CN103998935B - Hsp90组合疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于选择癌症涉及路径或癌症涉及路径的组分的抑制剂以与HSP90抑制剂一起向罹患癌症的个体共投予的方法，所述方法包含以下步骤：(a)在使得来自个体的含有癌细胞的样品中存在的一种或一种以上癌症路径组分结合于HSP90抑制剂或HSP90抑制剂的类似物、同源物或衍生物的条件下使所述样品与所述HSP90抑制剂或所述HSP90抑制剂的所述类似物、同源物或衍生物接触；(b)检测结合于所述HSP90抑制剂或所述HSP90抑制剂的类似物、同源物或衍生物的路径组分；(c)分析步骤(b)中所检测的路径组分以便鉴别如下路径，所述路径包括步骤(b)中所检测的组分和所述路径的其它组分；和(d)选择步骤(c)中所鉴别的路径或路径组分的抑制剂。本发明进一步涉及一种通过共投予HSP90抑制剂和癌症涉及路径或其组分的抑制剂来治疗癌症患者的方法。

Description

HSP90组合疗法
本文所描述的本发明至少部分是通过得到国家癌症研究所的健康与人类服务部(National Cancer Institute,Department of Health and Human Services)的授权书第ROI CA155226号的支持而进行的；并且美国政府(U.S.Government)对任何所述本发明具有权利。
在整个本申请案中，鉴别了许多公开文献，包括已颁布和正在申请中的专利申请案、公开案等。这些文献是以全文引用的方式并入本申请案中以帮助定义如所属领域的技术人员已知的当前工艺水平。
技术领域
无
背景技术
极大的需要了解维持癌细胞的恶性表型的分子畸变。所述了解将能够更有选择性地靶向促肿瘤分子并且帮助开发更有效和毒性更小的抗癌治疗。大部分癌症由多种分子损伤引起，并且很可能所产生的冗余限制了信号传导分子的特异性抑制剂的活性。虽然对活性路径的组合抑制就会有较好的临床结果，但对致癌路径的全面鉴别目前力所不及。
基因组技术(包括大规模基因组测序)的应用已使得在各种癌症中鉴别出许多基因突变，从而突出了这种疾病的复杂性(莱伊(Ley)等人,2008；帕森斯(Parsons)等人,2008)。然而，尽管这些基因分析适用于提供关于肿瘤基因构成的信息，但其本质上缺乏阐明因基因缺陷而异常活化的信号传导网络的功能复杂性的能力。因此以患者和疾病阶段特异性方式鉴定肿瘤固有的分子损伤的互补蛋白质组学方法的开发必须跟进。
大部分蛋白质组策略限于测量特定肿瘤中的蛋白质表达，允许鉴别与病理学病况相关的新蛋白质，但无法提供关于这些发现的功能意义的信息(哈纳斯(Hanash)和塔古奇(Taguchi),2010)。一些功能信息可使用针对特定蛋白质的抗体或翻译后修饰并且通过使用针对某些酶的活性位点的小分子进行基于活性的蛋白质谱分析来获得(库驰(Kolch)和皮特(Pitt),2010；野村(Nomura)等人,2010；布雷默(Brehme)等人,2009；阿什曼(Ashman)和维拉尔(Villar),2009)。尽管这些方法已证明适用于查询特定路径或翻译后修饰，但其同样不适于捕获关于恶性病况的更全面信息(哈纳斯和塔古奇,2010)。此外，当前蛋白质组学方法成本高又费时。举例来说，蛋白质组分析经常需要对样品进行昂贵的SILAC标记或二维凝胶分离。
因此，需要开发捕获关于恶性病况的重要信息的更简单、更成本有效的蛋白质组学方法。因为认识到分子伴侣蛋白(chaperone protein)热休克蛋白(heat shockprotein)(Hsp90)维持许多致癌蛋白(oncoprotein)呈假稳定状态(祖侯克(Zuehlke)和约翰逊(Johnson),2010；沃克曼(Workman)等人,2007)，所以Hsp90可能是开发新蛋白质组学方法中的重要蛋白质。
在这一假设的支持下，认识到热休克蛋白(Hsp90)(一种起使许多蛋白质适当地折叠成其活性构象作用的伴侣蛋白)在维持转化表型中起重要作用(祖侯克和约翰逊,2010；沃克曼等人,2007)。Hsp90和其相关共伴侣(co-chaperone)帮助细胞蛋白质(统称为“客户蛋白(client protein)”)的正确构象折叠，其中许多是控制细胞生长、分化、DNA损伤反应和细胞存活的信号转导路径的效应物。肿瘤细胞对失调蛋白质的成瘾(即通过突变、异常表达、不当细胞移位等)可因此变得决定性地取决于Hsp90(沃克曼等人,2007)。虽然Hsp90是在大部分细胞类型和组织中表达，但卡莫尔(Kamal)等人的研究工作证明正常Hsp90和癌细胞Hsp90之间的重要区别(卡莫尔等人,2003)。具体来说，其显示肿瘤的特征为对于某些Hsp90抑制剂具有高亲和力的多伴侣复合的Hsp90，而正常组织具有对于这些抑制剂具有低亲和力的潜在、未复合的Hsp90。
Hsp90的许多客户蛋白还在数种病理(包括癌症)的疾病发作和进展中起主要作用。(怀特赛(Whitesell)和林德奎斯特(Lindquist),自然评论：癌症(Nat Rev Cancer)2005,5,761；沃克曼等人,纽约科学研究会年报(Ann NY Acad Sci)2007,1113,202；罗(Luo)等人,分子神经退化(Mol Neurodegener)2010,5,24。)因此，还显著关注Hsp90抑制剂在癌症治疗中的应用。(塔尔多内(Taldone)等人,药理学见解(Opin Pharmacol)2008,8,370；加宁(Janin),最新药物发现(Drug Discov Today)2010,15,342。)
基于上文所阐述的一堆证据，我们假设可鉴别与Hsp90相关的关键致癌蛋白的蛋白质组学方法可提供对个别肿瘤的生物学的全面了解并且可广泛应用于开发新的癌症疗法。因此，本发明提供用于鉴别与Hsp90相关的致癌蛋白的工具和方法。此外，本发明提供用于鉴别用于癌症患者的治疗方案的方法。
发明内容
本发明涉及如下发现：能够靶向肿瘤富集的Hsp90复合物的小分子(例如Hsp90抑制剂)可用于亲和力捕获Hsp90依赖性致癌客户蛋白。后续鉴别结合生物信息分析能够产生转化特异性损伤的详细分子图谱。这一图谱可指导对于特定患者最佳有效的组合疗法的开发。所述分子图谱具有某些优于更常见基因标志方法的优点，因为大部分抗癌剂是靶向蛋白质而非基因的小分子，并且许多靶向特定分子变化的小分子目前正在药物开发阶段。
因此，本发明涉及基于Hsp90抑制剂的化学生物学/蛋白质组学方法，其结合生物信息分析来发现致癌蛋白和路径。我们表明所述方法可提供恶性细胞中的Hsp90依赖性蛋白质组的肿瘤逐一全面概述，所述蛋白质组包含许多关键信号传导网络并且认为是代表相当大部分功能恶性蛋白质组。
本发明提供可亲和力捕获Hsp90依赖性致癌客户蛋白的小分子探针。另外，本发明提供利用分子探针亲和力捕获Hsp90依赖性致癌客户蛋白的能力来设计蛋白质组学方法的方法，所述蛋白质组学方法在结合生物信息路径分析时鉴别不同类型癌症中的失调信号传导网络和关键致癌蛋白。
一方面，本发明提供衍生自基于嘌呤和嘌呤样(例如PU-H71、MPC-3100、德拜(Debio)0932)、异噁唑(例如NVP-AUY922)和吲唑-4-酮(例如SNX-2112)化学种类的Hsp90抑制剂的小分子探针(参见图3)。在一个实施例中，Hsp90抑制剂是PU-H71，8-(6-碘-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基硫基)-9-(3-异丙基氨基-丙基)-9H-嘌呤-6-基胺(参见图3)。PU-H71分子可通过拴系物(tether)或连接子连接于固体载体(例如珠粒)。选择连接位点和拴系长度以确保分子维持对于Hsp90的高亲和力。在一个特定实施例中，基于PU-H71的分子探针具有图30中所示的结构。连接于固体载体的Hsp90抑制剂的其它实施例展示于图32-35和38中。所属领域的技术人员应了解，与看家Hsp90复合物相比，分子维持对于致癌Hsp90复合物物质的更高亲和力。两种Hsp90物质如莫里克(Moulick)等人,自然：化学生物学(Naturechemical biology)(2011)中所定义。当结合于Hsp90时，Hsp90抑制剂捕获呈客户蛋白结合构象的Hsp90。
另一方面，本发明提供鉴别与Hsp90相关的特定致癌蛋白的方法，所述致癌蛋白与癌症的发展和进展有关。所述方法涉及使来自罹患癌症的个体的含有癌细胞的样品与Hsp90抑制剂接触，并且检测结合于所述Hsp90抑制剂的致癌蛋白。在特定实施例中，Hsp90抑制剂连接于固体载体，例如珠粒。在这些实施例中，可将结合于固体载体的Hsp90蛋白所具有的致癌蛋白洗脱于缓冲液中并提交标准SDS-PAGE，并且可通过传统手段分离和分析所洗脱的蛋白质。在所述方法的一些实施例中，致癌蛋白的检测包含使用质谱法。有利的是，本发明的方法不需要对样品进行昂贵的SILAC标记或二维分离。
在本发明的某些实施例中，路径组分的分析包含使用生物信息计算机程序，例如用来定义所述组分网络的组分。
本发明的方法可用于确定与各种类型的癌症相关的致癌蛋白，包括(但不限于)乳癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、子***、结肠癌、绒膜癌、膀胱癌、子***、基底细胞癌、绒膜癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈部癌、急性淋巴细胞癌(acute lymphocytic cancer，ACL)、骨髓性白血病(包括急性骨髓性白血病(acutemyeloid leukemia，AML)和慢性骨髓性白血病(chronic myeloid leukemia，CML))、多发性骨髓瘤、T细胞白血病淋巴瘤、肝癌、淋巴瘤(包括霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、淋巴细胞性淋巴瘤、神经母细胞瘤、滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤)、口腔癌、卵巢癌、胰脏癌、***癌、直肠癌、肉瘤、皮肤癌(例如黑色素瘤)、睾丸癌、甲状腺癌、肾癌、脊髓增生性病症、胃肠癌(包括胃肠基质肿瘤)、食道癌、胃癌、胆囊癌、***癌、脑肿瘤(包括神经胶质瘤)、淋巴瘤(包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤)。另外，本发明提供用于鉴别与特定癌症相关的失调信号传导网络的蛋白质组学方法。另外，所述方法可用于鉴别新的致癌蛋白和机制。
另一方面，本发明的方法可用于提供用于设计癌症患者的个人化疗法的合理基础。个人化癌症治疗方法是基于如下前提：个别癌症患者将具有造成疾病发展和进展的不同因素。举例来说，如通过目前可用的方法所确定，不同的致癌蛋白和/或癌症涉及路径可造成疾病的发作和后续进展，即使当考虑具有相同癌症类型和处于相同进展阶段的患者时。此外，致癌蛋白和癌症涉及路径经常在个别癌症患者中随疾病进展而改变。因此，癌症治疗方案在理论上应达到以个体为基础治疗患者的目标。通过使用所述个体化方法所确定的治疗方案将允许抗肿瘤活性增强并且毒性更小和化疗或放射更少。
因此，一方面，本发明提供以个体为基础鉴别癌症患者的治疗方案的方法。所述方法涉及使来自罹患癌症的个体的含有癌细胞的样品与Hsp90抑制剂接触，检测结合于所述Hsp90抑制剂的致癌蛋白，并选择靶向至少一种结合于Hsp90抑制剂的致癌蛋白的癌症疗法。在某些方面，可根据结合于Hsp90的致癌蛋白的鉴别来选择药物组合。本发明的方法可用于鉴别各种不同癌症的治疗方案，包括(但不限于)乳癌、肺癌、脑癌、子***、结肠癌、绒膜癌、膀胱癌、子***、绒膜癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈部癌、急性淋巴细胞癌(ACL)、骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、T细胞白血病淋巴瘤、肝癌、淋巴瘤(包括霍奇金氏病和淋巴细胞性淋巴瘤、神经母细胞瘤)、口腔癌、卵巢癌、胰脏癌、***癌、直肠癌、肉瘤、皮肤癌、睾丸癌、甲状腺癌和肾癌。
另一方面，方法涉及使来自罹患癌症的个体的含有癌细胞的样品与Hsp90抑制剂接触，检测结合于所述Hsp90抑制剂的致癌蛋白，确定与这些致癌蛋白相关的蛋白质网络并选择靶向来自结合于Hsp90抑制剂的致癌蛋白网络的至少一种分子的癌症疗法。
在某些方面，可根据结合于Hsp90的致癌蛋白的鉴别来选择药物组合。在其它方面，可根据与结合于Hsp90的致癌蛋白相关的网络的鉴别来选择药物组合。本发明的方法可用于鉴别各种不同癌症的治疗方案，包括(但不限于)乳癌、肺癌、脑癌、子***、结肠癌、绒膜癌、膀胱癌、子***、绒膜癌、结肠癌、子宫内膜癌食道癌、胃癌、头颈部癌、急性淋巴细胞癌(ACL)、骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、T细胞白血病淋巴瘤、肝癌、淋巴瘤(包括霍奇金氏病和淋巴细胞性淋巴瘤神经母细胞瘤)、口腔癌、卵巢癌、胰脏癌、***癌、直肠癌、肉瘤、皮肤癌、睾丸癌、甲状腺癌和肾癌。
在本发明的一个实施例中，在使用上述方法鉴别癌症患者的个人化治疗方案后，向所述患者投予所选的药物或药物组合。在服用所选药物或药物组合的足够量的时间后，可从患者取得另一样品并且可再次进行本发明的分析以确定患者的致癌概况(oncogenicprofile)是否改变。必要时，可改变药物剂量或可鉴别新的治疗方案。因此，本发明提供监测癌症患者随时间进展和根据需要改变治疗方案的方法。
另一方面，本发明的方法可用于提供用于设计围绕Hsp90抑制剂所构建的癌症患者的个人化组合性疗法的合理基础。所述治疗方案可允许抗肿瘤活性增强并且毒性更小和化疗更少。靶向Hsp90和互补肿瘤驱动路径可提供较好的抗肿瘤策略，因为数条数据线表明完全抑制致癌靶可能是治疗活性的关键，同时限制肿瘤适应和逐渐形成抗药性的能力。
因此，本发明提供一种用于选择癌症涉及路径或癌症涉及路径的组分的抑制剂以与HSP90抑制剂一起向罹患癌症的个体共投予的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)使来自所述个体的含有癌细胞的样品与以下接触：(i)当所述Hsp90结合于所述样品中存在的癌症路径组分时结合于Hsp90的Hsp90抑制剂；或(ii)当所述Hsp90结合于所述样品中的所述癌症路径组分时结合于Hsp90的所述Hsp90抑制剂的类似物、同源物或衍生物；
(b)检测结合于Hsp90的路径组分；
(c)分析步骤(b)中所检测的路径组分以便鉴别包括步骤(b)中所检测的组分和所述路径的其它组分的路径；和
(d)选择步骤(c)中所鉴别的路径或路径组分的抑制剂。
关于本发明，癌症涉及路径是与代谢、基因信息加工、环境信息加工、细胞过程或有机体***有关的路径，包括表1中所列的任何路径。
在本发明的实践中，癌症涉及路径或癌症涉及路径的组分与选自由以下组成的群组的癌症有关：结肠直肠癌、胰脏癌、甲状腺癌、白血病(包括急性骨髓性白血病和慢性骨髓性白血病)、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、***癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、乳癌、神经母细胞瘤、脊髓增生性病症、胃肠癌(包括胃肠基质肿瘤、食道癌、胃癌)、肝癌、胆囊癌、***癌、脑肿瘤(包括神经胶质瘤)、淋巴瘤(包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤)和妇科癌症(包括卵巢癌、子***和子宫内膜癌)。举例来说，癌症涉及路径的组分和/或路径可以是图1中所鉴别的任何组分。
在涉及个人化医学的一个优选实施例中，在步骤(a)中个体是与癌症涉及路径或癌症涉及路径的组分的抑制剂待投予对象相同的个体，但本发明在步骤(a)中还预期个体是癌症参照个体。
在本发明的实践中，在步骤(a)中样品包含任何肿瘤组织或任何生物流体，例如血液。
适合用于本发明中的样品包括(但不限于)受到破坏的癌细胞、经过溶解的癌细胞和经过声波处理的癌细胞。
关于本发明的实践，待向个体投予的Hsp90抑制剂可与以下相同或不同：(a)所用的Hsp90抑制剂，或(b)步骤(a)中所用的Hsp90抑制剂、Hsp90抑制剂的类似物、同源物或衍生物。
在一个实施例中，其中待向个体投予的Hsp90抑制剂是PU-H71或具有PU-H71的生物活性的PU-H71的类似物、同源物或衍生物。
在另一个实施例中，PU-H71是所用的Hsp90抑制剂，或是步骤(a)中所用的Hsp90抑制剂、其类似物、同源物或衍生物。或者，Hsp90抑制剂可以是选自由图3中所示的化合物组成的群组。
在一个实施例中，在步骤(a)中Hsp90抑制剂或Hsp90抑制剂的类似物、同源物或衍生物优选地固定于固体载体(例如珠粒)上。
在某些实施例中，在步骤(b)中路径组分的检测包含使用质谱法，并且在步骤(c)中路径组分的分析包含使用生物信息计算机程序。
在本发明的一个实例中，癌症是淋巴瘤，并且在步骤(c)中所鉴别的路径组分是Syk。在另一个实例中，癌症是慢性骨髓性白血病(CML)并且在步骤(c)中所鉴别的路径或路径组分是图15中所示的网络中的任一种所示的路径或组分，例如图15中所鉴别的以下路径组分中的一种，即mTOR、IKK、MEK、NFκB、STAT3、STAT5A、STAT5B、Raf-1、bcr-abl、Btk、CARM1或c-MYC。在一个这种实例中，在步骤(c)中所鉴别的路径组分是mTOR并且在步骤(d)中所选择的抑制剂是PP242。在另一个这种实例中，在步骤(c)中所鉴别的路径是选自以下路径的路径：PDK/mTOR-、NFκB-、MAPK-、STAT-、FAK-、MYC和TGF-β介导的信号传导路径。在本发明的另一个实例中，癌症是淋巴瘤，并且在步骤(c)中所鉴别的路径组分是Btk。在又一个实例中，癌症是胰脏癌，并且在步骤(c)中所鉴别的路径或路径组分是图16的网络1-10和图24的网络中的任一种所示的路径或路径组分。在另一个实例中，在步骤(c)中所鉴别的路径和路径组分是mTOR，并且在其一个实例中，在步骤(d)中所选择的mTOR抑制剂是PP242。本发明还提供一种治疗罹患癌症的个体的方法，所述方法包含向所述个体共投予(A)Hsp90抑制剂和(B)癌症涉及路径的组分的抑制剂，所述抑制剂在(B)中不需要但可以通过本文所描述的方法来选择。因此，本发明提供一种治疗方法，其中共投予包含同时、伴随、依序或附加投予(A)中的抑制剂和(B)中的抑制剂。治疗罹患癌症的个体的方法的一个实例包含向所述个体共投予(A)Hsp90抑制剂和(B)Btk抑制剂。治疗罹患癌症的个体的方法的另一个实例包含向所述个体共投予(A)Hsp90抑制剂和(B)Syk抑制剂。在所述方法中，癌症可以是淋巴瘤。治疗罹患慢性骨髓性白血病(CML)的个体的方法的另一个实例包含向所述个体共投予(A)Hsp90抑制剂和(B)mTOR、IKK、MEK、NFκB、STAT3、STAT5A、STAT5B、Raf-1、bcr-abl、CARM1、CAMKII或c-MYC中的任一种的抑制剂。在本发明的一个实施例中，(B)中的抑制剂是mTOR抑制剂。在上述方法的另一个实施例中，在(a)中Hsp90抑制剂或所述Hsp90抑制剂的类似物、同源物或衍生物的结合捕获呈癌症路径组分结合状态的Hsp90。此外，本发明提供一种治疗罹患胰脏癌的个体的方法，所述方法包含所述个体共投予(A)Hsp90抑制剂和(B)图16和24中所示的网络中的任一种所示的路径或路径组分的抑制剂。本发明还提供一种治疗罹患乳癌的个体的方法，所述方法包含向所述个体共投予(A)Hsp90抑制剂和(B)图22中所示的网络中的任一种所示的路径或路径组分的抑制剂。此外，本发明提供一种治疗罹患淋巴瘤的个体的方法，所述方法包含向所述个体共投予(A)Hsp90抑制剂和(B)图23中所示的网络中的任一种所示的路径或路径组分的抑制剂。在立即进行的方法中，(B)中的抑制剂可以是mTOR抑制剂，例如PP242。此外，本发明提供一种治疗罹患慢性骨髓性白血病(CML)的个体的方法，所述方法包含所述个体投予CARM1抑制剂。在另一个实施例中，本发明提供一种用于鉴别罹患癌症的个体的癌症涉及路径或癌症涉及路径的一种或一种以上组分的方法，所述方法包含：
(a)使来自所述个体的含有癌细胞的样品与以下接触：(i)当所述Hsp90结合于所述样品中存在的癌症路径组分时结合于Hsp90的Hsp90抑制剂；或(ii)当所述Hsp90结合于所述样品中的所述癌症路径组分时结合于Hsp90的所述Hsp90抑制剂的类似物、同源物或衍生物；
(b)检测结合于Hsp90的路径组分，以便由此鉴别癌症涉及路径或所述一种或一种以上路径组分。在这个实施例中，癌症涉及路径或癌症涉及路径的组分可与选自由以下组成的群组的任何癌症有关：结肠直肠癌、胰脏癌、甲状腺癌、白血病(包括急性骨髓性白血病和慢性骨髓性白血病)、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、***癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、乳癌、神经母细胞瘤、脊髓增生性病症、胃肠癌(包括胃肠基质肿瘤、食道癌、胃癌)、肝癌、胆囊癌、***癌、脑肿瘤(包括神经胶质瘤)、淋巴瘤(包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤)和妇科癌症(包括卵巢癌、子***和子宫内膜癌)。此外，在步骤(a)中样品可包含肿瘤组织或生物流体，例如血液。在某些实施例中，在步骤(a)中样品可包含受到破坏的癌细胞、经过溶解的癌细胞或经过声波处理的癌细胞。然而，可使用其它形式的细胞。
在这种方法的实践中，Hsp90抑制剂可以是PU-H71或PU-H71的类似物、同源物或衍生物，尽管PU-H71是目前优选的抑制剂。然而，在本发明的实践中，Hsp90抑制剂可以是选自由图3中所示的化合物组成的群组。在一个实施例中，在步骤(a)中Hsp90抑制剂或Hsp90抑制剂的类似物、同源物或衍生物固定于固体载体(例如珠粒)上；和/或在步骤(b)中路径组分的检测包含使用质谱法；和/或在步骤(c)中路径组分的分析包含使用生物信息计算机程序。
在本发明的一个合乎需要的实施例中，在(a)中Hsp90抑制剂或所述Hsp90抑制剂的类似物、同源物或衍生物的结合捕获呈癌症路径组分结合状态的Hsp90。
本发明还提供一种用于进行所述方法的试剂盒，所述试剂盒包含固定于固体载体(例如珠粒)上的Hsp90抑制剂。通常，所述试剂盒将另外包含对照物珠粒、缓冲溶液和使用说明书。本发明还提供一种固定于固体载体上的Hsp90抑制剂，其中所述抑制剂适用于本文所描述的方法。一个实例是所述抑制剂是PU-H71。另一方面，本发明提供一种具有以下结构的化合物：
此外，本发明提供一种用于选择癌症涉及路径或癌症涉及路径的组分的抑制剂的方法，所述方法包含根据所描述的方法鉴别所述癌症涉及路径或所述路径的一种或一种以上组分，然后选择所述路径或所述组分的抑制剂。另外，本发明提供一种治疗个体的方法，所述方法包含根据所描述的方法选择抑制剂并单独向所述个体投予所述抑制剂或除投予路径组分的抑制剂以外向所述个体投予所述抑制剂。更通常，所述投予将是重复实现的。此外，描述用于鉴别路径组分或选择抑制剂的方法可对同一个体进行至少两次。在另一个实施例中，本发明提供一种用于监测用Hsp90抑制剂治疗癌症的功效的方法，所述方法包含测量作为与所述癌症有关的路径的组分的生物标记的变化。举例来说，所用的生物标记可以是通过本文所描述的方法鉴别的组分。另外，本发明提供一种用于监测用Hsp90抑制剂和与所述癌症有关且Hsp90抑制的路径的组分的第二抑制剂两者治疗癌症的功效的方法，所述方法包含监测作为所述路径的组分的生物标记的变化。举例来说，所用的生物标记可以是由第二抑制剂抑制的路径的组分。最后，本发明提供一种用于鉴别癌症疗法的新靶的方法，所述方法包含通过本文所描述的方法鉴别与所述癌症有关的路径的组分，其中由此鉴别的组分先前尚未与所述癌症有关。
附图说明
图1描绘人类中的示范性癌症涉及路径和其组分。
图2展示蛋白激酶抑制剂的数种实例。
图3展示PU-H71的结构和数种其它已知Hsp90抑制剂。
图4.PU-H71与癌细胞中较丰富的有限量的Hsp90相互作用。(a)使用H9010(一种抗Hsp90抗体)的依序免疫纯化步骤耗尽MDA-MB-468细胞提取物中的Hsp90。溶解物＝对照细胞提取物。(b)通过依序化学和免疫纯化步骤分离来自MDA-MB-468提取物的Hsp90。通过光密度测定法定量每一池中Hsp90的量并且相对于内标正规化值。(c)在所指示细胞中用131I-PU-H71进行饱和研究。计数所有分离的细胞样品并且测定131I-PU-H71的特定吸收。将这些数据相对于131I-PU-H71的浓度制图，得到饱和结合曲线。呈现四次分离重复的代表性数据(下)。通过西方印迹(Western blot)分析在所指示细胞中Hsp90的表达(上)。
图5.PU-H71对于与致癌蛋白和共伴侣复合的Hsp90具有选择性并且分离Hsp90。(a)通过与H9010(一种非特异性IgG)一起沉淀或通过PU-H71-或对照物-珠粒分离K562提取物中的Hsp90复合物。对照物珠粒含有乙醇胺，一种Hsp90惰性分子。通过西方印迹分析沉降物中的蛋白质。(b,c)在K562提取物中用H9010和PU-珠粒以所指示的频率和以所示的顺序进行如所指示的单一或依序免疫和化学沉淀。通过WB分析沉降物和残余上清液中的蛋白质。NS＝非特异性。(d)用媒剂(-)或PU-H71(+)处理K562细胞24小时，并且通过西方印迹分析蛋白质。(e)通过西方印迹分析在Hsp70基因敲除的细胞中蛋白质的表达(左)和以相对发光单位(relative luminescence unit，RLU)呈现蛋白质水平的变化(右)。对照＝杂乱siRNA。(f)在K562提取物中用GM-、SNX-和NVP-珠粒以所指示的频率和以所示的顺序进行如所指示的依序化学沉淀。通过西方印迹分析沉降物和残余上清液中的蛋白质。(g)K562细胞中的Hsp90以与异常Bcr-Abl和正常c-Abl蛋白两者的复合物形式存在。PU-H71而非H9010对于Bcr-Abl致癌蛋白结合的Hsp90群体具有选择性。
图6.PU-H71鉴别CML细胞中的异常信号体(signalosome)。(a)通过将K562提取物与PU-珠粒一起培育通过化学沉淀来分离蛋白质复合物，并且通过MS探测蛋白质的身份。在IPA中分析这些蛋白质之间的连通性，并产生蛋白质网络。通过PU-珠粒鉴别的蛋白质网络(网络1到13)与已知典型骨髓性白血病信号传导(通过IPA提供)完全重叠。所鉴别的蛋白质网络和组分蛋白质的详细名单展示于表5f和图15中。(b)突出显示PU-珠粒的路径图鉴别CML信号体，其聚焦于网络1(Raf-MAPK和PI3K-AKT路径)、2(NF-κB路径)和8(STAT5路径)。所鉴别的网络中的关键节点蛋白是以黄色描绘。(c)通过西方印迹验证MS研究结果。(左)通过化学沉淀通过将K562提取物与PU-或对照物-珠粒一起培育来分离蛋白质复合物，并且通过西方印迹分析蛋白质。在对照物-珠粒沉降物中未检测到蛋白质并且为了简单表示起见省去那些数据。(右)用媒剂(-)或PU-H71(+)处理K562细胞24小时，并且通过WB分析蛋白质。(d)在初级CML细胞提取物中用PU-和对照物-珠粒进行单一化学沉淀。通过WB分析沉降物中的蛋白质。
图7.PU-H71鉴别的蛋白质和网络是对于恶性表型重要的那些蛋白质和网络。(a)用所指示的抑制剂处理K562细胞72小时并且通过阿拉马蓝分析(Alamar Blue assay)分析细胞生长。数据以平均值±SD(n＝3)呈现。(b)在K562提取物中用PU-珠粒以所指示的频率进行如所指示的依序化学沉淀。通过WB分析沉降物和残余上清液中的蛋白质。(c)在K562细胞中评估CARM1敲除对使用台盼蓝(Tryptan blue)(左)或吖啶橙(Acridine orange)/溴化乙锭(Ethidium bromide)(右)染色的细胞存活力的影响。(d)通过WB在K562白血病和Mia-PaCa-2胰脏癌细胞中分析所选择的潜在Hsp90相互作用蛋白质的表达。(e)将分别从K562和Mia-PaCa-2细胞提取物中选择PU-珠粒上分离并随后通过MS鉴别的蛋白质列成表格。在MS分析中可见+++，极高；++，高；+，中等和-，未鉴别出肽。(f)在Mia-PaCa-2细胞提取物中用PU-和对照物-珠粒进行单一化学沉淀。通过WB分析沉降物中的蛋白质。(g)如图(a)中分析选择抑制剂对Mia-PaCa-2细胞生长的影响。
图8.Hsp90有助于增强CML中的STAT5活性。(a)用PU-H71(5μM)、格列卫(Gleevec)(0.5μM)或DMSO(媒剂)处理K562细胞所指示的时间并且通过WB分析的蛋白质。(b)如所指示的在K562细胞中用PU-和对照物-珠粒进行依序化学沉淀。通过WB分析沉降物和残余上清液中的蛋白质。(c)用胰蛋白酶处理来自用媒剂或PU-H71预处理的细胞的STAT5免疫复合物所指示的时间并且通过WB分析蛋白质。(d)在PU-H71(5μM)存在和不存在下用钒酸盐(1mM)处理K562细胞所指示的时间。通过WB分析蛋白质(上)，通过光密度测定法定量并针对处理时间绘图(下)。数据以平均值±SD(n＝3)呈现。(e)通过基于ELISA的分析在用所指示浓度的PU-H71处理24小时的K562细胞中分析STAT5a和STAT5b的DNA结合能力。(f)用STAT5或Hsp90抗体相对于IgG对照组对两种已知的STAT5靶基因(CCND2和MYC)进行定量染色质免疫沉淀分析(quantitative chromatin immunoprecipitation assay，QChIP)。使用扩增基因间区域的引物作为阴性对照组。结果表示为特定抗体(STAT5或Hsp90)相对于各自IgG对照组的输入量百分比。(g)通过QPCR在暴露于1μM PU-H71的K562细胞中测量CCND2和MYC的转录物丰度。结果表示为与基线(时间0小时)相比的变化倍数并相对于RPL13A进行正规化。使用HPRT作为阴性对照组。用实验复本生物学一式五份进行实验。数据呈现为平均值±SEM。(h)提出CML中的STAT5信号传导的机制并且Hsp90有助于增加所述信号传导。Hsp90结合于STAT5并影响所述STAT5构象并且将呈活性构象的STAT5直接维持在含有STAT5的转录复合物中。
图9.用于调查肿瘤致癌蛋白的化学蛋白质组学方法的示意图。Hsp90在癌细胞中形成生物化学上独特的复合物。大部分癌细胞Hsp90类似于正常细胞(绿色)保留“看家”伴侣功能，而癌细胞中富集或扩增的功能上独特的Hsp90池与维持肿瘤细胞存活所需的致癌蛋白(黄色)特异性相互作用。PU-H71与Hsp90特异性相互作用并优先对于致癌蛋白(黄色)/Hsp90物质而非WT蛋白(绿色)/Hsp90物质具有选择性，并且捕获呈客户结合构象的Hsp90。因此PU-H71珠粒可用于分离致癌蛋白/Hsp90物质。在初始步骤中，将癌细胞提取物与PU-H71珠粒一起培育(1)。这个初始化学沉淀步骤纯化并富集异常蛋白质群体作为PU-珠粒结合的Hsp90复合物的一部分(2)。然后以SDS缓冲液洗脱来自PU-珠粒沉降物的货物蛋白，提交标准SDS-PAGE(3)，然后提取分离的蛋白质并以胰蛋白酶处理用于LC/MS/MS分析(4)。使用Mascot搜寻引擎进行初始蛋白质鉴别，并且使用思高福德蛋白质组软件(ScaffoldProteome Software)进一步评估(5)。然后使用英吉纽提路径分析(Ingenuity PathwayAnalysis；IPA)由所鉴别的蛋白质构建生物网络(6、7)。所形成的蛋白质网络图提供用于开发对于特定肿瘤最佳有效的个人化疗法的无价模板。所述方法可(a)以肿瘤逐一方式建立分子变化图，(b)鉴别新的致癌蛋白和癌症机制，(c)鉴别与Hsp90互补的治疗性靶并开发合理的组合性靶向疗法，并且(d)鉴别用于选择可能受益于Hsp90疗法的患者和用于在临床试验期间对Hsp90抑制剂功效进行药效学监测的肿瘤特异性生物标记。
图10.(a、b)如所指示的，通过连续化学和免疫纯化步骤分离来自乳癌和CML细胞提取物的Hsp90(120μg)。分离上清液以分析剩余的Hsp90。通过西方印迹分析每一部分中的Hsp90。溶解物＝内源性蛋白质含量；PU-、GM-和对照物-珠粒指示特定珠粒上分离的蛋白质。H9010和IgG指示由特定抗体分离的蛋白质。对照物珠粒含有Hsp90惰性分子。数据与从多次重复实验(n≥2)所获得的数据一致。(c)在周边血液白细胞(peripheral bloodleukocyte，PBL)提取物(250μg)中进行依序化学和免疫纯化步骤以分离PU-H71和H9010特异性Hsp90物质。所有样品都是通过西方印迹分析(上)。通过流式细胞测量术使用Hsp90-PE抗体和PU-H71-FITC评估PBL中的Hsp90结合。FITC-TEG＝非特异性结合对照组(下)。
图11.(a)在正常细胞中，Hsp90的组成性表达是其将细胞蛋白质折叠并移位到其适当细胞区室的进化保守性看家功能所需的(“看家复合物”)。在恶性转化时，细胞蛋白质受到突变、活动过度、保留在不恰当的细胞区室中或其它手段的干扰。这些功能上发生改变的蛋白质的存在是引发和维持恶性表型所需的，并且其为由应激调节的Hsp90的亚群特异性维持的这些致癌蛋白(“致癌复合物”)。PU-H71特异性结合于Hsp90中陪伴致癌蛋白的部分(“致癌复合物”)。(b)在K562细胞提取物中使用PU-和对照物-珠粒以及H9010和IgG固定的抗体分离Hsp90和其相互作用共伴侣。对照物珠粒含有Hsp90惰性分子。(c)通过三个连续免疫纯化步骤用H9010(Hsp90特异性抗体)分离来自K562细胞提取物的Hsp90。分离残余上清液以分析剩余的蛋白质。通过西方印迹分析每一部分中的蛋白质。溶解物＝内源性蛋白质含量。数据与从多次重复实验(n≥2)所获得的数据一致。
图12.GM和PU-H71对于异常蛋白质/Hsp90物质具有选择性。(a)在实验中监测Bcr-Abl和Abl结合的Hsp90物质，其中用所指示量的K562细胞溶解物(左)探测恒定体积的PU-H71珠粒(80μL)，或其中用所指示体积的PU-H71珠粒(右)探测恒定量的溶解物(1mg)。(b)(左)PU-和GM-珠粒(80μL)识别SKMel28黑色素瘤细胞提取物(300μg)中的Hsp90-突变型B-Raf复合物，但无法与正常结肠纤维母细胞CCD18Co提取物(300μg)中可见的Hsp90-WT B-Raf复合物相互作用。H9010(Hsp90抗体)识别两种Hsp90物质。(c)在MDA-MB-468细胞提取物(300μg)中，PU-和GM-珠粒(80μl)与HER3和Raf-1激酶而不与非致癌酪氨酸-蛋白激酶CSK(一种c-Src相关酪氨酸激酶)和p38相互作用。(d)(右)PU-珠粒(80μL)与v-Src/Hsp90而非c-Src/Hsp90物质相互作用。为有助于c-Src(一种丰度低于v-Src的蛋白质)检测，与v-Src转化的3T3细胞(250μg)相比，使用较高量的表达c-Src的3T3细胞溶解物(1,000μg)，从而对3T3细胞(溶解物、3T3纤维母细胞相对于v-Src 3T3纤维母细胞)中检测到的较高Hsp90水平提供解释。溶解物＝内源性蛋白质含量；PU-、GM-和对照物-珠粒指示特定珠粒上分离的蛋白质。Hsp90抗体和IgG指示由特定抗体分离的蛋白质。对照物珠粒含有Hsp90惰性分子。数据与从多次重复实验(n≥2)所获得的数据一致。
图13.在表达Bcr-Abl的CML细胞系(a)中和在初级CML细胞提取物(b)中用PU-和对照组珠粒进行单一化学沉淀。通过西方印迹分析沉降物中的蛋白质。如所报导的在初级CML样品中注意到数种Bcr-Abl裂解产物(迪罗夫(Dierov)等人,2004)。N/A＝不可用。
图14.PU-H71对于Hsp90具有选择性。(a)对数个Hsp90抑制剂珠粒-沉降物凝胶进行库马斯(Coomassie)染色。将K562溶解物(60μg)与25μL所指示的珠粒一起培育。用所指示的缓冲液洗涤后，将沉降物中的蛋白质涂覆于SDS-PAGE凝胶上。(b)在针对359种激酶的scanMAX筛选(阿姆比特公司(Ambit))中测试PU-H71(10μM)。呈现PU-H71的TKEEspotTM相互作用图。仅SNARK(NUAK家族SNFl样激酶2)(激酶树上的红色圆点)表现为小分子的潜在低亲和力激酶命中。
图15.PU-珠粒上富集和如通过生物信息路径分析经由使用英吉纽提路径分析(IPA)软件所产生的最高计分网络。在K562慢性骨髓性白血病细胞中进行分析。(a)网络1；得分＝38；mTOR/PDK和MAPK路径。(b)网络2；得分＝36；NFκB路径。(c)网络8；得分＝14；STAT路径。(d)网络12；得分＝13；粘着斑网络。(e)网络7；得分＝22；c-MYC致癌基因驱动路径。(f)网络10；得分＝18；TGFβ路径。2或2以上的得分至少具有不由单独随机机会所产生的99％置信度。
基因表达、细胞周期和细胞组装，个别蛋白质以节点显示，用灰色表示在这项研究中所鉴别的蛋白质。通过IPA所鉴别的蛋白质仅以白色节点表示。使用不同的形状表示基因产物的功能类别。当实体是复合物的一部分时，蛋白质在网络中描绘为两个圈；当仅存在一个单元时描绘为单个圈；分别描绘为向上或向下指的三角形以描述磷酸酶或激酶；描绘为横向椭圆形以描述转录因子；和描绘为圆以描述“其它”功能。边线描述节点之间的关系性质：有箭头的边线意指蛋白质A作用于蛋白质B，而无箭头的边线表示两种蛋白质之间仅为结合。直接相互作用在网络图中显示为实线，而间接相互作用显示为虚线。在一些情况下，关系可在来源于一个分子并指回同一个分子的环形箭头或线形态下存在。所述关系称为“自我参考(self-referential)”并且由分子作用于自身的能力产生。
图16.PU-珠粒上富集和如通过生物信息路径分析经由使用英吉纽提路径分析(IPA)软件所产生的最高得分网络。在MiaPaCa2胰脏癌细胞中进行分析。
图17.在Mia-PaCa-2细胞中mTOR抑制剂PP242与Hsp90抑制剂PU-H71协同作用。用单一药剂或PP242与PU-H71的组合处理胰脏细胞(Mia-PaCa-2)72小时并通过阿拉马蓝分析测定细胞毒性。使用周-特氏方法(Chou-Talalay method)分析药物组合研究中的协同作用和/或拮抗作用的计算机模拟。(a)在中效方程式中，fa是受影响细胞的分率，例如抑制率；fu＝(1-fa)，其为未受影响细胞的分率；D是产生fa所需的剂量。(b)基于实际实验数据，计算整个范围的效应水平(Fa)的连续CI值，产生Fa-CI图。CI<1、＝1和>1分别指示协同作用、累加效应和拮抗作用。(c)经过正规化的等效线图，展示经过正规化的药物1(PU-H71)和药物2(PP242)的剂量。PU＝PU-H71，PP＝PP242。
mTOR与Hsp90抑制剂之间的协同作用的定量分析：为测定pp242(mTOR抑制剂)与PU-H71(Hsp90抑制剂)之间的药物相互作用，如先前所描述使用周-特氏组合指数(CI)等效线图方法。基于质量作用定律的中效原理，这种方法通过计算机模拟来定量两种或两种以上药物组合的协同作用或拮抗作用，而不考虑每种药物的机制。基于演算法，计算机软件显示中效图、组合指数图和经过正规化的等效线图(其中使用2种药物的非恒定比率组合)。使用PU-H71(0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.0125μM)和pp242(0.5、0.125、0.03125、0.0008、0.002、0.001μM)以所提及浓度的单一药剂形式使用或以非恒定比率(PU-H71:pp242；1:1、1:2、1:4、1:7.8、1:15.6、1:12.5)组合。使用方程式Fa＝1-Fu计算Fa(被杀死细胞的分率)；Fu是未受影响的细胞的分率并用于使用计算机软件(CompuSyn，美国新泽西州帕拉母斯(Paramus,New Jersey,USA))的剂量效应分析。
图18.Bcl-6是Bcl-6依赖性DLBCL细胞中的Hsp90的客户并且Hsp90抑制剂与Bcl-6抑制剂的组合比单独的每种抑制剂更有效。a)用所指示浓度的PU-H71处理细胞24小时并且通过西方印迹分析蛋白质。b)PU-H71珠粒指示Hsp90与核中的Bcl-6相互作用。c)在Bcl-6依赖性DLBCL细胞中Hsp90抑制剂PU-H71与Bcl-6抑制剂RI-BPI的组合比单独的每种抑制剂更有效。
图19.本发明的方法的数次重复鉴别B细胞受体网络为OCI-Ly1细胞中的主要路径以证明并验证所述方法的稳定性和准确度。
图20.验证B细胞受体网络为OCI-LY1和OCI-LY7 DLBCL细胞中的Hsp90依赖性网络。a)用Hsp90抑制剂PU-H71处理细胞并且通过西方印迹分析蛋白质。b)PU-H71珠粒指示Hsp90与OCI-LY1和OCI-LY7 DLBCL细胞中的BTK和SYK相互作用。c)在Bcl-6依赖性OCI-LY1、OCI-LY7、法拉奇(Farage)和SUDHL6 DLBCL细胞中Hsp90抑制剂PU-H71与SYK抑制剂R406的组合比单独的每种抑制剂更有效。
图21.在K562CML细胞中CAMKII抑制剂KN93和mTOR抑制剂PP242与Hsp90抑制剂PU-H71协同作用。
图22.PU-珠粒上富集和如通过生物信息路径分析经由使用英吉纽提路径分析(IPA)软件所产生的最高得分网络。在MDA-MB-468三阴性乳癌细胞中进行分析。通过所述方法鉴别的主要信号传导网络是PI3K/AKT、IGF-IR、NRF2介导的氧化应激反应、MYC、PKA和IL-6信号传导路径。(a)在MDA-MB-468乳癌细胞中通过PU-珠粒蛋白质组和生物信息方法所鉴别的网络的简化表示。(b)IL-6路径。在MDA-MB-468乳癌细胞中通过PU-珠粒方法所鉴别的关键网络组分是以灰色描绘。
图23.PU-珠粒上富集和如通过生物信息路径分析经由使用英吉纽提路径分析(IPA)软件所产生的最高得分网络。在OCI-Ly1弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞中进行分析。在弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系OCI-LY1中，通过所述方法所鉴别的主要信号传导网络是B受体、PKCteta、PI3K/AKT、CD40、CD28和ERK/MAPK信号传导路径。(a)B细胞受体路径。通过PU-珠粒方法所鉴别的关键网络组分是以灰色描绘。(b)CD40信号传导路径。通过PU-珠粒方法所鉴别的关键网络组分是以灰色描绘。(c)CD28信号传导路径。通过PU-珠粒方法所鉴别的关键网络组分是以灰色描绘。
图24.PU-珠粒上富集和如通过生物信息路径分析经由使用英吉纽提路径分析(IPA)软件所产生的最高得分网络。在Mia-PaCa-2胰脏癌细胞中进行分析。(a)PU-珠粒鉴别Mia-PaCa-2癌细胞中的异常信号体。通过PU-珠粒所鉴别的蛋白质路径是PI3K-Akt-mTOR-NFkB路径、TGF-β路径、Wnt-β-连环素路径、PKA路径、STAT3路径、JNK路径和Rac-cdc42-ras-ERK路径。(b)细胞周期-G2/M DNA损伤检查点调节。通过PU-珠粒方法所鉴别的关键网络组分是以灰色描绘。
图25.PU-H71与PARP抑制剂奥拉帕尼(olaparib)在抑制MDA-MB-468(上图)和HCC1937(下图)乳癌细胞的克隆源性存活中协同作用。
图26.Hsp90抑制剂的结构。
图27.A)Hsp90α(PDB ID：2FWZ)与PU-H71(球棒模型)和化合物5(管状模型)的相互作用。B)Hsp90α(PDB ID：2VCI)与NVP-AUY922(球棒模型)和化合物10(管状模型)的相互作用。C)Hsp90α(PDB ID：3D0B)与化合物27(球棒模型)和化合物20(管状模型)的相互作用。氢键以黄色虚线展示并且重要活性位点氨基酸残基和水分子以棒表示。
图28.A)通过沉淀用PU-、SNX-和NVP-珠粒或对照物-珠粒(80μL)分离K562提取物(250μg)中的Hsp90。对照物珠粒含有2-甲氧基乙胺，一种Hsp90惰性分子。通过西方印迹分析沉降物中的蛋白质。B)在MDA-MB-468细胞提取物(300μg)中，PU-珠粒分离与致癌客户蛋白c-Kit和IGF-IR复合的Hsp90。为评估PU-H71对Hsp90致癌客户蛋白的稳态水平的影响，用PU-H71(5μM)处理细胞24小时。C)在K562细胞提取物中，PU-珠粒(40μL)分离与Raf-1和Bcr-Abl致癌蛋白复合的Hsp90。溶解物＝内源性蛋白质含量；PU-和对照物-珠粒指示特定珠粒上分离的蛋白质。数据与从多次重复实验(n≥2)所获得的数据一致。
图29.A)通过化学沉淀用含有抗生蛋白链菌素固定的PU-H71-生物素构筑体或对照组抗生蛋白链菌素固定的D-生物素的珠粒从JNPL3小鼠(一种阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)转基因小鼠模型)的脑中分离含有Hsp90的蛋白质复合物。异常τ物质由箭头指示。从6月龄雌性JNPL3小鼠提取c1、c2和s1、s2，分别是皮质和皮质下脑匀浆物(右)。对脑溶解物蛋白质含量的西方印迹分析(左)。B)如通过PU-H71-生物素所检测的MV4-11白血病细胞中的细胞表面Hsp90。数据与从多次重复实验(n≥2)所获得的数据一致。
图30.PU-H71珠粒(6)的合成。
图31.PU-H71-生物素(7)的合成。
图32.NVP-AUY922珠粒(11)的合成。
图33.SNX-2112珠粒(21)的合成。
图34.SNX-2112的合成。
图35.嘌呤和嘌呤样Hsp90抑制剂珠粒的合成。描述嘧啶与咪唑并吡啶(即X＝N或CH)型抑制剂两者。试剂和条件：(a)Cs2CO3、1,2-二溴乙烷或1,3-二溴丙烷、DMF、室温；(b)NH2(CH2)6NHBoc、DMF、室温、24小时；(c)TFA、CH2Cl2、室温、1小时；(d)Affigel-10、DIEA、DMAP、DMF。
9-(2-溴乙基)-8-(6-(二甲基氨基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基硫基)-9H-嘌呤-6-胺(9-(2-Bromoethyl)-8-(6-(dimethylamino)benzo[d][1,3]dioxol-5-ylthio)-9H-purin-6-amine)(2a)。在室温下搅拌含1a(29mg，0.0878mmol)、Cs2CO3(42.9mg，0.1317mmol)、1,2-二溴乙烷(82.5mg，37.8μL，0.439mmol)的DMF(0.6mL)1.5小时。然后再加入Cs2CO3(14mg，0.043mmol)并再搅拌混合物20分钟。在减压下干燥混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH:AcOH，15:1:0.5)纯化残余物，得到2a(24mg，63％)。1H NMR(500MHz,CDCl3/MeOH-d4)δ8.24(s,1H),6.81(s,1H),6.68(s,1H),5.96(s,2H),4.62(t,J＝6.9Hz,2H),3.68(t,J＝6.9Hz,2H),2.70(s,6H)；MS(ESI)m/z 437.2/439.1[M+H]+。
(6-((2-(6-氨基-8-((6-(二甲基氨基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)乙基)氨基)己基)氨基甲酸叔丁酯(tert-Butyl(6-((2-(6-amino–8-((6-(dimethylamino)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)thio)-9H-purin-9-yl)ethyl)amino)hexyl)carbam ate)(3a)。在室温下搅拌含2a(0.185g，0.423mmol)和6-氨基己基氨基甲酸叔丁酯(0.915g，4.23mmol)的DMF(7mL)24小时。浓缩反应混合物并对残余物进行色谱分析[CHCl3:MeOH:MeOH-NH3(7N)，100:7:3]，得到0.206g(85％)3a；MS(ESI)m/z 573.3[M+H]+。
(4a).将3a(0.258g，0.45mmol)溶解于15mL CH2Cl2:TFA(4:1)中并在室温下搅拌溶液45分钟。在减压下去除溶剂并在高度真空下干燥残余物过夜。将这物质溶解于DMF(12mL)中并加入固相肽合成容器中的25mL Affi-Gel 10珠粒(预先洗涤，3×50mL DMF)中。加入225μL N,N-二异丙基乙胺和若干DMAP晶体并在室温下将这物质震荡2.5小时。然后加入2-甲氧基乙胺(0.085g，97μl，1.13mmol)并继续震荡30分钟。然后去除溶剂并用CH2Cl2:Et3N(9:1，4×50mL)、DMF(3×50mL)、菲特氏缓冲液(Felts buffer)(3×50mL)和i-PrOH(3×50mL)洗涤珠粒，每次10分钟。在-80℃下将珠粒4a贮存于i-PrOH(珠粒:i-PrOH(1:2)，v/v)中。
9-(3-溴丙基)-8-(6-(二甲基氨基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基硫基)-9H-嘌呤-6-胺(9-(3-Bromopropyl)-8-(6-(dimethylamino)benzo[d][1,3]dioxol-5-ylthio)-9H-purin-6-ami ne)(2b)。在室温下搅拌含1a(60mg，0.1818mmol)、Cs2CO3(88.8mg，0.2727mmol)、1,3-二溴丙烷(184mg，93μL，0.909mmol)的DMF(2mL)40分钟。在减压下干燥混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH:AcOH，15:1:0.5)纯化残余物，得到2b(60mg，73％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.26(s,1H),6.84(br s,2H),6.77(s,1H),6.50(s,1H),5.92(s,2H),4.35(t,J＝7.0Hz,2H),3.37(t,J＝6.6Hz,2H),2.68(s,6H),2.34(m,2H)；MS(ESI)m/z 451.1/453.1[M+H]+。
(6-((3-(6-氨基-8-((6-(二甲基氨基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)丙基)氨基)己基)氨基甲酸叔丁酯(tert-Butyl(6-((3-(6-amino-8-((6-(dimethylamino)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)thio)-9H-purin-9-yl)prop yl)amino)hexyl)carbamate)(3b)。在室温下搅拌含2b(0.190g，0.423mmol)和6-氨基己基氨基甲酸叔丁酯(0.915g，4.23mmol)的DMF(7mL)24小时。浓缩反应混合物并对残余物进行色谱分析[CHCl3:MeOH:MeOH-NH3(7N)，100:7:3]，得到0.218g(88％)3b；MS(ESI)m/z 587.3[M+H]+。
(4b)。将3b(0.264g，0.45mmol)溶解于15mL CH2Cl2:TFA(4:1)中并在室温下搅拌溶液45分钟。在减压下去除溶剂并在高度真空下干燥残余物过夜。将这物质溶解于DMF(12mL)中并加入固相肽合成容器中的25mL Affi-Gel 10珠粒(预先洗涤，3×50mL DMF)中。加入225μL N,N-二异丙基乙胺和若干DMAP晶体并在室温下将这物质震荡2.5小时。然后加入2-甲氧基乙胺(0.085g，97μl，1.13mmol)并继续震荡30分钟。然后去除溶剂并用CH2Cl2:Et3N(9:1，4×50mL)、DMF(3×50mL)、菲特氏缓冲液(3×50mL)和i-PrOH(3×50mL)洗涤珠粒，每次10分钟。在-80℃下将珠粒4b贮存于i-PrOH(珠粒:i-PrOH(1:2)，v/v)中。
1-(2-溴乙基)-2-((6-(二甲基氨基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)硫基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-4-胺(1-(2-Bromoethyl)-2-((6-(dimethylamino)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)thio)-1H-imidazo[4,5-c]pyridine-4-amine)(5a)。在室温下搅拌含1b(252mg，0.764mmol)、Cs2CO3(373mg，1.15mmol)、1,2-二溴乙烷(718mg，329μL，3.82mmol)的DMF(2mL)1.5小时。然后再加入Cs2CO3(124mg，0.38mmol)并再搅拌混合物20分钟。在减压下干燥混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH，10:1)纯化残余物，得到5a(211mg，63％)；MS(ESI)m/z 436.0/438.0[M+H]+。
(6-((2-(4-氨基-2-((6-(二甲基氨基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)硫基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)乙基)氨基)己基)氨基甲酸叔丁酯(tert-Butyl(6-((2-(4-amino-2-((6-(dimethylamino)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)thio)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-1-yl)ethyl)amino)hexyl)carbamate)(6a)。在室温下搅拌含5a(0.184g，0.423mmol)和6-氨基己基氨基甲酸叔丁酯(0.915g，4.23mmol)的DMF(7mL)24小时。浓缩反应混合物并对残余物进行色谱分析[CHCl3:MeOH:MeOH-NH3(7N)，100:7:3]，得到0.109g(45％)6b；MS(ESI)m/z 572.3[M+H]+。
(7a)。将6a(0.257g，0.45mmol)溶解于15mL CH2Cl2:TFA(4:1)中并在室温下搅拌溶液45分钟。在减压下去除溶剂并在高度真空下干燥残余物过夜。将这物质溶解于DMF(12mL)中并加入固相肽合成容器中的25mL Affi-Gel 10珠粒(预先洗涤，3×50mL DMF)中。加入225μL N,N-二异丙基乙胺和若干DMAP晶体并在室温下将这物质震荡2.5小时。然后加入2-甲氧基乙胺(0.085g，97μl，1.13mmol)并继续震荡30分钟。然后去除溶剂并用CH2Cl2:Et3N(9:1，4×50mL)、DMF(3×50mL)、菲特氏缓冲液(3×50mL)和i-PrOH(3×50mL)洗涤珠粒，每次10分钟。在-80℃下将珠粒7a贮存于i-PrOH(珠粒:i-PrOH(1:2)，v/v)中。
珠粒7b是如上文对于7a所描述以类似方式制备。
图36.生物素标记的嘌呤和嘌呤样Hsp90抑制剂的合成。试剂和条件：(a)EZ-胺-PEO3-生物素、DMF、室温。
(8a)。在室温下搅拌含2a(3.8mg，0.0086mmol)和EZ-胺-PEO3-生物素(5.4mg，0.0129mmol)的DMF(0.2mL)24小时。浓缩反应混合物并对残余物进行色谱分析[CHCl3:MeOH-NH3(7N)，10:1]，得到2.3mg(35％)8a。MS(ESI):m/z 775.2[M+H]+。
(9a)。在室温下搅拌含5a(3.7mg，0.0086mmol)和EZ-胺-PEO3-生物素(5.4mg，0.0129mmol)的DMF(0.2mL)24小时。浓缩反应混合物并对残余物进行色谱分析[CHCl3:MeOH-NH3(7N)，10:1]，得到1.8mg(27％)9a。MS(ESI):m/z 774.2[M+H]+。
生物素标记的化合物8b和9b是以类似方式分别由2b和5b制备。
图37.生物素标记的嘌呤和嘌呤样Hsp90抑制剂的合成。试剂和条件：(a)N-(2-溴乙基)-邻苯二甲酰亚胺或N-(3-溴丙基)-邻苯二甲酰亚胺、Cs2CO3、DMF、室温；(b)水合肼、MeOH、CH2Cl2、室温；(c)EZ-NHS-LC-LC-生物素、DIEA、DMF、室温；(d)EZ-NHS-PEG4-生物素、DIEA、DMF、室温。
2-(3-(6-氨基-8-(6-(二甲基氨基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基硫基)-9H-嘌呤-9-基)丙基)异吲哚啉-1,3-二酮(2-(3-(6–Amino–8-(6-(dimethylamino)benzo[d][1,3]dioxol-5-ylthio)-9H-purin-9-yl)propyl)isoindoline-1,3-dion e)。在室温下搅拌含1a(0.720g，2.18mmol)、Cs2CO3(0.851g，2.62mmol)、2-(3-溴丙基)异吲哚啉-1,3-二酮(2.05g，7.64mmol)的DMF(15mL)2小时。在减压下干燥混合物并通过柱色谱(CH2Cl2:MeOH:AcOH，15:1:0.5)纯化残余物，得到0.72g(63％)标题化合物。1H NMR(500MHz,CDCl3/MeOH-d4):δ8.16(s,1H),7.85-7.87(m,2H),7.74-7.75(m,2H),6.87(s,1H),6.71(s,1H),5.88(s,2H),4.37(t,J＝6.4Hz,2H),3.73(t,J＝6.1Hz,2H),2.69(s,6H),2.37-2.42(m,2H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C25H24N7O4S,计算值518.1610；实验值518.1601。
9-(3-氨基丙基)-8-(6-(二甲基氨基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基硫基)-9H-嘌呤-6-胺
(9-(3-Aminopropyl)-8-(6-(dimethylamino)benzo[d][1,3]dioxol-5-ylthio)-9H-purin-6-amine)(10b)。在室温下搅拌含2-(3-(6-氨基-8-(6-(二甲基氨基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基硫基)-9H-嘌呤-9-基)丙基)异吲哚啉-1,3-二酮(0.72g，1.38mmol)、水合肼(2.86g，2.78mL，20.75mmol)的CH2Cl2:MeOH(4mL:28mL)2小时。在减压下干燥混合物并通过柱色谱(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，20:1)纯化残余物，得到430mg(80％)10b。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.33(s,1H),6.77(s,1H),6.49(s,1H),5.91(s,2H),5.85(br s,2H),4.30(t,J＝6.9Hz,2H),2.69(s,6H),2.65(t,J＝6.5Hz,2H),1.89-1.95(m,2H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ154.5,153.1,151.7,148.1,147.2,146.4,144.8,120.2,120.1,109.3,109.2,101.7,45.3,45.2,40.9,38.6,33.3；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C17H22N7O2S,计算值388.1556；实验值388.1544。
(12b)。在室温下搅拌含10b(13.6mg，0.0352mmol)、EZNHS-LC-LC-生物素(22.0mg，0.0387mmol)和DIEA(9.1mg，12.3μL，0.0704mmol)的DMF(0.5mL)1小时。在减压下浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化所得残余物，得到22.7mg(77％)12b。MS(ESI):m/z 840.2[M+H]+。
(14b)。在室温下搅拌含10b(14.5mg，0.0374mmol)、EZ-NHS-PEG4-生物素(24.2mg，0.0411mmol)和DIEA(9.7mg，13μL，0.0704mmol)的DMF(0.5mL)1小时。在减压下浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化所得残余物，得到24.1mg(75％)14b。MS(ESI):m/z 861.3[M+H]+。
生物素标记的化合物12a、13a、13b、14a、15a和15b是如对于12b和14b所描述以类似方式制备。
图38.德拜0932型珠粒的合成。试剂和条件：(a)Cs2CO3、DMF、室温；(b)TFA、CH2Cl2、室温；(c)6-(BOC-氨基)己酸、EDCI、DMAP、室温、2小时；(d)Affigel-10、DIEA、DMAP、DMF。
8-((6-溴苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)硫基)-9-(2-(哌啶-4-基)乙基)-9H-嘌呤-6-胺(8-((6-Bromobenzo[d][1,3]dioxol-5-yl)thio)-9-(2-(piperidin-4-yl)ethyl)-9H-purin-6-amin e)(18)。在室温下搅拌含16(300mg，0.819mmol)、Cs2CO3(534mg，1.64mmol)、17(718mg，2.45mmol)的DMF(10mL)1.5小时。过滤反应混合物并在减压下干燥并且进行色谱分析(CH2Cl2:MeOH，10:1)，得到Boc保护的N9/N3异构体的混合物。在室温下加入20mL TFA:CH2Cl2(1:1)并搅拌6小时。在减压下干燥反应混合物并通过制备型HPLC纯化，得到18(87mg，22％)；MS(ESI)m/z 477.0[M+H]+。
6-氨基-1-(4-(2-(6-氨基-8-((6-溴苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)乙基)哌啶-1-基)己-1-酮(6-Amino-1-(4-(2-(6-amino-8-((6-bromobenzo[d][1,3]dioxol-5-yl)thio)-9H-purin-9-yl)ethyl)piperidin-1-yl)hexan-1-one)(19)。向18(150mg，0.314mmol)于CH2Cl2(5ml)中的混合物中加入6-(Boc-氨基)己酸(145mg，0.628mmol)、EDCI(120mg，0.628mmol)和DMAP(1.9mg，0.0157mmol)。在室温下搅拌反应混合物2小时，然后在减压下浓缩并通过制备型TLC[CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，15:1]纯化残余物，得到161mg(74％)19；MS(ESI)m/z 690.1[M+H]+。
(20)。将19(0.264g，0.45mmol)溶解于15mL CH2Cl2:TFA(4:1)中并在室温下搅拌溶液45分钟。在减压下去除溶剂并在高度真空下干燥残余物过夜。将这物质溶解于DMF(12mL)中并加入固相肽合成容器中的25mL Affi-Gel 10珠粒(预先洗涤，3×50mL DMF)中。加入225μL N,N-二异丙基乙胺和若干DMAP晶体并在室温下将这物质震荡2.5小时。然后加入2-甲氧基乙胺(0.085g，97μl，1.13mmol)并继续震荡30分钟。然后去除溶剂并用CH2Cl2:Et3N(9:1，4×50mL)、DMF(3×50mL)、菲特氏缓冲液(3×50mL)和i-PrOH(3×50mL)洗涤珠粒，每次10分钟。在-80℃下将珠粒20贮存于i-PrOH(珠粒:i-PrOH(1:2)，v/v)中。
图39.连接于生物素的德拜0932的合成。试剂和条件：(a)EZ-NHS-LC-LC-生物素、DIEA、DMF、35℃；(b)EZ-NHS-PEG4-生物素、DIEA、DMF、35℃。
(21)。在35℃下加热含18(13.9mg，0.0292mmol)、EZ-NHS-LC-LC-生物素(18.2mg，0.0321mmol)和DIEA(7.5mg，10.2μL，0.0584mmol)的DMF(0.5mL)6小时。在减压下浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化所得残余物，得到7.0mg(26％)21。MS(ESI):m/z 929.3[M+H]+。
(22)。在35℃下加热含18(13.9mg，0.0292mmol)、EZ-NHS-PEG4-生物素(18.9mg，0.0321mmol)和DIEA(7.5mg，10.2μL，0.0584mmol)的DMF(0.5mL)6小时。在减压下浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化所得残余物，得到8.4mg(30％)22；MS(ESI):m/z 950.2[M+H]+。
图40.连接于生物素的SNX 2112型Hsp90抑制剂的合成。试剂和条件：(a)EZ-NHS-LC-LC-生物素、DIEA、DMF、室温；(b)EZ-NHS-PEG4-生物素、DIEA、DMF、室温。
(24)。在室温下搅拌含23(16.3mg，0.0352mmol)、EZ-NHS-LC-LC-生物素(22.0mg，0.0387mmol)和DIEA(9.1mg，12.3μL，0.0704mmol)的DMF(0.5mL)1小时。在减压下浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH，10:1)纯化所得残余物，得到26.5mg(82％)24；MS(ESI):m/z 916.4[M+H]+。
(25)。在室温下搅拌含23(17.3mg，0.0374mmol)、EZ-NHS-PEG4-生物素(24.2mg，0.0411mmol)和DIEA(9.7mg，13μL，0.0704mmol)的DMF(0.5mL)1小时。在减压下浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH 10:1)纯化所得残余物，得到30.1mg(78％)25；MS(ESI):m/z 937.3[M+H]+。
具体实施方式
本发明提供鉴别癌症涉及路径和癌症涉及路径的与Hsp90相关的特定组分(例如致癌蛋白)的方法，所述特定组分与癌症的发展和进展有关。所述方法涉及使来自罹患癌症的个体的含有癌细胞的样品与Hsp90抑制剂接触，并且检测癌症涉及路径的结合于所述Hsp90抑制剂的致癌蛋白组分。
如本文中所使用，某些术语具有在如下每一所述术语后所阐述的含义：
“癌症涉及路径”意指任何分子路径，其变化与细胞从正常转化为癌症表型有关。癌症涉及路径可包括与代谢、基因信息加工、环境信息加工、细胞过程和有机体***有关的路径。许多所述路径的列表阐述于表1中并且可在KEGG路径数据库和国家癌症研究所的自然路径相互作用数据库(the National Cancer Institute's Nature PathwayInteraction Database)中在线找到关于所述路径的更详细的信息。还参见以下公司的网站：马萨诸塞州贝弗利(Beverly,Mass.)的细胞信号传导技术(Cell SignalingTechnology)；加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,Calif)的拜奥卡塔公司(BioCarta)；和加利福尼亚州卡尔斯巴德(Clarsbad,Calif)的英杰/生命技术公司(Invitrogen/LifeTechnologies Corporation)。另外，图1描绘识别的路径与癌症有关。
表1.潜在癌症涉及路径的实例。
“癌症涉及路径的组分”意指位于癌症涉及路径中的分子实体，其可被靶向以便实现对路径的抑制和与路径相关并且由在路径中的活性引起的癌症表型变化。所述组分的实例包括图1中所列的组分。
“癌症涉及路径的组分的抑制剂”意指与癌症涉及路径或癌症涉及路径的组分相互作用以便实现对路径的抑制和由在路径中的活性引起的癌症表型变化的化合物(除Hsp90抑制剂以外)。特定组分的抑制剂的实例是普遍已知的。仅举例来说，以下美国专利和美国专利申请公开案描述如下所列的路径组分的抑制剂的实例：
SYK：美国专利申请公开案US 2009/0298823 A1、US 2010/0152159 A1、US 2010/0316649 A1
BTK：美国专利6,160,010；美国专利申请公开案US 2006/0167090 A1、US 2011/0008257 A1
EGFR：美国专利5,760,041；US 7,488,823 B2；US 7,547,781 B2
mTOR：美国专利US 7,504,397 B2；美国专利申请公开案US 2011/0015197 A1
MET：美国专利US 7,037,909 B2；美国专利申请公开案US 2005/0107391 A1、US2006/0009493 A1
MEK：美国专利US 6,703,420 B1；美国专利申请公开案US 2007/0287737 A1
VEGFR：美国专利US 7,790,729 B2；美国专利申请公开案US 2005/0234115 A1、US2006/0074056 A1
PTEN：美国专利申请公开案US 2007/0203098 A1、US 2010/0113515 A1
PKC：美国专利5,552,396；US 7,648,989 B2
Bcr-Abl：美国专利US 7,625,894 B2；美国专利申请公开案US 2006/0235006 A1。
此外，蛋白激酶的抑制剂的数个实例展示于图2中。
“Hsp90抑制剂”意指与伴侣热休克蛋白90(Hsp90)相互作用并抑制其活性的化合物。数种已知Hsp90抑制剂(包括PU-H71)的结构展示于图3中。已描述许多其它Hsp90抑制剂。参见例如美国专利US 7,820,658 B2；US 7,834,181 B2；和US 7,906,657 B2。还参见以下：
哈迪克J帕特尔,沙努莫蒂,加布里拉池欧斯,托尼塔尔多内.用于癌症治疗的热休克蛋白90抑制剂的发现和开发进展.药物发现专家意见,2011年5月,第6卷,第5期,第559-587:559-587页(Hardik J Patel,Shanu Modi,Gabriela Chiosis,TonyTaldone.Advances in the discovery and development of heat-shock protein90inhibitors for cancer treatment.Expert Opinion on Drug Discovery May 2011,Vol.6,No.5,Pages 559-587:559-587)；
波特JR,弗里兹CC,迪普KM.Hsp90抑制剂的发现和开发：一种有前途的癌症治疗路径.化学生物学新见.2010年6月；14(3):412-20(Porter JR,Fritz CC,DepewKM.Discovery and development of Hsp90inhibitors:a promising pathway forcancer therapy.Curr Opin Chem Biol.2010Jun；14(3):412-20)；
加宁YL.热休克蛋白90的ATP酶抑制剂(第二季).当代药物发现.2010年5月；15(9-10):342-53(Janin YL.ATPase inhibitors of heat-shock protein 90,secondseason.Drug Discov Today.2010May；15(9-10):342-53)；
塔尔多内T,池欧斯G.嘌呤骨架Hsp90抑制剂.医药化学当代课题.2009；9(15):1436-46(Taldone T,Chiosis G.Purine-scaffold Hsp90inhibitors.Curr Top MedChem.2009；9(15):1436-46)；和
塔尔多内T,孙W,池欧斯G.热休克蛋白90抑制剂的发现和开发.生物有机和药物化学.2009年5月15日；17(6):2225-35(Taldone T,Sun W,Chiosis G.Discovery andDevelopment of heat shock protein 90inhibitors.Bioorg Med Chem.2009Mar 15；17(6):2225-35)。
小分子Hsp90探针
将小分子连接于固体载体是一种探测其靶和靶相互作用搭配物的极适用方法。实际上，连接于固体载体的格尔德霉素(geldanamycin)能够用于鉴别Hsp90为其靶。大概设计所述化学探针的最关键方面是确定用于连接小分子配体的适当位点，和设计分子与固体载体之间的适当连接子。我们设计Hsp90化学探针的策略需要数个步骤。第一，为了验证最佳连接子长度和其连接于Hsp90配体的位点，使连接子修饰的配体停泊于Hsp90α的适当X射线晶体结构上。第二，在测量与来源于癌细胞提取物的Hsp90的竞争性结合的荧光偏振(fluorescent polarization，FP)分析中评估连接子修饰的配体。这种分析使用Cy3b标记的格尔德霉素作为FP优化Hsp90配体(杜(Du)等人,2007)。这些步骤对于确保固体载体固定的分子维持对于Hsp90的强亲和力是重要的。最后，将连接子修饰的小分子连接于固体载体，并且通过与含有Hsp90的细胞提取物一起培育来验证其与Hsp90的相互作用。
当需要探针鉴别与致癌客户蛋白复合的Hsp90时，更重要的要求是(1.)所述探针对于“致癌Hsp90物质”保留选择性和(2.)在结合于Hsp90时所述探针锁定呈客户蛋白结合构象的Hsp90。“致癌Hsp90”的观念另外定义于本申请案以及图11中。
当需要探针通过质谱技术鉴别与致癌客户蛋白复合的Hsp90时，其它重要的要求是(1.)所述探针分离足够的蛋白质物质和(2.)如分别由Hsp90致癌客户和非特异性树脂结合的蛋白质的量定义的信噪比足够大以便通过质谱法可鉴别。本申请案提供制备所述探针的实例。
我们选择Affi-10(伯乐公司(BioRad))用于配体连接。这些琼脂糖珠粒在IOC间隔臂的末端具有N-羟基丁二酰亚胺酯，并且因此，每一连接子被设计成含有远端胺官能团。连接子连接于PU-H71的位点是由其结合于人类Hsp90α(PDB ID：2FWZ)的N端域的共晶体结构来辅助的。这种结构显示嘌呤的N9胺不与蛋白质直接接触而是针对溶剂(图27A)(伊莫米诺(Immormino)等人,2006)。同样，先前SAR表明这是吸引人的位点，因为其先前用于引入水溶基(赫(He)等人,2006)。设计化合物5(PU-H71-C6连接子)并使其停泊于Hsp90活性位点上(图27A)。PU-H71的所有相互作用得以阻止，并且计算机模型清楚地显示连接子朝向溶剂暴露区域定向。因此，合成化合物5作为连接于固体载体的即时前体(参见化学性质，图30)。在FP分析中，5保留对于Hsp90的亲和力(IC50＝19.8nM，与PU-H71的22.4nM相比，表8)，然后能够使我们有把握地朝着通过连接于Affi-10来合成固体载体固定的PU-H71探针(6)(图30)前进。
我们还设计了PU-H71的生物素标记衍生物。生物素标记药剂优于固体载体药剂的一个优点是其可用于直接在细胞或体内***中探测结合。然后可将配体-Hsp90复合物捕获于含有生物素结合的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素的珠粒上。通常，这种方法减少与来自细胞提取物的化学沉淀相关的非特异性结合。或者，对于体内实验，可在特定组织(即癌症肿块)中通过使用抗生蛋白链菌素标记的结合物(即FITC-抗生蛋白链菌素)来检测活性位点(在这种情况下是Hsp90)的存在。通过使2与生物素基-3,6,9-三氧杂十一烷二胺(EZ-胺-PEO3-生物素)反应来获得生物素标记的PU-H71(7)(图31)。7保留对于Hsp90的亲和力(IC50＝67.1nM)并且含有用于亲和纯化的能够与抗生蛋白链菌素相互作用的暴露的生物素。
从NVP-AUY922与Hsp90α(PDB ID：2VCI，图27B)可用的共晶体结构和相关3,4-二芳基吡唑与Hsp90α的共晶体结构，以及从SAR，显然4-芳基环的对位处的取代基存在相当大的容许度(布拉夫(Brough)等人,2008；张(Cheung)等人,2005；迪莫克(Dymock)等人,2005；巴里尔(Barril)等人,2006)。因为4-芳基取代基主要针对溶剂并且对位处的取代似乎对结合亲和力具有极小影响，所以我们决定在这个位置上将分子连接于固体载体。为了能够实现连接，将吗啉基团改为1,6-二氨基己基，得到10作为用于连接于固体载体的即时前体。使10停泊于活性位点上(图27B)显示其维持NVP-AUY922的所有相互作用并且连接子朝向溶剂暴露区域定向。当在结合分析中测试10时，其也保留亲和力(IC50＝7.0nM，与NVP-AUY922的4.1nM相比，表8)并且随后用于连接于固体载体(参见化学性质，图32)。
尽管SNX-2112与Hsp90的共晶体结构并不是公共可用的，但相关四氢-4H-咔唑-4-酮(27)结合于Hsp90α(PDB ID：3D0B，图27C)的共晶体结构是公共可用的(巴塔(Barta)等人,2008)。这一情况连同对于27所报导的SAR一起使人想到连接于反-4-氨基环己醇取代基的羟基的连接子。通过酯键直接连接6-氨基-已酸并不认为是合乎需要的，因为所述键因普遍存在的酯酶而在溶解物混合物中具有潜在不稳定性。因此，用氨基取代羟基，得到反-1,4-二氨基环己烷衍生物18(图33)。所述变化导致与SNX-2112相比效力几乎损失14倍(表8)。将6-(Boc-氨基)己酸连接于18并且在脱除保护基后，获得20作为用于连接于珠粒的即时前体(参见化学性质，图33)。停泊表明20的相互作用类似于27(图27C)并且连接子朝向溶剂暴露区域定向。经过测定20对于Hsp90具有良好亲和力(IC50＝24.7nM，与SNX-2112的15.1nM和18的210.1nM相比，表8)并且已恢复18损失的几乎所有亲和力。通过我们的结合模型充分地解释了18和20与SNX-2112两者之间的活性差异，因为化合物20(-C＝O，图27C)和SNX-2112(-OH，未图示)与Lys 58的侧链氨基形成氢键。18含有强碱性氨基并且不能与Lys 58侧链(NH2，未图示)形成氢键。这与黄(Huang)等人的如下观察结果吻合良好：这个位置上的碱性胺失宠。20的酰胺键使18的碱性氨基转化为能够充当Lys 58的H键接受者的非碱性酰胺基，类似于SNX-2112的羟基。
PU-H71珠粒(6)的合成展示于图30中并且从用1,3-二溴丙烷使8-芳基硫基嘌呤(1)的9-烷基化(赫等人,2006)以得到35％产率的2开始。形成2所获得的低产率可能主要是归因于不可避免的竞争的3-烷基化。使用五当量1,3-二溴丙烷确保1的完全反应并且限制其它不合需要的副反应，例如二聚化，其也可能造成低产率。使2与6-氨基己基氨基甲酸叔丁酯(3)反应，得到90％产率的Boc保护的氨基嘌呤4。用TFA脱除保护基，随后与Affi-10反应，得到6。也通过使2与EZ-胺-PEO3-生物素反应来合成生物素标记的PU-H71(7)(图31)。
由醛8合成NVP-AUY922珠粒(11)(布拉夫等人,2008)展示于图32中。从用3使8还原性胺化而获得75％产率的9并且无可检测的Boc基团损失。在单一步骤中，Boc与苯甲基保护基两者都用BCl3去除，得到78％产率的异噁唑10，然后使其与Affi-10反应，得到11。
SNX-2112珠粒(21)的合成展示于图33中，并且虽然在专利文献(瑟雷尼克斯(Serenex)等人,2008，WO-2008130879A2；瑟雷尼克斯等人,2008，US-20080269193A1)中提及化合物17和18，但既未进行适当表征，也未充分描述其合成。因此，我们觉得值得详细地描述所述合成。从甲苯磺酰肼(12)与双甲酮(13)的缩合获得89％产率的甲苯磺酰腙14。在用三氟乙酸酐处理所产生的55％产率的中间物三氟酰基衍生物的碱促进环化缩合后进行14到四氢吲唑酮15的一锅法转化(one-pot conversion)。使15与2-溴-4-氟苯甲腈在DMF中反应，得到91％产率的16。感兴趣的是注意到这一反应的区域选择性，如芳基化在N1处选择性进行。在类似于15的吲唑-4-酮的计算机研究中，已知1H互变异构体与2H互变异构体两者平衡存在，然而，由于其较高的偶极矩，1H互变异构体在极性溶剂中是有利的(克拉利蒙特(Claramunt)等人,2006)。用反-1,4-二氨基环己烷使16胺化是在布奇沃德条件(Buchwaldcondition)(欧德(Old)等人,1998)下使用三(二苯亚甲基丙酮)二钯[Pd2(dba)3]和2-二环己基膦基-2'-(N,N-二甲基氨基)联苯(DavePhos)完成的，得到腈17(24％)以及酰胺18(17％)，合并产率大于41％。在17完全水解后，使18与6-(Boc-氨基)己酸和EDCI/DMAP偶合，得到91％产率的19。在脱除保护基后，获得20，然后使其与Affi-10反应，得到21。
利用数种方法来测量合成最终探针的反应进展。通过测量每一化合物的λmax的降低来使用液体的UV监测。一般来说，观察到在1.5小时后λmax不存在进一步降低，从而指示反应完成。利用TLC作为反应进展的粗测量标准，而使用液体的LC-MS监测证实完全反应。虽然在TLC时因为使用过量化合物(1.2当量)而斑点不会消失，但密度明显降低指示反应进展。
Hsp90抑制剂PU-H71(赫等人,2006)和NVP-AUY922(布拉夫等人,2008)的合成和充分表征已在别处有报导。SNX-2112先前已在专利文献(瑟雷尼克斯等人,2008，WO-2008130879A2；瑟雷尼克斯等人,2008，US-20080269193A1)中提及，但仅最近对其进行了充分表征和适当地描述其合成(黄等人,2009)。在这个研究项目开始时，关于其合成的特定细节是缺乏的。另外，我们难以在对于类似化合物所报导的条件下[Pd(OAc)2、DPPF、NaOtBu、甲苯、120℃、微波]再现用反-4-氨基环己醇使16胺化。在我们手中，最多仅检测到微量产物。将催化剂改为PdCl2、Pd(PPh3)4或Pd2(dba)3或将溶剂改为DMF或1,2-二甲氧基乙烷(DME)或将碱改为K3PO4不会产生任何改良。因此，我们修改这一步骤并且能够在布奇沃德条件(欧德等人,1998)下使用Pd2(dba)3和DavePhos在DME中使16与反-4-氨基环己醇四氢哌喃醚(24)偶合，得到腈25(28％)以及酰胺26(17％)，合并产率为45％(图34)。这些是用于使16与反-1,4-二氨基环己烷偶合的条件，并且类似地在反应过程中一些25水解为26。因为出于我们的目的，这是不必要的，所以我们并不对25优化这一反应。我们推测所述反应的主要障碍是反-4-氨基环己醇在甲苯中的低溶解度并且使用THP保护的醇24至少最低限度地增加溶解度。在从26去除THP基团后获得SNX-2112并且进行充分表征(1H、13C-NMR、MS)。
接着，我们研究合成的珠粒是否保留与癌细胞中的Hsp90相互作用。将共价连接于PU-H71、NVP-AUY922、SNX-2112或2-甲氧基乙胺的任一种的琼脂糖珠粒(分别是PU-、NVP-、SNX-、对照物-珠粒)与K562慢性骨髓性白血病(CML)或MDA-MB-468乳癌细胞提取物一起培育。如图28A中所见，Hsp90抑制剂而非对照物-珠粒有效地分离癌细胞溶解物中的Hsp90。对照物珠粒含有与Affi-10结合的Hsp90非活性化学物质(2-甲氧基乙胺)(参见实验)，向固体载体与细胞提取物中的蛋白质的潜在非特异性结合提供实验对照。
此外，为探测这些化学工具分离肿瘤细胞中的真正Hsp90客户蛋白的能力，我们将连接于固体载体的PU-H71(6)与癌细胞提取物一起培育。我们能够证明MDA-MB-468细胞中的Hsp90/c-Kit和Hsp90/IGF-IR复合物(图28B)和K562细胞中的Hsp90/Bcr-Abl和Hsp90/Raf-1复合物(图28C)的剂量依赖性分离。这些是分别在驱动三阴性乳癌和CML中的转化表型中具有重要作用的Hsp90依赖性致癌蛋白(怀特赛和林德奎斯特,2005；赫维兹(Hurvitz)和芬恩(Finn),2009；劳(Law)等人,2008)。根据Hsp90介导的c-Kit和IGF-IR调节，用PU-H71处理MDA-MB-468细胞导致这些蛋白质的稳态水平降低(图28B，比较溶解物、-和+PU-H71)。近年来我们能够使用PU-珠粒(6)分离和鉴别新颖Hsp90客户，例如弥漫性大B细胞淋巴瘤中的转录抑制因子BCL-6(瑟池特(Cerchietti)等人,2009)和突变型JAK2驱动的脊髓增生性病症中的JAK2(丸林(Marubayashi)等人,2010)。我们还能够鉴别对三阴性乳癌具有特异性的Hsp90致癌客户(卡尔达斯-罗普斯(Caldas-Lopes)等人,2009)。除阐明Hsp90在这些肿瘤中的作用机制以外，所鉴别的蛋白质是重要的肿瘤特异性致癌客户并且将在临床研究期间在监测PU-H71和Hsp90抑制剂在这些癌症中的临床功效时作为生物标记引入。
尽管在分离与客户蛋白复合的Hsp90方面PU-H71-珠粒优于PU-H71-生物素珠粒，然而也可使用PU-H71-生物素(7)进行类似实验(图29A)。
重要的是应注意先前试图使用固体载体固定的GM分离Hsp90/客户蛋白复合物很少有成功的(施特勒(Tsaytler)等人,2009)。在所述情况下，在制备步骤期间洗去结合于Hsp90的蛋白质。为防止损失与Hsp90相互作用的蛋白质，作者必须使癌细胞提取物经受与DSP(一种同双官能氨基反应性DTT可逆交联剂)交联，从而表明与PU-H71不同，GM无法稳定Hsp90/客户蛋白相互作用。当使用具有直接共价连接于Affi-10树脂的GM的珠粒时，我们观察到类似概况。结晶学和生物化学研究表明GM优先与不利于某些客户蛋白结合的呈apo开放构象的Hsp90相互作用(雷欧(Roe)等人,1999；史特宾(Stebbins)等人,1997；尼施雅(Nishiya)等人,2009)，从而为GM-珠粒捕获Hsp90/客户蛋白复合物的有限能力提供了可能解释。目前不知道其它Hsp90化学型偏爱哪些Hsp90构象，但在NVP-和SNX-珠粒也可用的情况下，如本文所报导，现在可进行类似评估，从而产生对这些药剂与Hsp90的相互作用和这些相互作用的生物学意义的充分了解。
在本文所设计的化学工具的另一应用中，我们表明PU-H71-生物素(7)也可用于特异性检测在细胞表面上表达时的Hsp90(图29B)。已在某些情况下报导Hsp90(主要是细胞溶质蛋白质)移位到细胞表面。举例来说，在乳癌中，膜Hsp90与辅助癌细胞侵袭有关(西德拉(Sidera)和帕萨维迪(Patsavoudi),2008)。活细胞中的膜Hsp90的特异性检测可能是通过使用PU-H71-生物素(7)进行，因为虽然结合生物素的Hsp90抑制剂可能会进入细胞，但用于检测生物素的抗生蛋白链菌素结合物不能透过细胞。图29B展示PU-H71-生物素而非D-生物素可检测白血病细胞表面上的Hsp90表达。
总而言之，我们已基于三种不同Hsp90抑制剂(各自具有不同化学型)制备适用的化学工具。通过连接于例如PU-H71(嘌呤)、NVP-AUY922(异噁唑)和SNX-2112(吲唑-4-酮)-珠粒的固体载体上或者通过生物素标记(PU-H71-生物素)制备这些工具。通过这些探针有效地从癌细胞提取物中分离Hsp90和在PU-H71珠粒(6)情况下分离含有Hsp90致癌蛋白的复合物的能力来证明其效用。在其设计中利用可用的共晶体结构和SAR，并且停泊于Hsp90α的适当X射线晶体结构用于验证连接子的连接位点。这些工具是努力充分了解Hsp90生物学和设计具有最有利临床概况的Hsp90抑制剂的重要化学工具。
使用Hsp90探针鉴别致癌蛋白和路径
本发明提供使用上述Hsp90探针鉴别癌症涉及路径的组分(例如致癌蛋白)的方法。在本发明的一个实施例中，所述癌症涉及路径是与代谢、基因信息加工、环境信息加工、细胞过程或有机体***有关的路径。举例来说，癌症涉及路径可以是表1中所列的路径。
更具体来说，癌症涉及路径或癌症涉及路径的组分与癌症有关，例如选自由以下组成的群组的癌症：结肠直肠癌、胰脏癌、甲状腺癌、白血病(包括急性骨髓性白血病和慢性骨髓性白血病)、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、***癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、乳癌、神经母细胞瘤、脊髓增生性病症、胃肠癌(包括胃肠基质肿瘤、食道癌、胃癌)、肝癌、胆囊癌、***癌、脑肿瘤(包括神经胶质瘤)、淋巴瘤(包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤)和妇科癌症(包括卵巢癌、子***和子宫内膜癌)。
以下小节描述使用本发明的Hsp90探针确定Hsp90在癌细胞中的性质和鉴别致癌蛋白和癌症涉及路径。
癌细胞中的异质Hsp90呈现
为研究小分子Hsp90抑制剂与肿瘤Hsp90复合物的相互作用，我们使用共价连接于格尔德霉素(GM)或PU-H71的琼脂糖珠粒(分别是GM-和PU-珠粒)(图4、5)。化学上独特的药剂GM与PU-H71都是通过结合于其N端域调节凹穴来与Hsp90相互作用并抑制Hsp90(加宁,2010)。比较而言，我们还产生了与抗Hsp90抗体(H9010)偶合的G蛋白琼脂糖-珠粒。
首先，我们在乳癌中和在慢性骨髓性白血病(CML)细胞溶解物中评估这些药剂与Hsp90的结合。使用H9010而非使用非特异性IgG的四个连续免疫沉淀(IP)步骤有效地从这些提取物中耗尽Hsp90(图4a，4xH9010和未图示)。相比之下，具有PU-或GM-珠粒的依序沉降物仅去除总细胞Hsp90中的一部分(图4b、10a、10b)。具体来说，在MDA-MB-468乳癌细胞中，合并的PU-珠粒部分占总细胞Hsp90池的约20-30％，并且进一步添加新鲜PU-珠粒等分试样无法使溶解物中的残余Hsp90沉淀(图4b，PU-珠粒)。虽然这个PU耗尽的残余Hsp90部分难以接近小分子，但其维持对于H9010的亲和力(图4b，H9010)。从这个情况我们推断MDA-MB-468细胞提取物中的相当大部分Hsp90仍然呈天然构象而不与PU-H71反应。
为排除细胞溶解物中的Hsp90配置变化使其不可用于与固定的PU-H71而非与抗体结合的可能性，我们分析在完整癌细胞中放射性标记的131I-PU-H71与Hsp90的结合(图4c，下)。131I-PU-H71和PU-H71的化学结构相同：PU-H71含有稳定的碘原子(127I)而131I-PU-H71含有放射性碘；因此，同位素标记的131I-PU-H71具有与未经标记的PU-H71相同的化学和生物学性质。在数种癌细胞系中131I-PU-H71与Hsp90的结合在每个细胞的许多明确但独特位点处变得饱和(图4c，下)。我们定量MDA-MB-468细胞中由PU-H71所结合的细胞Hsp90的部分。首先，我们测得Hsp90占这些细胞中的总细胞蛋白质的2.66-3.33％，这与其它肿瘤细胞中的Hsp90的报导丰度吻合(沃克曼等人,2007)。约41.65×106个MDA-MB-468细胞溶解，得到3875μg蛋白质，其中103.07-129.04μg是Hsp90。因此，一个细胞含有(2.47-3.09)×10-6μg、(2.74-3.43)×10-11μmol或(1.64-2.06)×107个Hsp90分子。在MDA-MB-468细胞中，131I-PU-H71至多结合于5.5×106个可用的细胞结合位点(图4c，下)，其达到总细胞Hsp90的26.6-33.5％(以5.5×106/(1.64-2.06)×107×100计算)。这个值显著类似于由细胞提取物中的PU-珠粒沉降物获得的值(图4b)，从而证实PU-H71结合于MDA-MB-468细胞中占总Hsp90池的约30％的一部分Hsp90并验证了使用PU-珠粒有效地分离这个池。在K562和其它已建立的t(9；22)+CML细胞系中，PU-H71结合总细胞Hsp90的10.3-23％(图4c、10b、10c)。
总体来说，这些数据表明例如PU-H71的某些Hsp90抑制剂优先结合于在癌细胞中比在正常细胞中更丰富的Hsp90物质的亚群(图11a)。
致癌蛋白和WT蛋白结合的Hsp90物质共存于癌细胞中，但PU-H71对于致癌蛋白/ Hsp90物质具有选择性
为研究与这些Hsp90物质相关的生物化学功能，我们分别用抗体-和Hsp90-抑制剂珠粒进行免疫沉淀(IP)和化学沉淀(CP)，并且我们分析Hsp90在这些情形下结合于与所选择的已知客户亚群的共沉淀物的能力。首先研究K562CML细胞，因为这种细胞系共表达异常Bcr-Abl蛋白(一种组成性活性激酶)和其正常对应物c-Abl。这两种Abl物质可通过分子量清楚地分开并且因此可容易通过西方印迹进行区分(图5a，溶解物)，从而有助于在相同细胞情形下分析Hsp90致癌和野生型(WT)客户。我们观察到H9010而非非特异性IgG分离与Bcr-Abl与Abl两者复合的Hsp90(图5a和11，H9010)。免疫沉淀的Bcr-Abl和Abl(图5a和5b，左，H9010)与上清液中残余的每种蛋白质的部分(图5b，左，残余上清液)的比较指示抗体并不优先富集结合于K562细胞中的突变或WT形式的Abl的Hsp90。
相比之下，PU结合的Hsp90优先分离Bcr-Abl蛋白(图5a和5b，右，PU-珠粒)。在Hsp90/Bcr-Abl物质的PU-珠粒耗尽(图5b，右，PU-珠粒)后，H9010使残余Hsp90/Abl物质沉淀(图5b，右，H9010)。PU-珠粒在实质上饱和条件下保留对于Hsp90/Bcr-Abl物质的选择性(即过量溶解物，图12a，左，和珠粒，图12a，右)。如进一步证实PU-H71对于Bcr-Abl/Hsp90物质的生物化学选择性，Bcr-Abl比Abl更易被PU-H71降解(图5d)。PU-H71对于异常Abl物质的选择性扩展到其它已建立的t(9；22)+CML细胞系(图13a)，以及初级CML样品(图13b)。
致癌而非WT蛋白结合的Hsp90物质最依赖于共伴侣募集以用于Hsp90对客户蛋白 的调节
为进一步区分PU-H71-和抗体-相关Hsp90部分，我们进行依序耗尽实验并评估两种物质的共伴侣支持者(祖侯克和约翰逊,2010)。含有Hsp90的Hsp90/Bcr-Abl复合物的部分结合数种共伴侣，包括Hsp70、hsp40、HOP和HIP(图5c，PU-珠粒)。PU-珠粒沉降物还富集了数种其它Hsp90共伴侣物质(表5a-d)。这些发现有力地表明PU-H71识别共伴侣结合的Hsp90。显示包括Hsp90/Abl物质的PU-珠粒耗尽的残余Hsp90池并不与共伴侣相关(图5c，H9010)，但在溶解物中检测出其丰富表达(图5c，残余上清液)。然而，共伴侣被总细胞提取物中的H9010分离(图11b、11c)。
这些发现表明独特的Hsp90池的存在优先结合于CML细胞中的Bcr-Abl或Abl(图5g)。H9010结合于含有Hsp90物质的Bcr-Abl与Abl两者，而PU-H71对于Bcr-Abl/Hsp90物质具有选择性。我们的数据还表明当Hsp90调节异常(即Bcr-Abl)而非正常(即Abl)蛋白质的活性时，其可利用并更强烈地需要典型共伴侣Hsp70、Hsp40和HOP(图11a)。根据这一假设，我们发现在K562细胞中Bcr-Abl比Abl对Hsp70(一种Hsp90共伴侣)的敲除更敏感(图5e)。
PU-H71的致癌蛋白/Hsp90物质选择性和复合物捕获能力并非所有Hsp90抑制剂共 有
随后我们评估以类似于PU-H71的方式与Hsp90的N端调节凹穴相互作用的其它抑制剂(包括合成抑制剂SNX-2112和NVP-AUY922以及天然产物GM)(加宁,2010)是否可选择性分离类似的Hsp90物质(图5f)。SNX-珠粒显示对于Bcr-Abl/Hsp90的选择性，而NVP-珠粒的表现类似于H9010并且不区分Bcr-Abl/Hsp90和Abl/Hsp90物质(分别参见SNX-相对于NVP-珠粒；图5f)。虽然GM-珠粒也识别细胞溶解物中的Hsp90的亚群(图10a)，但其比PU-珠粒在使Bcr-Abl共沉淀方面的有效性小得多(图5f，GM-珠粒)。先前已报导GM在捕获Hsp90/客户蛋白复合物方面的类似无效性(施特勒等人,2009)。
PU-H71的致癌蛋白/Hsp90物质选择性和复合物捕获能力并不限于Bcr-Abl/Hsp90 物质
为确定针对致癌蛋白的选择性是否并不限于Bcr-Abl，我们测试其它肿瘤细胞系中的数种其它明确的Hsp90客户蛋白(图12b-d)(达罗查迪亚斯(da Rocha Dias)等人,2005；古波维克(Grbovic)等人,2006)。与我们在K562细胞中的结果一致，H9010使Hsp90沉淀，Hsp90与在SKMel28黑色素瘤细胞中表达的突变型B-Raf和在CCD18Co正常结肠纤维母细胞中表达的WT B-Raf两者复合(图12b，H9010)。然而，PU-和GM-珠粒选择性识别Hsp90/突变型B-Raf，显示极少识别Hsp90/WT B-Raf(图12b，PU-珠粒和GM-珠粒)。然而，如在K562细胞中的情况，GM-珠粒比PU-珠粒在使突变型客户蛋白共沉淀方面的有效性显著更小。对于其它Hsp90客户获得类似结果(图12c、12d；施特勒等人,2009)。
PU-H71-珠粒鉴别CML中的异常信号体
上文所呈现的数据表明与Hsp90特异性相互作用的PU-H71(图14；塔尔多内和池欧斯(Chiosis),2009)优先对于致癌蛋白/Hsp90物质具有选择性并捕获呈客户结合构象的Hsp90(图5)。因此，我们检验PU-H71珠粒是否可用作研究致癌Hsp90客户蛋白的细胞补体的工具。因为假设异常Hsp90客户包含对于维持肿瘤表型最关键的各种蛋白质(祖侯克和约翰逊,2010；沃克曼等人,2007；德兹万(Dezwaan)和弗瑞曼(Freeman),2008)，所以这种方法可以肿瘤特异性方式鉴别关键信号传导路径。为检验这一假设，我们在K562细胞中进行通过PU-H71珠粒分离的货物蛋白的无偏性分析，其中已知至少一些关键功能性损伤(任(Ren),2005；伯克(Burke)和卡洛尔(Carroll),2010)。
使用PU-珠粒或对照物-珠粒从细胞溶解物中分离的货物蛋白经受通过纳米液相色谱联合串联质谱法(纳米LC-MS/MS)进行的蛋白质组学分析。使用Mascot搜寻引擎进行初始蛋白质鉴别，并且使用思高福德蛋白质组软件进一步评估(表5a-d)。在与PU-珠粒相互作用的蛋白质中，鉴别出Bcr-Abl(参见Bcr和Abl1，表5a和图6)，从而证实先前的数据(图5)。
然后使用英吉纽提路径分析(IPA)由所鉴别得蛋白质构建生物网络(图6a、6b、15；表5e、5f)。IPA将PU-H71分离的蛋白质分配成十三个与细胞死亡、细胞周期、细胞生长和增殖相关的网络。这些网络与已知的典型CML信号传导路径完全重叠(图6a)。
除信号传导蛋白质以外，我们鉴别调节碳水化合物和脂类代谢、蛋白质合成、基因表达和细胞组装与组织化的蛋白质。这些发现与假定的Hsp90在维持细胞自动调节和作为细胞转化的重要介体中的广泛作用一致(祖侯克和约翰逊,2010；沃克曼等人,2007；德兹万和弗瑞曼,2008；麦克莱伦(McClellan)等人,2007)。
在通过MS鉴别后，在K562细胞与初级CML母细胞两者中通过化学沉淀和西方印迹进一步验证许多关键蛋白质(图6c，左，图6d、13a、13b)。也查询PU-H71对这些蛋白质的稳态水平的影响以进一步支持其Hsp90调节的表达/稳定性(图6c，右)(祖侯克和约翰逊,2010)。
PU-珠粒上富集的最高得分网络是通过在CML中由Bcr-Abl传送异常信号传导所使用的网络：PI3K/mTOR、MAPK和NFκB介导的信号传导路径(网络1，22种聚焦分子，得分＝38；和网络2，22种聚焦分子，得分＝36，表5f)。对于这些网络形成联系图以研究组分蛋白质之间的关系(图15a、15b)。为清晰起见简化这些图，仅保留主要路径组分和关系(图6b)。
PI3K/mTOR路径
PI3K/mTOR路径的活化作为Bcr-Abl白血病生成的基本信号传导机制之一发生(任,2005)。在这一路径中备受关注的是哺乳动物雷帕霉素靶(mammalian target ofrapamycin，mTOR)，其在Bcr-Abl转化细胞中组成性活化，从而导致翻译失调并造成白血病生成。最新研究提供了证据，mTORC1与mTORC2复合物两者都是在Bcr-Abl细胞中活化并且在介导促有丝***反应的基因产物的mRNA翻译中以及在细胞生长和存活中起关键作用(卡拉约尔(Carayol)等人,2010)。在PU-Hsp90沉降物中鉴别mTOR和mTOR的关键活化因子，例如RICTOR、RAPTOR、Sin1(MAPKAP1)、3类PI3K(PIK3C3，也称为hVps34)和PIK3R4(VSP15)(信国(Nobukuni)等人,2007)(表5a、5d；图6c、6d、13b)。
NF-κB路径
核因子-κB(NF-κB)的活化是初级骨髓细胞的Bcr-Abl转化和Bcr-Abl转化的造血细胞在裸小鼠中形成肿瘤所需的(麦克库布瑞(McCubrey)等人,2008)。通过这一路径富集的PU分离的蛋白质包括NF-κB以及NF-kB的活化因子，例如通过独立的域结合NF-κ-B诱导激酶(NIK)和IKK并将其组装成活性激酶复合物的IKBKAP，和TBK-1(TANK结合激酶1)和TAB1(TAK1结合蛋白1)，两者都是I-κB激酶/NF-κB级联反应的正调节因子(汉克和卡琳(Karin),2006)(表5a、5d)。近年来，证明骨髓性白血病细胞中NF-κB级联反应的Bcr-Abl诱导性活化主要是通过酪氨酸磷酸化PKD2(或PRKD2)介导(米哈伊罗夫(Mihailovic)等人,2004)，我们在本文中将其鉴别为PU-H71/Hsp90相互作用因子(表5a、5d；图6c、6d、13b)。
Raf/MAPK路径
PU-Hsp90结合池中还包括MAPK路径(CML中活化的另一重要路径)的关键效应物(任,2005；麦克库布瑞等人,2008)，例如Raf-1、A-Raf、ERK、p90RSK、vav和数种MAPK(表5a、5d；图6c、6d、13b)。除ERK信号转导级联反应以外，我们鉴别对活化P38MAPK路径起作用的组分，例如MEKK4和TAB1。IPA将MAPK路径与许多不同信号转导路径(包括PI3K/mTOR、STAT和粘着斑路径)的关键元件联系起来(图15a-d、6b)。
STAT路径
STAT路径也在CML中活化并且赋予细胞因子独立性和防止细胞凋亡(麦克库布瑞等人,2008)并且通过PU-H71化学沉淀富集(网络8，20种聚焦分子，得分＝14，表5f，图15c)。STAT5与STAT3都与PU-H71-Hsp90复合物相关(表5a、5d；图6c、6d、13b)。在CML中，通过磷酸化进行的STAT5活化是由Bcr-Abl驱动(任,2005)。在前B淋巴母细胞白血病细胞中由Bcr-Abl组成性磷酸化和活化的布鲁顿氏无丙球蛋白血症酪氨酸激酶(Brutonagammaglobulinemia tyrosine kinase，BTK)(亨德里克斯(Hendriks)和凯尔斯勃(Kersseboom),2006)也可通过STAT5传导信号(马哈詹(Mahajan)等人,2001)。BTK是我们在CML中鉴别的另一种Hsp90调节的蛋白质(表5a、5d；图6c、6d、13b)。除磷酸化以外，STAT可在骨髓细胞中通过钙蛋白酶(CAPN1)介导的蛋白水解裂解来活化，从而产生截短的STAT物质(欧达(Oda)等人,2002)。CAPN1还见于PU结合的Hsp90沉降物中，如为活化的Ca(2+)/钙调素依赖性蛋白激酶IIγ(CaMKIIgamma)，其也由Bcr-Abl活化(司(Si)和柯林斯(Collins),2008)(表5a、5d)。CML中的CaMKIIγ活性与涉及MAPK和STAT路径的多个关键信号转导网络的活化相关。具体来说，在骨髓性白血病细胞中，CaMKIIγ还直接磷酸化STAT3并增强其转录活性(司和柯林斯,2008)。
粘着斑路径
祖血细胞滞留和归巢(homing)到骨髓微环境是通过存活和增殖的受体和促效剂来调节。Bcr-Abl诱导粘着独立性，导致造血干细胞从骨髓异常释放，并导致黏着受体信号传导路径在配体结合不存在下活化。粘着斑路径在PU-H71沉降物中良好地呈现(网络12，16种聚焦分子，得分＝13，表5f，图15d)。粘着斑相关蛋白质桩蛋白(paxillin)、FAK、粘着斑蛋白(vinculin)、踝蛋白(talin)和张力蛋白(tensin)在Bcr-Abl转染细胞系中组成性磷酸化(撒尔格亚(Salgia)等人,1995)，并且这些蛋白质也在PU-Hsp90复合物中分离(表5a、5d和图6c)。在CML细胞中，FAK可活化STAT5(乐(Le)等人,2009)。
本文还鉴别CML中的其它重要转化路径，那些由MYC(索耶斯(Sawyers),1993)(网络7，15种聚焦分子，得分＝22，图6a和15e，表5f)和TGF-β(那珂(Naka)等人,2010)(网络10，13种聚焦分子，得分＝18，图6a和15f，表5f)驱动的路径。所鉴别的网络也是那些对于疾病进展和CML的异常细胞周期和增殖重要的网络(网络3，20种聚焦分子，得分＝33；网络4，20种聚焦分子，得分＝33；网络5，20种聚焦分子，得分＝32；网络6，19种聚焦分子，得分＝30；网络9，14种聚焦分子，得分＝20；网络11，12种聚焦分子，得分＝17；和网络13，10种聚焦分子，得分＝12，图6a和表5f)。
总而言之，在CML中PU-H71富集参与恶性表型不可缺少的信号传导路径的具有广泛代表性的蛋白质(图6)。初级CML样品中保留PU结合的Hsp90与异常CML信号体的相互作用(图6d、13b)。
PU-H71鉴别的蛋白质和网络是对于恶性表型重要的那些蛋白质和网络
我们证明在PU-珠粒沉降物中这些蛋白质的存在在功能上是显著的并且提出在CML细胞中Hsp90在广泛支持恶性信号体中的作用。
为证明通过PU-珠粒鉴别的网络对于K562中的转化是重要的，我们随后表明来自个别网络的关键节点蛋白的抑制剂(图6b，黄色盒子-Bcr-Abl、NFκB、mTOR、MEK和CAMIIK)减弱K562细胞的生长和增殖潜力(图7a)。
随后我们证明尚未指定在CML中的作用的PU-珠粒鉴别的Hsp90相互作用因子也会造成转化表型。在来自CML细胞系和初级CML细胞的PU-珠粒沉降物中验证组蛋白-精氨酸甲基转移酶CARM1(许多基因的转录共活化因子)(贝德福德(Bedford)和克拉克(Clarke),2009)(图6c、6d、13)。这是Hsp90与CARM1之间首次报导的联系，尽管已显示其它精氨酸甲基转移酶(例如PRMT5)是卵巢癌细胞中的Hsp90客户(马洛尼(Maloney)等人,2007)。虽然CARM1水平提高与***和乳癌的发展有关，但对CARM1在CML白血病生成中的重要性却知之甚少(贝德福德和克拉克,2009)。我们发现CARM1基本上由PU-珠粒识别的Hsp90物质完全捕获(图7b)并且也对PU-H71降解敏感(图6c，右)。因此，CARM1可能是CML中新颖的Hsp90致癌蛋白。实际上，使用CARM1而非对照组shRNA的敲除实验(图7c)证明K562细胞的存活力降低和细胞凋亡诱导，从而支持这一假设。
为证明PU沉降物中蛋白质的存在不仅是归因于其丰富的表达，而且还归因于其参与异常活化的信号传导，我们比较来自K562和Mia-PaCa-2(一种胰脏癌细胞系)的PU-珠粒沉降物(表5a)。虽然两种细胞都表达高水平的STAT5蛋白(图7d)，但仅在K562细胞中注意到如通过STAT5磷酸化所证明的STAT5路径的活化(图7d)和DNA结合(嘉伽纳森(Jaganathan)等人,2010)。因此，仅在K562PU-珠粒沉降物中鉴别到这种蛋白(表5a和图7e)。相比之下，在来自K562(图6c、7e)与Mia-PaCa-2细胞提取物(图7e、7f)两者的PU-Hsp90复合物中鉴别到活化的STAT3。
在K562和Mia-PaCa-2细胞中通过PU-珠粒鉴别mTOR路径(图7e、7f)，并且实际上，PP242(一种靶向mTOR的ATP域的选择性抑制剂)(阿普塞尔(Apsel)等人,2008)对其的药理学抑制对两种细胞都有毒(图7a、7g)。另一方面，Abl抑制剂格列卫(德宁格(Deininger)和德鲁克(Druker),2003)仅对K562细胞有毒(图7a、7g)。两种细胞都表达Abl，但仅K562具有致癌Bcr-Abl(图7d)，并且PU-珠粒在K562中而非在Mia-PaCa-2细胞中将Abl鉴别为Bcr-Abl(图7e)。
PU-H71鉴别致癌STAT活化的新颖机制
PU-珠粒沉降物含有在CML白血病生成中组成性活化的数种蛋白质，包括Bcr-Abl(任,2005)、CAMKIIγ(司和柯林斯,2008)、FAK(撒尔格亚等人,1995)、vav-1(卡察夫(Katzav),2007)和PRKD2(米哈伊罗夫等人,2004)。这些是典型的Hsp90调节客户，其稳定性依赖于Hsp90，因为其稳态水平在Hsp90抑制时降低(图6c)(祖侯克和约翰逊,2010；沃克曼等人,2007)。在CML中还报导了STAT3和STAT5的组成性活化(任,2005；麦克库布瑞等人,2008)。然而，这些蛋白质并不符合典型客户蛋白的标准，因为STAT5和STAT3水平在Hsp90抑制时保持基本上未改变(图6c)。PU沉降物还含有可能分离为活性信号传导巨大复合物的一部分的蛋白质，例如mTOR、VSP32、VSP15和RAPTOR(卡拉约尔等人,2010)。如通过p-mTOR的细胞水平所测量的mTOR活性也似乎比复合物组分对Hsp90抑制更敏感(即在PU-H71处理的细胞中比较p-mTOR和RAPTOR的相对减少，图6c)。此外，PU-Hsp90复合物含有衔接蛋白，例如GRB2、DOCK、CRKL和EPS15，其将Bcr-Abl连接于K562中的多个异常活化的信号传导路径的关键效应物(布雷默等人,2009；任,2005)(图6b)。其表达在Hsp90抑制时也保持不变(图6c)。因此，我们想知道Hsp90对某些致癌路径的影响是否延伸超出其典型折叠作用。具体来说，如先前已假定(德兹万和弗瑞曼,2008；普拉特(Pratt)等人,2008)，我们假设Hsp90也可能充当维持呈活性配置的信号传导复合物的支架分子。
Hsp90结合于STAT5并影响其构象
为进一步研究这一假设，我们聚焦于STAT5，其在CML中组成性磷酸化(德格如特(de Groot)等人,1999)。通过磷酸化和去磷酸化事件的平衡来测定总p-STAT5水平。因此，K562细胞中的高p-STAT5水平可反映上游激酶活性的增加或蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP酶)活性的降低。Hsp90与p-STAT5之间的直接相互作用也可调节p-STAT5的细胞水平。
为剖析这些潜在机制的相对影响，我们首先研究PU-H71对主要激酶和调节K562细胞中的STAT5磷酸化的PTP酶的影响。Bcr-Abl直接活化STAT5而无需JAK磷酸化(德格如特等人,1999)。协调地，STAT5磷酸化在Bcr-Abl抑制剂格列卫存在下快速降低(图8a，左，格列卫)。虽然Hsp90调节Bcr-Abl稳定性，但Hsp90抑制后的稳态Bcr-Abl水平降低需要超过3小时(安(An)等人,2000)。实际上，如通过CRKL磷酸化不降低(图8a，左，PU-H71、p-CRKL/CRKL)所证明，在使用PU-H71的情况下在其使p-STAT5水平降低(图8a，左，PU-H71、p-STAT5)的时间间隔内观察到Bcr-Abl表达(图8a，左，PU-H71、Bcr-Abl)或功能无变化。同样，注意到HCK(经Bcr-Abl转染的32Dcl3细胞中的STAT5的激酶活化因子，卡勒杰曼(Klejman)等人,2002)的活性和表达无变化(图8a，右，HCK/p-HCK)。
因此，在0到90分钟间隔内PU-H71使p-STAT5磷酸化降低(图8c，左，PU-H71)不可能用Bcr-Abl或其它激酶的去稳定来解释。
因此，我们检验在PU-H71存在下p-STAT5水平的快速降低是否可通过PTP酶活性的增加来说明。SHP2(主要细胞溶质STAT5磷酸酶)(徐(Xu)和瞿(Qu),2008)的表达和活性在这一时间间隔内也不改变(图8a，右，SHP2/p-SHP2)。类似地，形成切断STAT信号传导的负反馈环的SOCS1和SOCS3的水平(德宁格和德鲁克,2003)不受PU-H71影响(图8a，右，SOCS1/3)。
因此，在0-90分钟间隔内对STAT5无影响很可能是归因于激酶或磷酸酶活性朝向STAT5变化。作为替代性机制，并且因为大多数p-STAT5而非STAT5在CML细胞中结合Hsp90(图8b)，所以我们假设活化的STAT5的细胞水平是通过直接结合于Hsp90来微调。
STAT的活化/失活循环需要其在不同的二聚体构象之间转变。STAT的磷酸化在反平行二聚体构象时发生，所述构象在磷酸化时触发平行二聚体构象。另一方面，STAT的去磷酸化需要广泛的空间再定向，即酪氨酸磷酸化的STAT二聚体必须从平行配置转变为反平行配置以暴露磷酸化酪氨酸作为磷酸酶的较好靶(林(Lim)和曹(Cao),2006)。我们发现STAT5在结合于Hsp90时更易受到胰蛋白酶裂解(图8c)，从而表明Hsp90的结合直接调节STAT5的构象状态，可能保持STAT5呈不利于去磷酸化和/或有利于磷酸化的构象。
为研究这一可能性，我们使用脉冲追踪策略，其中将原钒酸盐(Na3VO4)(一种非特异性PTP酶抑制剂)加入细胞中以阻断STAT5的去磷酸化。然后在稍后数个时间点测定p-STAT5的残余水平(图8d)。在PU-H71不存在下，p-STAT5快速积累，而在PU-H71存在下，细胞p-STAT5水平减少。这种方法的动力学(图8d)类似于p-STAT5稳态降低的速率(图8a，左，PU-H71)。
Hsp90维持呈活性构象的STAT5直接在含有STAT5的转录复合物中
除STAT5磷酸化和二聚化以外，STAT5的生物活性需要其核移位和直接结合于其各种靶基因(德格如特等人,1999；林和曹,2006)。因此，我们想知道Hsp90是否也可有助于STAT5基因的转录活化，并因此参与启动子相关的STAT5转录复合物。使用基于ELISA的分析，我们发现STAT5(图8e)在K562细胞中具有组成性活性并结合于STAT5结合一致序列(5'-TTCCCGGAA-3')。STAT5活化和DNA结合在用PU-H71抑制Hsp90时以剂量依赖性方式被部分消除(图8e)。此外，在K562细胞中的定量ChIP分析揭露在关键STAT5靶MYC和CCND2上存在Hsp90与STAT5两者(图8f)。两蛋白质都不存在于基因间控制区中(未图示)。因此，PU-H71(1μM)降低STAT5靶基因CCND2、MYC、CCND1、BCL-XL和MCL1(卡察夫,2007)，而非对照组基因HPRT和GAPDH(图8g和未图示)的mRNA丰度。
总体来说，这些数据显示在CML细胞中STAT5活性积极地由Hsp90调节(图8h)。我们的发现与结合于STAT5的Hsp90可调节蛋白质构象的情况一致，并且通过这一机制，其改变STAT5磷酸化/去磷酸化动力学，从而使平衡向水平增加的p-STAT5位移。另外，Hsp90维持呈活性构象的STAT5直接在含有STAT5的转录复合物中。然而，考虑到STAT路径的复杂性，无法排除其它潜在机制。因此，除其在促进蛋白质稳定性中的作用以外，Hsp90通过维持呈活性配置的客户蛋白而促进肿瘤形成。
更广泛地说，数据表明其为细胞Hsp90中与支持肿瘤细胞中的致癌蛋白功能最密切有关的PU-H71-Hsp90部分，并且可使用PU-H71-Hsp90蛋白质组鉴别维持特定肿瘤细胞中的恶性表型所需的具有广泛代表性的蛋白质路径(图9)。
讨论
现应了解，维持肿瘤细胞存活所需的许多蛋白质在其编码序列中可能不呈现突变，但鉴别这些蛋白质对于了解个别肿瘤如何起作用仍极其重要。全基因组突变研究可能不鉴别这些致癌蛋白，因为突变对于许多基因来说并不是支持肿瘤细胞存活所需的(例如多发性骨髓瘤中的IRF4和B细胞淋巴瘤中的BCL6)(瑟池特等人,2009)。例如RNAi筛选的高度复杂、昂贵和大规模的方法已成为用于鉴别各种肿瘤中的致癌蛋白的补体的主要手段(宏恩(Horn)等人,2010)。我们在本文中呈现一种快速并简单的用于调查肿瘤致癌蛋白而不考虑其是否突变的化学蛋白质组学方法(图9)。所述方法利用PU-H71的数种性质，PU-H71i)优先结合于Hsp90中与致癌客户蛋白相关的部分，并且ii)锁定呈致癌客户结合配置的Hsp90。同时，这些特征极大地有助于通过质谱法对肿瘤相关蛋白客户进行化学亲和性纯化(图9)。我们提出，这种方法提供一种肿瘤逐一剖析独特癌症的损伤特征的有效工具。由于纯化并富集异常蛋白质群体作为PU-珠粒结合的Hsp90复合物的一部分的初始化学沉淀步骤，因此所述方法不需要对样品进行昂贵的SILAC标记或2-D凝胶分离。反而，简单地以SDS缓冲液洗脱来自PU-珠粒沉降物的货物蛋白，提交标准SDS-PAGE，然后提取分离的蛋白质并以胰蛋白酶处理用于LC/MS/MS分析。
虽然这种方法呈现一种鉴别维持肿瘤细胞的恶性表型的致癌蛋白的独特方法，但需要意识到，类似于其它化学蛋白质组学或基于抗体的蛋白质组学技术，其也具有潜在局限性(里克斯(Rix)和苏普替法噶(Superti-Furga),2009)。举例来说，“粘性”或丰富蛋白质也可以无差别对待方式结合于通过PU-H71珠粒分离的蛋白质。数个研究者将所述蛋白质按目录分类(崔克尔-穆卡伊(Trinkle-Mulcahy)等人,2008)，而且我们已通过如下清楚了解使用这些列表将其从沉降物中消除：这些蛋白质中的一些可能实际上是真的Hsp90客户。其次，虽然我们已呈现数条证据证明PU-H71对于Hsp90具有特异性(图11；塔尔多内和池欧斯,2009)，但必须也认为在珠粒上存在的高浓度的PU-H71下，药物与少量蛋白质的非特异性和直接结合是不可避免的。
尽管存在先前段落中所描述的潜在局限性，但我们已使用这种方法对CML中Hsp90促进的异常信号传导路径进行了首次全面评估。通过PU-H71亲和纯化鉴别的Hsp90相互作用组(interactome)与充分表征的CML信号体明显重叠(图6a)，从而表明这种方法能够鉴别大部分确定这种形式白血病的分子基础的路径和蛋白质的复杂网络。我们提出，为了鉴别驱动个别肿瘤中的恶性表型的异常信号传导网络，PU-H71化学蛋白质组学分析可以扩展到其它形式的癌症(图9)。举例来说，我们在本文中进一步表明，如何使用所述方法鉴别MDA-MB-468三阴性乳癌细胞、MiaPaCa2胰脏癌细胞和OCI-LY1弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞中的异常蛋白质网络。
因为单一药剂疗法在癌症中不可能具有治愈性，所以有必要设计合理的组合性疗法方法。致癌Hsp90骨架信号传导网络的蛋白质组鉴别可鉴别可使用特异性小分子抑制剂进一步靶向的其它致癌蛋白。实际上，通过我们的方法鉴别为造成K562CML细胞转化并且是个别网络(图6b，黄色盒子)上的钥匙节点蛋白的mTOR和CAMKII的抑制剂具有作为单一药剂的活性(图7a)并且与Hsp90抑制协同影响这些白血病细胞的生长(图21)。
当应用于表征不充分的肿瘤类型时，PU-H71化学蛋白质组学可提供用于组合性疗法的不太明显并更有力的候选靶。我们在MDA-MB-468三阴性乳癌细胞、MiaPaCa2胰脏癌细胞和OCI-LY1弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞中举例说明这一观念。
在三阴性乳癌细胞系MDA-MB-468中，通过所述方法鉴别的主要信号传导网络是PI3K/AKT、IGF-IR、NRF2介导的氧化应激反应、MYC、PKA和IL-6信号传导路径(图22)。如通过所述方法鉴别的路径组分列于表3中。
表3.
PI3K-AKT-mTOR路径
磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3kinase，PI3K)是一个脂类激酶家族，其肌醇脂类产物在细胞因子、生长因子和其它细胞外基质蛋白的信号转导路径中起重要作用。PI3K分为三类：I类、II类和III类，其中I类是研究最充分的。其为由催化和调节亚单位组成的杂二聚体。这些物质中最常见到的是p110和p85。由I类PI3K使磷酸肌醇(4,5)二磷酸(PIP2)磷酸化可产生PtdIns(3,4,5)P3。不同的PI3k与各种信号传导路径有关。这是通过其与如受体酪氨酸激酶(RTK)、衔接分子GAB1-GRB2和激酶JAK的分子相互作用来介导的。这些物质集中在一起以活化PDK1，然后使AKT磷酸化。AKT遵循两个独特路径：1)抑制作用-举例来说，AKT通过使Bad/Bcl-XL复合物的Bad组分磷酸化来抑制细胞凋亡，从而允许细胞存活。2)活化作用-AKT活化IKK，从而导致NF-κB活化和细胞存活。通过其抑制以及活化作用，AKT与如能量贮存、细胞周期进程、蛋白质合成和血管生成的许多细胞过程有关。
这一路径由以下各物构成，但不限于以下各物：1-磷脂酰基-D-肌醇4,5-二磷酸、14-3-3、14-3-3-Cdkn1b、Akt、BAD、BCL2、BCL2L1、CCND1、CDC37、CDKN1A、CDKN1B、瓜氨酸、CTNNB1、EIF4E、EIF4EBP1、ERK1/2、FKHR、GAB1/2、GDF15、肝糖合成酶、GRB2、Gsk3、Ikb、IkB-NfkB、IKK(复合物)、ILK、整合素、JAK、L-精氨酸、LIMS1、MAP2K1/2、MAP3K5、MAP3K8、MAPK8IP1、MCL1、MDM2、MTOR、NANOG、NFkB(复合物)、氧化氮、NOS3、P110、p70S6k、PDPK1、磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸、PI3K p85、PP2A、PTEN、PTGS2、RAF1、Ras、RHEB、SFN、SHC1(包括EG:20416)、SHIP、Sos、THEM4、TP53(包括EG:22059)、TSC1、Tsc1-Tsc2、TSC2、YWHAE。
IGF-IR信号传导网络
***-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)是一种受生长激素控制的肽激素。IGF-1促进细胞增殖、生长和存活。六种特异性结合蛋白，IGFBP 1-6允许对IGF活性进行更有细微差别的控制。IGF-1受体(IGF-IR)是一种跨膜酪氨酸激酶蛋白。IGF-1诱导性受体活化导致自体磷酸化，随后活化下游路径的能力增强。活化的IGF-IR使SHC和IRS-1磷酸化。SHC以及衔接分子GRB2和SOS形成活化Ras/Raf/MEK/ERK路径的信号传导复合物。ERK移位到核可导致转录调节因子ELK-1、c-Jun和c-Fos的活化，所述转录调节因子诱导促进细胞生长和分化的基因。IRS-1通过PI3K/PDK1/AKT/BAD路径活化细胞存活路径。IRS-1还通过PI3K/PDKl/p70RSK路径活化细胞生长路径。IGF-1也通过诱导JAK-1、JAK-2和STAT-3的酪氨酸磷酸化而通过JAK/STAT路径传导信号。SOCS蛋白能够抑制JAK，由此抑制这一路径。衔接蛋白GRB10与IGF-IR相互作用。GRB10还结合E3泛素接合酶NEDD4并促进配体刺激的IGF-IR的泛素化、内化和降解作为长期信号传导减弱的手段。
这一路径由以下各物构成，而非限于以下各物：1-磷脂酰基-D-肌醇4,5-二磷酸、14-3-3、14-3-3-Bad、Akt、非典型蛋白激酶C、BAD、CASP9(包括EG:100140945)、Ck2、ELK1、ERK1/2、FKHR、FOS、GRB10、GRB2、IGF1、Igf1-Igfbp、IGF1R、Igfbp、IRS1/2、JAK1/2、JUN、MAP2K1/2、MAPK8、NEDD4、p70S6k、PDPK1、磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸、PI3K(复合物)、Pka、PTK2(包括EG:14083)、PTPN11、PXN、RAF1、Ras、RASA1、SHC1(包括EG:20416)、SOCS、SOCS3、Sos、SRF、STAT3、Stat3-Stat3。
NRF2介导的氧化应激反应
氧化应激是由活性氧的产生与活性中间物的解毒之间的不平衡引起的。例如过氧化物和自由基的活性中间物可对细胞的许多部分(例如蛋白质、脂类和DNA)极具破坏性。严重氧化应激可触发细胞凋亡和坏死。氧化应激与例如动脉粥样硬化、帕金森氏病(Parkinson's disease)和阿尔茨海默病的许多疾病有关。氧化应激也与老化有关。细胞对氧化应激的防御反应包括诱导去毒酶和抗氧化酶。核因子-红细胞系2相关因子2(nuclearfactor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)结合于这些酶的启动子内的抗氧化剂反应元件(antioxidant response element，ARE)并且激活其转录。非活性Nrf2通过与肌动蛋白结合蛋白Keap1缔合而保留在细胞质中。在使细胞暴露于氧化应激时，Nrf2响应于蛋白激酶C、磷脂酰肌醇3-激酶和MAP激酶路径而磷酸化。磷酸化后，Nrf2移位到核，结合ARE并转移活化去毒酶和抗氧化酶，例如谷胱甘肽S-转移酶、细胞色素P450、NAD(P)H醌氧化还原酶、血红素加氧酶和超氧化歧化酶。
这一路径由以下各物构成，但不限于以下各物：ABCC1、ABCC2、ABCC4(包括EG:10257)、肌动蛋白、肌动蛋白-Nrf2、Afar、AKR1A1、AKT1、AOX1、ATF4、BACH1、CAT、Cbp/p300、CBR1、CCT7、CDC34、CLPP、CUL3(包括EG:26554)、Cul3-Roc1、Cyp1a/2a/3a/4a/2c、EIF2AK3、ENC1、EPHX1、ERK1/2、ERP29、FKBP5、FMO1(包括EG:14261)、FOS、FOSL1、FTH1(包括EG:14319)、FTL、GCLC、GCLM、GPX2、GSK3B、GSR、GST、HERPUD1、HMOX1、Hsp22/Hsp40/Hsp90、JINK1/2、Jnkk、JUN/JUNB/JUND、KEAP1、Keap1-Nrf2、MAF、MAP2K1/2、MAP2K5、MAP3K1、MAP3K5、MAP3K7(包括EG:172842)、MAPK14、MAPK7、MKK3/6、肌腱膜纤维肉瘤致癌基因、NFE2L2、NQO、PI3K(复合物)、Pkc(s)、PMF1、PPIB、PRDX1、Psm、PTPLAD1、RAF1、Ras、RBX1、活性氧物质、SCARB1、SLC35A2、Sod、SQSTM1、STIP1、TXN(包括EG:116484)、TXNRD1、UBB、UBE2E3、UBE2K、USP14、VCP。
蛋白激酶A信号传导路径
蛋白激酶A(PKA)调节如生长、发育、记忆和代谢般不同的过程。其以两个催化亚单位(PKA-C)和一个调节(PKA-R)亚单位二聚体的四聚复合物形式存在。II型PKA通过AKAP锚定到细胞内的特定位置。例如神经递质、激素、发炎性刺激、应激、肾上腺素和去甲肾上腺素的细胞外刺激通过例如GPCR和ADR-α/β的受体活化G蛋白。这些受体以及例如CRHR、GcgR和DCC的其它受体负责cAMP积累，从而导致PKA活化。ATP转化为cAMP是由9种跨膜AC酶和一种可溶性AC介导的。跨膜AC是受杂三聚G蛋白Gαs、Gαq和Gαi调节。Gαs和Gαq活化AC，而Gαi抑制AC。Gβ和Gγ亚单位与Gαs和Gαq发挥协同作用以活化ACII、IV和VII。然而，β和γ亚单位以及Gαi抑制ACI、V和VI的活性。
G蛋白通过活化PLC而间接影响cAMP信号传导，从而产生DAG和IP3。DAG转而又活化PKC。IP3调节cAMP信号传导上游的蛋白质并通过IP3R从ER释放Ca2+。CaCn和CNG也释放Ca2+。Ca2+释放活化钙调素、CamKKs和CamKs，其通过活化ACI而参与cAMP调节。Gα13通过两个非依赖性路径活化MEKK1和RhoA，所述路径诱导IκBα的磷酸化和降解以及PKA的活化。在如低氧、局部缺血和热休克的应激条件下高水平的cAMP也会直接活化PKA。TGF-β通过SMAD蛋白的磷酸化而活化PKA而与cAMP无关。PKA使受磷蛋白磷酸化，受磷蛋白调节SERCA2的活性，导致心肌收缩，而TnnI的磷酸化介导舒张。PKA还活化KDELR以促进蛋白质修复，由此维持细胞的稳态。Ca2+浓度增加、随后PKA活化可增强eNOS活性，其为心血管内稳定所必需的。活化的PKA通过抑制Raf1来抑制ERK活化。PKA抑制14-3-3蛋白与BAD和NFAT的相互作用以促进细胞存活。PKA使内皮MLCK磷酸化，从而导致基础MLC磷酸化降低。其也使细丝蛋白、内收蛋白、桩蛋白和FAK磷酸化并且与应力纤维的消失和膜褶皱中的F-肌动蛋白积累有关。PKA还通过使特定PPtase1抑制剂DARPP32磷酸化来控制磷酸酶活性。PKA的其它底物包括组蛋白H1、组蛋白H2B和CREB。
这一路径由以下各物构成，但不限于以下各物：1-磷脂酰基-D-肌醇4,5-二磷酸、14-3-3、ADCY、ADCY1/5/6、ADCY2/4/7、ADCY9、内收蛋白、AKAP、APC、ATF1(包括EG:100040260)、ATP、BAD、BRAF、Ca2+、钙调神经磷酸酶蛋白、钙调素、CaMKII、CHUK、Cng通道、Creb、CREBBP、CREM、CTNNB1、环状AMP、DCC、二酰基甘油、ELK1、ERK1/2、细丝蛋白、粘着斑激酶、G蛋白α、G蛋白βγ、G蛋白β、G蛋白γ、GLI3、肝糖、肝糖磷酸化酶、肝糖合成酶、GNA13、GNAQ、GNAS、GRK1/7、Gsk3、Hedgehog、组蛋白H1、组蛋白h3、Ikb、IkB-NfkB、肌醇三磷酸、ITPR、KDELR、LIPE、MAP2K1/2、MAP3K1、Mlc、肌球蛋白轻链激酶、肌球蛋白2、Nfat(家族)、NFkB(复合物)、NGFR、NOS3、NTN1、Patched、Pde、Phk、Pka、Pka催化亚单位、PKAr、Pkc(s)、PLC、PLN、PP1蛋白复合物群组、PPP1R1B、PTP酶、PXN、RAF1、Rap1、RHO、RHOA、Rock、Ryr、SMAD3、Smad3-Smad4、SMAD4、SMO、TCF/LEF、Tgfβ、Tgfβ受体、TGFBR1、TGFBR2、TH、Tni、VASP。
IL-6信号传导路径
IL-6在发炎中的主要作用使其成为控制与癌症相关的发炎的重要靶。IL-6反应是通过糖蛋白130(GP130)传输，糖蛋白130充当所有IL-6相关细胞因子的通用信号转导受体亚单位。IL-6型细胞因子利用杰纳斯激酶(Janus Kinase，JAK)家族的酪氨酸激酶和信号转导因子和转录活化因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)家族作为信号转导的主要介体。在由IL-6刺激受体时，与GP130相关的JAK家族的激酶受到活化，从而导致GP130磷酸化。GP130的数个磷酸酪氨酸残基充当STAT因子(主要是STAT3和STAT1)的停泊位点。随后，使STAT磷酸化，形成二聚体并移位到核，在核中其调节靶基因的转录。除JAK/STAT信号转导路径以外，IL-6也活化有丝***原活化蛋白激酶(MAPK)路径的细胞外信号调节激酶(ERK1/2)。ERK1/2的上游活化因子包括RAS和含有src同源性-2的蛋白GRB2和SHC。SHC蛋白是由JAK2活化且因此充当IL-6活化的JAK/STAT和RAS-MAPK路径之间的纽带。MAPK响应于IL-6活化的RAS的磷酸化导致核因子IL-6(NF-IL6)活化，其转而又刺激IL-6基因的转录。IL-6基因的转录也通过活化核因子κB(NFκB)由肿瘤坏死因子(tumornecrosis factor，TNF)和白细胞介素-1(IL-1)刺激。
基于本文所描述的方法在MDA-MB-468细胞中的发现，提出这些所鉴别的路径的组分的抑制剂在与Hsp90抑制剂组合使用时是有效的，所述抑制剂例如那些靶向(但不限于)AKT、mTOR、PI3K、IGF1R、IKK、Bcl2、PKA复合物、磷酸二酯酶的抑制剂。
AKT抑制剂的实例是PF-04691502、磷酸曲西立滨(Triciribine phosphate)(NSC- 280594)、A-674563、CCT128930、AT7867、PHT-427、GSK690693、MK-2206。
PI3K抑制剂的实例是2-(1H-吲唑-4-基)-6-(4-甲烷磺酰基哌嗪-1-基甲基)-4-吗啉-4-基噻吩并(3,2-d)嘧啶(2-(lH–indazol–4-yl)-6-(4–methanesulfonylpiperazin–l-ylmethyl)–4–morpholin-4-ylthieno(3,2-d)pyrimidine)、BKM120、NVP-BEZ235、PX-866、SF1126、XL147。
mTOR抑制剂的实例是德福莫司、依维莫司、NVP-BEZ235、OSI-027、他克莫司、替罗莫司、Ku-0063794、WYE-354、PP242、OSI-027、GSK2126458、WAY-600、WYE-125132。
Bcl2抑制剂的实例是ABT-737、奥巴妥拉克斯(Obatoclax)(GX15-070)、ABT-263、TW-37。
IGF1R抑制剂的实例是NVP-ADW742、BMS-754807、AVE1642、BIIB022、西妥木单抗(cixutumumab)、甘尼妥单抗(ganitumab)、IGF1、OSI-906。
JAK抑制剂的实例是柠檬酸他菲替尼(Tofacitinib citrate)(CP-690550)、AT9283、AG-490、INCB018424(鲁索利替尼(Ruxolitinib))、AZD1480、LY2784544、NVP-BSK805、TG101209、TG-101348。
IkK抑制剂的实例是SC-514、PF 184。
磷酸二酯酶抑制剂的实例是氨茶碱(aminophylline)、阿那格雷(anagrelide)、阿罗茶碱(arofylline)、咖啡碱(caffeine)、西洛司特(cilomilast)、双嘧达莫(dipyridamole)、喘定(dyphylline)、L 869298、L-826,141、米力农(milrinone)、***、己酮可可碱(pentoxifylline)、罗氟司特(roflumilast)、咯利普兰(rolipram)、替托司特(tetomilast)、茶碱(theophylline)、甲苯磺丁脲(tolbutamide)、氨利酮(amrinone)、阿那格雷(anagrelide)、阿罗茶碱(arofylline)、咖啡碱、西洛司特、L 869298、L-826,141、米力农、己酮可可碱、罗氟司特、咯利普兰、替托司特。
在弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系OCI-LY1中，通过所述方法所鉴别的主要信号传导网络是B细胞受体、PKCteta、PI3K/AKT、CD40、CD28和ERK/MAPKL信号传导路径(图23)。如通过所述方法鉴别的路径组分列于表4中。
表4.
B细胞受体信号传导
通过B细胞抗原受体(B cell antigen receptor，BCR)传送的信号对于B淋巴细胞的发育、存活和活化是至关重要的。这些信号也在去除可能自体反应性B淋巴细胞中起重要作用。BCR由识别表面结合抗原的膜抗体和相关Ig-α和Ig-β杂二聚体构成，所述杂二聚体能够通过称为基于免疫受体酪氨酸的活化基元(immunoreceptor tyrosine basedactivation motif，ITAM)的细胞溶质基元进行信号转导。B细胞抗原受体(BCR)识别多价抗原可引发一系列互连信号传导事件，其以细胞反应而终结。BCR的啮合诱导ITAM中的酪氨酸残基的磷酸化。ITAM的磷酸化是由SYK激酶和SRC家族激酶(包括LYN、FYN和BLK)介导的。由磷酸化的ITAM相互活化的这些激酶转而又触发互连信号传导路径的级联反应。BCR的活化导致核因子κB(NFκB)受到刺激。由NF-kB进行的BCR信号传导的核心是由布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)、衔接蛋白B细胞连接子(adaptor B-cell linker，BLNK)和磷脂酶Cγ2(PLCγ2)所形成的复合物。酪氨酸磷酸化衔接蛋白充当BCR相关酪氨酸激酶与下游效应分子之间的桥梁。BLNK是在BCR活化时磷酸化的并且用来使酪氨酸激酶SYK与PLCγ2的活化耦联。由BTK促使PLCγ2受到完全刺激。受到刺激的PLCγ2触发DAG和Ca2+介导的蛋白激酶活化(PKC)，其转而又活化IkB激酶(IKK)和随后的NFκB。除NFκB的活化以外，BLNK也与如VAV和GRB2的其它蛋白质相互作用，导致有丝***原活化蛋白激酶(MAPK)路径的活化。这导致如c-JUN的数种因子的转移活化、转录活化因子(ATF)和ELK6的活化。另一种衔接蛋白，磷酸肌醇3-激酶的B细胞衔接蛋白(PI3K)(称为BCAP)一旦由SYK活化，则触发PI3K/AKT信号传导路径。这一路径抑制肝糖合成酶激酶3(GSK3)，导致如活化T细胞核因子(nuclear factor of activated Tcell，NFAT)的转录因子的核积累和蛋白质合成的增强。PI3K/AKT路径的活化也导致B细胞凋亡的抑制。这一路径强调B细胞受体抗原信号传导的重要组分。
这一路径由以下各物构成，但不限于以下各物：1-磷脂酰基-D-肌醇4,5-二磷酸、ABL1、Akt、ATF2、BAD、BCL10、Bcl10-Card10-Malt1、BCL2A1、BCL2L1、BCL6、BLNK、BTK、钙调素、CaMKII、CARD10、CD19、CD22、CD79A、CD79B、Creb、CSK、DAPP1、EGR1、ELK1、ERK1/2、ETS1、Fcgr2、GAB1/2、GRB2、Gsk3、Ikb、IkB-NfkB、IKK(复合物)、JINK1/2、Jnkk、JUN、LYN、MALT1、MAP2K1/2、MAP3K、MKK3/4/6、MTOR、NFAT(复合物)、NFκB(复合物)、P38MAPK、p70S6k、PAG1、磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸、PI3K(复合物)、PIK3AP1、PKC(β,θ)、PLCG2、POU2F2、Pp2b、PTEN、PTPN11、PTPN6、PTPRC、Rac/Cdc42、RAF1、Ras、SHC1(包括EG:20416)、SHIP、Sos、SYK、VAV。
PKCteta路径
有效免疫反应依赖于特殊化白细胞鉴别外来分子并通过分化作出反应成为成熟效应细胞的能力。细胞表面抗原识别装置和复杂细胞内受体耦联信号转导机构介导这一紧密调节过程，其在高保真下操作以将自体抗原和非自体抗原区别开来。T细胞的活化需要TCR与MHC呈现肽抗原的持续实体相互作用，其导致T细胞-APC接触区域(一种称为免疫突触或超分子活化簇的特殊化区域)的多种细胞分子元件的暂时空间重组。最新研究已将PKCθ(Ca非依赖性PKC家族的成员)鉴别为T细胞超分子活化簇的基本组分，其介导TCR信号传导中的数种关键功能，导致通过IL-2基因诱导使细胞活化、分化和存活。高水平的PKCθ是在骨骼肌和淋巴组织中，主要在胸腺和***中表达，其中在脾中表达水平较低。T细胞构成用于PKCθ表达的初级位置。在T细胞中，发现CD4+/CD8+单阳性周边血液T细胞和CD4+/CD8+双阳性胸腺细胞表达高水平的PKCθ。在T细胞表面上，TCR/CD3啮合诱导Src、Syk、ZAP70和Tec家族PTK的活化，导致PLCγ1、PI3K和Vav受到刺激和膜募集。依赖于Rac和肌动蛋白细胞骨架重组以及PI3K的Vav介导路径负责将PKCθ选择性募集到超分子活化簇。产生PLCγ1的DAG也在PKCθ的初始募集中起作用。转录因子NF-κB和AP-1是PKCθ的初级生理学靶。由PKCθ对这些转录因子的有效活化需要整合TCR和CD28协同刺激信号。在APC上具有CD80/CD86(B7-1/B7-2)配体的CD28是将PKCθ特定地募集到超分子活化簇所需的。充当TCR/CD28协同刺激靶的转录元件是IL-2启动子中的CD28RE。CD28RE是NF-κB和AP-1的组合性结合位点。最新研究提出，通过PKCθ调节TCR与NF-κB的耦联是受各种独特机制影响的。PKCθ可与IKK复合物直接缔合并调节IKK复合物；PKCθ可通过CaMKII间接调节IKK复合物；其可在涉及BCL10和MALT1的最新描述的路径的上游起作用，其同时通过IKK复合物调节NF-κB和IκB。已发现PKCθ促进活化诱导性T细胞死亡(Activation-induced T cell death，AICD)，其为一种限制活化抗原特异性T细胞扩增并确保一旦特定病原体已清除则结束免疫反应的重要过程。酶促活性PKCθ与钙调神经磷酸酶选择性协同作用以活化卡斯蛋白酶(caspase)8介导的Fas/FasL依赖性AICD。CD28协同刺激在TCR介导的IL-2制备中起主要作用，并且在其不存在时T细胞进入称为无效能的无反应性稳定状态。PKCθ介导的CREB磷酸化和其随后结合于IL-2启动子中的cAMP反应元件不利地调节IL-2转录，由此驱动反应性T细胞进入无效能状态。PKCθ在T细胞中的选择性表达和其在成熟T细胞活化中的主要作用使其成为用于移植和自体免疫疾病中的免疫抑制的具有吸引力的药物靶。
这一路径由以下各物构成，但不限于以下各物：Ap1、BCL10、Bcl10-Card11-Malt1、钙调神经磷酸酶蛋白、CaMKII、CARD11、CD28、CD3、CD3-TCR、CD4、CD80(包括EG:12519)、CD86、二酰基甘油、ERK1/2、FOS、FYN、GRAP2、GRB2、Ikb、IkB-NfkB、Ikk(家族)、IL2、肌醇三磷酸、JUN、LAT、LCK、LCP2、MALT1、MAP2K4、MAP3K、MAPK8、II类MHC(复合物)、Nfat(家族)、NFkB(复合物)、佛波醇豆蔻酸酯乙酸酯、PI3K(复合物)、PLCγ、POU2F1、PRKCQ、Rac、Ras、Sos、TCR、VAV、电压门控钙通道、ZAP70。
CD40信号传导
CD40是将存活信号传送到B细胞的肿瘤坏死因子超家族细胞表面受体的成员。在配体结合时，由细胞表面CD40引起的典型信号传导遵循需要细胞质衔接蛋白(称为TNF受体相关因子[TRAF]，其由脂类筏中的CD40募集)和IKK复合物的多级级联反应。通过NF-κB活化，CD40信号体活化与B细胞生长和存活有关的多种基因的转录。因为CD40信号体在侵袭性淋巴瘤中具有活性并且促使肿瘤生长，所以正在设计针对CD40的免疫治疗性策略并且目前在临床试验中进行测试(拜耳(Bayes)2007和费娜莉(Fanale)2007)。
CD40介导的信号转导诱导与针对病原体的宿主防御有关的许多基因的转录。这是通过多个路径(包括NF-κB、MAPK和STAT3)的活化来完成的，所述路径通过活化c-Jun、ATF2和Rel转录因子来调节基因表达。CD40L的受体聚集是通过配体与p53缔合、ASM移位到质膜、ASM活化和神经酰胺形成来介导的。神经酰胺用来使CD40L和数种TRAF蛋白(包括TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF5和TRAF6)与CD40聚集。TRAF2、TRAF3和TRAF6直接结合于CD40。TRAF1不直接结合CD40，但通过与TRAF2杂二聚化而募集到膜微域。类似于TRAF1的募集，TRAF5也以TRAF3依赖性方式间接募集到CD40。Act1将TRAF蛋白连接于TAK1/IKK以活化NF-κB/I-κB，并连接于MKK复合物以活化JNK、p38MAPK和ERK1/2。NIK也在活化IKK中起主导作用。Act1依赖性CD40介导的NF-κB活化保护细胞以防CD40L诱导的细胞凋亡。在用CD40L或其它发炎性介体刺激时，I-κB蛋白由IKK磷酸化并且NF-κB是通过Act1-TAK1路径活化的。然后磷酸化的I-κB快速泛素化并降解。释放的NF-κB移位到核并激活转录。由TNF诱导的A20抑制NF-κB活化以及TNF介导的细胞凋亡。TRAF3启动信号传导路径，导致p38和JNK的活化，但抑制Act1依赖性CD40介导的NF-κB活化并引发CD40L诱导的细胞凋亡。TRAF2是活化SAPK路径所需的，而且也在CD40介导的表面上调、B细胞中的IgM分泌和ICAM1上调中起作用。由CD40L接合CD40可刺激人类近端小管细胞的原代培养物中的MCP1和IL-8产生，并且这主要是通过TRAF6的募集和ERK1/2、SAPK/JNK和p38MAPK路径的活化来进行的。SAPK/JNK和p38MAPK路径的活化是由TRAF6介导的，而ERK1/2活性可能是由其它TRAF成员介导的。然而，所有三种MAPK路径的刺激都是MCP1和IL-8产生所需的。通过CD40刺激活化的其它路径包括JAK3-STAT3和PI3K-Akt路径，其有助于CD40L赋予B细胞的抗细胞凋亡性质。CD40直接结合于JAK3并且介导STAT3活化，随后介导ICAM1、CD23和LT-α的上调。
这一路径由以下各物构成，但不限于以下各物：Act1、Ap1、ATF1(包括EG:100040260)、CD40、CD40LG、ERK1/2、FCER2、Iκb激酶、ICAM1、Ikb、IkB-NfkB、JAK3、Jnk、LTA、MAP3K14、MAP3K7(包括EG:172842)、MAPKAPK2、Mek、NFkB(复合物)、P38MAPK、PI3K(复合物)、STAT3、Stat3-Stat3、TANK、TNFAIP3、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF5、TRAF6。
CD28信号传导路径
CD28是TCR/CD3的共受体并且是主要阳性协同刺激分子。在与CD80和CD86接合时，CTLA4提供用于结束活化的阴性协同刺激信号。此外，CD28与I类调节PI3K结合可将PI3K募集到膜，导致产生PIP3并将含有普列克底物蛋白同源性域的蛋白质(例如PIK3C3)募集到质膜。PI3K是活化Akt所需的，其转而又调节许多下游靶以促进细胞存活。除NFAT以外，NF-κB在IL-2启动子和抗细胞凋亡因子的转录调节中具有关键作用。为此，PLC-γ利用PIP2作为底物来产生IP3和DAG。IP3引起通过IP3R释放Ca2+，并且DAG活化PKC-θ。在RLK、PLC-γ和Ca2+的影响下；PKC-θ通过直接以及间接相互作用来调节IKK复合物的磷酸化状态。此外，CARMA1的活化使BCL10磷酸化并使MALT1二聚化，这是足以活化IKK的事件。IL-2启动子中的两种CD28反应性元件具有NF-κB结合位点。NF-κB二聚体通常通过结合于抑制I-κB而保留在细胞质中。I-κB的磷酸化引发其泛素化和降解，由此释放NF-κB以移位到核。同样，由于钙调素-钙调神经磷酸酶相互作用而使NFAT移位到核有效地促进IL-2表达。通过TCR-CD28-PI3K信号传导活化Vav1将CD28与Rac和CDC42的活化关联，并且这可增强TCR-CD3-CD28介导的细胞骨架再组织化。Rac调节肌动蛋白聚合以驱动板状足突起(lamellipodial protrusion)和膜边缘波动(membrane ruffling)，而CDC42产生极性并诱导丝状伪足(filopodia)和微端丝(microspike)的形成。CDC42和Rac GTP酶(GTPase)依序起活化下游效应物(如WASP和PAK1)以诱导ARP活化并导致细胞骨架重排的作用。CD28通过MEKK1、MKK和JNK的后续活化来影响Rac/PAKl介导的IL-2转录。JNK使c-Jun和c-Fos磷酸化并活化，其为IL-2转录所必需的。通过CD28进行信号传导促使细胞因子IL-2mRNA产生和进入细胞周期、T细胞存活、T辅助细胞分化和免疫球蛋白同型转换。
这一路径由以下各物构成，但不限于以下各物：1,4,5-IP3、1-磷脂酰基-D-肌醇4,5-二磷酸、Akt、Ap1、Arp2/3、BCL10、Ca2+、钙调神经磷酸酶蛋白、钙调素、CARD11、CD28、CD3、CD3-TCR、CD4、CD80(包括EG:12519)、CD86、CDC42、CSK、CTLA4、二酰基甘油、FOS、FYN、GRAP2、GRB2、Ikb、IkB-NfkB、IKK(复合物)、IL2、ITK、ITPR、Jnk、JUN、LAT、LCK、LCP2、MALT1、MAP2K1/2、MAP3K1、II类MHC(复合物)、Nfat(家族)、NFkB(复合物)、PAK1、PDPK1、磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸、PI3K(复合物)、PLCG1、PRKCQ、PTPRC、RAC1、SHP、SYK、TCR、VAV1、WAS、ZAP70。
ERK-MAPK路径
ERK(细胞外调节激酶)/MAPK(有丝***原活化蛋白激酶)路径是转导关于细胞内的减数***/有丝***、生长、分化和癌发生的细胞信息的关键路径。膜结合受体酪氨酸激酶(RTK)常常是生长因子受体，是这一路径的起点。配体与RTK结合活化RTK的固有酪氨酸激酶活性。如生长因子受体结合蛋白2(growth factor receptor bound protein 2，GRB2)、无七之子(son of sevenless，SOS)和Shc的衔接分子在酪氨酸磷酸化RTK上形成信号传导复合物并活化Ras。活化的Ras引发激酶级联反应，以活化MEK(MAPK激酶)并使其磷酸化的Raf(MAPK激酶激酶)开始；MEK活化ERK(MAPK)并使其磷酸化。细胞质内的ERK可使各种靶磷酸化，包括细胞骨架蛋白、离子通道/受体和翻译调节因子。ERK也移位到核内，在核内其通过与如ELK-1、STAT-1和-3、ETS和MYC的转录调节因子相互作用来诱导基因转录。细胞质内p90RSK的ERK活化导致其核移位，在核内其通过与转录调节因子CREB、c-Fos和SRF相互作用来间接诱导基因转录。Ras和Raf的RTK活化有时采用替代路径。举例来说，整合素通过FAK介导的路径来活化ERK。ERK也可通过CAS-CRK-Rap1介导的B-Raf活化和ERK的PLCγ-PKC-Ras-Raf活化来活化。
这一路径由以下各物构成，但不限于以下各物：1,4,5-IP3、1-磷脂酰基-D-肌醇4,5-二磷酸、14-3-3(β,γ,θ,η,ζ)、14-3-3(η,θ,ζ)、ARAF、ATF1(包括EG:100040260)、BAD、BCAR1、BRAF、c-Myc/N-Myc、cAMP-Gef、CAS-Crk-DOCK 180、Cpla2、Creb、CRK/CRKL、环状AMP、二酰基甘油、DOCK1、DUSP2、EIF4E、EIF4EBP1、ELK1、ERK1/2、Erk1/2二聚体、ESR1、ETS、FOS、FYN、GRB2、组蛋白h3、Hsp27、整合素、KSR1、LAMTOR3、MAP2K1/2、MAPKAPK5、MKP1/2/3/4、MNK1/2、MOS、MSK1/2、NFATC1、Pak、PI3K(复合物)、Pka、PKC(α,β,γ,δ,ε,ι)、PLCγ、PP1/PP2A、PPARG、PTK2(包括EG:14083)、PTK2B(包括EG:19229)、PXN、Rac、RAF1、Rap1、RAPGEF1、Ras、RPS6KA1(包括EG:20111)、SHC1(包括EG:20416)、Sos、SRC、SRF、Stat1/3、踝蛋白、VRK2。
基于由本文所描述的方法在DLBCL OCI-LY1中的发现，提出这些路径的组分的抑制剂的组合在与Hsp90抑制剂组合使用时是有效的，所述抑制剂例如那些靶向(但不限于)SYK、BTK、mTOR、PI3K、Ikk、CD40、MEK、Raf、JAK、MHC复合物组分、CD80、CD3的抑制剂。
BTK抑制剂的实例是PCI-32765。
SYK抑制剂的实例是R-406、R406、R935788(福他替尼二钠(Fostamatinibdisodium))。
CD40抑制剂的实例是SGN-40(抗huCD40mAb)。
CD28路径的抑制剂的实例是阿巴西普(abatacept)、贝拉塔昔(belatacept)、布利那单抗(blinatumomab)、莫罗莫那(muromonab)-CD3、维西单抗(visilizumab)。
II类主要组织相容性复合物抑制剂的实例是阿泊珠单抗(apolizumab)。
PI3K抑制剂的实例是2-(1H-吲唑-4-基)-6-(4-甲烷磺酰基哌嗪-1-基甲基)-4-吗啉-4-基噻吩并(3,2-d)嘧啶、BKM120、NVP-BEZ235、PX-866、SF 1126、XL147。
mTOR抑制剂的实例是德福莫司、依维莫司、NVP-BEZ235、OSI-027、他克莫司、替罗莫司、Ku-0063794、WYE-354、PP242、OSI-027、GSK2126458、WAY-600、WYE-125132。
JAK抑制剂的实例是柠檬酸他菲替尼(CP-690550)、AT9283、AG-490、INCBO18424(鲁索利替尼)、AZD1480、LY2784544、NVP-BSK805、TGI01209、TG-101348。
IkK抑制剂的实例是SC-514、PF184。
Raf抑制剂的实例是索拉非尼(sorafenib)、维罗非尼(vemurafenib)、GDC-0879、PLX-4720、PLX4032(维罗非尼)、NVP-BHG712、SB590885、AZ628、ZM 336372。
SRC抑制剂的实例是AZM-475271、达沙替尼(dasatinib)、塞卡替尼(saracatinib)。
在MiaPaCa2胰脏癌细胞系中，通过所述方法鉴别的主要信号传导网络是PI3K/AKT、IGF1、细胞周期-G2/M DNA损伤检查点调节、ERK/MAPK和PKA信号传导路径(图24)。
数种网络组分蛋白质之间的相互作用在图16中举例说明。
胰脏腺癌持续是最致命的癌症之一，是美国癌症死亡的第四大主要原因。超过80％的患者在诊断时呈现晚期疾病并且因此不是可能治愈性外科切除术的候选者。自1997年的关键III期试验以来，基于吉西他滨(Gemcitabine)的化学疗法仍旧主要治疗局部晚期或转移性胰脏腺癌。尽管用吉西他滨治疗在晚期胰脏癌患者中可实现显著症状控制，但其反应率仍然较低并且与约6个月的中值存活时间相关。这些结果反映了用于这种肿瘤类型的现有治疗策略的不适宜性，并且需要共同努力地开发用于胰脏癌患者的新的并更有效的疗法。
Pub Med.文献的当前评述、临床试验数据库(clinicaltrials.gov)、美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology，ASCO)和美国癌症研究协会(AmericanAssociation of Cancer Research，AACR)网站得出结论，胰脏癌的分子发病机制涉及多个路径和确定的突变，从而表明这一复杂性是靶向疗法在这种疾病中失败的主要原因。面对调节细胞增殖、存活和转移的活化致癌路径的复杂机制，靶向单一活化分子的疗法因此无法制服众多异常细胞过程，并且在晚期疾病中可能具有有限的治疗性益处。
基于由本文所描述的方法在MiaPaCa2细胞中的发现，提出这些所鉴别的路径的组分的抑制剂的组合在与Hsp90抑制剂组合使用时是有效的，所述抑制剂例如那些靶向(但不限于)AKT、mTOR、PI3K、JAK、STAT3、IKK、Bcl2、PKA复合物、磷酸二酯酶、ERK、Raf、JNK的抑制剂。
AKT抑制剂的实例是PF-04691502、磷酸曲西立滨(NSC-280594)、A-674563、CCT128930、AT7867、PHT-427、GSK690693、MK-2206二盐酸盐。
PI3K抑制剂的实例是2-(1H-吲唑-4-基)-6-(4-甲烷磺酰基哌嗪-1-基甲基)-4-吗啉-4-基噻吩并(3,2-d)嘧啶、BKM120、NVP-BEZ235、PX-866、SF 1126、XL147。
mTOR抑制剂的实例是德福莫司、依维莫司、NVP-BEZ235、OSI-027、他克莫司、替罗莫司、Ku-0063794、WYE-354、PP242、OSI-027、GSK2126458、WAY-600、WYE-125132。
Bcl2抑制剂的实例是ABT-737、奥巴妥拉克斯(GX15-070)、ABT-263、TW-37。
JAK抑制剂的实例是柠檬酸他菲替尼(CP-690550)、AT9283、AG-490、INCBO18424(鲁索利替尼)、AZD1480、LY2784544、NVP-BSK805、TGI01209、TG-101348。
IkK抑制剂的实例是SC-514、PF184。
磷酸二酯酶抑制剂的实例是氨茶碱、阿那格雷、阿罗茶碱、咖啡碱、西洛司特、双嘧达莫、喘定、L 869298、L-826,141、米力农、***、己酮可可碱、罗氟司特、咯利普兰、替托司特、茶碱、甲苯磺丁脲、氨利酮、阿那格雷、阿罗茶碱、咖啡碱、西洛司特、L 869298、L-826,141、米力农、己酮可可碱、罗氟司特、咯利普兰、替托司特。
实际上，通过我们的方法鉴别为可能有助于MiaPaCa2细胞转化(图7e)的mTOR抑制剂作为单一药剂具有活性(图7f)并且在影响这些胰脏癌细胞的生长中与Hsp90抑制协同作用(图17)。
mTOR与Hsp90抑制剂之间的协同作用的定量分析：为确定pp242(mTOR抑制剂)与PU-H71(Hsp90抑制剂)之间的药物相互作用，如先前所描述使用周-特氏(Chou-Talalay)组合指数(CI)等效线图方法。基于质量作用定律的中效原理，这种方法通过计算机模拟来定量两种或两种以上药物组合的协同作用或拮抗作用，而不考虑每种药物的机制。基于演算法，计算机软件显示中效图、组合指数图和经过正规化的等效线图(其中使用2种药物的非恒定比率组合)。PU-H71(0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.0125μm)和pp242(0.5、0.125、0.03125、0.0008、0.002、0.001μm)以所提及浓度的单一药剂形式使用或以非恒定比率(PU-H71:pp242；1:1、1:2、1:4、1:7.8、1:15.6、1:12.5)组合。使用方程式Fa＝1-Fu计算Fa(被杀死细胞的分率)；Fu是未受影响的细胞的分率并用于使用计算机软件(CompuSyn，美国新泽西州帕拉母斯)的剂量效应分析。
以类似方式，通过我们的方法鉴别为有助于MDA-MB-468细胞转化的PI3K-AKT-mTOR路径的抑制剂在与Hsp90抑制剂组合时在MDA-MB-468乳癌细胞中是更有效的。
细胞周期：G2/M DNA损伤检查点调节
G2/M检查点是细胞周期内的第二检查点。这个检查点防止细胞的受损DNA进入M期，同时也防止暂停以使得可进行DNA修复。这种调节对于维持基因组稳定性和防止细胞经历恶性转化是重要的。共济失调毛细血管扩张突变(ataxia telangiectasia mutated，ATM)和共济失调毛细血管扩张突变和rad3相关(ataxia telangiectasia mutated andrad3related，ATR)是对DNA损伤起反应的关键激酶。ATR对UV损伤起反应，而ATM对DNA双链断裂(double-strand break，DSB)起反应。ATM和ATR活化激酶Chk1和Chk2，其转而又抑制Cdc25(通常活化Cdc2的磷酸酶)。Cdc2(周期素依赖性激酶)是进入M期所需的关键分子。对于其活性，其需要结合于周期素B1。肿瘤抑制基因p53是G2/M检查点调节中的重要分子。ATM、ATR和Chk2有助于p53活化。此外，p19Arf机械地起防止p53受到MDM2中和的作用。Mdm4是p53的转录抑制因子。DNA损伤诱导的Mdm4磷酸化通过靶向Mdm4而降解来活化p53。熟知的p53靶基因(如Gadd45和p21)与抑制Cdc2有关。另一p53靶基因14-3-3σ结合于Cdc2-周期素B复合物，使其无活性。由p53抑制周期素B1基因也有助于阻断进入有丝***。以这种方式，在使得细胞进入M期之前执行许多检查。
这一路径由以下各物构成，但不限于以下各物：14-3-3、14-3-3(β,ε,ζ)、14-3-3-Cdc25、ATM、ATM/ATR、BRCA1、Cdc2-周期素B、Cdc2-周期素B-Sfh、Cdc25B/C、CDK1、CDK7、CDKN1A、CDKN2A、Cdkn2a-Mdm2、CHEK1、CHEK2、CKS1B、CKS2、周期素B、EP300、Ep300/Pcaf、GADD45A、KAT2B、MDM2、Mdm2-Tp53-Mdm4、MDM4、PKMYT1、PLK1、PRKDC、RPRM、RPS6KA1(包括EG:20111)、Scf、SFN、Top2、TP53(包括EG:22059)、WEE1。
基于由本文所描述的方法的发现，提出这一路径的组分的抑制剂的组合在与Hsp90抑制剂组合使用时是有效的，所述抑制剂例如那些靶向CDK1、CDK7、CHEK1、PLK1和TOP2A(B)的抑制剂。
抑制剂的实例是AQ4N、贝卡特林(becatecarin)、BN 80927、CPI-0004Na、道诺霉素(daunorubicin)、右雷佐生(dexrazoxane)、阿霉素(doxorubicin)、依沙芦星(elsamitrucin)、表柔比星(epirubicin)、依托泊苷(etoposide)、加替沙星(gatifloxacin)、吉米沙星(gemifloxacin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、萘啶酮酸(nalidixic acid)、奈莫柔比星(nemorubicin)、诺氟沙星(norfloxacin)、新生霉素(novobiocin)、匹克生琼(pixantrone)、塔福坡塞德(tafluposide)、TAS-103、替拉扎明(tirapazamine)、伐柔比星(valrubicin)、XK469、BI2536。
PU-珠粒还将DNA损伤、复制和修复、同源重组和细胞对电离辐射的反应的蛋白质鉴别为选择的CML、胰脏癌和乳癌细胞中的Hsp90调节路径。PU-H71与作用于这些路径的药剂协同作用。
具体来说，在K562CML细胞、MDA-MB-468乳癌细胞和Mia-PaCa-2胰脏癌细胞中所鉴别的Hsp90调节路径中的数种路径与DNA损伤、复制和修复反应和/或同源重组有关(表3、5a-5f)。Hsp90抑制可与作用于DNA损伤和/或同源重组的药剂协同作用或累加作用(即加强用IR/化学疗法或其它药剂治疗后持续的DNA损伤，所述药剂例如作用于对于通过无差错同源重组修复路径来修复双链DNA断裂重要的蛋白质的PARP抑制剂)。实际上，我们发现PU-H71使Mia-PaCa-2人类胰脏癌细胞具有放射敏感性。我们还发现在MDA-MB-468和HCC1937乳癌细胞中PU-H71与PARP抑制剂奥拉帕尼协同作用(图25)。
肿瘤细胞存活所需的Hsp90客户的鉴别也可充当用于选择可能受益于Hsp90疗法的患者和用于在临床试验期间对Hsp90抑制剂功效进行药效学监测的肿瘤特异性生物标记(即图6、20中的客户，其表达或磷酸化在Hsp90抑制时改变)。肿瘤特异性Hsp90客户谱分析最终可得到一种用于个人化治疗性靶向肿瘤的方法(图9)。
这项研究具体化并且显著扩充了卡玛尔(Kamal)等人的研究，提供对原始模型的更完善了解，其中将肿瘤中的Hsp90描述为全部以多伴侣复合物形式存在，而来自正常组织的Hsp90是以潜在、未复合状态存在(卡玛尔等人,2003)。我们提出Hsp90在癌细胞中形成生物化学独特的复合物(图11a)。根据这种观点，大部分癌细胞Hsp90类似于正常细胞保留“看家”伴侣功能，而癌细胞中富集或扩增的功能上独特的Hsp90池与维持肿瘤细胞存活所需的致癌蛋白特异性相互作用。或许这一部分Hsp90表示在肿瘤细胞情形下扩增并组成性维持的细胞应激特定形式的伴侣复合物。我们的数据表明其可执行维持恶性表型所必需的功能。一种所述作用是调节突变(即mB-Raf)或嵌合蛋白(即Bcr-Abl)的折叠(祖侯克和约翰逊,2010；沃克曼等人,2007)。现在我们呈现另一作用的实验证据；即，有助于与异常活化的信号传导复合物有关的分子的支架和复合物形成。在这里我们描述Hsp90在维持CML中的组成性STAT5信号传导中的所述作用(图8h)。这些数据与先前研究一致，在先前研究中我们表明Hsp90是通过B细胞淋巴瘤细胞中的BCL6致癌转录抑制因子维持功能性转录抑制复合物所需的(瑟池特等人,2009)。
总而言之，我们的研究使用化学工具提供对肿瘤相关Hsp90的异质性的新的见识并且利用特定Hsp90抑制剂的生物化学特征鉴别肿瘤特异性生物路径和蛋白质(图9)。我们相信本文所描述的功能性蛋白质组学方法将允许鉴别在独特肿瘤中变得失调的关键蛋白质组亚群。这将允许如通过本文所描述的STAT机制举例说明的鉴别新的癌症机制，如通过本文所描述的CARM1举例说明的鉴别新的致癌蛋白，和鉴别与Hsp90互补的用于开发合理的组合靶向疗法的治疗性靶。
材料与方法
细胞系和初级细胞
从美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)获得CML细胞系K562、Kasumi-4、MEG-01和KU182，三阴性乳癌细胞系MDA-MB-468，HER2+乳癌细胞系SKBr3，黑色素瘤细胞系SK-Mel-28，***癌细胞系LNCaP和DU145，胰脏癌细胞系Mia-PaCa-2，结肠纤维母细胞、CCCD18Co细胞系。从日本研究生物资源库(Japanese Collection ofResearch Bioresources)获得CML细胞系KCl-22。如前文所描述转染NIH-3T3纤维母细胞(安等人,2000)。将细胞培养于补充有10％FBS、1％L-谷氨酰胺、1％青霉素(penicillin)和链霉素(streptomycin)的DMEM/F12(MDA-MB-468、SKBr3和Mia-PaCa-2)、RPMI(K562、SK-Mel-28、LNCaP、DU145和NIH-3T3)或MEM(CCD18Co)中。在补充有20％FBS、10ng/ml粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)和1×Pen/Strep的IMDM中维持Kasumi-4细胞。从购自纽约血液中心(New York BloodCenter)的患者血液中获得PBL(人类周边血液白细胞)和脐血。35ml细胞悬浮液在15ml菲科帕克淋巴细胞分离液(Ficoll-Paque plus)(通用电气医疗集团(GE Healthcare))上分层。在4℃下将样品以2,000rpm离心40分钟，并收集白细胞界面。将细胞接种于含10％FBS的RPMI培养基中并如所指示使用。在知情同意的情况下获得初级人类母细胞危象CML和AML细胞。对试样的操作和分析是由罗切斯特大学(University of Rochester)、威尔康奈尔医学院(Weill Cornell Medical College)和宾夕法尼亚大学伦理审查委员会(University ofPennsylvania Institutional Review Boards)批准。使用菲科帕克(Ficoll-Plaque)(纽约皮斯卡塔市的医药生物技术公司(Pharmacia Biotech,Piscataway,NY))密度梯度分离法来分离单核细胞。将细胞低温保存于由伊思考夫氏改良杜尔贝科培养基(Iscove'smodified Dulbecco medium，IMDM)、40％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和10％二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)组成的冷冻培养基或CryoStorTMCS-10(培芝公司(Biolife))中。当培养时，使细胞保持在5％CO2、37℃的湿润氛围下。
用于化学和免疫沉淀的细胞溶解
通过将细胞收集于加入了1μg/μL蛋白酶抑制剂(亮肽素(leupeptin)和抑肽酶(aprotinin))的菲特氏缓冲液(HEPES 20mM、KCl 50mM、MgCl2 5mM、NP40 0.01％、新鲜制备的Na2MoO4 20mM，pH 7.2-7.3)中，随后进行三个连续冷冻(在干冰中)和融化步骤来溶解细胞。根据制造商的说明书使用BCA试剂盒(皮尔斯公司(Pierce))测定总蛋白质浓度。
免疫沉淀
将10μL体积的Hsp90抗体(H9010)或正常IgG(圣克鲁斯生物技术公司(Santa CruzBiotechnology))与40μL蛋白G琼脂糖珠粒(阿普斯特公司(Upstate))一起加入指示量的细胞溶解物中，并且在4℃下培育混合物过夜。用菲特氏溶解缓冲液洗涤所述珠粒五次并且通过SDS-PAGE、随后通过标准西方印迹程序进行分离。
化学沉淀
用溶解缓冲液洗涤含有与琼脂糖珠粒结合的Hsp90非活性化学物质(乙醇胺)的Hsp90抑制剂珠粒或对照物珠粒三次。除非另有指示，否则在4℃下将珠粒结合物(80μL)与指示量的细胞溶解物(120-500μg)一起培育，并且用溶解缓冲液将体积调整到200μL。培育后，用溶解缓冲液洗涤珠粒结合物5次并且通过西方印迹分析沉降物中的蛋白质。对于耗尽研究来说，如所指示的进行2-4次连续化学沉淀，随后进行免疫沉淀步骤。
本文在第173-183页中还描述其它方法。
补充材料
表5图例
表5.(a-d)PU-珠粒沉降物中所分离并且如补充材料和方法中所指示鉴别的蛋白质的列表。(e)用于在英吉纽提路径中进行分析的定位蛋白质的数据集。(f)通过生物信息路径分析使用英吉纽提路径分析(IPA)软件所产生的蛋白质调节网络。通过IPA分析表5e中所列的蛋白质。
表5a.使用QSTAR-Elite混合四极飞行时间质谱仪(QTof MS)(AB/MDS Sciex)鉴别的假定Hsp90相互作用蛋白
#GChiosis_K562andMiPaca2_All，在08/05/2010创建样品报告
GChiosis_K562andMiPaca2_All
显示：指定光谱数
表5b.使用QSTAR-Elite混合四极飞行时间质谱仪(QTof MS)(AB/MDS Sciex)鉴别的假定Hsp90相互作用共伴侣
*Grp94和Trap-1是PU-H71直接结合的Hsp90同功异型物
表5c.使用QSTAR-Elite混合四极飞行时间质谱仪(GT of MS)(AB/MDS Sciex)鉴别的在蛋白酶体路径中起作用的假定Hsp90相互作用蛋白
表5d.使用Waters Xevo QTof MS鉴别的假定Hsp90相互作用蛋白
*灰色是切开的凝胶尺寸无法匹配所报导的MW的蛋白质
表5e.从输入列表中选择用于通过英吉纽提路径进行加工的功能、路径和网络分析合适的蛋白质
年英吉纽提***公司保留所有权利。
表5f.通过英吉纽提路径核心分析(Ingenuity Pathways Core Analysis)分配给K562细胞系中通过PU-H71分离的蛋白质的重要网络和相关生物功能
年英吉纽提***公司保留所有权利。
*IPA根据那个网络与输入蛋白质的拟合来计算每一种可能网络的得分。将所述得分计算为指示因随机机会同时发现既定网络中的输入蛋白质的可能性的p值的负的以10为底的对数。因此，2或2以上的得分至少具有不由单独随机机会所产生的99％置信度。
补充材料与方法
试剂
如先前所报导的合成Hsp90抑制剂、固定的固体载体和荧光素标记衍生物(塔尔多内等人,2011,小……的合成和评估(Synthesis and Evaluation of Small...)；塔尔多内等人,2011,荧光……的合成和评估(Synthesis and Evaluation of Fluorescent...)；赫等人,2006)。我们从LC实验室公司(LC Laboratories)购买格列卫，从赛导通生物科技有限公司(Selleck)购买AS703026，从托克里斯公司(Tocris)购买KN-93，并且从西格玛公司(Sigma)购买PP242、BMS-345541和钒酸钠。所有化合物都是以DMSO储备液形式使用。
西方印迹
用PU-H71或DMSO(媒剂)处理细胞24小时并在补充有亮肽素(西格玛奥尔德里奇公司(Sigma Aldrich))和抑肽酶(西格玛奥尔德里奇公司)的50mM Tris(pH 7.4)、150mMNaCl和1％NP40溶解缓冲液中溶解。根据制造商的说明书使用BCA试剂盒(皮尔斯公司)测定蛋白质浓度。通过SDS/PAGE电泳解析蛋白质溶解物(15-200μg)，转移到硝基纤维素膜上并用以下针对如下各物的初级抗体进行探测：Hsp90(1:2000，SMC-107A/B；斯捷马克公司(StressMarq))、Bcr-Abl(1:75，554148；BD法明杰公司(BD Pharmingen))、PI3K(1:1000，06-195；阿普斯特公司)、mTOR(1:200，Sc-1549；圣克鲁斯公司(Santa Cruz))、p-mTOR(1:1000，2971；细胞信号传导公司(Cell Signaling))、STAT3(1:1000，9132；细胞信号传导公司)、p-STAT3(1:2000，9145；细胞信号传导公司)、STAT5(1:500，Sc-835；圣克鲁斯公司)、p-STAT5(1:1000，9351；细胞信号传导公司)、RICTOR(1:2000，NB100-611；诺维斯生物公司(Novus Biologicals))、RAPTOR(1:1000，2280；细胞信号传导公司)、P90RSK(1:1000，9347；细胞信号传导公司)、Raf-1(1:300，Sc-133；圣克鲁斯公司)、CARM1(1:1000，09-818；密理博公司(Millipore))、CRKL(1:200，Sc-319；圣克鲁斯公司)、GRB2(1:1000，3972；细胞信号传导公司)、FAK(1:1000，Sc-1688；圣克鲁斯公司)、BTK(1:1000，3533；细胞信号传导公司)、A-Raf(1:1000，4432；细胞信号传导公司)、PRKD2(1:200，sc-100415，圣克鲁斯公司)、HCK(1:500，06-833；密理博公司)、p-HCK(1:500，ab52203；艾碧康公司(Abcam))和β-肌动蛋白(1:2000，A1978；西格玛公司)。然后将膜与相应辣根过氧化酶结合的二级抗体的1:3000稀释液一起培育。根据制造商的说明书使用ECL-增强化学发光检测***(安玛西亚生物科学公司(Amersham Biosciences))进行检测。
光密度测定法
在Adobe Photoshop 7.0.1中扫描凝胶并且使用Un-Scan-It 5.1软件(斯尔克科技公司(Silk Scientific))进行定量光密度分析。
纳米LC-MS/MS
首次通过在4℃下与对照物珠粒一起培育过夜预清洗如上所述制备的溶解物。在4℃下将含预清洗的K562细胞提取物(1,000μg)的200μl菲特氏溶解缓冲液与PU-H71或对照物-珠粒(80μl)一起培育24小时。根据制造商的程序(伯乐公司)用溶解缓冲液洗涤珠粒，通过在2％SDS中沸腾来洗脱蛋白质，在变性凝胶上分离并进行库马斯染色。如所描述的，用胰蛋白酶消化从沉降物中凝胶拆分的蛋白质(温克勒(Winkler)等人,2002)。使胶内胰蛋白酶消化物在装填于艾本德(Eppendorf)凝胶加样头中的2μL柱床体积的Poros50R2(应用生物***公司(Applied Biosystems)-‘AB’)反相珠粒上经受微提纯程序(俄杰门-布朗玛格(Erdjument-Bromage)等人,1998)，并且用0.1％甲酸(FA)稀释洗脱液。使用配备有纳米喷雾离子源的QSTAR-Elite混合四极飞行时间质谱仪(QTof MS)(AB/MDS Sciex)进行分批纯化池的分析。使用艾克斯金特(Eksigent)纳米MDLC***(艾克斯金特技术有限公司(Eksigent Technologies,Inc))以20μL/min的流速将肽混合物(20μL)加载于捕获保护柱(来自LC帕克斯公司(LC Packings)的0.3×5mm PepMap C18 100滤柱)上。洗涤后，通过保护柱颠倒流动，并在85分钟内用5-45％MeCN梯度(在0.1％FA中)以200nL/min的流速将肽洗脱到75微米×15厘米熔融硅石毛细管PepMap C18柱(LC帕克斯公司)上；将洗脱液引导到75微米(具有10微米孔口)熔融硅石纳米电喷雾针(新奥杰特公司(New Objective))。电喷雾电离(ESI)针电压设定为约1800V。在自动、数据依赖性MS/MS采集模式下操作质量分析器，其中阈值设定为选择用于碎片扫描的双或三电荷前体离子的每秒10个计数。从400到1800amu记录0.25秒的全谱扫描(survey scan)；然后依序收集所选择的前体离子的至多3次MS/MS扫描，从100到1800amu记录。根据选择用于MS/MS的前体离子的m/z值自动调整碰撞能量。在相应碎片工作周期结束后的60秒内从重复选择中排除所选择的前体离子。使用Mascot搜寻引擎(马曲斯科学公司(Matrix Science)，2.2.04版；www.matrixscience.com)和NCBI(国家医学图书馆(National Library of Medicine)，NIH-人类分类学，含有223,695种蛋白质序列)和IPI(国际蛋白质索引(International Protein Index)，英国辛克斯顿的EBI(EBI,Hinxton,UK)-人类分类学，含有83,947种蛋白质序列)数据库从LC-MS/MS数据进行初始蛋白质鉴别。允许错过一个胰蛋白酶裂解位点，前体离子质量公差＝0.4Da碎片离子质量公差＝0.4Da，，Met-氧化物、Cys-丙烯酰胺和N端乙酰化允许蛋白质修饰。通常在激活‘需要粗体红色’下并使用显著阈值得分p<0.05来应用MudPit计分。将所有鉴别的蛋白质的独特肽计数(或‘光谱计数’)和序列覆盖百分比输出到思高福德蛋白质组软件(2_06_01版，www.proteomesoftware.com)作进一步生物信息分析(表5a)。使用来自Mascot的输出结果，思高福德验证、组织并解释质谱数据，从而允许更容易地处理大量数据、比较样品和搜索蛋白质修饰。在第二个MS***，Waters Xevo QTof MS仪器中验证实验结果(表5d)。从如所指示的进一步分析中鉴别并去除潜在非特异性相互作用因子(崔克尔-穆卡伊等人,2008)。
生物信息路径分析
进一步通过生物信息路径分析来分析蛋白质(英吉纽提路径分析8.7[IPA]；加利福尼亚州芒廷维尤的英吉纽提***公司(Ingenuity Systems,Mountain View,CA)，www.ingenuity.com)(穆迪(Munday)等人,2010；安徒生(Andersen)等人,2010)。IPA基于定期更新的“英吉纽提路径知识库”构建假想蛋白质相互作用簇。英吉纽提路径知识库是一个极大的专业数据库，它由从生物学文献中采集的蛋白质之间的数百万种个别关系组成。这些关系涉及直接蛋白质相互作用，包括实体结合相互作用、酶底物关系和翻译控制下的顺反关系。以节点(个别蛋白质)和边线(节点之间的生物关系)用图呈现网络。连接两个分子的线表示关系。因此，结合、作用于彼此或以任何其它方式彼此有关的任何两个分子将视为在其之间具有一定关系。每一种分子间关系都是使用英吉纽提知识库中所含的科学信息建立的。以分子之间的线或箭头展示关系。箭头指示关系的方向性，使得从分子A到B的箭头将指示分子A作用于B。直接相互作用在网络图中以实线显示，而间接相互作用以虚线显示。在一些情况下，关系可以来源于一个分子并指回同一个分子的环形箭头或线形态存在。所述关系称为“自我参考”并且由分子作用于自身的能力产生。实际上，将含有差别表达的蛋白质的UniProtKB识别符的数据集上传到IPA中。然后IPA由这些蛋白质和来自数据库的扩充蛋白质簇所需的其它蛋白质构建假想网络。优化网络产生以包括尽可能多的来自所输入的表达谱的蛋白质，并且力求获得高度连接网络。当实体是复合物的一部分时，蛋白质在网络中描绘为两个圆；当仅存在一个单元时描绘为单个圆；分别描绘为向上或向下指的三角形以描述磷酸酶或激酶；描绘为横向椭圆形以描述转录因子；和描绘为圆以描述“其它”功能。IPA根据那个网络与输入蛋白质的拟合来计算每一种可能网络的得分。将所述得分计算为指示因随机机会同时发现既定网络中的输入蛋白质的可能性的p值的负的以10为底的对数。因此，2或2以上的得分至少具有不由单独随机机会所产生的99％置信度。本文所呈现的所有网络都指定得分为10或10以上(表5f)。
放射性同位素结合研究和Hsp90定量研究
用131I-PU-H71和细胞(K562、MDA-MB-468、SKBr3、LNCaP、DU-145、MRC-5和PBL)进行饱和研究。简单来说，将一式三份细胞样品与递增量的131I-PU-H71在1μM未经标记的PU-H71存在或不存在下混合。在回转式震荡器中震荡溶液并在1小时后分离细胞且使用布兰戴尔(Brandel)细胞收集器用冰冷的Tris缓冲生理盐水洗涤。计数所有分离的细胞样品并且测定131I-PU-H71的特定吸收。将这些数据相对于131I-PU-H71的浓度制图，得到饱和结合曲线。为定量PU结合的Hsp90，溶解9.2×107个K562细胞、6.55×107个KCL-22细胞、2.55×107个KU182细胞和7.8×107个MEG-01细胞，分别产生6382、3225、1349和3414μg总蛋白质。为计算Hsp90的百分比，通过使用所建立的从海拉(HeLa)细胞(Stressgen#ADI-SPP-770)纯化的重组Hsp90的标准曲线定量细胞Hsp90表达。
脉冲追踪
如所指示的，用Na3VO4(1mM)在PU-H71(5μM)存在或不存在下处理K562细胞。在所指示的时间收集细胞并在50mM Tris(pH 7.4)、150mM NaCl和1％NP-40溶解缓冲液中溶解，然后经受西方印迹程序。
胰蛋白酶消化
用媒剂或PU-H71(50μM)处理K562细胞30分钟。收集细胞并在50mM Tris(pH 7.4)、150mM NaCl、1％NP-40溶解缓冲液中溶解。用抗STAT5抗体(圣克鲁斯公司，sc-835)使STAT5蛋白从500μg总蛋白质溶解物中免疫沉淀。用胰蛋白酶缓冲液(50mM Tris(pH8.0)、20mMCaCl2)洗涤结合于蛋白G琼脂糖珠粒的蛋白质沉淀物并将33ng胰蛋白酶加入每一样品中。在37℃下培育样品并在所指示的时间点收集等分试样。使蛋白质等分试样经受SDS-PAGE并针对STAT5进行印迹操作。
活化STAT5 DNA结合分析
按照制造商的说明书通过基于ELISA的分析(TransAM，加利福尼亚州卡尔斯巴德的阿维莫替公司(Active Motif,Carlsbad,CA))来分析STAT5a和STAT5b的DNA结合能力。简单来说，用PU-H71 1和10μM或对照组处理5×106个K562细胞24小时。将十微克细胞溶解物加入含有预吸附的STAT一致寡核苷酸(5'-TTCCCGGAA-3')的孔中。对于对照组处理的细胞，在20pmol含有野生型或突变型STAT一致结合位点的竞争寡核苷酸不存在或存在下进行分析。使用干扰素处理的海拉细胞(每孔5μg)作为用于所述分析的阳性对照组。培育和洗涤后，将兔多克隆抗STAT5a或抗STAT5b抗体(1:1000，阿维莫替公司)加入各孔中，随后加入HPR-抗兔二级抗体(1:1000，阿维莫替公司)。加入HRP底物后，使用655nm的参考波长在450nm下读取吸光度(Synergy4，佛蒙特州威努斯基的伯腾仪器有限公司(Biotek,Winooski,VT))。在这一分析中，吸光度与样品中存在的DNA结合的转录因子的量成正比。实验重复进行四次。结果由使用SEM得到的平均吸光度值以任意单位(AU)表示。
定量染色质免疫沉淀(Q-ChIP)
如前文所描述在一定修改下进行Q-ChIP(瑟池特等人,2009)。简单来说，用1％甲醛固定108个K562细胞，溶解并进行声波处理(必能信(Branson)声波器，必能信公司)。将STAT5N20(圣克鲁斯公司)和Hsp90(兹美德公司(Zymed))抗体加入预清洁样品中并在4℃下培育过夜。然后，加入蛋白-A或G珠粒，并且从所述珠粒洗脱样品，随后解交联。使用PCR纯化管柱(凯杰公司(Qiagen))纯化DNA。通过定量PCR(应用生物***公司7900HT)使用FastSYBR Green(应用生物***公司)定量ChIP产物。用以下引物检测含有STAT结合位点的靶基因：CCND2(5-GTTGTTCTGGTCCCTTTAATCG和5-ACCTCGCATACCCAGAGA)、MYC(5-ATGCGTTGCTGGGTTATTTT和5-CAGAGCGTGGGATGTTAGTG)和基因间控制区(5-CCACCTGAGTCTGCAATGAG和5-CAGTCTCCAGCCTTTGTTCC)。
实时QPCR
按照制造商的说明书使用RNeasy Plus试剂盒(凯杰公司)从PU-H71处理的K562细胞和对照组K562细胞提取RNA。使用High Capacity RNA-to-cDNA试剂盒(应用生物***公司)合成cDNA。我们用以下引物扩增特定基因：MYC(5-AGAAGAGCATCTTCCGCATC和5-CCTTTAAACAGTGCCCAAGC)、CCND2(5-TGAGCTGCTGGCTAAGATCA和5-ACGGTACTGCTGCAGGCTAT)、BCL-XL(5-CTTTTGTGGAACTCTATGGGAACA和5-CAGCGGTTGAAGCGTTCCT)、MCL1(5-AGACCTTACGACGGGTTGG和5-ACATTCCTGATGCCACCTTC)、CCND1(5-CCTGTCCTACTACCGCCTCA和5-GGCTTCGATCTGCTCCTG)、HPRT(5-CGTCTTGCTCGAGATGTGATG和5-GCACACAGAGGGCTACAATGTG)、GAPDH(5-CGACCACTTTGTCAAGCTCA和5-CCCTGTTGCTGTAGCCAAAT)、RPL13A(5-TGAGTGAAAGGGAGCCAGAAG和5-CAGATGCCCCACTCACAAGA)。使用Fast SYBR Green条件(在95℃下20秒初始步骤，随后40个在95℃下1秒和在60℃下20秒的循环)检测转录物丰度。从所关注的对应基因中减去看家基因(RPL13A)的CT值(ΔCT)。由CT值的标准偏差计算差值的标准偏差(重复进行)。然后，使用ΔΔCT方法相对于其各自对照组处理的细胞表示PU-H71处理的细胞的ΔCT值。通过以下表达式测定用药物处理的细胞相对于对照组处理的细胞中每一基因的表达倍数：2-ΔΔCT。结果是以表达倍数与重复的平均标准误差表示。
Hsp70敲除
根据制造商的说明书通过电穿孔(阿玛萨公司(Amaxa))和核转染溶液V(Nucleofector Solution V)(阿玛萨公司)进行转染。使用如先前所报导(鲍沃斯(Powers)等人,2008)针对Hsp70的开放阅读框架(HSPA1A；寄存编号NM_005345)设计的siRNA进行Hsp70敲除研究。用颠倒的对照组siRNA序列(Hsp70C；达玛肯RNA技术公司(Dharmacon RNAtechnologies))转染阴性对照组细胞。用于研究的针对Hsp70的活性序列是Hsp70A(5'-GGACGAGUUUGAGCACAAG-3')和Hsp70B(5'-CCAAGCAGACGCAGAUCUU-3')。用于对照组的序列是Hsp70C(5'-GGACGAGUUGUAGCACAAG-3')。根据制造商的说明书用0.5μM siRNA转染含三百万个细胞的2mL培养基(补充有1％L-谷氨酰胺、1％青霉素和链霉素的RPMI)。将转染的细胞维持在6孔板中并且在84小时时进行溶解，随后进行标准西方印迹程序。
激酶筛选(费边(Fabian)等人,2005)
对于大多数分析来说，在24孔深孔板中使激酶标记的T7噬菌体菌株在来源于BL21菌株的大肠杆菌宿主中并联生长。使大肠杆菌生长到对数阶段并用来自冷冻储备液的T7噬菌体感染(感染倍率＝0.4)并且在32℃下在震荡下培育直到溶解(90-150分钟)。将溶解物离心(6,000×g)并过滤(0.2μm)以去除细胞碎片。在HEK-293细胞中产生残余激酶并且随后用DNA标记用于qPCR检测。在室温下用生物素标记的小分子配体处理涂有抗生蛋白链菌素的磁性珠粒30分钟，产生亲和力树脂以用于激酶分析。用过量生物素阻断配体珠粒(liganded bead)并用阻断缓冲液(SeaBlock(皮尔斯公司)、1％BSA、0.05％吐温20(Tween20)、1mM DTT)洗涤以去除未结合的配体并减少非特异性噬菌体结合。通过在1×结合缓冲液(20％SeaBlock、0.17×PBS、0.05％吐温20、6mM DTT)中组合激酶、配体亲和力珠粒(liganded affinity bead)和测试化合物来组装结合反应。用100％DMSO将测试化合物制备成40×储备液并直接稀释用于分析。所有反应都是在聚丙烯384孔板中以0.04ml的最终体积进行。在室温下在震荡下培育分析板1小时并且用洗涤缓冲液(1×PBS、0.05％吐温20)洗涤亲和力珠粒。然后将珠粒再悬浮于洗脱缓冲液(1×PBS、0.05％吐温20、0.5μm非生物素标记的亲和力配体)中并在室温下在震荡下培育30分钟。通过qPCR测量洗脱液中的激酶浓度。KINOMEscan选择性得分(S)是化合物选择性的定量度量。它是通过将结合于化合物的激酶数除以所测试的独特激酶(不包括突变变异体)的总数来计算。TKEEspotTM是由KTNOMEscan开发的专用数据可视化软件工具(费边等人,2005)。用红色圆圈标示发现结合的激酶，其中较大的圆圈指示较高亲和力结合。修改激酶树状图并且在科学与细胞信号传导技术公司(Science and Cell Signaling Technology,Inc)的许可下再现。
慢病毒载体、慢病毒产生和K562细胞传导
CARM1的shRNA敲除的慢病毒构筑体是购自欧鹏生物***公司(Openbiosystem)的TRC慢病毒shRNA库：pLKO.1-shCARM1-KD1(目录号：RHS3979-9576107)和pLKO.1-shCARM1-KD2(目录号：RHS3979-9576108)。对照组shRNA(shRNA杂乱)是Addgene质粒1864。克隆GFP以替换嘌呤霉素作为选择标记。通过如先前所描述的方案(莫法特(Moffat)等人,2006)短暂转染293T来产生慢病毒。收集病毒上清液，通过0.45μm过滤器过滤并浓缩。用高效价慢病毒浓缩悬浮液在8μg/ml凝聚胺(polybrene)(奥尔德里奇公司(Aldrich))存在下感染K562细胞。转染72小时后针对绿色荧光(GFP)对转导的K562细胞进行分选。
RNA萃取和定量实时PCR(qRT-PCR)
对于qRT-PCR，使用RNeasy微型试剂盒(德国凯杰公司)从106个细胞分离总RNA，然后经受用随机六聚体进行反转录(SuperScript III试剂盒，英杰公司)。使用ABI 7500序列检测***进行实时PCR反应。使用Sybr green I化学或TaqMan方法(康涅狄格州诺沃克的PE应用生物***公司(PE Applied Biosystems,Norwalk,CT))检测PCR产物。关于实时PCR分析的详情在其它地方有所描述(赵(Zhao)等人,2009)。用于CARM1 qPCR的引物序列是TGATGGCCAAGTCTGTCAAG(正向)和TGAAAGCAACGTCAAACCAG(反向)。
细胞存活力、细胞凋亡和增殖分析
使用锥虫蓝(Trypan Blue)进行未转染或用CARM1 shRNA或杂乱转染的K562细胞的存活力评估。这种发色团带负电并且除非膜受损，否则不与细胞相互作用。因此，所有细胞(不包括染料)都可行。使用荧光显微术通过混合2μL吖啶橙(100μg/mL)、2μL溴化乙锭(100μg/mL)和20μL细胞悬浮液来评估细胞凋亡分析。在至少五个随机场中计数最少200个细胞。通过基于特殊的核和细胞质荧光检查细胞形态学的变化而将活的凋亡细胞与死的凋亡、坏死和正常细胞区别开。活细胞呈现完整的质膜(绿色)，而死细胞呈现受损的质膜(橙色)。包括皱缩、异染色质凝缩和核脱粒的超微结构变化的出现更加与凋亡一致并且受到破坏的细胞质膜与坏死一致。凋亡细胞百分比(细胞凋亡指数)计算为：凋亡细胞％＝(具有凋亡核的细胞总数/所计数的细胞总数)×100。对于增殖分析，将5×103个K562细胞接种于96孔黑色固定板(康宁公司(Corning))上。根据制造商的指示进行所述分析(CellTiter-Glo发光细胞存活力分析，普洛麦格公司(Promega))。所有实验都重复三次。如所指示的，使用阿拉马蓝分析进行生长抑制研究。这种试剂提供细胞培养物中的细胞存活力的快速客观度量，并且其使用指示剂染料刃天青(resazurin)来测量细胞代谢能力，即细胞存活力的指标。简单来说，将指数生长的细胞接种于微量滴定板(康宁#3603)中并且在37℃下培育所指示的时间。加入所指示浓度的药物一式三份，并且培育所述板72小时。加入刃天青(55μM)，并且6小时后使用Analyst GT(荧光强度模式，激发530nm，发射580nm，使用560nm分色镜)读取板。使用Softmax Pro和GraphPad Prism软件分析结果。通过比较从经过处理的细胞相对于对照组细胞获得的荧光读数来计算细胞生长抑制百分比。将IC50计算为使细胞生长抑制50％的药物浓度。
mTOR与Hsp90抑制剂之间的协同作用的定量分析
为确定pp242(mTOR抑制剂)与PU-H71(Hsp90抑制剂)之间的药物相互作用，如先前所描述使用周-特氏组合指数(CI)等效线图方法(周(Chou),2006；周和特拉莱(Talalay),1984)。基于质量作用定律的中效原理，这种方法通过计算机模拟来定量两种或两种以上药物组合的协同作用或拮抗作用，而不考虑每种药物的机制。基于演算法，计算机软件显示中效图、组合指数图和经过正规化的等效线图(其中使用2种药物的非恒定比率组合)。PU-H71(0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.0125μm)和pp242(0.5、0.125、0.03125、0.0008、0.002、0.001μm)以所提及浓度的单一药剂形式使用或以非恒定比率(PU-H71:pp242；1:1、1:2、1:4、1:7.8、1:15.6、1:12.5)组合。使用方程式Fa＝1-Fu计算Fa(被杀死细胞的分率)；Fu是未受影响的细胞的分率并用于使用计算机软件(CompuSyn，美国新泽西州帕拉母斯)的剂量效应分析。
流式细胞测量术
CD34分离-根据制造商的说明书使用CD34 MicroBead试剂盒和自动磁性细胞分选仪autoMACS进行CD34+细胞分离(加利福尼亚州奥本的米坦伊生物技术公司(MiltenyiBiotech,Auburn,CA))。存活力分析-将CML细胞系以每毫升5×105个细胞的密度接种于48孔板中，并且用所指示剂量的PU-H71处理。每24小时收集细胞，用含Annexin V-V450(BD生物科学公司(BD Biosciences))和7-AAD(英杰公司)的Annexin V缓冲液(10mM HEPES/NaOH、0.14M NaCl、2.5mM CaCl2)染色。通过流式细胞测量术(BD生物科学公司)分析细胞存活力。对于患者样品，将初级CML细胞以每毫升2×106个细胞接种于48孔板中，并且用所指示剂量的PU-H71处理至多96小时。在4℃下用含CD34-APC、CD38-PE-CY7和CD45-APC-H7抗体(BD生物科学公司)的FACS缓冲液(PBS、0.05％FBS)将细胞染色30分钟，随后进行AnnexinV/7-AAD染色。PU-H71结合分析-将CML细胞系以每毫升5×105个细胞的密度接种于48孔板中，并且用1μM PU-H71处理。在处理后4小时，用FACS缓冲液洗涤细胞两次。为测量活细胞中的PU-H71-FITC结合，在室温下用含7-AAD的FACS缓冲液将细胞染色10分钟，并且通过流式细胞测量术(BD生物科学公司)分析。或者，在4℃下用固定缓冲液(BD生物科学公司)固定细胞30分钟，在冰上用Perm Buffer III(BD生物科学公司)渗透30分钟，然后通过流式细胞测量术分析。在PU-H71-FITC处理后96小时，用含Annexin V-V450(BD生物科学公司)和7-AAD的Annexin V缓冲液将细胞染色，并且经受流式细胞测量术以测量存活力。为评估PU-H71-FITC与白血病患者样品的结合，将初级CML细胞以每毫升2×106个细胞接种于48孔板中，并且用1μM PU-H71-FITC处理。在处理后24小时，洗涤细胞两次，并且在4℃下用含CD34-APC、CD38-PE-CY7和CD45-APC-H7抗体的FACS缓冲液染色30分钟，随后进行7-AAD染色。在处理后96小时，用CD34-APC、CD38-PE-CY7和CD45-APC-H7抗体将细胞染色，随后进行Annexin V-V450和7-AAD染色以测量细胞存活力。对于竞争测试，用1μM未结合的PU-H71处理密度为每毫升5×105个细胞的CML细胞系或密度为每毫升2×106个细胞的初级CML样品4小时，随后用1μM PU-H71-FITC处理1小时。收集细胞，洗涤两次，用含7-AAD的FACS缓冲液染色，并且通过流式细胞测量术分析。Hsp90染色-在4℃下用固定缓冲液(BD生物科学公司)固定细胞30分钟，并且在冰上用Perm Buffer III(BD生物科学公司)渗透30分钟。用抗Hsp90藻红蛋白结合物(PE)(F-8克隆，加利福尼亚州的圣克鲁斯生物技术公司(Santa CruzBiotechnologies；CA))将细胞染色60分钟。洗涤细胞，然后通过流式细胞测量术分析。使用正常小鼠IgG2a-PE作为同型对照组。
统计分析
除非另有指示，否则如在GraphPad Prism(第4版；格兰帕德软件公司(GraphPadSoftware))中所执行的通过未配对的双尾t检验(2-tailed t test)分析数据。小于0.05的P值视为显著。除非另作说明，否则数据是以重复两次或三次的平均值±SD或平均值±SEM呈现。误差条线表示平均值的SD或SEM。如果呈现单个图，那么数据表示2或3次个别实验。
由Hsp90维持B细胞受体路径和COP9信号体揭露弥漫性大B细胞淋巴瘤中的新颖治 疗性靶
实验概述
热休克蛋白90(Hsp90)是一种丰富的分子伴侣，其底物蛋白质与细胞存活、增殖和血管生成有关。Hsp90是组成性表达的并且也可通过细胞应激(例如热休克)诱导。因为其可陪伴维持恶性表型所必需的底物蛋白质，所以Hsp90是具有吸引力的癌症治疗性靶。事实上，抑制Hsp90导致许多其底物蛋白质的降解。PUH71(Hsp90抑制剂)选择性抑制与伴侣致癌蛋白有关的致癌Hsp90复合物并且具有有效的抗肿瘤活性弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。通过将PUH71固定于固体载体上，可使Hsp90复合物沉淀并进行分析以鉴别Hsp90的底物致癌蛋白，从而揭露已知和新颖的治疗性靶。使用这种方法的初步数据将B细胞受体(BCR)路径的许多组分鉴别为DLBCL中Hsp90的底物蛋白质。BCR路径活化与淋巴瘤形成和DLBCL的存活有关。除此以外，还将COP9信号体(CSN)的许多组分鉴别为DLBCL中Hsp90的底物。CSN与肿瘤形成和NF-κB的活化(DLBCL的存活机制)有关。基于这些发现，我们假设Hsp90和BCR路径组分和/或CSN的组合抑制将协同杀死DLBCL。因此，我们的明确目的是：
明确目的1：确定Hsp90和BCR路径的相伴调节是否在体外和体内协力杀死DLBCL细胞
将使用固定的PU-H71使DLBCL细胞系中的Hsp90复合物沉降以检测Hsp90与BCR路径组分之间的相互作用。将针对BCR路径组分的降解来分析用递增剂量的PU-H71处理的DLBCL细胞系。将用单独BCR路径组分的抑制剂和BCR路径组分的抑制剂与PU-H71的组合处理DLBCL细胞系并评估存活力。将在DLBCL异种移植小鼠模型中研究有效的组合治疗。
明确目的2：评估CSN在DLBCL中的作用
子目的1：确定CSN是否可为DLBCL治疗性靶
CP和用PU-H71处理将验证CSN为DLBCL细胞系中Hsp90的底物。单独和与PU-H71组合使DLBCL细胞系中的CSN基因切除以证明DLBCL的存活对CSN的依赖性。将用单独CSN抑制和CSN抑制与PU-H71的组合处理小鼠异种移植模型，以显示对肿瘤生长和动物存活的影响。
子目的2：确定CSN在DLBCL存活中的机制
将使用CSN的免疫沉淀(IP)证明CSN-CBM相互作用。将使用CSN的基因切除在DLBCL细胞系中证明Bcl10的降解和NF-κB活性的切除。
背景与意义
1.DLBCL分类
DLBCL是非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)的最常见形式。为了改善DLBCL的诊断和治疗，许多研究已试图对这种分子异质疾病进行分类。一种基因表达谱分析研究将DLBCL分成两个主要亚型(阿利拉利扎德(Alizadeh)等人,2000)。生发中心(germinal center，GC)B细胞样(GCB)DLBCL可通过表达对于生发中心分化重要的基因(包括BCL6和CD 10)来表征，而活化B细胞样(ABC)DLBCL可通过类似于活化周边血液B细胞的基因表达谱来区分。NF-κB路径在ABC DLBCL中更具活性并且经常突变。另一种使用基因表达谱分析的分类尝试鉴别出三个主要种类的DLBCL。OxPhos DLBCL显示与氧化磷酸化、线粒体功能和电子传输链有关的基因的显著富集。BCR/增殖DLBCL可通过与细胞周期调节有关的基因的表达增加来表征。基于T细胞受体(T-cell receptor，TCR)的多个组分和与T细胞活化有关的其它基因的表达增加来鉴别宿主反应(host response，HR)DLBCL(蒙提(Monti)等人,2005)。
使用患者样品进行这些有希望的分类并且仍未是诊断或治疗患者的最终答案。因为患者样品包含异质细胞群体并且肿瘤微环境在疾病中起作用(迪琼(de Jong)和恩布雷德(Enblad),2008)，所以DLBCL细胞系不能像患者样品那样分类。然而，可使用充分表征的细胞系作为DLBCL的不同亚型的模型，以研究疾病背后的分子机制。
2.DLBCL：新颖疗法的需求
例如环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿霉素(doxorubicin)、长春新碱(vincristine)和***(prednisone)的组合的标准化学疗法方案(CHOP)治愈约40％的DLBCL患者，其中GCB和ABC患者的5年总存活率分别是60％和30％>(赖特(Wright)等人,2003)。将利妥昔单抗免疫疗法加入这种治疗时程中(R-CHOP)使DLBCL患者的存活率增加10到15％(科伊菲尔(Coiffier)等人,2002)。然而，40％的DLBCL患者对R-CHOP不起反应，并且这种组合化学免疫疗法的副作用并不耐受良好，从而突出了对鉴别用于这种疾病的新颖靶和治疗的需求。
患者肿瘤的分类已在一定程度上推进了对DLBCL背后的分子机制的了解。直到这些详情被充分了解，才可个别地定制治疗。用新药单独治疗和组合治疗的临床前研究和在DLBCL中新靶的研究将提供对疾病背后的分子机制的新的理解。
3.Hsp90：有前途的靶
Hsp90是一种用于癌症的新兴治疗性靶。伴侣蛋白是组成性表达的，但也可在细胞应激(例如热休克)时诱导。Hsp90维持与例如存活、增殖和血管生成的细胞过程有关的各种底物蛋白质的稳定性(内克尔(Neckers),2007)。Hsp90的底物蛋白质包括致癌蛋白，例如多形性大细胞淋巴瘤中的NPM-ALK，和慢性骨髓性白血病中的BCR-ACL(波维尼(Bonvini)等人,2002；戈尔(Gorre)等人,2002)。因为Hsp90维持疾病维持所必需的致癌底物蛋白质的稳定性，所以其为具有吸引力的治疗性靶。事实上，抑制Hsp90导致许多其底物蛋白质的降解(波维尼等人,2002；卡尔达斯-罗普斯等人,2009；池欧斯等人,2001；内克尔,2007；尼曼帕里(Nimmanapalli)等人,2001)。因此，已开发许多Hsp90抑制剂用于临床(塔尔多内等人,2008)。
4.PU-H71：新颖的Hsp90抑制剂
已显示新颖的嘌呤骨架Hsp90抑制剂PU-H71具有有效的抗肿瘤作用和与其它Hsp90抑制剂相比改良的药效学概况和更小的毒性(卡尔达斯-罗普斯等人,2009；瑟池特等人,2010a；池欧斯和内克尔,2006)。我们实验室的研究已显示，PU-H71通过BCL-6(与DLCBL增殖和存活有关的转录抑制因子)的降解部分地有效杀死DLBCL细胞系、异种移植物和离体患者样品(瑟池特等人,2010a)。
PU-H71的独特性质是其对于肿瘤相关Hsp90的高亲和力，这解释了为什么显示药物优先在肿瘤中积累(卡尔达斯-罗普斯等人,2009；瑟池特等人,2010a)。PU-H71的这种性质使其成为鉴别用于癌症疗法的新颖靶的有用工具。通过将PU-H71固定于固体载体上，可获得肿瘤特异性Hsp90复合物的化学沉淀(CP)，并且可使用蛋白质组学方法鉴别Hsp90的底物蛋白质。在DLBCL细胞系中使用这种方法的初步实验已揭露至少两种由DLBCL细胞中的Hsp90稳定的潜在靶：BCR路径和COP9信号体(CSN)。
5.癌症的组合疗法
因为单一药剂疗法不具治愈性，所以鉴别癌症的合理组合治疗是必要的(表6)。单一疗法由于肿瘤细胞异质性而在癌症中并非有效。尽管肿瘤起源于单细胞，但其基因不稳定性产生异质子代细胞群体，经常针对增强的呈细胞凋亡抗性形式的存活能力、降低的对正常生长因子的依赖性和较高增殖能力来选择所述细胞群体(哈纳汗(Hanahan)和温伯格(Weinberg),2000)。因为肿瘤包含异质细胞群体，所以单一药物将杀死特定肿瘤中的并非所有细胞，而存活的细胞使得肿瘤复发。肿瘤异质性使得潜在药物靶的数目增加且因此对组合治疗的需求增加。
表6.肿瘤治愈需要多种治疗剂。(库夫DW(Kufe DW),2003)
a一种试剂是有疗效的，但两种或两种以上的治疗试剂具有更高的治愈率。
b一种试剂治愈状态1非洲伯基特，但优选两种或两种以上。
暴露于化学治疗剂可产生可在药物存在下存活的抗性肿瘤细胞群体。避免这种治疗抗性是组合治疗的另一重要基本原则。
具有不重叠副作用的药物的组合在较低剂量的每种药物下可产生叠加或协同抗肿瘤作用，因而降低副作用。因此，协同作用或增强作用的可能有利结果包括i)增加治疗性作用的功效、ii)降低剂量但增加或维持相同功效以避免毒性、iii)将抗药性的发展减到最小、iv)提供针对靶相对于宿主的选择性协同作用(或功效协同作用)。药物组合因为这些治疗性益处已广泛用于治疗复杂疾病，例如癌症和传染性疾病。
因为抑制Hsp90可杀死恶性细胞并导致许多其底物蛋白质的降解，所以鉴别肿瘤-Hsp90底物蛋白质可揭露其它治疗性靶。在这项研究中，我们的目的是在DLBCL存活中研究BCR路径和CSN(Hsp90的底物)作为与Hsp90抑制的组合疗法的潜在靶。我们预计对Hsp90和其底物蛋白质的组合抑制将协同杀死DLBCL，从而使得患者反应增加而毒性降低。
6.Hsp90与其底物BCL6抑制之间的协同作用：原理证据
转录抑制因子BCL6(GCB DLBCL基因表达的标志)是DLBCL中所最通常涉及的致癌基因。BCL6形成转录抑制复合物以不利地调节与GC B细胞的DNA损伤反应和浆细胞分化有关的基因表达。BCL6是B细胞经历免疫球蛋白亲和力成熟(叶(Ye)等人,1997)和生发中心中的体细胞超突变所需的。BCL6的异常组成性表达(叶等人,1993)可导致如动物模型中所示的DLBCL。BCL6的肽模拟抑制剂RIBPI选择性杀死BCL-6依赖性DLBCL细胞(瑟池特等人,2010a；瑟池特等人,2009b)并且正在开发用于临床。
使用PU-H71珠粒的CP揭露BCL6是DLBCL细胞系中Hsp90的底物蛋白质，并且用PU-H71处理可诱导BCL6降解(瑟池特等人,2009a)(图18)。RI-BPI与PU-H71处理协同杀死DLBCL细胞系和异种移植物(瑟池特等人,2010b)(图18)。这一发现充当原理证据，证明可通过肿瘤-Hsp90的CP鉴别DLBCL中的靶并且对Hsp90和其底物蛋白质的组合抑制协同杀死DLBCL。
7.BCR信号传导
BCR是一种大的跨膜受体，其配体介导的活化导致B细胞中的广泛下游信号传导级联反应(在图19中概述)。BCR的细胞外配体结合域是膜免疫球蛋白(membraneimmunoglobulin，mIg)，最经常是mIgM或mIgD，类似于所有抗体，其含有两个重Ig(IgH)链和两个轻Ig(IgL)链。Igα/Igβ(CD79a/CD79b)杂二聚体与mIg缔合并且充当受体的信号转导部分。BCR的配体结合引起受体聚集，通过src家族激酶(Lyn、Blk、Fyn)诱导CD79a/CD79b的细胞质尾上所见的基于免疫受体酪氨酸的活化基元(immunoreceptor tyrosine-basedactivation motif，ITAM)的磷酸化。Syk(一种细胞质酪氨酸激酶)被募集到CD79a/CD79b上的双重磷酸化ITAM，在那里被活化，产生涉及布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)、磷脂酶Cγ(PLCγ)和蛋白激酶Cβ(PKC-β)的信号传导级联反应。BLNK是一种可募集PLCγ、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3-K)和Vav的重要衔接分子。通过BCR聚集活化这些激酶可导致在膜上形成BCR信号体，所述BCR信号体包含BCR、CD79a/CD79b杂二聚体、src家族激酶、Syk、BTK、BLNK和其相关信号传导酶。BCR信号体介导信号从膜上的受体转导到下游信号传导效应物。
通过Ras将来自BCR信号体的信号转导到细胞外信号相关激酶(ERK)家族蛋白质并且通过Rac/cdc43转导到有丝***原活化蛋白激酶(MAPK)家族。PLCγ的活化使得细胞钙(Ca2+)增加，从而导致Ca2+-钙调素激酶(CamK)和NFAT的活化。值得注意的是，细胞Ca2+的增加可活化PKC-β，其使Carma1(CARD11)(一种与BCL10和MALT1形成复合物的衔接蛋白)磷酸化。这种CBM复合物活化IκB激酶(IKK)，导致IκB磷酸化，其螯合细胞溶质中的NF-κB亚单位。使磷酸化的IκB泛素化，从而使其降解并使NF-κB亚单位定位到核。这一复杂路径中的许多其它下游效应物(p38MAPK、ERK1/2、CaMK)移位到核以影响与细胞存活、增殖、生长和分化有关的基因(NF-κB、NFAT)的转录变化。Syk还活化磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，导致细胞PIP3增加。这种第二信使活化促进细胞生长和存活的急性转化逆转录病毒(acutelytransforming retrovirus，Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)路径(达尔波托(Dal Porto)等人,2004)。
8.DLBCL中的异常BCR信号传导
BCR信号传导是B细胞的存活和成熟(兰姆(Lam)等人,1997)，特别是通过NF-κB传导存活信号所必需的。事实上，组成性NF-κB信号传导是ABC DLBCL的特点(戴维斯(Davis)等人,2001)。此外，BCR和其效应物的突变促使DLBCL、尤其是ABC DLBCL中NF-κB的活性增强。
已显示CD79a/CD79b杂二聚体的ITAM中的突变与DLBCL中的超反应性BCR活化相关并且降低受体内化(戴维斯等人,2010)。CD79ITAM突变还通过Lyn激酶阻断负调节。Lyn使CD22和Fcγ-受体(与BCR通信的膜受体)上的基于免疫受体酪氨酸的不活化基元(immunoreceptor tyrosine-based inactivation motif，ITIM)磷酸化。在停泊于这些磷酸化的ITIM上后，SHP1使CD79ITAM脱磷酸，从而引起BCR信号传导下调。Lyn还在负调节位点处使Syk磷酸化，从而降低其活性(陈(Chan)等人,1997)。综上所述，ABC与GCB DLBCL两者中所见的CD79 ITAM的突变导致Lyn激酶活性降低和通过BCR进行的信号传导增加。
BCR路径组分中的某些突变直接增强NF-κB活性。CARD11衔接蛋白中的体细胞突变导致IKK的组成性活化，从而引起NF-κB活性增强，甚至在BCR啮合不存在下(稜兹(Lenz)等人,2008)。A20(一种泛素编辑酶)通过从IKK去除泛素链来终止NF-κB信号传导。A20中的不活化突变从ABC DLBCL中的NF-κB信号传导中去除这一妨碍因素(康帕诺(Compagno)等人,2009)。
ABC DLBCL中的这一组成性BCR活性被称为“慢性活性BCR信号传导”以将其与“紧张BCR信号传导”区别开。紧张BCR信号传导维持成熟B细胞并且不需要CARD11，因为缺乏CBM组分的小鼠具有正常B细胞数目(托梅(Thome),2004)。然而，慢性活性BCR信号传导需要CBM复合物并且通过显著的BCR聚集(抗原刺激B细胞而非静止B细胞的特征)来区分。事实上，与GCB DLBCL细胞系相比，CARD11、MALT1和BCL10的敲除优先对ABC有毒(尼果(Ngo)等人,2006)。慢性活性BCR信号传导主要与ABC DLBCL相关，然而CARD11和CD79 ITAM突变发生在GCB DLBCL中(戴维斯等人,2010；稜兹等人,2008)，表明BCR信号传导在DLBCL的亚型中是潜在靶。
9.靶向DLBCL中的BCR路径
因为其促进细胞生长、增殖和存活，所以BCR信号传导是癌症中的明显靶。DLBCL中BCR路径的突变(上文所描述)突出了其作为疾病中的靶的相关性。事实上，已靶向DLBCL中BCR的许多组分，并且这些治疗中的一些已经落实到患者。
蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)受体O截短型(PTPROt)(Syk的负调节因子)的过表达可抑制DLBCL中的增殖并诱导细胞凋亡，从而将Syk鉴别为DLBCL中的靶(陈等人,2006)。通过小分子福他替尼二钠(R406)抑制Syk可阻断DLBCL细胞系中的增殖并诱导细胞凋亡(陈等人,2008)。这种经口可用的化合物也显示显著临床活性和在DLBCL患者中的良好耐受性(弗里德贝格(Friedberg)等人,2010)。
RNA干扰筛选揭露Btk为DLBCL中的潜在靶。靶向Btk的短发夹RNA(shRNA)对DLBCL细胞系、尤其是ABC DLBCL具有高毒性。Btk的小分子不可逆抑制剂PCI-32765(宏尼伯格(Honigberg)等人,2010)有效杀死DLBCL细胞系、尤其是ABC DLBCL(戴维斯等人,2010)。所述化合物正在临床试验中并且已显示在B细胞恶性病中的功效和良好耐受性(福勒(Fowler)等人,2010)。
NF-κB的组成性活性使其成为DLBCL中合理的靶。可通过不同方法靶向NF-κB。抑制IKK可阻断IkB的磷酸化，从而防止NF-κB亚单位的释放和核移位。MLX105(一种选择性IKK抑制剂)有效杀死ABC DLBCL细胞系(兰姆等人,2005)。NEDD8活化酶(NAE)调节磷酸化IκB的CRL1βTRCP泛素化，导致其降解和NF-κB亚单位的释放。通过小分子(例如MLN4924)抑制NAE可诱导ABC DLBCL的细胞凋亡并且在DLBCL和患者异种移植模型中显示强肿瘤负荷消退。MLN4924显示在ABC DLBCL中更具效力，由于对组成性NF-κB活性的较高依赖性而预期其以这一亚型存活(米霍兰(Milhollen)等人,2010)。因为其活化IKK，所以抑制PKC-β是阻断NF-κB活性的另一方法。即使在高剂量下，特定PKC-β抑制剂(例如Ly379196)仍可杀死ABC与GCBDLBCL细胞系两者(苏(Su)等人,2002)。
这些靶向NF-κB活性的方法是有前途的DLBCL疗法。对IKK和NAE的抑制在ABCDLBCL中最有效，但在GCB DLBCL中也可见有效性较小的作用。这些研究表明组合NF-κB活性与其它靶向疗法可在DLBCL亚型中产生更加稳固的作用。
PI3K/Akt/mTOR路径在许多人类疾病中失调并且在DLBCL中组成性活化(笈多(Gupta)等人,2009)。因为恶性细胞利用这一路径促进细胞生长和存活，所以已深入研究所述路径的小分子抑制剂。雷帕霉素(西罗莫司(sirolimus))(靶向mTOR的大环内脂抗菌素)是FDA批准的口服免疫抑制剂(亚普(Yap)等人,2008)。依维莫司(一种经口可用的雷帕霉素类似物)也已经批准作为移植物免疫抑制剂(胡德(Hudes)等人,2007)。这些化合物在DLBCL细胞系和患者样品中具有抗肿瘤活性(笈多,2009)，但其作用主要是具有抗增殖性和仅具有窄细胞毒性。为实现细胞毒性，已评估雷帕霉素和依维莫司与许多其它治疗剂的组合(阿克勒(Ackler)等人,2008；亚普等人,2008)。依维莫司在DLBCL中的II期临床研究已获得适度成功，其中ORR为35％(里德C(Reeder C),2007)。还显示依维莫司使DLBCL细胞系对其它细胞毒性剂敏感(万纳(Wanner)等人,2006)。这些发现清楚地证明mTOR抑制在DLBCL中、尤其在组合疗法中的治疗潜力。
抑制Akt也是有前途的癌症疗法并且可以许多方式靶向。基于脂类的抑制剂阻断Akt的PIP3结合PH域以防止其移位到膜。一种所述药物哌立福新(perifosine)已在体外和体内显示抗肿瘤活性。
总的说来，化合物仅显示部分反应，从而促使与其它靶向疗法组合(亚普等人,2008)。Akt的小分子抑制剂(例如GSK690693)引起淋巴瘤和白血病、尤其ALL的生长抑制和细胞凋亡(利维(Levy)等人,2009)，并且作为单一疗法或与其它靶向疗法组合可有效杀死DLBCL。
MAPK路径是癌症治疗剂中的另一受关注靶。致癌基因MCT-1在DLBCL患者样品中高度表达并且由ERK调节。抑制ERK可在DLBCL异种移植模型中引起细胞凋亡(戴(Dai)等人,2009)。已开发ERK和MEK的小分子抑制剂并且在临床中证明极佳的安全概況和肿瘤抑制活性。然而，对这些药物的反应尚不稳固，其中观察到四种部分患者反应并在22％的患者中报导稳定疾病(弗莱德(Friday)和阿迪艾(Adjei),2008)。单独抑制MEK可能不足以引起细胞毒性，因为MAPK路径的上游调节因子(即Ras和Raf)在癌症中的突变频率最高并且可调节不管MEK抑制仍维持细胞存活的其它激酶。面对这些缺陷，MEK抑制剂(例如AZD6244)已进入临床阶段。对MEK抑制的部分反应表明这些抑制剂与其它靶向疗法的组合可揭露更加稳固的患者反应(弗莱德和阿迪艾,2008)。
10.CSN：结构和功能
1996年最初在拟南芥(Aradopsis)中发现CSN为光形态发生的负调节因子(查姆维兹(Chamovitz)等人,1996)。所述复合物从酵母到人类高度保守并且包含八个亚单位，CSN1-CSN8，按照从最大到最小的大小编号(邓(Deng)等人,2000)。大部分CSN亚单位作为八亚单位全复合物(holocomplex)的一部分更稳定，但已报导一些较小复合物，例如含有CSN4-7的微型CSN(奥任(Oron)等人,2002；友田(Tomoda)等人,2002)。最初鉴别为Jun活化域结合蛋白(Junactivation-domain-binding protein，Jab1)的CSN5独立于全CSN而起作用，并且已显示与许多细胞信号传导介体相互作用(加藤(Kato)和加藤米田(Yoneda-Kato),2009)。这些复合物的分子结构和功能性尚不清楚了解。
CSN5和CSN6各自含有MPR1-PAD1-N端(MPN)域，但仅CSN5含有JAB1MPN域金属酶基元(JAMM/MPN+基元)。其它六个亚单位含有蛋白酶体-COP9信号体-起始因子3域(PCI(或PINT))(霍夫曼(Hofmann)和布赫(Bucher),1998)。尽管这些域的确切功能尚不完全了解，但其与蛋白酶体和eIF3复合物的盖状复合物具有极其类似的同源性(霍夫曼和布赫,1998)，表明CSN的功能与蛋白质合成和降解有关。
最佳表征的CSN功能是调节蛋白质稳定性。CSN通过使骨架蛋白去类泛素化来调节蛋白质降解。骨架蛋白是泛素E3接合酶中心处的蛋白质骨架。其也充当泛素E2结合酶的停泊位点和靶向用于降解的蛋白质底物。骨架蛋白-RING-E3接合酶(CRL)是泛素接合酶的最大家族。通过结合Nedd8对CRL的骨架蛋白亚单位的翻译后修饰是CRL活性所需的(千叶(Chiba)和田中(Tanaka),2004；奥赫(Ohh)等人,2002)。CSN5JAMM基元催化从CRL上去除Nedd8；这种去类泛素化反应需要完整的CSN全复合物(寇普(Cope)等人,2002；莎伦(Sharon)等人,2009)。尽管骨架蛋白去类泛素化不活化CRL，但CSN是CRL活化所需的(施韦希海默(Schwechheimer)和邓,2001)，并且可防止CRL组分通过自泛素化自毁(佩斯(Peth)等人,2007)。
CSN具有许多其它生物功能，包括细胞凋亡和细胞增殖。剔除小鼠中的CSN组分2、3、5和8由于大量细胞凋亡而引起早期胚胎死亡，其中CSN5剔除展现最严重表型(莱克-安徒生(Lykke-Andersen)等人,2003；梅农(Menon)等人,2007；友田(Tomoda)等人,2004；严(Yan)等人,2003)。这些功能可能与复合物在蛋白质稳定性和降解中的作用有关，因为这些基因剔除动物中的表型与NAE剔除小鼠(立石(Tateishi)等人,2001)和各种骨架蛋白剔除小鼠(迪莱(Dealy)等人,1999；李(Li)等人,2002；王(Wang)等人,1999)中的表型相似。
切除胸腺细胞中的CSN5由于促细胞凋亡BCL2相关X蛋白(Bax)的表达增加和抗细胞凋亡Bcl-xL蛋白的表达降低而导致细胞凋亡(帕纳托尼(Panattoni)等人,2008)。CSN5与周期素依赖性激酶(CDK)抑制剂p27的相互作用表明其在细胞增殖中的作用(友田等人,1999)。CSN5剔除的胸腺细胞显示G2停滞(帕纳托尼等人,2008)，而CSN8在T细胞从休眠进入细胞周期中起作用(梅农等人,2007)。
11.CSN和癌症
CSN与例如细胞凋亡、增殖和细胞周期调节的细胞功能有关表明其可在癌症中起作用。事实上，在各种肿瘤中观察到CSN5的过表达(表7)，并且敲除CSN5可抑制肿瘤细胞增殖(福本(Fukumoto)等人,2006)。CSN5也与真菌介导的与细胞增殖、侵袭和血管生成有关的基因的转录活化有关(埃德尔(Adler)等人,2006)。CSN2和CSN3分别由于其克服衰老(李尔(Leal)等人,2008)和抑制小鼠纤维母细胞增殖(加藤-米田(Yoneda-Kato)等人,2005)的能力而鉴别为假定肿瘤抑制因子。
表7.与肿瘤进展有关的CSN5过表达或临床结果(理查德(Richardson)和尊德尔(Zundel),2005)
在异种移植模型中敲除CSN5可显著降低肿瘤生长(苏普特诺(Supriatno)等人,2005)。天然产物姜黄素的衍生物通过抑制CSN5来抑制胰脏癌细胞的生长(李等人,2009)。综上所述，这些发现表明CSN是良好的癌症治疗性靶。
12.CSN和NF-κB活化：在DLBCL中的作用？
CSN在不同细胞环境下不同地调节NF-κB活性。在类风湿性关节炎患者的TNFα刺激的滑膜细胞(synviocyte)中，敲除CSN5可消除TNFR1接合依赖性IκBα降解和NF-κB活化(王等人,2006)。然而，切除TNFα刺激的内皮细胞中的CSN亚单位导致IκBα稳定和NF-κB的持续核移位(史怀彻(Schweitzer)和纳曼(Naumann),2010)。
研究T细胞中的CSN证明其在T细胞发育和存活中的关键作用。来自无CSN5小鼠的胸腺细胞显示细胞周期停滞和细胞凋亡增加。重要的是，这些细胞显示IκBα积累、核NF-κB积累降低和抗细胞凋亡NF-κB靶基因的表达降低(帕纳托尼等人,2008)，从而表明CSN5调节T细胞活化。事实上，CSN与活化T细胞中的CBM复合物相互作用。T细胞活化通过MALT1刺激CSN与MALT1和CARD11以及和BCL10的相互作用。CSN2和CSN5通过使BCL10去泛素化来稳定CBM。敲除任一亚单位可引起Bcl10的快速降解，而且还阻断TCR刺激的T细胞中的IKK活化，从而表明CSN可通过这一机制调节NF-κB活性(维特克(Welteke)等人,2009)。
CSN在NF-κB调节中的确切功能未明确定义，并且可能视细胞类型而不同。CSN与NF-κB调节有关(特别是在T细胞中并通过稳定CBM)表明其可在DLBCL病理中起作用。
初步结果
在OCI-Ly1和OCI-Ly7 DLBCL细胞系中进行CP。溶解细胞，并且提取细胞溶质和核溶解物。将溶解物与对照组或涂有PUH71的琼脂糖珠粒一起培育过夜，然后洗涤以去除非特异性结合蛋白。通过在SDS/PAGE加载缓冲液中沸腾来洗脱紧密结合蛋白，通过SDS/PAGE分离并且通过胶态蓝染色观测。将凝胶泳道切成区段并通过质谱法由我们的合作者进行分析。在PUH71沉降物而非对照组沉降物中高度呈现(由肽的数目确定)的蛋白质是候选者DLBCL相关Hsp90底物蛋白质。在排除常见蛋白质污染物和琼脂糖蛋白质组后，我们获得两个细胞系中由多种肽表示的80％重叠假定客户蛋白(N＝～200)。在这些实验中在PU-H71Hsp90客户中高度呈现的路径之一是BCR路径(200种中的23种蛋白质，在图19和图23中以灰色展示)。我们开始验证这一发现。初步数据显示Syk和Btk用递增的PU-H71都降解并且在DLBCL的CP中用PU-H71都沉降。PU-H71与R406(一种Syk抑制剂)协同杀死DLBCL细胞系(图20)。
实验方法
目的1：确定Hsp90和BCR路径的相伴调节是否在体外和体内协力杀死DLBCL细胞
我们的初步数据将BCR路径的许多组分鉴别为DLBCL中Hsp90的底物蛋白质。BCR路径与肿瘤形成和DLBCL存活有关。我们假设对Hsp90和BCR路径的组分的组合抑制将协同杀死DLBCL。
实验设计和预期结果
将DLBCL细胞系维持在培养物中。GCB DLBCL细胞系将包括OCI-Ly1、OCI-Ly7和Toledo。ABC DLBCL细胞系将包括OCI-Ly3、OCI-Ly10、HBL-1、TMD8。将细胞系OCI-Ly1、OCI-Ly7和OCI-Ly10维持在含有10％FBS并补充有青霉素和链霉素的90％伊思考夫氏改良培养基(Iscove's modified medium)中。细胞系Toledo、OCI-Ly3和HBL-1将在补充有青霉素和链霉素、L-谷氨酰胺和HEPES的90％RPMI和10％FBS中生长。TMD8细胞系将在含有补充有青霉素和链霉素的90％mem-α和10％FBS培养基中生长。
在两个DLBCL细胞系的PU-H71CP的蛋白质组学分析的初步实验中将BCR路径的组分鉴别为Hsp90的底物蛋白质。为检验BCR路径的组分由Hsp90稳定，将使用DLBCL细胞系进行CP并通过西方印迹使用BCR路径组分的市售抗体进行分析，所述抗体包括CD79a、CD79b、Syk、Btk、PLCγ2、AKT、mTOR、CAMKII、p38 MAPK、p40ERK1/2、p65、Bcl-XL、Bcl6。将用递增的盐浓度进行CP以显示Hsp90对于这些底物蛋白质的亲和力。因为一些蛋白质以低水平表达，所以将进行细胞溶解物的核/细胞溶质分离以富集使用全细胞溶解物不容易检测到的Hsp90底物蛋白质。
BCR路径组分的Hsp90稳定也将通过用递增剂量的PU-H71处理DLBCL细胞系来证明。以上所列的底物蛋白质的水平将通过西方印迹来测定。预期底物蛋白质通过暴露于PU-H71而以剂量依赖性和时间依赖性方式降解。
DLBCL细胞系的存活力将在用PU-H71或BCR路径组分(Syk、Btk、PLCγ2、AKT、mTOR、p38 MAPK、p40 ERK1/2、NF-κB)的抑制剂处理后进行评估。BCR路径组分的抑制剂将基于DLBCL中的报导数据和临床试验中的用途进行选择和优先考虑。举例来说，马尼克(Melnick)实验室具有适当MTA以使用PCI-32765和MLN4924(上文所描述)。将细胞以足以保持未处理的细胞指数生长持续药物处理的持续时间的浓度接种于96孔板中。将在一式三份孔中投予6种不同浓度的药物持续48小时。将用荧光测定刃天青还原方法(CellTiter-Blue，普洛麦格公司)测量细胞存活力。
将在马尼克实验室(伯腾仪器有限公司(BioTek))中使用Synergy4微量培养板读取器测量荧光(560激发/590发射)。将在PU-H71情况下相对于适当媒剂对照组(例如水)正规化经过处理的细胞的存活力。剂量-效应曲线和与对照组相比使细胞系生长抑制50％(GI50)的药物浓度的计算将使用CompuSyn软件(拜索夫特公司(Biosoft))进行。尽管这些发现中的许多可通过公开数据证实，但制定使用这些抑制剂的有效方法和确定其在我们的细胞系中的剂量反应将是证明Hsp90和BCR路径的组合抑制作用的稍后组合处理实验所必需的。
一旦确定BCR路径抑制剂的个别剂量-反应曲线和GI50，那么将用PU-H71和BCR路径的单一抑制剂处理DLBCL细胞以证明所述组合对细胞杀死的作用。实验将在96孔板中使用上述条件进行。将用6种不同浓度的恒定比率的药物组合处理细胞一式三份，其中最高剂量为如在个别剂量-反应实验中所测量的每种药物的GI50的两倍。为了确定最有效治疗时程，将以不同顺序投与药物：PU-H71，随后24小时后药物X；药物X，随后24小时后PU-H71；和PU-H71与药物X一起。将在48小时后使用上文所提及的分析测定存活力。细胞存活力的等效线图分析将使用Compusyn软件进行。
上文所提出的在DLBCL细胞系中的组合处理将在剂量和时程方面指导在异种移植模型中的实验。展现最佳细胞杀死作用的药物时程将落实到异种移植模型中。将DLBCL细胞系皮下注射到SCID小鼠中，使用预期对药物起反应的两个细胞系和预期不起反应的一个细胞系作为阴性对照组。将每隔一天监测肿瘤生长直到可触知(约75-100mm3)。动物(n＝20)将随机分成以下各组：对照组、PU-H71、BCR路径抑制剂(药物X)和PU-H71+药物X，其中每组五个动物。为测量药物对肿瘤生长的作用，将在药物投予后每隔一天用Xenogen IVIS***测量肿瘤体积。十天后，将处死所有动物，并且将通过TUNEL分析肿瘤的细胞凋亡。为评估药物对存活的作用，将处理如上文所指定的第二组动物并当肿瘤大小达到1000mm3时处死。将以生物化学方法分析肿瘤以证明药物达到其靶，例如通过ELISA分析NF-κB活性或下游靶的磷酸化。我们将对经过处理的小鼠进行马尼克实验室中所建立的毒性研究，包括身体检查、宏观和显微组织检查、血清化学反应和CBC(瑟池特等人,2009a)。
替代方案和缺陷
如果用于检测细胞存活力的荧光分析与一些细胞系不相容(由于例如培养基的酸性)，那么将使用基于ATP的发光方法(CellTiter-Glo，普洛麦格公司)。此外，因为一些药物可能在48小时内不会杀死细胞，所以必要时将进行较高药物剂量和更长药物培育以确定最佳药物处理。可能抑制一些BCR路径组分当与抑制Hsp90组合时不会显示改善的杀死DLBCL的作用，但基于上文所示的初步数据，我们相信一些组合将比单独的任一药物更加有效。
目的2：评估CSN在DLBCL中的作用
子目的1：确定CSN是否可为DLBCL治疗性靶
我们的初步数据已将CSN的亚单位鉴别为DLBCL中Hsp90的底物蛋白质。CSN与癌症有关并且可在DLBCL存活中起作用。我们假设DLBCL的存活需要CSN并且对Hsp90和CSN的组合抑制将协同杀死DLBCL。
实验设计和预期结果
将检验CSN亚单位在DLBCL细胞系(上文所描述)中的表达。将溶解DLBCL细胞系以进行蛋白质收集并通过SDS-PAGE和西方印迹使用CSN亚单位的市售抗体和作为内参考物(loading control)的肌动蛋白进行分析。
在两个DLBCL细胞系的PU-H71 CP的初步蛋白质组学分析中将CSN鉴别为Hsp90的底物蛋白质。为检验Hsp90稳定CSN，将如上文所述使用DLBCL细胞系进行CP并通过西方印迹分析。CSN的Hsp90稳定也将通过用递增的PU-H71浓度处理DLBCL细胞系来证明。CSN亚单位的蛋白质水平将通过西方印迹来测定。预期CSN亚单位在暴露于PU-H71时以剂量依赖性和时间依赖性方式降解。
将用含有靶向CSN2或CSN5的短发夹(sh)RNA的慢病毒pLKO.1载体感染DLBCL细胞系并通过嘌呤霉素抗性进行选择。这些载体是通过RNAi协会购得的。因为敲除一个CSN亚单位可影响其它CSN亚单位的表达(梅农等人,2007；史怀彻等人,2007；史怀彻和纳曼,2010)和敲除CSN2可消除CSN全复合物的形成，所以将使用这些亚单位。因为这一亚单位含有CSN的酶促域，所以将使用CSN5敲除。将针对每一靶测试3到5种shRNA的池以获得靶蛋白质得到最佳敲除的序列。将使用空载体和杂乱shRNA作为对照组。因为我们预计敲除CSN亚单位将杀死DLBCL细胞，并且我们的目的是测量细胞存活力，所以将使用四环素(tet)诱导性构筑体。这种方法也可允许我们确定使用shRNA诱导滴定来剂量依赖性敲除CSN亚单位的条件。在感染和tet诱导后将通过西方印迹评估敲除效率。在感染后将使用目的1中所描述的方法评估细胞的存活力。我们预计敲除CSN将杀死DLBCL，并且由于CSN在稳定CBM复合物中的作用预期ABC DLBCL比GCB DLBCL的存活更依赖于CSN。
在对DLBCL的CSN单一疗法实验后，在DLBCL细胞系中诱导CSN敲除将与PU-H71处理组合。为了进行48小时细胞存活力实验，将使用证明在48小时内(如早期实验中所评估的)有效剂量依赖性CSN敲除的shRNA构筑体。将使用如上文所描述的对照组shRNA。将用不同剂量的恒定比率的tet和PU-H71处理对照组细胞和感染靶向CSN亚单位的tet诱导性shRNA构筑体的细胞一式三份。为了确定最有效治疗时程，将以不同顺序投予药物：PU-H71，随后tet；tet，随后PU-H71；和PU-H71与tet一起。将如目的1中所描述测量细胞存活力。预期对CSN和Hsp90的组合抑制协同杀死DLBCL、尤其是ABC DLBCL。
上文所提出的对DLBCL细胞系中CSN和Hsp90的组合抑制将指导在异种移植模型中的实验。将在异种移植实验中使用来自体外实验的PU-H71和CSN敲除的最有效组合。对于异种移植将使用对照组和诱导性剔除CSN的DLBCL细胞，使用预期对处理起反应的两个细胞系和预期不对处理起反应的一个细胞系作为阴性对照组。将用媒剂、PU-H71或tet，使用如通过体外实验所确定的PU-H71和tet的最有效组合的剂量和时程处理动物。肿瘤生长、动物存活和毒性将如目的1中所描述进行分析。
替代方案和缺陷
通过四环素诱导滴定来实现CSN的剂量依赖性敲除可能证明是困难的。如果为了说明原理证据而进行这一实验，那么将使用具有不同敲除效率的shRNA模拟作为单一疗法和与不同剂量的PU-H71组合的CSN的递增抑制。
子目标2：确定DLBCL依赖于CSN的机制
因为已显示CSN与CBM复合物相互作用并活化受到刺激的T细胞中的IKK，所以我们假设CSN与CBM相互作用，稳定Bcl10，并活化DLBCL中的NF-κB。
实验设计和预期结果
将DLBCL细胞溶解物与有效地使整个CSN复合物沉淀的CSN1的抗体一起培育(达西法克瑞雅(da Silva Correia)等人,2007；韦(Wei)和邓,1998)。将通过SDS-PAGE分离沉淀的CSN1复合物并通过西方印迹使用CBM的不同组分的市售抗体分析与CBM组分的相互作用：CARD11、BCL10和MALT1。基于所报导的T细胞实验，我们预期与GCB DLBCL细胞系相比，由于ABC DLBCL中的慢性活性BCR信号传导，因此CSN优先与ABC DLBCL细胞系中的CARD11和MALT1相互作用。
因为已显示CSN、尤其是CSN5调节活化T细胞中的Bcl10稳定性和降解，所以我们假设CSN稳定DLBCL中的Bcl10。将如上文所描述用靶向CSN亚单位的短发夹(sh)RNA感染DLBCL细胞系。将用tet处理细胞以诱导CSN亚单位敲除并且将通过西方印迹定量受感染和经过诱导的细胞中的Bcl10蛋白水平。我们预期Bcl10水平因CSN亚单位敲除而以剂量依赖性和时间依赖性方式降解。为证明Bcl10蛋白减少不是细胞死亡的结果，通过在细胞溶解之前用锥虫蓝计数活细胞来测量细胞存活力。将CSN亚单位敲除与蛋白酶体抑制组合以证明Bcl10降解是CSN切除的特定作用。
预期敲除CSN2或CSN5可消除DLBCL细胞系中的NF-κB活性。使用受对照组shRNA或CSN2或CSN5的shRNA感染的DLBCL细胞系，将以数种方式分析对照组和受感染细胞的NF-κB活性。首先，将通过西方印迹分析溶解物以测定IκBα蛋白的水平。其次，将通过溶解细胞的核和细胞溶质部分的西方印迹或通过来自对照组和受感染细胞的核的基于培养板的EMSA来测量NF-κB亚单位p65和c-Rel的核移位。最后，将通过分别通过反转录酶PCR(RT-PCR)和西方印迹制备的cDNA的定量PCR在转录物和蛋白质水平上评估这些细胞的NF-κB靶基因表达。
替代方案和缺陷
因为显示CSN与TCR刺激的T细胞中的CBM相互作用，所以我们预计CSN与DLBCL、尤其是ABC DLBCL中的CBM相互作用，因为这一亚型展现慢性活性BCR信号传导。如果CSN-CBM相互作用在DLBCL中不明显，那么为了活化BCR路径并刺激CBM形成，将用IgM刺激细胞。为确定CSN与CBM的相互作用的动力学，将在从IgM刺激时刻起的时程内进行如上文所描述的细胞IP。为将CSN-CBM相互作用与CBM形成的动力学关联起来，将进行BCL10IP以证明在相同时程内的BCL10-CARD11相互作用。
结论和未来方向
开发PU-H71作为用于DLBCL的新疗法是有前途的，但组合治疗可能更有效并且毒性更小。PU-H71也可用作鉴别Hsp90的底物蛋白质的工具。在使用这种方法的实验中，将BCR路径和CSN鉴别为DLBCL中Hsp90的底物。
BCR在DLBCL肿瘤形成和存活中起作用，并且为靶向这一路径的组分所作的努力已获得成功。我们预计组合PU-H71和对BCR路径组分的抑制将是一种更有效并且毒性更小的治疗方法。将在细胞和异种移植模型中评估所鉴别的协同组合以落实到临床试验，并且最终将患者治疗向合理设计的靶向疗法推进并远离化学疗法。
CSN与癌症和NF-κB活化有关，表明其可为DLBCL中的良好靶。我们假设CSN稳定CBM复合物，从而促进NF-κB活化和DLBCL存活。因此，我们预计对Hsp90和CSN的组合抑制将协同杀死DLBCL。这些研究将充当原理证据，证明可使用这一提议中所描述的蛋白质组学方法来鉴别新治疗性靶。
未来的研究将鉴别靶向CSN的化合物，并且最终将CSN抑制剂作为用于DLBCL的创新疗法而应用到临床。确定CSN抑制的下游效应(例如CBM稳定和NF-κB活化)可对三种药物的其它组合性药物方案显示出新的机会。未来的研究将评估同时抑制Hsp90、CSN和其下游靶的三种药物的组合性方案。
将使用临床开发中的其它Hsp90抑制剂(例如17-DMAG)进行在这项研究中所见的使用PU-H71的最有效药物组合以证明所鉴别的有效药物组合的广泛临床适用性。
DLBCL(非霍奇金氏淋巴瘤的最常见形式)是一种保持不变而不会治愈的侵袭性疾病。本文所提出的研究将推进对DLBCL背后的分子机制的了解并改善患者疗法。
在本文中，我们报导基于连接于Affi-10珠粒的嘌呤、嘌呤样异噁唑和吲唑-4-酮化学种类的分子的设计和合成(图30、32、33、35、38)以及生物素标记的嘌呤、嘌呤样、吲唑-4-酮和异噁唑化合物的合成(图31、36、37、39、40)。这些是研究和了解Hsp90抑制剂的独特特性的分子基础的化学工具。其也可用于通过检查结合的客户蛋白和共伴侣来充分了解Hsp90肿瘤生物学。了解最可能由每种Hsp90抑制剂调节的Hsp90的肿瘤特异性客户可使得较好的选择药效学标记和因此较好的临床设计。并非最后，了解这些Hsp90抑制剂之间的分子差异可使得鉴别出的特征可使得设计具有最有利临床概况的Hsp90抑制剂。
合成Hsp90探针的方法
6.1.总则
在布鲁克(Bruker)500MHz仪器上记录1H和13C NMR光谱。化学位移是以从作为内标的TMS向低场移动的δ值(以ppm计)报导。1H数据如下报导：化学位移、多样性(s＝单峰、d＝双重峰、t＝三重峰、q＝四重峰、br＝宽峰、m＝多重峰)、耦合常数(Hz)、积分。13C化学位移是以从作为内标的TMS向低场移动的δ值(以ppm计)报导。在具有电喷雾电离和SQ检测器的沃特世Acquity超高效液相色谱仪(Waters Acquity Ultra Performance LC)上获得低分辩率质谱。在具有PDA、MicroMass ZQ和ELSD检测器和反相柱(沃特世X-Bridge C18，4.6×150mm，5μm)的沃特世自动纯化***上，使用(a)H2O+0.1％TFA和(b)CH3CN+0.1％TFA、在10分钟内以1.2mL/min从5到95％b的梯度，进行高效液相色谱分析。使用230-400目硅胶(EMD)进行柱色谱分析。所有反应都是在氩气保护下进行。Affi-10珠粒是购自伯乐公司(加利福尼亚州赫拉克勒斯(Hercules,CA)。EZ-胺-PEO3-生物素是购自皮尔斯公司(伊利诺斯州罗克福德(Rockford,Il))。PU-H71(赫等人,2006)和NVP-AUY922(布拉夫等人,2008)是根据先前公开的方法合成的。GM是购自奥尔德里奇公司。
6.2.合成
6.2.1.9-(3-溴丙基)-8-(6-碘苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基硫基)-9H-嘌呤-6-胺(9-(3-Bromopropyl)-8-(6-iodobenzo[d][1,3]dioxol-5-ylthio)-9H-purin-6-amine)(2)
将1(赫等人,2006)(0.500g，1.21mmol)溶解于DMF(15mL)中。加入Cs2CO3(0.434g，1.33mmol)和1,3-二溴丙烷(1.22g，0.617mL，6.05mmol)并在室温下搅拌混合物45分钟。然后再加入Cs2CO3(0.079g，0.242mmol)并搅拌混合物45分钟。在减压下去除溶剂并对所得残余物进行色谱分析(CH2Cl2:MeOH:AcOH，120:1:0.5到80:1:0.5)，得到0.226g(35％)呈白色固体状的2。1H NMR(CDCl3/MeOH-d4)δ8.24(s,1H),7.38(s,1H),7.03(s,1H),6.05(s,2H),4.37(t,J＝7.1Hz,2H),3.45(t,J＝6.6Hz,2H),2.41(m,2H)；MS(ESI):m/z 534.0/536.0[M+H]+。
6.2.2.6-氨基己基氨基甲酸叔丁酯(tert-Butyl 6-aminohexylcarbamate)(3)(汉森(Hansen)等人,1982)
将1,6-二氨基己烷(10g，0.086mol)和Et3N(13.05g，18.13mL，0.129mol)悬浮于CH2Cl2(300mL)中。在室温下在90分钟内逐滴加入二碳酸叔丁酯(9.39g，0.043mol)于CH2Cl2(100mL)中的溶液并持续搅拌18小时。将反应混合物加入分液漏斗中并用水(100mL)、盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。对所得残余物进行色谱分析[CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，70:1到20:1]，得到7.1g(76％)3。1H NMR(CDCl3)δ4.50(br s,1H),3.11(br s,2H),2.68(t,J＝6.6Hz,2H),1.44(s,13H),1.33(s,4H)；MS(ESI):m/z 217.2[M+H]+。
6.2.3.6-(3-(6-氨基-8-(6-碘苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基硫基)-9H-嘌呤-9-基)丙基氨基)己基氨基甲酸叔丁酯(tert-Butyl 6-(3-(6-amino-8-(6-iodobenzo[d][1,3]dioxol-5-ylthio)-9H-purin-9-yl)propylamino)hexylcarbamate)(4)
在室温下搅拌含2(0.226g，0.423mmol)和3(0.915g，4.23mmol)的DMF(7mL)24小时。浓缩反应混合物并对残余物进行色谱分析[CHCl3:MeOH:MeOH-NH3(7N)，100:7:3]，得到0.255g(90％)4。1H NMR(CDCl3)δ8.32(s,1H),7.31(s,1H),6.89(s,1H),5.99(s,2H),5.55(br s,2H),4.57(br s,1H),4.30(t,J＝7.0Hz,2H),3.10(m,2H),2.58(t,J＝6.7Hz,2H),2.52(t,J＝7.2Hz,2H),1.99(m,2H),1.44(s,13H),1.30(s,4H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ156.0,154.7,153.0,151.6,149.2,149.0,146.3,127.9,120.1,119.2,112.4,102.3,91.3,79.0,49.8,46.5,41.8,40.5,31.4,29.98,29.95,28.4,27.0,26.7；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C26H37IN7O4S,计算值670.1673；实验值670.1670；HPLC:tR＝7.02分钟。
6.2.4.N1-(3-(6-氨基-8-(6-碘苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基硫基)-9H-嘌呤-9-基)丙基)己烷-1,6-二胺(N1-(3-(6–Amino–8-(6-iodobenzo[d][1,3]dioxol–5-ylthio)-9H-purin-9-yl)propyl)hexane-1,6-diamine)(5)
将4(0.310g，0.463mmol)溶解于15mL CH2Cl2:TFA(4:1)中并在室温下搅拌溶液45分钟。在减压下去除溶剂并对残余物进行色谱分析[CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，20:1到10:1]，得到0.37g白色固体。将这固体溶解于水(45mL)中并加入固体Na2CO3直到pH～12。用CH2Cl2(4×50mL)萃取这一物质并用水(50mL)洗涤合并的有机层，经Na2SO4干燥，过滤且在减压下浓缩，得到0.200g(76％)5。1H NMR(CDCl3)δ8.33(s,1H),7.31(s,1H),6.89(s,1H),5.99(s,2H),5.52(br s,2H),4.30(t,J＝6.3Hz,2H),2.68(t,J＝7.0Hz,2H),2.59(t,J＝6.3Hz,2H),2.53(t,J＝7.1Hz,2H),1.99(m,2H),1.44(s,4H),1.28(s,4H)；13C NMR(125MHz,CDCl3/MeOH-d4)δ154.5,152.6,151.5,150.0,149.6,147.7,125.9,119.7,119.6,113.9,102.8,94.2,49.7,46.2,41.61,41.59,32.9,29.7,29.5,27.3,26.9；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C21H29IN7O2S,计算值570.1148；实验值570.1124；HPLC:tR＝5.68分钟。
6.2.5.PU-H71-Affi-Gel 10珠粒(6)
将4(0.301g，0.45mmol)溶解于15mL CH2Cl2:TFA(4:1)中并在室温下搅拌溶液45分钟。在减压下去除溶剂并在高度真空下干燥残余物过夜。将这一物质溶解于DMF(12mL)中并加入固相肽合成容器中的25mL Affi-Gel 10珠粒(预先洗涤，3×50mL DMF)中。加入225μLN,N-二异丙基乙胺和若干DMAP晶体并在室温下将这一物质震荡2.5小时。然后加入2-甲氧基乙胺(0.085g，97μl，1.13mmol)并继续震荡30分钟。然后去除溶剂并用CH2Cl2:Et3N(9:1，4×50mL)、DMF(3×50mL)、菲特氏缓冲液(3×50mL)和i-PrOH(3×50mL)洗涤珠粒，每次10分钟。在-80℃下将珠粒6贮存于i-PrOH(珠粒:i-PrOH(l:2)，v/v)中。
6.2.6.PU-H71-生物素(7)
在室温下搅拌含2(4.2mg，0.0086mmol)和EZ-胺-PEO3-生物素(5.4mg，0.0129mmol)的DMF(0.2mL)24小时。浓缩反应混合物并对残余物进行色谱分析[CHCl3:MeOH-NH3(7N)，5:1]，得到1.1mg(16％)7。1H NMR(CDCl3)δ8.30(s,1H),8.10(s,1H),7.31(s,1H),6.87(s,1H),6.73(br s,1H),6.36(br s,1H),6.16(br s,2H),6.00(s,2H),4.52(m,1H),4.28-4.37(m,3H),3.58-3.77(m,10H),3.55(m,2H),3.43(m,2H),3.16(m,1H),2.92(m,1H),2.80(m,2H),2.72(m,1H),2.66(m,2H),2.17(t,J＝7.0Hz,2H),2.04(m,2H),1.35-1.80(m,6H)；MS(ESI):m/z 872.2[M+H]+。
6.2.7. 6-(4-(5-(2,4-双(苯甲酰基)-5-异丙基苯基)-3-(乙基氨甲酰基)异噁唑-4-基)苯甲基氨基)己基氨基甲酸叔丁酯(tert-Butyl 6-(4-(5-(2,4-bis(benzyloxy)-5-isopropylphenyl)-3-(ethylcarbamoyl)isoxazol-4-yl)benzylamino)hexylcarbamate)(9)
将AcOH(0.26g，0.25mL，4.35mmol)加入8(布拉夫等人,2008)(0.5g，0.87mmol)、3(0.56g，2.61mmol)、NaCNBH3(0.11g，1.74mmol)、CH2Cl2(21mL)和分子筛(3g)的混合物中。在室温下搅拌反应混合物1小时。然后在减压下浓缩并进行色谱分析[CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，100:1到60:1]，得到0.50g(75％)9。1H NMR(CDCl3)δ7.19-7.40(m,12H),7.12-7.15(m,2H),7.08(s,1H),6.45(s,1H),4.97(s,2H),4.81(s,2H),3.75(s,2H),3.22(m,2H),3.10(m,3H),2.60(t,J＝7.1Hz,2H),1.41-1.52(m,13H),1.28-1.35(m,4H),1.21(t,J＝7.2Hz,3H),1.04(d,J＝6.9Hz,6H)；MS(ESI):m/z 775.3[M+H]+。
6.2.8. 4-(4-((6-氨基己基氨基)甲基)苯基)-5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-N-乙基异噁唑-3-甲酰胺(4-(4-((6-Aminohexylamino)methyl)phenyl)–5-(2,4–dihydroxy-5-isopropylphenyl)-N-ethylisoxazole-3-carboxamide)(10)
向9(0.5g，0.646mmol)于CH2Cl2(20mL)中的溶液中加入BCl3(1.8mL，1.87mmol，1.0M于CH2Cl2中)的溶液并且在室温下搅拌这一物质10小时。加入饱和NaHCO3并在减压下蒸发CH2Cl2。小心地倾析水并用EtOAc和CH2Cl2洗涤残余黄色沉淀物数次，得到0.248g(78％)10。1H NMR(CDCl3/MeOH-d4)δ7.32(d,J＝8.1Hz,2H),7.24(d,J＝8.1Hz,2H),6.94(s,1H),6.25(s,1H),3.74,(s,2H),3.41(q,J＝7.3Hz,2H),3.08(m,1H),2.65(t,J＝7.1Hz,2H),2.60(t,J＝7.1Hz,2H),1.40-1.56(m,4H),1.28-1.35(m,4H),1.21(t,J＝7.3Hz,3H),1.01(d,J＝6.9Hz,6H)；13C NMR(125MHz,CDCl3/MeOH-d4)δ168.4,161.6,158.4,157.6,155.2,139.0,130.5,129.5,128.71,128.69,127.6,116.0,105.9,103.6,53.7,49.2,41.8,35.0,32.7,29.8,27.6,27.2,26.4,22.8,14.5；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C28H39N4O4,计算值495.2971；实验值495.2986；HPLC:tR＝6.57分钟。
6.2.9.NVP-AUY922-Affi-Gel 10珠粒(11)
将10(46.4mg，0.094mmol)溶解于DMF(2mL)中并且在固相肽合成容器中加入5mLAffi-Gel 10珠粒(预洗涤，3×8mL DMF)中。加入45μL N,N-二异丙基乙胺和若干DMAP晶体并在室温下将这一物质震荡2.5小时。然后加入2-甲氧基乙胺(17.7mg，21μl，0.235mmol)并持续震荡30分钟。然后去除溶剂并用CH2Cl2(3×8mL)、DMF(3×8mL)、菲特氏缓冲液(3×8mL)和i-PrOH(3×8mL)洗涤珠粒，每次10分钟。在-80℃下将珠粒11贮存于i-PrOH(珠粒:i-PrOH(1:2)，v/v)中。
6.2.10.N'-(3,3-二甲基-5-氧代亚环己基)-4-甲基苯磺酰肼(N'-(3,3–Dimethyl–5-oxocyclohexylidene)-4-methylbenzenesulfonohydrazide)(14)(海格尔(Hiegel)和布克(Burk),1973)
将10.00g(71.4mmol)双甲酮(13)、13.8g(74.2mmol)甲苯磺酰肼(12)和对甲苯磺酸(0.140g，0.736mmol)悬浮于甲苯(600mL)中并在搅拌下使这一物质回流1.5小时。当还是热的时，过滤反应混合物并且用甲苯(4×100mL)、冰冷的乙酸乙酯(2×200mL)和己烷(2×200mL)洗涤固体并干燥，得到19.58g(89％)呈固体状的14。TLC(100％EtOAc)Rf＝0.23；1HNMR(DMSO-d6)δ9.76(s,1H),8.65(br s,1H),7.69(d,J＝8.2Hz,2H),7.41(d,J＝8.1Hz,2H),5.05(s,1H),2.39(s,3H),2.07(s,2H),1.92(s,2H),0.90(s,6H)；MS(ESI):m/z 309.0[M+H]+。
6.2.11. 6,6-二甲基-3-(三氟甲基)-6,7-二氢-1H-吲唑-4(5H)-酮(6,6–Dimethyl–3-(trifluoromethyl)-6,7-dihydro-1H-indazol-4(5H)-one)(15)
向含5.0g(16.2mmol)14的THF(90mL)和Et3N(30mL)中整份加入三氟乙酸酐(3.4g，2.25mL，16.2mmol)。在55℃下加热所得红色溶液3小时。冷却到室温后，加入甲醇(8mL)和1MNaOH(8mL)并且在室温下搅拌溶液3小时。用25mL饱和NH4Cl稀释反应混合物，倾倒于分液漏斗中并用EtOAc(3×50mL)萃取。用盐水(3×50mL)洗涤合并的有机层，经Na2SO4干燥并在减压下浓缩，，得到红色油状残余物，对其进行色谱分析(己烷:EtOAc，80:20到60:40)，得到2.08g(55％)呈橙色固体状的15。TLC(己烷:EtOAc,6:4)Rf＝0.37；1H NMR(CDCl3)δ2.80(s,2H),2.46(s,2H),1.16(s,6H)；MS(ESI):m/z 231.0[M-H]-。
6.2.12. 2-溴-4-(6,6-二甲基-4-氧代-3-(三氟甲基)-4,5,6,7-四氢-1H-吲唑-1-基)苯甲腈(2-Bromo-4-(6,6-dimethyl-4-oxo-3-(trifluoromethyl)-4,5,6,7-tetrahydro-1H-indazol-1-yl)benzonitrile)(16)
向15(0.100g，0.43mmol)和NaH(15.5mg，0.65mmol)于DMF(8mL)中的混合物中加入2-溴-4-氟苯甲腈(86mg，0.43mmol)并且在90℃下加热5小时。在减压下浓缩反应混合物并对残余物进行色谱分析(己烷:EtOAc，10:1到10:2)，得到0.162g(91％)呈白色固体状的16。1H NMR(CDCl3)δ7.97(d,J＝2.1Hz,1H),7.85(d,J＝8.4Hz,1H),7.63(dd,J＝8.4,2.1Hz,1H),2.89(s,2H),2.51(s,2H),1.16(s,6H)；MS(ESI):m/z 410.0/412.0[M-H]-。
6.2.13. 2-(反-4-氨基环己基氨基)-4-(6,6-二甲基-4-氧代-3-(三氟甲基)-4,5,6,7-四氢-1H-吲唑-1-基)苯甲腈(2-(trans–4-Aminocyclohexylamino)–4-(6,6-dimethyl-4-oxo-3-(trifluoromethyl)-4,5,6,7-tetrahydro-1H-indazol-1-yl)benzonitrile)(17)
使16(0.200g，0.485mmol)、NaOtBu(93.3mg，0.9704mmol)、Pd2(dba)3(88.8mg，0.097mmol)和DavePhos(38mg，0.097mmol)于1,2-二甲氧基乙烷(15mL)中的混合物脱气并用氩气冲洗数次。加入反-1,4-二氨基环己烷(0.166g，1.456mmol)并且使烧瓶再次脱气并用氩气冲洗，随后在50℃下加热反应混合物过夜。在减压下浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化残余物，得到52.5mg(24％)17。另外，分离38.5mg(17％)酰胺18，总产率为41％。1H NMR(CDCl3)δ7.51(d,J＝8.3Hz,1H),6.81(d,J＝1.8Hz,1H),6.70(dd,J＝8.3,1.8Hz,1H),4.64(d,J＝7.6Hz,1H),3.38(m,1H),2.84(s,2H),2.81(m,1H),2.49(s,2H),2.15(d,J＝11.2Hz,2H),1.99(d,J＝11.0Hz,2H),1.25-1.37(m,4H),1.14(s,6H)；MS(ESI):m/z 446.3[M+H]+。
6.2.14. 2-(反-4-氨基环己基氨基)-4-(6,6-二甲基-4-氧代-3-(三氟甲基)-4,5,6,7-四氢-1H-吲唑-1-基)苯甲酰胺(2-(trans-4-Aminocyclohexylamino)–4-(6,6-dimethyl-4-oxo-3-(trifluoromethyl)-4,5,6,7-tetrahydro-1H-indazol-1-yl)benzamide)(18)
在室温下搅拌17(80mg，0.18mmol)于DMSO(147μl)、EtOH(590μl)、5N NaOH(75μl)和H2O2(88μl)的溶液3小时。在减压下浓缩反应混合物并通过制备型TLC[CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1]纯化残余物，得到64.3mg(78％)18。1H NMR(CDCl3)δ8.06(d,J＝7.5Hz,1H),7.49(d,J＝8.4Hz,1H),6.74(d,J＝1.9Hz,1H),6.62(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),5.60(br s,2H),3.29(m,1H),2.85(s,2H),2.77(m,1H),2.49(s,2H),2.13(d,J＝11.9Hz,2H),1.95(d,J＝11.8Hz,2H),1.20-1.42(m,4H),1.14(s,6H)；MS(ESI):m/z464.4[M+H]+；HPLC:tR＝7.05分钟。
6.2.15.6-(反-4-(2-氨甲酰基-5-(6,6-二甲基-4-氧代-3-(三氟甲基)-4,5,6,7-四氢-1H-吲唑-1-基)苯基氨基)环己基氨基)-6-氧代己基氨基甲酸叔丁酯(tert-Butyl6-(trans-4-(2-carbamoyl-5-(6,6-dimethyl-4-oxo-3-(trifluoromethyl)-4,5,6,7-tetrahydro-1H-indazol-1-yl)phenylamino)cyclohexylamino)-6-oxohexylcarbamate)(19)
向18(30mg，0.0647mmol)于CH2Cl2(1mL)中的混合物中加入6-(Boc-氨基)己酸(29.9mg，0.1294mmol)、EDCI(24.8mg，0.1294mmol)和DMAP(0.8mg，0.00647mmol)。在室温下搅拌反应混合物2小时，然后在减压下浓缩并通过制备型TLC[己烷:CH2Cl2:EtOAc:MeOH-NH3(7N)，2:2:1:0.5]纯化残余物，得到40mg(91％)19。1H NMR(CDCl3/MeOH-d4)δ7.63(d,J＝8.4Hz,1H),6.75(d,J＝1.7Hz,1H),6.61(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),3.75(m,1H),3.31(m,1H),3.06(t,J＝7.0Hz,2H),2.88(s,2H),2.50(s,2H),2.15(m,4H),2.03(d,J＝11.5Hz,2H),1.62(m,2H),1.25-1.50(m,17H),1.14(s,6H)；13C NMR(125MHz,CDCl3/MeOH-d4)δ191.5,174.1,172.3,157.2,151.5,150.3,141.5,140.6(q,J＝39.4Hz),130.8,120.7(q,J＝268.0Hz),116.2,114.2,109.5,107.3,79.5,52.5,50.7,48.0,40.4,37.3,36.4,36.0,31.6,31.3,29.6,28.5,28.3,25.7,25.4；HRMS(ESI)m/z[M+Na]+C34H47F3N6O5Na,计算值699.3458；实验值699.3472；HPLC:tR＝9.10分钟。
6.2.16.2-(反-4-(6-氨基己酰胺基)环己基氨基)-4-(6,6-二甲基-4-氧代-3-(三氟甲基)-4,5,6,7-四氢-1H-吲唑-1-基)苯甲酰胺(2-(trans-4-(6-Aminohexanamido)cyclohexylamino)-4-(6,6-dimethyl-4-oxo-3-(trifluorom ethyl)-4,5,6,7-tetrahydro-1H-indazol-1-yl)benzamide)(20)
将19(33mg，0.049mmol)溶解于1mL CH2Cl2:TFA(4:1)中并且在室温下搅拌溶液45分钟。在减压下去除溶剂并且通过制备型TLC[CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，6:1]纯化残余物，得到24mg(86％)20。1H NMR(CDCl3/MeOH-d4)δ7.69(d,J＝8.4Hz,1H),6.78(d,J＝1.9Hz,1H),6.64(dd,J＝8.4,1.9Hz,1H),3.74(m,1H),3.36(m,1H),2.92(t,J＝7.5Hz,2H),2.91(s,2H),2.51(s,2H),2.23(t,J＝7.3Hz,2H),2.18(d,J＝10.2Hz,2H),2.00(d,J＝9.1Hz,2H),1.61-1.75(m,4H),1.34-1.50(m,6H),1.15(s,6H)；13C NMR(125MHz,MeOH-d4)δ191.2,173.6,172.2,151.8,149.7,141.2,139.6(q,J＝39.5Hz),130.3,120.5(q,J＝267.5Hz),115.5,114.1,109.0,106.8,51.6,50.0,47.8,39.0,36.3,35.2,35.1,31.0,30.5,26.8,26.7,25.4,24.8；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C29H40F3N6O3,计算值577.3114；实验值577.3126；HPLC:tR＝7.23分钟。
6.2.17.SNX-2112-Affi-Gel 10珠粒(21)
将19(67mg，0.0992mmol)溶解于3.5mL CH2Cl2:TFA(4:1)中并且在室温下搅拌溶液20分钟。在减压下去除溶剂并且在高度真空下干燥残余物两小时。将这一物质溶解于DMF(2mL)中并且在固相肽合成容器中加入5mL Affi-Gel 10珠粒(预洗涤，3×8mL DMF)中。加入45μL N,N-二异丙基乙胺和若干DMAP晶体并在室温下将这一物质震荡2.5小时。然后加入2-甲氧基乙胺(18.6mg，22μl，0.248mmol)并持续震荡30分钟。然后去除溶剂并且用CH2Cl2(3×8mL)、DMF(3×8mL)和i-PrOH(3×8mL)洗涤珠粒，每次10分钟。在-80℃下将珠粒21贮存于i-PrOH(珠粒:i-PrOH(1:2)，v/v)中。
6.2.18.N-Fmoc-反-4-氨基环己醇(N-Fmoc-trans-4-aminocyclohexanol)(22)(克里斯特(Crestey)等人,2008)
向反-4-氨基环己醇盐酸盐(2.0g，13.2mmol)于二噁烷:水(26:6.5mL)中的溶液中加入Et3N(1.08g，1.49mL，10.7mmol)并且搅拌这一物质10分钟。然后在五分钟内加入Fmoc-OSu(3.00g，8.91mmol)并且在室温下搅拌所得悬浮液2小时。浓缩反应混合物到约5mL，然后加入一些CH2Cl2。过滤这一物质并且用H2O(4×40mL)洗涤固体，然后干燥，得到2.85g(95％)呈白色固体状的22。通过用CH2Cl2(2×100mL)萃取滤液，经Na2SO4干燥，过滤并去除溶剂来获得额外0.100g(3％)22，合并的产率为98％。TLC(己烷:EtOAc,20:80)Rf＝0.42；1H NMR(CDCl3)δ7.77(d,J＝7.5Hz,2H),7.58(d,J＝7.4Hz,2H),7.40(t,J＝7.4Hz,2H),7.31(t,J＝7.4Hz,2H),4.54(br s,1H),4.40(d,J＝5.6Hz,2H),4.21(t,J＝5.6Hz,1H),3.61(m,1H),3.48(m,1H),1.9-2.1(m,4H),1.32-1.48(m,2H),1.15-1.29(m,2H)；MS(ESI):m/z 338.0[M+H]+。
6.2.19.N-Fmoc-反-4-氨基环己醇四氢吡喃醚(N-Fmoc-trans-4-aminocyclohexanol tetrahydropyranyl ether)(23)
将1.03g(3.05mmol)22和0.998g(1.08mL，11.86mmol)3,4-二氢-2H-吡喃(DHP)悬浮于二噁烷(10mL)中。加入对甲苯磺酸吡啶鎓盐(0.153g，0.61mmol)并在室温下搅拌悬浮液。1小时后，再加入DHP(1.08mL，11.86mmol)和二噁烷(10mL)并持续搅拌。9小时后，再加入DHP(1.08mL，11.86mmol)并持续搅拌过夜。浓缩所得溶液并对残余物进行色谱分析(己烷:EtOAc，75:25到65:35)，得到1.28g(100％)呈白色固体状的23。TLC(己烷:EtOAc,70:30)Rf＝0.26；1H NMR(CDCl3)δ7.77(d,J＝7.5Hz,2H),7.58(d,J＝7.5Hz,2H),7.40(t,J＝7.4Hz,2H),7.31(dt,J＝7.5,1.1Hz,2H),4.70(m,1H),4.56(m,1H),4.40(d,J＝6.0Hz,2H),4.21(t,J＝6.1Hz,1H),3.90(m,1H),3.58(m,1H),3.45-3.53(m,2H),1.10-2.09(m,14H)；MS(ESI):m/z 422.3[M+H]+。
6.2.20.反-4-氨基环己醇四氢吡喃醚(trans-4-Aminocylohexanoltetrahydropyranyl ether)(24)
将1.28g(3.0mmol)23溶解于CH2Cl2(20mL)中并且加入哌啶(2mL)并在室温下搅拌溶液5小时。去除溶剂并通过色谱分析[CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，80:1到30:1]纯化残余物，得到0.574g(96％)呈油状残余物的24，其缓慢结晶。1H NMR(CDCl3)δ4.70(m,1H),3.91(m,1H),3.58(m,1H),3.49(m,1H),2.69(m,1H),1.07-2.05(m,14H)；MS(ESI):m/z200.2[M+H]+。
6.2.21. 4-(6,6-二甲基-4-氧代-3-(三氟甲基)-4,5,6,7-四氢-1H-吲唑-1-基)-2-(反-4-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)环己基氨基)苯甲腈(4-(6,6-Dimethyl-4-oxo-3-(trifluoromethyl)-4,5,6,7-tetrahydro-1H-indazol-1-yl)-2-(trans-4-(tetrahydro-2H-pyran-2-yloxy)cyclohexylamino)benzonitrile)(25)
使16(0.270g，0.655mmol)、NaOtBu(0.126g，1.31mmol)、Pd2(dba)3(0.120g，0.131mmol)和DavePhos(0.051g，0.131mmol)于1,2-二甲氧基乙烷(20mL)中的混合物脱气并且用氩气冲洗数次。加入24(0.390g，1.97mmol)并且使烧瓶再次脱气并用氩气冲洗，随后在60℃下加热反应混合物3.5小时。在减压下浓缩反应混合物并通过制备型TLC[己烷:CH2Cl2:EtOAc:MeOH-NH3(7N)，7:6:3:1.5]纯化残余物，得到97.9mg(28％)25。另外，分离60.5mg(17％)酰胺26，总产率为45％。1H NMR(CDCl3)δ7.52(d,J＝8.3Hz,1H),6.80(d,J＝1.7Hz,1H),6.72(dd,J＝8.3,1.8Hz,1H),4.72(m,1H),4.67(d,J＝7.6Hz,1H),3.91(m,1H),3.68(m,1H),3.50(m,1H),3.40(m,1H),2.84(s,2H),2.49(s,2H),2.06-2.21(m,4H),1.30-1.90(m,10H),1.14(s,6H)；MS(ESI):m/z 529.4[M-H]-。
6.2.22. 4-(6,6-二甲基-4-氧代-3-(三氟甲基)-4,5,6,7-四氢-1H-吲唑-1-基)-2-(反-4-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)环己基氨基)苯甲酰胺(4-(6,6-Dimethyl-4-oxo-3-(trifluoromethyl)-4,5,6,7-tetrahydro-1H-indazol-1-yl)-2-(trans-4-(tetrahydro-2H-pyran-2-yloxy)cyclohexylamino)benzamide)(26)
在室温下搅拌25(120mg，0.2264mmol)于DMSO(220μl)、EtOH(885μl)、5N NaOH(112μl)和H2O2(132μl)的溶液4小时。然后加入30mL盐水并且用EtOAc(5×15mL)萃取这一物质，经Na2SO4干燥，过滤且在减压下浓缩。通过制备型TLC[己烷:CH2Cl2:EtOAc:MeOH-NH3(7N)，7:6:3:1.5]纯化残余物，得到102mg(82％)26。1H NMR(CDCl3)δ8.13(d,J＝7.4Hz,1H),7.50(d,J＝8.4Hz,1H),6.74(d,J＝1.9Hz,1H),6.63(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),5.68(br s,2H),4.72(m,1H),3.91(m,1H),3.70(m,1H),3.50(m,1H),3.34(m,1H),2.85(s,2H),2.49(s,2H),2.05-2.19(m,4H),1.33-1.88(m,10H),1.14(s,6H)；MS(ESI):m/z 547.4[M-H]-。
6.2.23. 4-(6,6-二甲基-4-氧代-3-(三氟甲基)-4,5,6,7-四氢-1H-吲唑-1-基)-2-(反-4-羟基环己基氨基)苯甲酰胺(4-(6,6–Dimethyl–4–oxo–3-(trifluoromethyl)-4,5,6,7–tetrahydro-1H-indazol-1-yl)-2-(trans-4-hydroxycyclohexylamino)benzamide)(SNX-2112)
在65℃下加热含26(140mg，0.255mmol)和对甲苯磺酸吡啶鎓盐(6.4mg，0.0255mmol)的EtOH(4.5mL)17小时。在减压下浓缩反应混合物并通过制备型TLC[己烷:CH2Cl2:EtOAc:MeOH-NH3(7N)，2:2:1:0.5]纯化残余物，得到101mg(85％)SNX-2112。1H NMR(CDCl3)δ8.10(d,J＝7.4Hz,1H),7.52(d,J＝8.4Hz,1H),6.75(d,J＝1.3Hz,1H),6.60(dd,J＝8.4,1.6Hz,1H),5.97(br s,2H),3.73(m,1H),3.35(m,1H),2.85(s,2H),2.48(s,2H),2.14(d,J＝11.8Hz,2H),2.04(d,J＝11.1Hz,2H),1.33-1.52(m,4H),1.13(s,6H)；13C NMR(125MHz,CDCl3/MeOH-d4)δ191.0,171.9,151.0,150.0,141.3,140.3(q,J＝39.6Hz),130.4,120.3(q,J＝270.2Hz),115.9,113.7,109.2,107.1,69.1,52.1,50.2,40.1,37.0,35.6,33.1,30.2,28.0；MS(ESI):m/z 463.3[M-H]-,465.3[M+H]+；HPLC:tR＝7.97分钟。
6.2.24.对照物珠粒的制备
在固相肽合成容器中将DMF(8.5mL)加入20mL Affi-Gel 10珠粒(预洗涤，3×40mLDMF)中。加入2-甲氧基乙胺(113mg，129μL，1.5mmol)和若干DMAP晶体并在室温下震荡这一物质2.5小时。然后去除溶剂并且用CH2Cl2(4×35mL)、DMF(3×35mL)、菲特氏缓冲液(2×35mL)和i-PrOH(4×35mL)洗涤珠粒，每次10分钟。在-80℃下将珠粒贮存于i-PrOH(珠粒:i-PrOH(1:2)，v/v)中。
6.3.竞争分析
对于竞争研究，如先前所报导进行荧光偏振(FP)分析(杜等人,2007)。简单来说，在Analyst GT仪器(加利福亚州桑尼维尔的分子装置公司(Molecular Devices,Sunnyvale,CA))上进行FP测量。在黑色96孔微量滴定板(康宁#3650)中进行测量，其中激发与发射都从各孔顶部进行。用DMSO制备10μM GM-cy3B的储备液并且用菲特氏缓冲液(20mMHepes(K)(pH 7.3)、50mM KCl、2mM DTT、5mM MgCl2、20mM Na2MoO4和0.01％NP40以及0.1mg/mL BGG)稀释。向每一96孔中加入含6nM荧光GM(GM-cy3B)、3μg SKBr3溶解物(总蛋白质)和所测试的抑制剂(于DMSO中的原始储备液)的HFB缓冲液，最终体积为100μL。将药物加入一式三份孔中。对于每一分析，每一分析板上都包括背景孔(仅缓冲液)、示踪剂对照组(仅游离荧光GM)和结合的GM对照组(荧光GM并存在SKBr3溶解物)。使用GM作为阳性对照组。在4℃下在震荡器上培育分析板24小时并且测量以mP计的FP值。结合于Hsp90的示踪剂的部分与mP值有关并且相对于竞争剂浓度的值制图。通过拟合数据来获得替换50％结合的GM时的抑制剂浓度。所有实验数据都是使用SOFTmax Pro 4.3.1进行分析并且使用Prism 4.0(加利福尼亚州圣地亚哥的格兰帕德软件公司(Graphpad Software Inc.,San Diego,CA))制图。
6.4.化学沉淀、西方印迹和流式细胞测量术
从美国菌种保藏中心获得白血病细胞系K562和MV4-11和乳癌细胞系MDA-MB-468。将细胞培养于补充有10％FBS、1％L-谷氨酰胺、1％青霉素和链霉素的RPMI(K562)、伊思考夫氏改良杜尔贝科培养基(MV4-11)或DME/F12(MDA-MB-468)中，并且维持于37℃、5％CO2的湿润氛围下。通过将细胞收集在加入10μg/μL蛋白酶抑制剂(亮肽素和抑肽酶)的菲特氏缓冲液(HEPES 20mM、KCl 50mM、MgCl2 5mM、NP400.01％、新鲜制备的Na2MoO4 20mM，pH 7.2-7.3)中，随后进行三个连续冷冻(在干冰中)和解冻步骤来溶解细胞。根据制造商的说明书使用BCA试剂盒(皮尔斯公司)测定总蛋白质浓度。
用溶解缓冲液洗涤Hsp90抑制剂珠粒或含有与琼脂糖珠粒结合的Hsp90非活性化学物质(2-甲氧基乙胺)的对照组珠粒三次。然后在4℃下将珠粒结合物(80μL或如所指示)与细胞溶解物(250μg)一起培育过夜，并且用溶解缓冲液将体积调整到200-300μL。培育后，用溶解缓冲液洗涤珠粒结合物5次并且如下文所指示的通过西方印迹进行分析。
对于用PU-H71处理，使细胞生长到60-70％融合并且用抑制剂(5μM)处理24小时。用50mM Tris(pH 7.4)、150mM NaCl和1％NP-40溶解缓冲液制备蛋白质溶解物。
对于西方印迹，通过SDS/PAGE电泳解析蛋白质溶解物(10-50μg)，转移到硝基纤维素膜上并且用针对Hsp90的初级抗体(1:2000，SMC-107A/B，斯捷马克公司)、抗IGF-IR(1:1000，3027，细胞信号传导公司)和抗c-Kit(1:200，612318，BD转导实验室(BDTransduction Laboratories))进行探测。然后将膜与相应辣根过氧化酶结合的二级抗体的1:3000稀释液一起培育。根据制造商的说明书使用ECL-增强的化学发光检测***(安玛西亚生物科学公司)进行检测。
为检测PU-H71与细胞表面Hsp90的结合，在37℃下将每毫升500,000个细胞的MV4-11细胞与所指示浓度的PU-H71-生物素或作为对照组的D-生物素一起培育2小时，随后在4℃下对含藻红蛋白(PE)结合的抗生蛋白链菌素(SA)(BD生物科学公司)的FACS缓冲液(PBS+0.5％FBS)进行染色持续30分钟。然后使用BD-LSRII流动式细胞仪分析细胞。使用平均荧光强度(MFI)计算PU-H71-生物素与细胞的结合并且相对于用SA-PE染色的未处理细胞的MFI正规化各值。
6.5.停泊
在使用Ubuntu 8.10操作***的HP工作站xw8200上使用Glide 5.0(薛定谔公司(Schrodinger))进行分子停泊计算。从RCSB蛋白质数据库下载结合抑制剂PU-H71(PDB ID：2FWZ)、NVP-AUY922(PDB ID：2VCI)和27(PDB ID：3D0B)的Hsp90α复合物的坐标。对于停泊实验，使用Maestro 8.5的片段词典构筑化合物PU-H71、NVP-AUY922、5、10、20和27并使用所有原子液体刺激优化潜力(Optimized Potentials for Liquid Simulations-All Atom，OPLS-AA)力场(约根森(Jorgensen)等人,1996)，用如Macromodel9.6中所执行的最陡下降、随后截短牛顿(Newton)共轭梯度方案优化几何结构，并且进一步经受使用由薛定谔制药软件公司(LLC)提供的LigPrep 2.2应用程序的缺省参数进行配体制备。优化每一种蛋白质以用于随后使用由薛定谔制药软件公司提供的蛋白质制备向导(ProteinPreparation Wizard)进行网格生成和停泊。使用这一工具，将氢原子加入蛋白质中，指定键序，去除认为对于配体结合并不重要的结晶水分子，并将整个蛋白质减到最小。根据OPLS-2005力场指定蛋白质的部分原子电荷。随后，使用Glide中的受体网格生成工具制备网格。当各自结合的抑制剂在适当位置时，选择工作区配体的质心以界定网格框。选择大小类似于工作区配体的停泊配体的选项以用于确定网格大小。
随后，使用超精确(XP)Glide停泊方法使化合物PU-H71和5(结合于2FWZ)、NVP-AUY922和10(结合于2VCI)以及20和27(结合于3D0B)灵活地停泊到其各自结合位点中。尽管关于Glide所用的方法的详情在其它地方有所描述(帕特尔(Patel)等人,2008；弗里斯纳(Friesner)等人,2004；哈尔格伦(Halgren)等人,2004)，但下文提供关于所用参数的简短描述。将范德瓦尔半径(van der Waals radii)的标度因子的默认设置应用于配体和蛋白质的绝对部分电荷分别小于或等于0.15(标度因子为0.8)和0.25(标度因子为1.0)电子的那些原子。对于停泊操作未定义限制。在完成每一停泊计算时，每一配体允许产生至多100个位姿(pose)。我们的分析使用基于Glide计分功能的最高得分的停泊位姿(埃尔德里奇(Eldridge)等人,1997)。为了验证XP Glide停泊程序，从结合位点提取结晶结合的抑制剂(PU-H71或NVP-AUY922或27)并再停泊到其各自结合位点中。在停泊时抑制剂的定位和从和均方根差显而易见的晶体结构之间存在极佳一致。因此，本发明研究表明Glide在再现实验上所观察到的Hsp90抑制剂的结合模式方面的高停泊可靠性并且用于Glide停泊的参数组合理地再现X射线结构。
表8.来自SKBr3细胞提取物的Hsp90的结合亲和力。
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Claims (63)

1.Hsp90抑制剂在制备用于治疗个体中癌症的个人化治疗方案的药物中的用途，其中所述Hsp90抑制剂与癌症涉及路径组分的抑制剂共投予至所述个体；其中通过以下步骤鉴别所述癌症涉及路径组分：
(a)使来自所述个体的含有癌细胞的样品与探针接触，所述探针为Hsp90抑制剂，当所述Hsp90结合于所述样品中存在的癌症路径组分时所述Hsp90抑制剂优选地结合于肿瘤特异性Hsp90，这是相较于其与管家Hsp90的结合而言的，其中所述管家Hsp90不结合至该癌症路径组分；
(b)检测结合于所述肿瘤特异性Hsp90的路径组分；
(c)分析步骤(b)中所检测的路径组分以便鉴别如下路径，该路径包括步骤(b)中所检测的组分和所述路径的其它组分；和
(d)选择步骤(c)中所鉴别的路径或路径组分的抑制剂；
其中所述肿瘤特异性Hsp90与癌症涉及路径组分复合或当其结合于癌症涉及路径组分时，所述探针优选地结合于所述肿瘤特异性Hsp90；且
其中所述癌症涉及路径组分的抑制剂靶向至少一种结合于所述探针的致癌蛋白；且
其中所述探针为PU-H71。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症涉及路径是与代谢、遗传信息加工、环境信息加工、细胞过程或有机体***有关的路径。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述癌症涉及路径是表1中所列之路径。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症涉及路径或所述癌症涉及路径的组分与选自由以下组成的群组的癌症有关：结肠直肠癌、胰脏癌、甲状腺癌、包括急性骨髓性白血病和慢性骨髓性白血病的白血病、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、***癌、包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌的肺癌、乳癌、神经母细胞瘤、脊髓增生性病症、包括胃肠基质肿瘤、食道癌、胃癌的胃肠癌、肝癌、胆囊癌、***癌、包括神经胶质瘤的脑肿瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤的淋巴瘤、以及包括卵巢癌、子***和子宫内膜癌的妇科癌症。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述癌症涉及路径的组分和/或所述路径是在图1中鉴别。
6.根据权利要求1所述的用途，其中在步骤(a)中所述样品包含肿瘤组织。
7.根据权利要求1所述的用途，其中在步骤(a)中所述样品包含生物流体。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述生物流体是血液。
9.根据权利要求1所述的用途，其中在步骤(a)中所述样品包含受到破坏的癌细胞。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述受到破坏的癌细胞是经过溶解的癌细胞。
11.根据权利要求9所述的用途，其中所述受到破坏的癌细胞是经过声波处理的癌细胞。
12.如权利要求1所述的用途，其中待向所述个体投予的所述Hsp90抑制剂与步骤(a)中所用的所述探针不同。
13.根据权利要求1所述的用途，其中待向所述个体投予的所述Hsp90抑制剂是PU-H71。
14.根据权利要求12所述的用途，其中所述Hsp90抑制剂是选自由图3中所示的化合物组成的群组。
15.根据权利要求13或14所述的用途，其中在步骤(a)中所述探针是固定于固体载体上。
16.根据权利要求1所述的用途，其中所述路径组分的检测包含使用质谱法。
17.根据权利要求1所述的用途，其中在步骤(c)中所述路径组分的分析包含使用生物信息学计算机程序。
18.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症是淋巴瘤，并且在步骤(c)中所鉴别的路径组分是Syk。
19.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症是慢性骨髓性白血病(CML)并且在步骤(c)中所鉴别的路径或路径组分是图15中所示的任一种网络中所示的路径或组分。
20.根据权利要求19所述的用途，其中在步骤(c)中所鉴别的路径组分是mTOR、IKK、MEK、NFκB、STAT3、STAT5A、STAT5B、Raf-1、bcr-abl、Btk、CARM1或c-MYC。
21.根据权利要求19所述的用途，其中在步骤(c)中所鉴别的路径组分是mTOR并且在步骤(d)中所选择的抑制剂是PP242。
22.根据权利要求19所述的用途，其中在步骤(c)中所鉴别的路径是选自以下路径的路径：PI3K/mTOR-、NFκB-、MAPK-、STAT-、FAK-、MYC和TGF-β介导的信号传导路径。
23.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症是淋巴瘤，并且在步骤(c)中所鉴别的路径组分是Btk。
24.如权利要求1所述的用途，其中所述癌症是胰脏癌，并且在步骤(c)中所鉴别的路径或路径组分是图16的网络1-10和图24的网络中的任一种所示的路径或路径组分。
25.根据权利要求1所述的用途，其中在步骤(c)中所鉴别的路径和路径组分是mTOR。
26.根据权利要求25所述的用途，其中在步骤(d)中所选择的mTOR抑制剂是PP242。
27.根据权利要求1所述的用途，其中所述Hsp90抑制剂和所述癌症涉及路径组分的抑制剂同时、伴随、依序或附加共投予。
28.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症涉及路径组分的抑制剂是Btk抑制剂。
29.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症涉及路径组分的抑制剂是Syk抑制剂。
30.根据权利要求28所述的用途，其中所述癌症是淋巴瘤。
31.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症涉及路径组分的抑制剂是mTOR、IKK、MEK、NFκB、STAT3、STAT5A、STAT5B、Raf-1、bcr-abl、CARM1、CAMKII或c-MYC中的任一种的抑制剂，并且其中所述HSP90抑制剂与所述癌症涉及路径组分的抑制剂向罹患慢性骨髓性白血病(CML)的个体共投予。
32.根据权利要求31所述的用途，其中所述癌症涉及路径组分的抑制剂是mTOR抑制剂。
33.根据权利要求1所述的用途，其中在(a)中所述探针的结合捕获呈癌症路径组分结合状态的Hsp90。
34.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症涉及路径组分的抑制剂是图16和24中所示的任一种网络中所示的路径或路径组分的抑制剂，并且其中所述HSP90抑制剂与所述癌症涉及路径组分的抑制剂向罹患胰脏癌的个体共投予。
35.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症涉及路径组分的抑制剂是图22中所示的任一种网络中所示的路径或路径组分的抑制剂，并且其中所述HSP90抑制剂与所述癌症涉及路径组分的抑制剂向罹患乳癌的个体共投予。
36.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症涉及路径组分的抑制剂是图23中所示的任一种网络中所示的路径或路径组分的抑制剂，并且其中所述HSP90抑制剂与所述癌症涉及路径组分的抑制剂向罹患淋巴瘤的个体共投予。
37.根据权利要求34、35或36所述的用途，其中所述癌症涉及路径组分的抑制剂是mTOR抑制剂。
38.根据权利要求32所述的用途，其中所述mTOR抑制剂是PP242。
39.根据权利要求37所述的用途，其中所述mTOR抑制剂是PP242。
40.根据权利要求31和34-36任一项所述的用途，其中所述癌症涉及路径组分的抑制剂是选自柠檬酸他菲替尼CP-690550、AT9283、AG-490、鲁索利替尼INCB018424、AZD1480、LY2784544、NVP-BSK805、TG101209和TG-101348JAK的抑制剂。
41.根据权利要求31和34-36任一项所述的用途，其中所述癌症涉及路径组分的抑制剂是P13K抑制剂。
42.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症涉及路径组分的抑制剂是CARM1抑制剂，并且其中所述HSP90抑制剂与所述癌症涉及路径组分的抑制剂向罹患慢性骨髓性白血病(CML)的个体共投予。
43.根据权利要求27-32、34-36、38、39和42任一项所述的用途，其中所述HSP90抑制剂是PU-H71。
44.PU-H71在用于鉴别罹患癌症的个体中的癌症涉及路径或癌症涉及路径的一种或一种以上组分的用途，所述用途包含：
(a)使来自所述个体的含有癌细胞的样品与固定于固体载体上的PU-H71接触，当肿瘤特异性Hsp90结合于所述样品中存在的癌症路径组分时，所述PU-H71优先地结合于所述肿瘤特异性Hsp90；
(b)检测结合于Hsp90的路径组分；
以便由此鉴别所述癌症涉及路径或所述一种或一种以上路径组分。
45.根据权利要求44所述的用途，其中所述癌症涉及路径或所述癌症涉及路径的组分与选自由以下组成的群组的癌症有关：结肠直肠癌、胰脏癌、甲状腺癌、包括急性骨髓性白血病和慢性骨髓性白血病的白血病、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、***癌、包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌的肺癌、乳癌、神经母细胞瘤、脊髓增生性病症、包括胃肠基质肿瘤、食道癌、胃癌的胃肠癌、肝癌、胆囊癌、***癌、包括神经胶质瘤的脑肿瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤的淋巴瘤、以及包括卵巢癌、子***和子宫内膜癌的妇科癌症。
46.根据权利要求44所述的用途，其中在步骤(a)中所述样品包含肿瘤组织。
47.根据权利要求44所述的用途，其中在步骤(a)中所述样品包含生物流体。
48.根据权利要求47所述的用途，其中所述生物流体是血液。
49.根据权利要求44所述的用途，其中在步骤(a)中所述样品包含受到破坏的癌细胞。
50.根据权利要求49所述的用途，其中所述受到破坏的癌细胞是经过溶解的癌细胞。
51.根据权利要求49所述的用途，其中所述受到破坏的癌细胞是经过声波处理的癌细胞。
52.根据权利要求44所述的用途，其中在步骤(b)中所述路径组分的检测包含使用质谱法。
53.根据权利要求44所述的用途，其进一步包括分析步骤(b)中所检测的路径组分以便鉴别如下路径，所述路径包括步骤(b)中所检测的组分和所述路径的其它组分，其中所述路径组分的分析包含使用生物信息学计算机程序。
54.根据权利要求44所述的用途，其中在(a)中PU-H71至Hsp90的结合捕获呈癌症路径组分结合状态的Hsp90。
55.固定于固体载体上的PU-H71在用于选择癌症涉及路径或癌症涉及路径的组分的抑制剂的用途，所述用途包含依据权利要求44的用途鉴别所述癌症涉及路径或所述路径的一种或一种以上组分，然后选择所述路径或所述组分的抑制剂。
56.依据权利要求55的用途所选择的抑制剂在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
57.根据权利要求56所述的用途，其中依据权利要求55的用途所选择的抑制剂与Hsp90抑制剂一起投予。
58.根据权利要求56或57所述的用途，其中依据权利要求55的用途所选择的抑制剂与Hsp90抑制剂重复投予，或依据权利要求1的用途所选择的抑制剂与Hsp90抑制剂重复投予。
59.根据权利要求44或55所述的用途，其中所述用途对同一个体进行至少两次。
60.根据权利要求44所述的用途，其中经鉴别的所述癌症涉及路径组分用于监测用Hsp90抑制剂治疗癌症的功效，其包含测量作为与所述癌症有关的路径的组分的生物标记的变化。
61.根据权利要求44所述的用途，其中经鉴别的所述癌症涉及路径组分用于监测用Hsp90抑制剂和与所述癌症有关且Hsp90抑制的路径的组分的第二抑制剂两者治疗癌症的功效的用途，所述用途包含监测作为所述路径的组分的生物标记的变化。
62.根据权利要求61所述的用途，其中所述生物标记是由所述第二抑制剂抑制的路径的组分。
63.根据权利要求44所述的用途，其中经鉴别的所述癌症涉及路径组分为癌症疗法的新靶，因为如此鉴别的所述组分先前尚未与所述癌症相关。
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