胞用量为2×10⁵/孔，感染包装好的HIV-1病毒上清，病毒用量为10ng/1×10⁶细胞；（感染时使用促感染试剂polybrene）；

2)感染3h后换液，使用PBS清洗三次，弃上清，使用1640培养基（10%胎牛血清，1%双抗）培养，培养基每孔200μl，加入化合物每孔2μl，终浓度分别为50μM，5μM，0.5μM，0.05μM，0.005μM，0.0005μM，0μM；

3)使用2%TritonX-100处理收样的上清，收样4day，测P24Elisa。

实验结果如下表所示，本发明苯并五元杂环类化合物的IC₅₀值如下表所示：

化合物编号	IC50 (μM)
		1	1.51
2	0.89
		3	3.41
4	1.85
		5	0.99

从实验结果可知，本发明的苯并五元杂环类化合物具有较好的抑制病毒的效果。

实验四

MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfopheny)-2H-tetrazolium,innersalt)是一种新合成的四唑类化合物，它与MTT的应用原理相同，即被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成各自有色的甲瓒产物，其颜色深浅与某些敏感细胞株的活细胞数在一定范围内呈高度相关。根据测得的490n的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强，则表示药物毒性越小。

1)接种细胞，用含10％胎小牛血清的DMEM培养液将293t配成单个细胞悬液，以每孔1000个细胞接种到96孔板，每孔体积200μl；

2)24h贴壁后加入化合物，每孔2μl，终浓度分别为50μM，5μM，0.5μM，0.05μM，0.005μM，0.0005μM，0μM；

3)培养48h后，每孔加MTS溶液20μl，继续在培养箱中孵育2～4h；

4)选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，观察化合物对293t细胞的细胞毒性。

实验结果如下表所示，本发明苯并五元杂环类化合物的CC₅₀值如下表所示：

化合物编号	CC50 (μM)8 -->
		1	>50
2	>50
		3	>50
4	>50
		5	>50

从实验结果可以看出，本发明苯并五元杂环类化合物毒性较低，在293t细胞中均呈现成无细胞毒现象。

Claims (4)

1.苯并五元杂环类化合物在制备抗HIV-1病毒药物中的应用，所述苯并五元杂环类化合物具有如下通式：

式Ⅰ中：

R₁为连接有苯环的磺基，位于苯环的1或2号位；R₂为H、C1～C4的烷烃基，或带有五元环的碳酰胺基；

X为S或O；

连接有苯环的磺基为：

或，式中，R为甲基或乙基；

式Ⅲ中的位于苯环的4或5号位；Y为卤素，位于苯环的1～3号位；

式Ⅳ中，位于苯环的1～3号位；

带有五元环的碳酰胺基为式（6）中，n为1～3的整数，X₃为N、S或O。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：式Ⅰ中，连接有苯环的磺基为：

或。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：X₃为O，n=1。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：苯并五元杂环类化合物为或。