CN103995119B - 检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法 - Google Patents
检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法。方法步骤为:1)猪瘟全病毒抗原的制备、灭活和96孔聚苯乙烯反应板包被;2)利用悬挂棉绳法,采集唾液,处理后获得唾液一抗;3)将唾液一抗,按编号加入抗原包被的反应板上,22‑28℃饱和湿度反应1小时,洗涤;4)将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG‑FC抗体,按顺序加入到反应板上,22‑28℃饱和湿度避光反应30分钟,洗涤;5)将TMB显色剂 A液和B液1:1混合后,按顺序加入到反应板上,避光反应15分钟,加入终止液;6)放入酶标仪中,读取OD650数据,判定结果。本发明避免了单个动物采血的问题,适用于猪群大面积的猪瘟抗体调查。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法。
背景技术
猪瘟(Classical swine fever, CSF)是目前危害我国养猪业最重要的疾病,其病理特征表现为小血管壁的变性, 致使内脏器官多发性出血、梗塞和坏死, 以出血和发热为主要特征, 呈急性或慢性经过, 对养猪业危害极大。
猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV) 是引起猪瘟的病原,该病具有高度接触性和致死性、传播速度快、流行广泛、发病率和死亡率高等特点。临床上,该病可分为急性、亚急性、慢性、非典型性和不明显型。急性CSF 由强毒株引发, 一般导致高发病率和死亡率, 而弱毒病毒感染则表现不明显。
猪瘟的发现已有180多年历史,世界各国均对该病的防控做出了巨大的努力, 目前北美、澳洲和北欧的一些地区已成功地消灭了猪瘟, 但猪瘟在其他许多地区仍广泛流行。墨西哥、巴西、南美的大部分地区猪瘟仍呈地方性流行,在加勒比地区古巴、海地和多米尼加都存在猪瘟,在东南亚地区的大多数国家仍存在猪瘟的间歇发生。
自从1969年在我国使用兔化弱毒疫苗后, 猪瘟的暴发明显减少。目前在我国大陆和台湾地区仍有有猪瘟流行, 其中大陆多以散发和慢性病例为主, 但从20 世纪80 年代以后, 临床症状不典型且病程变长的非典型性猪瘟( 或慢性猪瘟) 成为该病的主要发生形式, 持续感染普遍存在,疫苗的预防效果明显下降, 使猪瘟防制遇到了新的困难。据估计,临床健康的猪群中,大约20%-30%的动物持续带毒;我国每年由猪瘟致死的猪占总死亡数的1/3, 经济损失在20亿元左右。
目前,疫苗免疫依然是我国猪瘟防控的最主要手段。采集免疫后猪只血液样本,分离血清,并检测特异性的血清抗体,是目前监控猪瘟主要的手段,对猪瘟疫苗免疫效果评价、免疫程序制定、流行状态监测均具有重要意义。然而这种采样方式存在诸多限制,一方面这种采集血液、分离血清的方法费时费力,采集的样本数量不大,占猪群的比例不高,且对动物的应激非常大。固定一头体重在50公斤左右的生长猪,并从前腔静脉采集血液,通常需要2-3个人,平均花费10分钟左右。而本专利设计的唾液样本采集方法,则以同一栏的猪为单位采集(15-20头),只需一个人,平均花费5分钟,悬挂和收集唾液采集绳,即可。相对而言,唾液采集法获得的样本可覆盖整群动物,数据基本可代表整群动物的平均免疫情况,更能反映猪群抗体的总体水平。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足,提供一种检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法。
检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法包括如下步骤:
1)猪瘟全病毒抗原的制备、灭活和抗原包被96孔聚苯乙烯反应板;
2)利用悬挂棉绳法,诱导动物咀嚼,采集唾液,处理后获得唾液一抗,保存备用;
3)将唾液一抗,以PBST溶液1:1稀释后,按编号加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中,每个反应孔加100ul,22-28℃饱和湿度反应1小时,洗涤备用;
4)将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体,以 PBST溶液1:2000稀释后,按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中,每个反应孔加100ul,22-28℃饱和湿度避光反应30分钟,以PBST洗涤备用;
5)将TMB显色剂 A液和B液1:1混合后,按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中,每个反应孔加50ul,避光反应15分钟,随后每个反应孔加入50ul 2M浓硫酸,终止反应;
6)放入酶标仪中,读取OD650数据,判定结果。
所述的步骤1)为:以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释猪瘟C株全病毒纯化灭活抗原至10000 TCID50/ml,以100ul/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板,并以5%脱脂奶粉封闭,获得ELISA反应的抗原基质,置于4℃备用。
所述的步骤2)为:以6股、直径3mm、长1m的全棉绳索悬挂于猪群中间或围栏上,底端高度与动物肩部齐平,并将绳索的悬挂端解松,待猪群撕咬30min后,回收绳索,并置于无菌的样品收集袋中,用双手放在样品袋外挤出浸润在绳索上的唾液,并收集与无菌的50ml离心管中,以3000g离心15min,取上清,获得唾液一抗,保存备用。
所述的步骤6)为:将终止后的96孔聚苯乙烯反应板,放入预热的酶标仪中,读取各反应孔的OD650数值,并根据以下公式判定结果:已知阳性样品与已知阴性样品的比值P/N≥2.1,而且已知阳性样品的OD值≥0.35;在上述条件成立的情况下,如果待检唾液样品与已知阴性样品的比值P/N≥2.1,而且待检唾液样品的OD值≥0.35,则判为阳性、即对应群体猪瘟抗体的阳性率≥80%;否则判为阴性,即对应群体猪瘟抗体的阳性率<80%。
本发明提供的猪瘟病毒唾液抗体采集和检测方法,避免了对单个动物采血的问题,相对于传统的血清抗体采集和检测方法,具有以下优点:1)唾液抗体的棉绳采集法对猪群没有任何应激,2)节省采样时间达 80%以上,3)节省2/3的采样人员,4)唾液样品对温度、环境、污染物的抵抗力更强,运输和保存更方便,4)可以对整个猪群实行大面积采样,所得结果更客观全面,5)猪瘟病毒唾液抗体检测与血清抗体检测的符合率在94%以上。
附图说明
图1是检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法的过程示意图;
图2是本发明的利用悬挂棉绳法,诱导动物咀嚼,采集唾液,处理后获得唾液一抗的示意图。
具体实施方式
检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法包括如下步骤:
1)猪瘟全病毒抗原的制备、灭活和抗原包被96孔聚苯乙烯反应板;
2)利用悬挂棉绳法,诱导动物咀嚼,采集唾液,处理后获得唾液一抗,保存备用;
3)将唾液一抗,以PBST溶液1:1稀释后,按编号加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中,每个反应孔加100ul,22-28℃饱和湿度反应1小时,洗涤备用;
4)将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体,以 PBST溶液1:2000稀释后,按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中,每个反应孔加100ul,22-28℃饱和湿度避光反应30分钟,以PBST洗涤备用;
5)将TMB显色剂 A液和B液1:1混合后,按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中,每个反应孔加50ul,避光反应15分钟,随后每个反应孔加入50ul 2M浓硫酸,终止反应;
6)放入酶标仪中,读取OD650数据,判定结果。
所述的步骤1)为:以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释猪瘟C株全病毒纯化灭活抗原至10000 TCID50/ml,以100ul/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板,并以5%脱脂奶粉封闭,获得ELISA反应的抗原基质,置于4℃备用。
所述的步骤2)为:以6股、直径3mm、长1m的全棉绳索悬挂于猪群中间或围栏上,底端高度与动物肩部齐平,并将绳索的悬挂端解松,待猪群撕咬30min后,回收绳索,并置于无菌的样品收集袋中,用双手放在样品袋外挤出浸润在绳索上的唾液,并收集与无菌的50ml离心管中,以3000g离心15min,取上清,获得唾液一抗,保存备用。
所述的步骤6)为:将终止后的96孔聚苯乙烯反应板,放入预热的酶标仪中,读取各反应孔的OD650数值,并根据以下公式判定结果:已知阳性样品与已知阴性样品的比值P/N≥2.1,而且已知阳性样品的OD值≥0.35;在上述条件成立的情况下,如果待检唾液样品与已知阴性样品的比值P/N≥2.1,而且待检唾液样品的OD值≥0.35,则判为阳性、即对应群体猪瘟抗体的阳性率≥80%;否则判为阴性,即对应群体猪瘟抗体的阳性率<80%。
实施例
1)以商品化的猪瘟病毒疫苗C株,1000 TCID50/ml(半数细胞感染量/毫升)浓度,感染ST细胞,培养48小时后,收集病毒液,4000g离心10min,取上清;35000g离心1h,获得纯化病毒,并滴定TCID50。将病毒液置于65℃水浴中,灭活30min,获得猪瘟全病毒纯化灭活抗原。将灭活抗原以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释至10000 TCID50/ml,以100ul/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板,,饱和湿度下,22-28℃孵育1h, 然后转到4℃孵育16h。随后弃去包被液,拍干ELISA板,加入以PBST (pH7.3,0.05% tween-20) 稀释的5%脱脂奶粉100ul/孔,于22-28℃封闭2h。 弃去封闭液,拍干ELISA板,每孔加入150 ul 洗液(PBST),洗涤5min×3次,拍干ELISA板,置于4℃备用,见图1。
2)以定制全棉绳索(6股、直径3mm、长1m)悬挂于猪群中间或围栏上,底端高度与动物肩部齐平,并将绳索的悬挂端解松,待猪群撕咬30min后,回收绳索,并置于无菌的样品收集袋中,用双手放在样品袋外,用力拧绳索,挤出浸润在绳索上的唾液,并收集于无菌的50ml离心管中,用于初步保存和运输(常温下、6小时内,或4℃下、72小时内运至实验室)。将唾液以3000g离心15min,取上清,获得唾液一抗,并与4℃(<7d)或-20℃(<60d)保存备用,见图2。
3)将处理备用的唾液一抗,以PBST(1:1)稀释后,按编号加入抗原包被的反应板上,100ul/孔,每个样品3个重复,同时设置PBST阴性和血清阳性抗体对照个3个孔。饱和湿度下,22-28℃孵育1h。随后弃去包被液,拍干ELISA板,每孔加入PBST 150 ul洗液(PBST),洗涤5 min×3次,拍干ELISA板,备用,见图1。
4)将辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG-FC抗体,以PBST为稀释液,作1:2000倍稀释后,按100ul/孔加入到上述一抗包被的反应孔中,22-28℃/饱和湿度反应30分钟,随后弃去包被液,拍干ELISA板,每孔加入PBST 150 ul洗液(PBST),洗涤5 min×3次,拍干ELISA板,备用,见图1。
5)TMB显色剂由A液(TMB原粉以乙醇溶解配成4.0mg/ml,用时以超纯水稀释20倍)和B液(尿素过氧化氢以pH5.2磷酸盐缓冲液配制成0.15mg/ml终浓度)两种储存溶液组成,现用现配,配制比例为1:1。将配制好的TMB显色液按50ul/孔加入到上述反应孔中,室温避光反应15min,随后加入50ul/孔终止液(2M浓硫酸),终止反应,见图1。
6)将终止后的反应板,放入预热的酶标仪中,读取各反应孔的OD650数值,并根据以下公式判定结果:已知阳性样品与已知阴性样品的比值(P/N)≥2.1,而且已知阳性样品的OD值≥0.35;在上述条件成立的情况下,如果待检口水样品与已知阴性样品的比值(P/N)≥2.1,而且待检唾液样品的OD值≥0.35,则判为阳性、即对应群体猪瘟抗体的阳性率≥80%;否则判为阴性,即对应群体猪瘟抗体的阳性率<80%。
本发明以相同的抗原包被板和分别优化的反应程序,对浙江省某4000头基础母猪的地规模化猪场,进行了唾液抗和血清抗体的检测对照实验。实际采样覆盖动物180头,采集唾液样本17个,采集血清样本180份。。如表1所示,相对血清抗体的采集(前腔静脉采血),唾液抗体样本的采集在时间和人力需求上,具有明显优势。如表2所示,唾液抗体和血清抗体在最终结果的判断上,符合率在94%以上,完全可以满足临床大样本的抗体调查需要。
表1 两种抗体田间采样所需人员和时间的对比
抗体采集方法 | 采样覆盖动物数 | 实际采样数 | 实际操作人员 | 耗时 |
唾液采集 | 180头 | 17个 | 1人 | 2小时 |
前腔静脉采血 | 180头 | 180个 | 3人 | 8小时 |
表2 两种抗体检测方法的符合率比较
Claims (1)
1.一种检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法,其特征在于包括如下步骤:
1)猪瘟C株全病毒抗原的制备、灭活和抗原包被96孔聚苯乙烯反应板,具体操作为:以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释猪瘟C株全病毒纯化灭活抗原至10000 TCID50/ml,以100ul/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板,并以5%脱脂奶粉封闭,获得ELISA反应的抗原基质,置于4℃备用;
2)利用悬挂棉绳法,诱导动物咀嚼,采集唾液,处理后获得唾液一抗,保存备用,具体操作为:以6股、直径3mm、长1m的全棉绳索悬挂于猪群中间或围栏上,底端高度与动物肩部齐平,并将绳索的悬挂端解松,待猪群撕咬30min后,回收绳索,并置于无菌的样品收集袋中,用双手放在样品袋外挤出浸润在绳索上的唾液,并收集与无菌的50ml离心管中,以3000g离心15min,取上清,获得唾液一抗,保存备用;
3)将唾液一抗,以PBST溶液1:1稀释后,按编号加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中,每个反应孔加100ul,22-28℃饱和湿度反应1小时,洗涤备用;
4)将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体,以 PBST溶液1:2000稀释后,按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中,每个反应孔加100ul,22-28℃饱和湿度避光反应30分钟,以PBST洗涤备用;
5)将TMB显色剂 A液和B液1:1混合后,按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中,每个反应孔加50ul,避光反应15分钟,随后每个反应孔加入50ul 2M浓硫酸,终止反应;
6)放入酶标仪中,读取OD650数据,判定结果,具体操作为:将终止后的96孔聚苯乙烯反应板,放入预热的酶标仪中,读取各反应孔的OD650数值,并根据以下公式判定结果:已知阳性样品与已知阴性样品的比值P/N≥2.1,而且已知阳性样品的OD值≥0.35;在上述条件成立的情况下,如果待检唾液样品与已知阴性样品的比值P/N≥2.1,而且待检唾液样品的OD值≥0.35,则判为阳性、即对应群体猪瘟抗体的阳性率≥80%;否则判为阴性,即对应群体猪瘟抗体的阳性率<80%。
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