CN103993019B - 玫瑰RrDFR1基因在调控植物花青素合成中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种玫瑰DNA片段的分离、克隆、功能验证及应用。所述的DNA片段包含玫瑰花色功能基因RrDFR1，其核苷酸序列如序列表SEQ？ID？NO：1所示，其对应的蛋白质的序列如SEQ？ID？NO：2所示。该基因片段能够改变植物的花色,提高植物花青素的含量。将该基因片段直接转化植物，使转基因植物的花色发生改变，花青素含量增加。

Description

玫瑰RrDFR1基因在调控植物花青素合成中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一种玫瑰基因片段的分离克隆、功能验证和应用。所述的基因与植物花青素代谢有关。将该基因的完整翻译区与花椰菜花叶病毒启动子结合后直接转入一般植物体，转基因植株的花色发生变化,花青素含量增加。

背景技术

植物的色素主要有三大类:甜菜碱类、类胡萝卜素类和花青素类。其中花青素是广泛存在于植物中的一种水溶性色素,它由一个基本的结构母核以及不同的取代基组成,因取代基类型及位置的差异从而形成了具有不同颜色的花青素物质包括红、粉、紫和蓝色等,其中大约88％的被子植物的花颜色是由花青素决定的,花青素在结构上主要分三类:天竺葵素(pelargonidin)、矢车菊素(cyanidin)和飞燕草素(delphinidin)。花青素主要以糖苷的形式存在于表皮细胞的液包内并有多种生理功能,例如帮助植物传粉,提高植物抗病性，以及保护植物免受低温和紫外线伤害等；花青素也是迄今为止所发现的植物中最强效的自由基清除剂,其强大的抗氧化能力可以预防心血管疾病、抗肿瘤、抗突变、抗动脉硬化功能，调节免疫活性等功能。此外,花青素还是一种安全、无毒的天然食用色素。因此,花青素在园艺、医药、化妆、食品等方面具有一定的应用潜力和研究价值。

玫瑰(RosarugosaThunb.)是蔷薇科蔷薇属落叶丛生灌木，花型秀美，芳香四溢，色彩绚丽，在中国传统名花中评价极高，素有“花中皇后”之称。玫瑰具有重要的经济价值,其花瓣含有丰富的花青素类物质，可以深入应用于食品、医疗、保健等。

发明内容

本发明的目的提供一种分离的玫瑰功能基因RrDFR1在调控植物花青素合成中的应用，该基因与花色的形成相关。

本发明通过下述技术方案实现：

本发明提供了玫瑰中表达RrDFR1的基因编码序列及其功能，具体包括：RrDFR1基因的核苷酸编码序列的克隆，表达载体构建，将该基因转化宿主烟草，获得转基因烟草植株，进行分子鉴定和表型观察。

本发明首先从玫瑰中克隆出RrDFR1功能基因，该基因片段为具有特定序列的DNA分子，其开放阅读框为1050bp，其核苷酸序列如序列表SEQIDN0：1所示。

本发明还提供了这种玫瑰RrDFR1蛋白编码序列，它有349个氨基酸残基，其对应的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

本发明还提供了用于调取获得玫瑰样品中基因RrDFR1的一对核苷酸引物。该引物根据基因RrDFR1设计，使用该对引物对玫瑰花瓣样品cDNA进行PCR扩增可获得1050bp的基因片段。该引物对的DNA序列如下所示：

P1正向引物:5’ATGGGATCGGAATCCGAG3’(见序列表SEQIDNO：3)

P2反向引物:5’TTAGCCTGTGACTTTGACACG3’(见序列表SEQIDNO：4)

本发明还提供了一对检测玫瑰RrDFR1基因在转基因烟草中表达的引物对。该引物对根据基因RrDFR1设计，用该对引物转化该基因的烟草样品cDNA进行RT-PCR扩增,检测该基因是否在转基因烟草中表达，获得长度为207bp的片段。

上述引物对的DNA序列如下所示：

P3正向引物:5’CAAGGGCATTGAGGAGAACTTGC3’(见序列表SEQIDNO：5)

P4反向引物:5’CCTGTGACTTTGACACGGACGA3’(见序列表SEQIDNO：6)

可以利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，通过直接DNA转化、电导、农杆菌介导等常规生物技术方法将本发明提供的RrDFR1的编码基因导入植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。使用本发明的基因片段构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前面可加上任意一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或者植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入具有抗性的抗生素标记物(例如卡那霉素或潮霉素等)。被转化的宿主是包括烟草在内的多种植物，培育不同花色的植物种类。

本发明还提供了一种转基因烟草花青素提取及测定方法。提液氮桶采取成熟花朵的花瓣，用液氮将花瓣研磨成细粉，分装到离心管中后迅速放入液氮中冻存,于-80℃超低温冰箱中保存备用。准确称取0.1g花瓣，加入0.5mL提取液(甲醇︰盐酸︰水体积比＝70︰0.1︰29.9，)于黑暗条件下4℃浸提24h，期间每隔6h用旋转振荡器振荡1min。12000rpm离心10min，取上清至新的离心管中，再用孔径0.22μm的尼龙微孔滤器过滤后，保存于–40℃冰箱中，用于花青苷的分析。用分光光度仪(UV-2401PC,SHIMADZU)分别在波长530nm与657nm处测量样本的吸光值。花青素的含量用如下公式计算：QAnthocyanins＝(A530－0.25×A657)×M^－1。

更详细的技术方案见《具体实施方式》。

附图说明

序列表SEQIDNO：1是本发明分离克隆的包含有RrDFR1基因编码区的DNA片段(其中1-1008bp为CDS)。序列全长为1050bp，编码349个氨基酸。

序列表SEQIDNO：2是上述RrDFR1基因片段对应的蛋白质的序列。

序列表SEQIDNO：3，SEQIDNO：4是扩增上述玫瑰花瓣样品cDNA的引物对的DNA序列。

序列表SEQIDNO：5，SEQIDNO：6是检测转基因烟草中表达基因片段引物对的DNA序列。

图1：是超量植物表达载体pCAMBIA2300s结构示意图。

图2：是重组质粒pCAMBIA2300s-RrDFR1结构示意图。

图3：对照早花烟草与转化RrDFR1基因的早花烟草的花色比较图。图中标记：图3A是对照早花烟草花色；图3B是本发明转RrDFR1基因早花烟草的花色。

图4：RrDFR1基因在转基因烟草中的表达量的电泳跑胶图。图4A是转RrDFR1基因的跑胶图，图4B是转看家基因eIF的跑胶图，图中标记：M为分子量大小，1-3为3个转基因株系，P为重组质粒pCAMBIA2300s-RrDFR1，CK为早花烟草(作为转基因早花烟草的对照)。

图5：对照早花烟草与转化RrDFR1基因的早花烟草花瓣花青素含量图。图中标记：1-为早花烟草；2、3-分别为RrDFR1-6、RrDFR1-12，为2个转基因的烟草株系。

具体实施方式

实施例1：分离克隆RrFLS1基因

本发明的前期对丰花玫瑰(又称“平阴一号”，http://tc.cctv.com/20100412/103621.shtml，丰花玫瑰的选育文献已经公开发表，见：吕传润(平阴玫瑰研究所)，玫瑰新品种-丰花玫瑰及栽培技术，山东林业科技，2007，5：77；华中农业大学园艺林学学院园艺植物生物学花卉实践教学基地从山东省平阴县平阴玫瑰研究所引种)不同时期的花朵进行了转录组测序(转录组测序由深圳华大基因科技有限公司完成)，在转录组测序结果中得到了RrDFR1基因的全长序列。根据转录测序RrDFR1基因的已知序列全长，设计特异引物P1(见序列表SEQIDNO：3)正向引物5’ATGGGATCGGAATCCGAG3’和P2(见序列表SEQIDNO：4)反向引物5’TTAGCCTGTGACTTTGACACG3’，将测序序列的1-1050bp从玫瑰品种‘丰花’(即丰花玫瑰)花瓣RNA反转录得到的cDNA中扩增出来，扩增得到的片段如下所示：

ATGGGATCGGAATCCGAGTCCGTTTGCGTGACAGGCGCCTCCGGTTTCGTAGGTTCATGGCTCGTCATGAGACTCCTAGAGCGCGGCTACACTGTCCGAGCCACCGTGCGAGACCCTGCTAATTCGAAGAAGGTGAAGCATCTGCTGGACTTACCAAAGGCGGCGACTCACTTGACGCTGTGGAAGGCAGACTTGGCGGAGGAGGGAAGCTTCGACGAAGCCATCAAGGGATGCACCGGAGTGTTCCATGTCGCCACTCCTATGGATTTTGAGTCCAAGGACCCTGAGAACGAAGTGATCAAACCTACTATAAATGGGGTGCTAGACATCATGAAAGCATGTCTAAAAGCAAAGACTGTAAGAAGGCTAGTGTTTACAGCTTCGGCTGGATCTGTCAATGTTGAAGAGACCCAAAAGCCGGTCTACAACGAAAGCAACTGGAGTGATGTCGAATTTTGCCGGAGAGTGAAGATGACTGGTTGGATGTATTTTGTATCCAAAACTCTAGCTGAGCAAGAGGCATGGAAGTTTGCCAAAGAAAATAACATTGATTTCATCACCATTATCCCAACTCTCGTAATCGGTCCATTTCTCATGCCTGCCATGCCGCCGAGCCTCATTACTGGACTTTCGCCACTCACTGGAAATGAAAGTCATTATTCGATCATAAAGCAAGGCCAATTCATTCATCTAGACGACCTCTGCCAATCTCATATATACTTGTATGAGCATCCGAAAGCAGAGGGCCGCTACATTTGTTCATCGCACGATGCTACGATTCATGAAATTGCGAAATTGCTGAGGGAAAAGTACCCCGAGTACAATGTTCCTACAACGTTCAAGGGCATTGAGGAGAACTTGCCAAAGGTCCATTTTTCTTCAAAGAAATTATTGGAAACAGGGTTCGAGTTCAAATACAGCTTGGAGGACATGTTTGTAGGAGCTGTTGATGCTTGTAAAGCAAAGGGTTTGCTTCCTCCTCCTACTGAAAGAGTTGAAAAGCAGGAGGTTGATGAGAGCAGTGTCGTCCGTGTCAAAGTCACAGGCTAA

扩增产物中的1-1050bp就是本发明的序列。具体步骤为：

1、采用常用的CTAB法(参照：《植物基因工程》，王关林，方宏筠主编)从玫瑰品种‘丰花’中提取花瓣总RNA，具体步骤如下：

1)向离心管中加入CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液(2％(W/V)CTAB，NaCl1.4mol/L,EDTA(乙二胺四乙酸)20mmol/L，Tris·Cl100mmol/L，2％(W/V)pvp)和10％的β-巯基乙醇，在水浴锅中预热。

2)将玫瑰花瓣用液氮冷却研磨，加入提取液中，混匀，65℃水浴10分钟

3)加入等体积的氯仿：异戊醇(体积比24：1)混合液，颠倒混匀，静置10min，4℃下12000g离心10min

4)取上清，重复步骤3)

5)取上清，加入终浓度为2mol/L的LiCl，冰浴10-12小时，12000g，4℃离心15分钟，弃上清，用75％乙醇清洗沉淀两次，溶于适量的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水中待用。

6)以从玫瑰品种‘丰花’中提取花瓣总RNA为模板，利用反转录酶(购自宝生物工程大连有限公司)将其反转录合成cDNA第一条链，反应条件为：65℃5min,42℃50min，70℃10min。

7)根据转录测序中的序列设计的特异引物P1(见序列表SEQIDN：3)5’ATGGGATCGGAATCCGAG3’和P2(见序列表SEQIDNO：4)5’TTAGCCTGTGACTTTGACACG3’，将RrDFR1从玫瑰品种‘丰花’花瓣RNA反转录得到的cDNA中扩增出来。

反应条件：94℃预变性4min；94℃30sec，60℃30sec,72℃1min,37个循环；72℃延伸10min。将扩增获得的PCR产物连入载体(购自宝生物工程大连有限公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因。该克隆被命名为质粒。

实施例2：RrDFR1基因超量表达载体的构建，转化

为了能更好地阐明此基因的功能，申请人将其在烟草中超量表达，从转基因植株的表型来验证。具体步骤是：首先将实施例1中得到的阳性克隆质粒用BamHⅠ和SalⅠ双酶切，回收目的片段；同时，用同样的方法酶切携带双烟草花叶病毒启动子35S的遗传转化载体pCAMBIA2300s(该遗传转化载体来自湖北省武汉市华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室构建和赠送)。酶切完毕，用包含RrDFR1基因的酶切片段和酶切的pCAMBIA2300s(图1)载体做连接反应，转化大肠杆菌DH5α(大肠杆菌菌株购自宝生物工程大连有限公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得重组载体(或称转化质粒)，申请人将其命名为重组质粒pCAMBIA2300s-RrDFR1。

通过农杆菌介导的烟草遗传转化方法将其导入到早花烟草中，经过侵染、共培养、筛选同时具有卡那霉素抗性和潮霉素抗性的转化苗，再通过生根、练苗移栽等常规步骤(参考文献：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著；黄培堂，王嘉玺等译；分子克隆实验指南(第三版)；北京，科学出版社；2002版)，得到转基因植株。

本发明的遗传转化的主要步骤和应用试剂如下所述：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄氨基嘌呤)；NAA(Naphthaleneaceticacid，萘乙酸)；Kan(Kanamycin，卡那霉素)；Cef(Cefotaxime，头孢霉素)；Hyg(Hygromycin，潮霉素)

(2)用于早花烟草遗传转化的培养基配方

表1列出了本发明的各种培养基的成分及其用量。

表1早花烟草转化培养基设计

注：1/2MS，MS培养基的配制参见：MurashigeT.andF.Skoog.Physiol.Plant,1962,15:473-497报道的方法。

表1中的Kan(Kanamycin，卡那霉素)、Cef(Cefotaxime，头孢霉素)，Hyg(Hygromycin，潮霉素)，采用0.45μm滤膜过滤方法灭菌，在上述除Kan、Hyg、Cef成分以外的培养基经常规121℃高压蒸汽灭菌20min后,待培养基冷却至50-60℃时，在超净工作台上加入。

(1)农杆菌介导的遗传转化步骤

1)农杆菌的培养

首先，在带有对应抗性选择的固体LB培养基(10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、Kan100mg/L+、琼脂1.5g/L)上预培养农杆菌EHA10548小时，培养温度28℃；挑取预培养农杆菌单菌落，接种于对应抗性选择的液体LB培养基(10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、Kan100mg/L)中，于28℃200rpm摇床培养过夜，至菌液浓度OD₆₀₀值大约为0.6。

2)叶盘转化法

a.剪取早花烟草无菌苗上部完全展开的幼嫩叶片，将叶片剪成0.8cm×0.8cm大小小块，放入无菌烧杯中；

b.将准备好的菌液倒入烧杯，轻轻摇晃烧杯。叶片在菌液中浸泡10min；

c.将步骤b中的叶片取出，转移至灭好菌的滤纸上吸干；然后放置在如上所述的共培养培养基上暗培养三天，培养温度为28℃；

d.三天后，将叶片转入如表1所述的出芽选择培养基上，光照和暗培养交替(光照强度1000-1500lx，光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)下培养，进行Kan和Hyg抗性芽的筛选分化，培养温度为28℃；

e.抗性芽形成后，将其切下，转入如上所述的壮苗选择培养基上，在光照和暗培养交替(光照强度1000-1500lx，光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)下培养，进行Kan和Hyg抗性苗的筛选，培养温度为28℃；

f.将筛选得到的抗性苗转入如上所述的生根选择培养基上使其生根，在光照和暗培养交替(光照强度1000-1500lx,光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)下培养，培养温度为28℃。

2)移栽

洗掉转基因早花烟草植株根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的一周内保持水分湿润。

本实施例共获得20个株系的PCR检测结果为阳性的转入重组质粒(或称转化质粒)pCAMBIA2300s-RrDFR1的T₀代转基因烟草。

实施例3：RrDFR1基因转基因T₀代在田间的表型观测与RT-PCR检测

转基因早花烟草植株下地移栽后，直至开花期，将转基因早花烟草的花型与未转化早花烟草的花型进行比较，发现转RrDFR1基因的烟草的花色发生改变：没有转化的早花烟草花色为粉红色(图3A)；转RrFLS1基因的早花烟草花色变为玫红色(图3B)。

为了验证转基因早花烟草花色的改变是否与转入的RrDFR1基因有关，本发明采用了常用的RT-PCR方法对部分转基因早花烟草植株中RrDFR1基因表达进行了检测(结果见图4)。具体步骤如下：采用TRIZOL试剂(购自宝生物工程大连有限公司)从转基因烟草1-8号株系中提取花的总RNA(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书操作)，利用反转录酶(购自宝生物工程大连有限公司)将其反转录合成cDNA第一条链，反应条件为65℃5min,42℃50min，70℃10min。先用报道的看家基因eIF(X79009)对反转录得到的cDNA进行检测和浓度调整，根据看家基因EIF的序列设计一对引物P5正向引物(5-GCAGCCGTGATCACACAGTATCT)和P6反向引物(5-ACACCCTTCCTTCCAAAACGT)，进行PCR检测，反应条件为：94℃预变性4min；94℃30sec，60℃30sec,72℃30sec,28个循环；72℃延伸10min。试验结果如图4所示，看家基因EIF在早花烟草和转基因早花烟草中均能扩出，并且亮度一致。然后，根据RrDFR1基因的序列，在靠近3’端设计一对引物P3(见序列表SEQIDNO：3)正向引物(5-CAAGGGCATTGAGGAGAACTTGC)和P4(见序列表SEQIDNO：4)反向引物(5-CCTGTGACTTTGACACGGACGA)，进行RT-PCR检测，反应条件为：94℃预变性4min；94℃30sec，60℃30sec,72℃1min,35个循环；72℃延伸10min。试验结果表明，3个转基因株系烟草内均检测到有RrDFR1基因的表达，结果如图4所示。图4：RrDFR1基因在转基因烟草中的表达量的电泳跑胶图。图4A是转RrDFR1基因的跑胶图，图4B是转看家基因eIF的跑胶图，图中标记：M为分子量大小，1-3为3个转基因株系，P为重组质粒pCAMBIA2300s-RrDFR1，CK为早花烟草(作为转基因早花烟草的对照)。

实施例4:转RrDFR1早花烟草次生代谢物的提取与测定

准确称取0.1g本发明的转RrDFR1早花烟草花瓣，加入0.5mL提取液(甲醇︰盐酸︰水体积比＝70︰0.1︰29.9)于黑暗条件下4℃浸提24h，期间每隔6h用旋转振荡器振荡1min。12000rpm离心10min，取上清至新的离心管中，再用孔径0.22μm的尼龙微孔滤器过滤后，保存于–40℃冰箱中。用分光光度仪(UV-2401PC,SHIMADZU)分别在波长530nm与657nm处测量样本的吸光值。花青素的含量用如下公式计算：QAnthocyanins＝(A530－0.25×A657)×M^－1。本实施例的花青素的检测结果见图5所示。

Claims (1)

1.核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示的玫瑰RrDFR1基因在调控烟草花青素合成中的应用。