CN103992989A - 一种猪流行性腹泻病毒及其应用 - Google Patents

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本发明公开了一种流行性腹泻病毒，其保藏编号为CCTCC NO：V201407。在电镜下观察，该病毒颗粒直径范围在90-190nm，表面有囊膜，囊膜上有花瓣状纤突，从核心向四周放射性分布。本发明还涉及猪流行性腹泻病毒的应用。本发明中的病毒可在vero细胞中高效增殖，病毒浓度可达107TCID50/mL，无外源病毒污染，对仔猪具有较强的致病力，病毒滴度10TCID50即能引起仔猪发病，有良好的免疫原性；根据本发明中的病毒制备的疫苗对猪的流行性腹泻具有较好的保护效果；根据本发明中的病毒制备的高滴度的血清抗体，具有较好的血清效价。

Description

一种猪流行性腹泻病毒及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，特别是一种猪流行性腹泻病毒及其应用。
背景技术
猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由冠状病毒科猪流行性腹泻病毒引起的一种侵害猪肠道的急性传染病。主要引起哺乳仔猪的腹泻、呕吐、脱水，最终导致死亡，死亡率极高。本病在欧洲和亚洲传播非常广泛，每年都会给一些国家和地区造成严重的经济损失，给养猪业带来了巨大的危害。2013年4月以后猪流行性腹泻在美国爆发，迅速蔓延至美国20多个州，给美国养猪业造成了严重的打击。对于大多数的病毒性腹泻来说，防治措施一般选择疫苗免疫，虽然目前已有猪流行性腹泻的商业疫苗用于猪群，但该病毒还是出现在了免疫猪群中，给该病的预防带来了极大的困难，因此寻找一个新的具有较好免疫原性的毒株对于猪流行性腹泻的预防措施及诊断方法的研制有重大的意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒CHYJ130330及其应用。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种猪流行性腹泻病毒CHYJ130330，该病毒的分类命名为猪流行性腹泻病毒，拉丁文学名为porcine epidemic diarrhea virus（PEDV），该病毒已于2014年3月5日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址：武汉市武昌珞珈山)进行的保藏，保藏编号为CCTCC V201407。
进一步，所述病毒的全基因序列为SEQ ID No.1所示的序列。
一种猪流行性腹泻病毒作为疫苗的应用，所述病毒依次经过感染细胞、培养、收获病毒液、灭活和纯化得到疫苗原液后，加入佐剂即得病毒疫苗。
优选的，所述病毒感染的细胞为非洲绿猴肾细胞。
优选的，所述病毒感染细胞后，37℃，5%CO2培养箱中培养，当细胞病变达80%以上时，收获病毒液。
优选的，所述灭活选用甲醛溶液。
优选的，所述疫苗原液中病毒浓度为107TCID50/mL。
优选的，所述佐剂为氢氧化铝。
一种以猪流行性腹泻病毒为免疫原制备抗血清的方法，所述病毒依次经过感染细胞、培养、收获病毒液、灭活和纯化得到疫苗原液后，用疫苗原液免疫动物，获得抗血清。
优选的，所述疫苗原液免疫动物时配合佐剂使用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明中的病毒CHYJ130330可在vero细胞中高效增殖，病毒浓度可达107TCID50/mL，无外源病毒污染；
2、本发明中的病毒CHYJ130330对仔猪具有较强的致病力，病毒滴度10TCID50即能引起仔猪发病，有良好的免疫原性；
3、根据本发明中的病毒CHYJ130330制备的疫苗对猪的流行性腹泻具有较好的保护效果；
4、根据本发明中的病毒CHYJ130330制备的高滴度的血清抗体，具有较好的血清效价。
附图说明
图1为本发明中猪流行性腹泻病毒CHYJ130330在不同分比率下的电镜图片；
图2为本发明中猪流行性腹泻病毒CHYJ130330传代稳定性实验中不同代次RT-PCR检测结果。
图2中，1为F5，2为F20，3为F40，4为F50，5为F60，6为F80，7为F100，8.为F120，9为阴性对照，10为阳性对照，M为marker DL2000。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1病毒的分离培养和鉴定
（一）病毒的分离、培养
自2013年广东省某猪场收集5日龄发病仔猪RT-PCR阳性的粪便标本，经处理后接种至非洲绿猴肾传代细胞（Vero）上，培养三代后细胞出现细胞融合，进行病毒分离，获得猪流行性腹泻病毒CHYJ130330。
（二）病毒的鉴定
1.基因组序列分析
对该病毒的基因组序列进行分析，全基因序列为SEQ ID No.1所示的序列（见序列表），其与GenBank中已有的猪流行性腹泻病毒的序列相比，核苷酸的同源性在99%以上。
2.电镜检查
在电镜下观察猪流行性腹泻病毒CHYJ130330，如图1所示，病毒颗粒直径范围在90-190nm，表面有囊膜，囊膜上有花瓣状纤突，从核心向四周放射性分布。
3.无菌、支原体检测
按照《中国兽药典》方法对该病毒进行无菌、支原体检查，结果表明无支原体和其它微生物污染。
4.病毒滴度检测
采用微量滴定法测定该株病毒的病毒浓度，采用方法如下：采用Vero细胞进行病毒滴度的测定。用96孔细胞培养板培养Vero细胞，将病毒用细胞维持液从10-1倍比稀释至10-8，分别将每个稀释度的病毒液接种100uL/孔，每个稀释度接种8孔，将对数生长期的Vero细胞稀释至3×106个细胞/mL，每个细胞空中接种100ul，同时设细胞对照孔。置37℃，5%CO2培养箱中培养，4-6天观察细胞感染病毒情况，计算病毒浓度，病毒浓度达107TCID50/mL。
5.传代稳定性实验
将病毒CHYJ130330在vero细胞上连续传代，每代进行电镜观察和RT-PCR检测，传代至120代，病毒培养仍可出现典型的细胞融合病变。RT-PCR检测结果呈PEDV阳性（见图2），证实该病毒可稳定传代。
实施例2疫苗的制备
猪流行性腹泻病毒CHYJ130330经过感染Vero细胞、培养、收获病毒液、测定TCID50、灭活和纯化后，得到疫苗原液，用于进一步制备疫苗。
（1）病毒培养
复苏Vero细胞，经扩增，至细胞长至薄单层后，将病毒CHYJ130330按1:10-1:100（v/v）比例接种至细胞瓶内，37℃，5%CO2培养箱中培养，每天观察细胞病变，当细胞病变达80%以上时，收获病毒液，-20℃保存备用。
（2）病毒灭活和纯化
病毒灭活前测定TCID50。将上述制备的病毒液用1:1000—1:10000（v/v）的甲醛溶液灭活24-48h。将病毒液按100mL加入42.5g硫酸铵的量加入硫酸铵，搅匀后至4℃冰箱搅拌沉淀过夜后，5000r/min离心40min，弃上清，沉淀用灭菌双蒸水悬浮，装于透析袋中，于PBS中搅拌透析过夜，即为纯化PEDV病毒。病毒纯化后进行离心：10000rpm下10min，取上清液并将其病毒浓度调整为107TCID50/mL，即为疫苗原液。
（3）疫苗制备
将上述疫苗原液与氢氧化铝佐剂按适当比例吸附后即获得病毒CHYJ130330疫苗半成品，疫苗半成品分装成100mL/瓶，经无菌检验后即为疫苗。
实施例3免疫原性试验
将实施例2制备的病毒CHYJ130330疫苗对仔猪进行免疫原性试验。
（1）将上述制备的疫苗于怀孕母猪产前40天、20天进行免疫，4mL/头/次，在整个试验过程中观察记录母猪的健康情况及产仔情况，并于免疫前、分娩时及分娩后7天、14天采集母猪的血液，收集血清，进行抗体中和测定。
方法如下：在96孔细胞培养板中加入分离获得的母猪血清，用细胞生长液倍比稀释至一定浓度后（每个稀释孔4个重复），加入事先稀释至200TCID50/mL的病毒液，混合均匀后放入37℃，5%CO2培养箱中中和1h-2h，然后加入细胞悬液，细胞浓度为2-3×105个/mL，置于37℃，5%CO2培养箱中进行培养。5-7天后观察细胞病变情况，其中以半数细胞出现病变的血清的最高稀释倍数为血清的中和效价，阳性判定指标为：中和效价大于1：8；阴性血清效价小于1：8。结果见下表1。
表1为母猪免疫试验中和抗体检查结果
采血时间 中和效价
免疫前(0d) ＜8
免疫后20d 8
分娩时（40d） 32
分娩后7d 32
分娩后14d 16
从表1可以看出，使用本发明病毒CHYJ130330制备的疫苗可诱发母猪长生抗猪流行性腹泻病毒的抗体，并随着免疫次数的增加而呈上升趋势。这一结果表明，使用该病毒CHYJ130330制备的疫苗对猪的流行性腹泻具有较好的保护效果。
（2）对上述母猪所产的3日龄仔猪进行攻毒试验，与未接种疫苗的母猪所产的仔猪进行比较，结果表明，本发明的病毒CHYJ130330疫苗具有较好的疫苗保护作用。
实施例4以病毒CHYJ130330为免疫原制备多抗血清
病毒CHYJ130330经过感染细胞、培养、收获病毒液、测定TCID50、灭活和纯化后，与弗氏完全佐剂充分乳化后，免疫新西兰大耳兔。采取颈背部皮下多点注射，2mL/只，3只/批。免疫两周后加强免疫，疫苗原液与弗氏不完全佐剂充分乳化后，颈背部皮下多点注射，2mL/只，共加强免疫3次，最后一次免疫2周后采血，分离血清进行中和抗体效价测定。
中和抗体效价测定方法：在96孔细胞板内加入分离的兔血清，用细胞维持液进行倍比稀释，加入稀释好的100TCID50/mL的病毒CHYJ130330病毒液，中和2-3h后加入细胞悬液，细胞浓度为2-3×105个/mL，置37℃，5%CO2培养箱中进行培养。5-7天后观察细胞病变情况，其中以出现细胞病变的血清最高稀释度为血清中和效价，阳性判断标准为：中和效价大于1：8，阴性对照血清效价小于1：8。试验结果显示3只新西兰兔的抗CHYJ130330血清的效价均大于1：1024。该结果证实使用本发明的病毒CHYJ130330免疫新西兰兔可获得血清效价较好的兔抗CHYJ130330多抗血清。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种猪流行性腹泻病毒，其保藏编号为CCTCC NO：V201407。 
2.如权利要求1 所述的病毒，所述病毒的全基因序列为SEQ ID No.1 所示的序列。
3.权利要求1所述病毒作为疫苗的应用，其特征在于，所述病毒依次经过感染细胞、培养、收获病毒液、灭活和纯化得到疫苗原液后，加入佐剂即得病毒疫苗。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病毒感染的细胞为非洲绿猴肾细胞。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病毒感染细胞后，37℃，5% CO2培养箱中培养，当细胞病变达80%以上时，收获病毒液。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，灭活选用甲醛溶液。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述疫苗原液中病毒浓度为107TCID50/mL。
8.  如权利要求3-7任一项所述的应用，其特征在于，所述佐剂为氢氧化铝。
9.以权利要求1 所述病毒为免疫原制备抗血清的方法，其特征在于，所述病毒依次经过感染细胞、培养、收获病毒液、灭活和纯化得到疫苗原液后，用疫苗原液免疫动物，获得抗血清。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述疫苗原液免疫动物时配合佐剂使用。  
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