CN103989912A - 用于缺血性脑卒中后神经再生的中药组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，涉及一种中药组合物，特别涉及一种用于缺血性脑卒中后神经再生的中药组合物及其制备预防或用于缺血性脑卒中后神经再生药物的应用。针对目前缺血性脑血管病的化学治疗药物肝毒性较大，本发明的提供一种用于缺血性脑卒中后神经再生的中药组合物，其包括如下组分：巴戟天15份、乌药6份、石榴皮10份、木通10份、浙贝母10份、牛膝20份，丹参20份、肿节风10份、川芎5份、青葙子8份、黄柏15份、牛蒡子7份、蛇床子10份、甘草10份。该中药组合物在用于缺血性脑卒中后神经再生方面均具有很好的治疗效果，具有显著的临床推广价值。

Description

用于缺血性脑卒中后神经再生的中药组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于缺血性脑卒中后神经再生的中药组合物，属于医药技术领域。

背景技术

缺血性脑血管病（ICVD）约占全部脑血管病的80%，具有发病率、致残率、治病率高的特点，已经成为严重危害人类健康的疾病之一。缺血性脑血管病是脑血管病中最主要的病种之一，是局部血液循环所提供的氧及其他营养物质与神经元代谢需求之间的骤然供需不平衡，最终导致缺血中央区的神经元受损的一类疾病。短暂性脑缺血发作简称TIA，也称一过性脑缺血发作或小中风，它是由于负责供应脑部血液的动脉血管短时间内供血不足，引起相应动脉负责供血的脑组织发生暂时性功能障碍。此病的主要临床症状常常表现为突然发作的头晕、眼花、眩晕、耳鸣、走路不稳，严重时意识模糊、双目失明或复视、单侧或双侧肢体无力与感觉异常、莫名其妙地摔倒、说话不流利等。能够引发短暂性脑缺血发作的原因颇多，诸如高血压、高脂血症、动脉粥样硬化、糖尿病是最主要和最常见的原因，而过度用脑，情绪激动，寒冷，劳累则可促其发生。

短暂性脑缺血发作每次犯病的时间持续不久，通常是数秒钟、数分钟或数小时不等，最长不超过24小时，因此容易被人忽视。实际上，短暂性脑缺血是脑血管病的先兆或危险信号，如不及时治疗极易恶化发展成为严重脑血管病从而威胁病人生命。据统计，约有25%-40%短暂性脑缺血患者在5年内将产生严重的脑梗塞。因此，对短暂性脑缺血发作应当进行积极治疗，降低血液粘稠度，调整血液的高凝状态，控制和维持血压在正常范围内，终止和减少短暂性脑缺血发作，预防或推迟脑梗塞的发生。

脑梗塞是由于脑动脉粥样硬化，血管内膜损伤使脑动脉管腔狭窄，进而因多种因素使局部血栓形成，使动脉狭窄加重或完全闭塞，导致脑组织缺血、缺氧、坏死，引起神经功能障碍的一种脑血管病。脑缺血和脑梗塞具有十分密切的联系，能够实现对脑缺血的治疗就会进一步延缓或者预防脑梗塞的发生和发展。

脑保护药物是目前神经学界研究的热点,各种药物处于不同研究阶段,但目前还没有一种药物可以对大脑保护取得公认的确切疗效。目前医学上对于脑缺血或脑梗塞的治疗尚没有特效药物，一般临床上建议是控制血压,清淡饮食,并可以服用扩血管药和活血化淤的药或者营养脑细胞的药物改善。但临床实践表明，上述药物的治疗效果并不能令人满意，而这些药物高昂的花费通常让患者苦不堪言。

中医药在用于缺血性脑卒中后神经再生方面积累大量的中医理论和临床实践。中医认为，缺血性脑血管病是脑血管意外之一，属于中医的“中风病”，“中风病”为“风、痨、臌、胀”四大难症之首，是仅次于心血管疾病与癌症而位居第三位的威胁人类生命的疾病，老年人易发，并有逐渐年轻化的趋势。缺血型中风病发作前绝大多数病人有先兆，中医称“中风先兆”。病人多有高血脂、高血糖、高粘血症、颈椎病等。主要病理变化是在脑动脉硬化、高脂血症、高粘血症的基础上，血流粘稠而缓慢，或者加上其它因素压迫脑血管，由粘、缓、窄的共同作用，使血管内形成小血栓或血管壁形成了附壁血栓，部分阻塞或者暂短的阻塞了脑血流，造成脑组织的短时缺血、缺氧，病人表现为一过性的头晕目眩、口角流涎、手臂麻木、下肢发软等症状。在“中风先兆”期及时进行防治，可预防中风病发生或者减轻患者的中风病症状，从而降低发病率、致残率及死亡率。传统医药治疗脑梗塞在昔日曾挽救了不少患者的生命，随着西方医学的发展，尽管传统医药倍受冷遇，但一些单方和提纯制剂目前仍广泛应用于临床，如丹参、银杏、川芎、葛根、灯盏花等中药制剂。中华医学会神经病学分会于1998年建议活血化淤的中药可用于急性缺血性脑卒中的治疗，但需要更多高质量的证据应证。目前国外指南中尚无有关中医中药治疗缺血性脑卒中的建议。

发明内容

针对目前医学实践中缺少脑缺血或脑梗塞显效治疗药物、且药物价格高昂的现有技术不足，本发明提供一种用于缺血性脑卒中后神经再生的药物。该药物以中药组合物为主要活性成分，其用于缺血性脑卒中后神经再生时，疗效显著，成本低廉，具有良好的医学应用前景。

针对目前缺血性脑血管病临床治疗药物的不足，本发明的第一个目的在于提供一种用于缺血性脑卒中后神经再生的中药组合物，该中药组合物在治疗急性缺血性脑血管病、慢性缺血性脑血管病以及过敏性缺血性脑血管病方面具有很好的治疗效果。本发明所述的中药组合物由以下重量份的原料制得：巴戟天14-20份、乌药4-8份、石榴皮6-12份、木通6-12份、浙贝母6-12份、牛膝15-25份、丹参15-25份、肿节风6-12份、川芎4-8份、青葙子8份、黄柏14-20份、牛蒡子4-8份、蛇床子6-12份、甘草6-12份。

本发明中药组合物优选由以下重量份的原料制得：巴戟天15份、乌药6份、石榴皮10份、木通10份、浙贝母10份、牛膝20份、丹参20份、肿节风10份、川芎5份、青葙子8份、黄柏15份、牛蒡子7份、蛇床子10份、甘草10份。

巴戟天为中草药双子叶植物茜草科巴戟天的干燥根。主治阳痿遗精、宫冷***、***、少腹冷痛、风湿痹痛、筋骨痿软。巴戟天与淫羊霍二者性味相近，均可补肾阳、强筋骨，祛风除湿。然淫羊霍辛、温之性较强，其辛散壮阳之力较峻，且温中寓燥，二药有一缓，一峻，一润、一燥之不同。盐巴戟天擅入肾经，补肾功强，用于肾亏阳蒌、早泄***，制巴戟天性缓毒去，使功更专，用治风冷腹痛，关节酸痛，小便失禁等证。

乌药为樟科植物乌药的干燥块根。全年均可采挖，除去细根，洗净，趁鲜切片，晒干，或直接晒干。《药品化义》中记载“乌药，气雄性温，故快气宣通，疏散凝滞，甚于香附。外解表而理肌，内宽中而顺气。以之散寒气，则客寒冷痛自除；驱邪气则天行疫瘴即却；开郁气，中恶腹痛，胸膈胀满，顿然可减；疏经气，中风四肢不遂，初产血气凝滞，渐次能通，皆藉其气雄之功也。”。

石榴皮系维吾尔医常用药材，为石榴科植物石榴(punicagranatum L.) 的干燥果

皮。石榴皮性酸、味涩, 在我国传统医药中主要用于久泻、出血等证。石榴皮中的多酚是一类具有多酚羟基化合物的总称，包括鞣花单宁、没食子单宁、鞣花酸、没食子酸等多种化合物，含量约为其干质量的10%-20%，具有抗菌、抗氧化、抗衰老、抗癌防癌、降血压和预防心脑血管疾病等多种生理和药理活性。

木通为双子叶植物药木通科植物白木通或三叶木通、木通（五叶木通）的木质茎。属木通科木通属。性味苦，凉。泻火行水。通利血脉。主治小便赤涩，淋浊，水肿，胸中烦热，喉痹咽痛，遍身拘痛，妇女经闭，乳汁不通。内无湿热，津亏，气弱，精滑，溲频及孕妇忌服。

牛膝为苋科植物牛膝的根，有补肝肾；强筋骨；活血通经；引火下行；利尿通淋的功效。主治：腰膝酸痛；下肢痿软；血滞经闭；痛经；产后血瘀腹痛；徵瘕；胞衣不下；热淋；血淋；跌打损伤；痈肿恶疮；咽喉肿痛。丹参具有活血散淤、消肿止血、消炎止痛、调经止痛、扩张冠状动脉、改善心肌缺血状况、降低血压、安神静心、降血糖和抗菌等功效，对***，经闭痛经，症瘕积聚，胸腹刺痛，热痹疼痛，疮疡肿痛，心烦不眠；肝脾肿大，心绞痛等病症有一定的疗效。此外，近代医学实验证明，丹参还具有抗血小板凝聚、降低血液黏度及调节内外凝血***的功能，是一种安全又可靠的治疗心脏血管疾病的天然中药。

肿节风为金粟兰科植物草珊瑚的干燥全株。夏、秋二季采收，除去杂质，晒干。功能主治抗菌消炎凉血清热解毒，祛风通络，活血散结。用于肺炎、阑尾炎、蜂窝组织炎属热毒壅盛证候者；以及风湿痹痛、跌扑损伤、肿瘤的辅助治疗。

川芎，原名芎藭。一种中药植物，常用于活血行气，祛风止痛，主要栽培于四川、云南、贵州、广西、湖北等地。 川芎辛温香燥，走而不守，既能行散，上行可达巅顶；又入血分，下行可达血海。活血祛瘀作用广泛，适宜瘀血阻滞各种病症；祛风止痛，效用甚佳，可治头风头痛、风湿痹痛等症。 昔人谓川芎为血中之气药，殆言其寓辛散、解郁、通达、止痛等功能。 本品辛温升散，凡阴虚阳亢及肝阳上亢者不宜应用；月经过多、孕妇亦忌用。

青葙子，系青葙的种子。该植物为一年生草本。高30-100厘米，茎直立，具分枝。花多数，密生，在茎和枝端形成塔状或圆柱状穗状花序。胞果卵状，包在宿存花被片内；盖裂，上部作帽状脱落。种子肾状圆形，黑色，光亮，放大镜下可见矩形网状花纹，呈同心圆状排列。种子脂肪油为青葙子油（celosiaol），并含烟酸和硝酸钾。味苦，微寒。有清肝火、祛风热、明目、降血压之功效，分布几乎遍及全国。

木通为双子叶植物药木通科植物白木通或三叶木通、木通（五叶木通）的木质茎。属木通科木通属。性味苦，凉。泻火行水。通利血脉。主治小便赤涩，淋浊，水肿，胸中烦热，喉痹咽痛，遍身拘痛，妇女经闭，乳汁不通。内无湿热，津亏，气弱，精滑，溲频及孕妇忌服。

蛇床子为伞形科植物蛇床的果实。别名：蛇米、蛇珠、蛇粟、蛇床仁、蛇床实、气果、双肾子、癞头花子、野茴香。 有温肾壮阳；燥湿杀虫；祛风止痒的功效。治男子阳痿；阴囊湿痒；女子宫寒***；寒湿带下；阴痒肿痛；风湿痹痛；湿疮疥癣。唐代用于阳痿及宫冷***。蛇床子有温肾助阳之功，治疗肾阴虚衰引起的男子阳痿，女子宫冷***，可与枸杞子、菟丝子、五味子、肉桂等同用，以益肾补火，助阳兴痿；《千金方》治肾阳虚寒，阳痿不起的天雄丸，即以本品配伍而成。用于男子阴囊湿痒，女子阴痒带下，湿疹疥癣。蛇床子可燥湿祛风，杀虫止痒。治阴囊湿疹，女子阴痒带多，可单用或与苦参、黄柏、明矾等煎汤外洗；《外科大成》以本品与威灵仙、当归尾、苦参同用，水熏洗，并服龙胆泻肝汤，治肾囊风瘙痒作痛。治湿疹疥癣，可与枯矾、苦参、黄柏、硼砂等合用；治秃疮、疥疮、瘙痒多水者，可以本品配伍枯矾、雄黄、大枫子等，如《疡科纲要》蛇床子散。

制备本发明中药组合物的方法如下：取上述重量组分的各药材，加药材总重量的5-15倍的水，浸泡10-60分钟，煎煮1-4次，每次1-3小时，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩至相对密度1.05-1.25的浸膏，该相对密度是在60摄氏度下的检测结果，加入乙醇至含醇量为60-90%（v/v），静置24小时，取上清液，回收乙醇至浓缩，即得。本发明上述中药组合物可以进一步制备成临床上常用的药物制剂，优选为合剂、片剂、胶囊剂。

本发明实施例7中药组合物对脑缺血模型大鼠海马一氧化氮和一氧化氮合酶的影响实验中，中药组合物各治疗组的NO和NOS水平均极显著低于模型组的NO和NOS水平，且明显低于阳性对照药尼莫地平治疗组的NO和NOS水平，提示中药组合物可以显著降低大鼠海马中的过氧化物，对大脑海马神经元具有明显的保护作用。本发明实施例8中中药组合物对脑缺血及其引发的脑梗塞治疗结果显示，中药组合物不仅可以显著降低大鼠脑缺血模型的血清MDA含量，减少自由基对大鼠脑的损伤，而且可以减小脑缺血大鼠的脑梗塞面积，可见中药组合物对缺血性脑损伤疾病特别是脑缺血以及脑缺血引发的脑梗塞具有显著的治疗效果，且这种治疗效果具有剂量依赖性。各给药组大鼠的海马锥体细胞的显微镜下照片显示模型组大鼠海马锥体细胞细胞核皱缩，染色深，细胞碎片多，应用中药组合物治疗后中药组合物组对脑缺血后损伤的神经元具有保护作用，其中中药组合物高剂量组的神经元细胞的细胞形态和数量与模型组具有十分显著的差异。本发明实施例8发现应用本发明中药组合物干预7 d 后, 其缺血BrdU+ 阳性细胞明显增加, 说明可促进内源性神经干细胞的激活、分化、增殖, 有利于缺血性损伤的神经细胞修复。该实施例还证实,本发明中药组合物能够激活内源性神经干细胞, 增加缺血区新生血管, 改善缺血区脑供血, 促进神经功能恢复。具体如下：与缺血性脑卒中组相比，阳性药物和本发明中药组合物均可以显著升高BrdU⁺细胞数量和CD31⁺细胞数量，其中本发明中药组合物在升高BrdU⁺细胞数量和CD31⁺细胞数量方面与阳性药物组相比具有显著性或极显著性的差异，本发明中药组合物对于神经干细胞的再生和脑微血管的生成体现出明显的剂量依赖性。

因此，本发明请求保护中药组合物用于用于缺血性脑卒中后神经再生的用途，由于现代动物福利的提高和饮食的复杂性，动物患脑血管疾病机率也明显增加。本发明所述的用途治疗对象可以为人或者动物，所述动物优选为哺乳动物。本发明所述的药物用途中，中药组合物用于缺血性脑卒中后神经再生时可以根据病情和药物性质选择合适的给药途径，优选为口服给药，用于治疗或预防脑缺血或脑梗塞的给药剂型可以为本发明上述所述的药物制剂，如合剂、片剂、胶囊剂。

本发明所述的药物组合物用于缺血性脑卒中后神经再生时具有以下优势：

1) 本发明中药组合物对脑缺血或脑梗塞治疗和预防效果确切，不仅可以为脑缺血或脑梗塞的治疗提供一种新的用药选择，而且其治疗效果优于阳性药物尼莫地平，适宜推广使用；

2) 本发明中药组合物可促进内源性神经干细胞的激活、分化、增殖， 有利于缺血性损伤的神经细胞修复；另外，本发明中药组合物能够激活内源性神经干细胞， 增加缺血区新生血管，改善缺血区脑供血， 促进神经功能恢复；

3)   本发明所述中药组合物起效剂量低，并可以制备成不同的给药剂型和给药剂量，可以根据患者疾病的严重程度选用合适的给药方案，从而可以大大提高患者的用药依从性，提高药物使用的长期效果。

具体实施方式

以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。在本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明所述的中药组合物进行适当改进、替换功效相同的组分，对于本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明的范围之内。

实施例1 本发明的中药组合物合剂

处方：巴戟天15份、乌药6份、石榴皮10份、木通10份、浙贝母10份、牛膝20份，丹参20份、肿节风10份、川芎5份、青葙子8份、黄柏15份、牛蒡子7份、蛇床子10份、甘草10份。

制备方法：取上述重量组分的各药材，加药材总重量的5倍的水，浸泡30分钟，煎煮2次，每次2小时，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩至相对密度1.1的浸膏，该相对密度是在60摄氏度下的检测结果，加入乙醇至含醇量为75%（v/v），静置24小时，取上清液，回收乙醇浓缩，加水至1000ml，搅匀，分装，流通蒸汽灭菌35min，即得合剂。

实施例2  本发明的中药组合物片剂

处方：巴戟天15份、乌药6份、石榴皮10份、木通10份、浙贝母10份、牛膝20份，丹参20份、肿节风10份、川芎5份、青葙子8份、黄柏15份、牛蒡子7份、蛇床子10份、甘草10份。

制备方法：取上述重量组分的各药材，加药材总重量的10倍的水，浸泡60分钟，煎煮1次，每次1小时，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩至相对密度1.25的浸膏，该相对密度是在60摄氏度下的检测结果，加入乙醇至含醇量为80%（v/v），静置24小时，取上清液，回收乙醇至浓缩，真空干燥、制粒，压片即得。

实施例3  本发明中药组合物胶囊

处方：巴戟天15份、乌药6份、石榴皮10份、木通10份、浙贝母10份、牛膝20份，丹参20份、肿节风10份、川芎5份、青葙子8份、黄柏15份、牛蒡子7份、蛇床子10份、甘草10份。

制备方法：取上述重量组分的各药材，加药材总重量的8倍的水，浸泡45分钟，煎煮4次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩至相对密度1.2的浸膏，该相对密度是在60摄氏度下的检测结果，加入乙醇至含醇量为90%（v/v），静置24小时，取上清液，回收乙醇至浓缩，真空干燥，制粒，装胶囊即得。

本发明中药组合物还可以含有其他药学辅料制成合适的药物制剂，如片剂、胶囊剂等。其中首先将中药组合物制备成中药组合物细粉，所述中药组合物细粉的制备方法为：取上述重量组分的各药材，加药材总重量的5-15倍的水，浸泡10-60分钟，煎煮1-4次，每次1-3小时，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩至相对密度1.05-1.25的浸膏，该相对密度是在60摄氏度下的检测结果，加入乙醇至含醇量为60-90%（v/v），静置24小时，取上清液，回收乙醇至浓缩，真空干燥后粉碎即可得到中药组合物细粉。

所述的中药组合物细粉可以应用于下述实施例中。

实施例4 本发明中药组合物片剂制备

处方：中药组合物细粉50g、淀粉25g、糊精35g、低取代羟丙基纤维素5g、硬脂酸镁1g、60%乙醇适量。

 制备工艺：称取处方量的、中药组合物细粉、淀粉、糊精和低取代羟丙基纤维素混合均匀。另取适宜量的60%乙醇，加入于混合粉末中，混合均匀后制软材，通过16目筛制粒，60℃以下干燥。干燥后完成后用18目筛进行整粒，筛出干粒中的细粉，与过筛的硬脂酸镁混匀，然后再与干颗粒混和均匀，压片，即得。

实施例5 本发明中药组合物片剂制备

    处方：中药组合物细粉25g、微晶纤维素18g、羟丙基纤维素15g、硬脂酸镁1.5g、 8%淀粉浆适量。

 制备工艺：称取处方量的中药组合物细粉、微晶纤维素和羟丙基纤维素混合均匀。另取适宜量的8%淀粉浆溶液，加入混合粉末中，混合均匀后制软材，通过16目筛制粒，60℃以下干燥。干燥后完成后用18目筛进行整粒，筛出干粒中的细粉，与过筛的硬脂酸镁混匀，然后再与干颗粒混和均匀，压片，即得。

实施例6 本发明中药组合物胶囊剂制备

    处方：中药组合物细粉25g、可压性淀粉40g、乳糖3g、低取代羟丙基纤维素5g、60%乙醇适量。

制备工艺：将处方中的各辅料过100目筛，称取中药组合物细粉与可压性淀粉、乳糖和低取代羟丙基纤维素混合均匀后，加入60%乙醇溶液制软材，18目筛制颗粒，于60℃干燥，16目筛整粒，装填胶囊，即得。

实施例7 中药组合物对脑缺血模型大鼠海马一氧化氮和一氧化氮合酶的影响

本试验中发明人采用尼莫地平作为阳性对照药物，它是一种Ca²⁺通道阻滞剂，通过有效地阻止Ca²⁺进入细胞内、抑制平滑肌收缩，达到解除血管痉挛之目的。动物实验证明，尼莫地平对脑动脉的作用远较全身其他部位动脉的作用强许多，并且由于它具有很高的脂溶性特点，易透过血脑屏障。此外，可选择性地作用于脑血管平滑肌，扩张脑血管，增加脑血流量，明显减少血管痉挛引起的缺血性脑损伤。

1、材料与方法

1.1动物分组

SPF级健康雄性SD大鼠60只，体重250-300 g，由山东大学实验动物中心提供。造模6周后，大鼠随机分为6组，正常对照组、模型组、尼莫地平组、中药组合物高剂量组(高剂量组)、中药组合物中剂量组(中剂量组)和中药组合物低剂量组(低剂量组)，每组10只。造模后第7周正常对照组和模型组大鼠分别给予等体积的溶媒灌胃，尼莫地平组大鼠给予30mg/(kg·d)，中药组合物高剂量组大鼠给药剂量100mg/(kg·d)，中药组合物中剂量组给药剂量50 mg/(kg·d)中药组合物低剂量组大鼠给药剂量为10mg/(kg·d)，连续给药3周。

1.2试剂和仪器

中药组合物：按实施例2制备工艺制备，中药组合物处方为：巴戟天15克、乌药6克、石榴皮10克、木通10克、浙贝母10克、牛膝20克，丹参20克、肿节风10克、川芎5克、青葙子8克、黄柏15g、牛蒡子7g、蛇床子10g、甘草10克。

尼莫地平：购自山西亚宝药业集团股份有限公司，批号90602；

NO、NOS试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号20091210；

一抗nNOS、iNOS、eNOS和t3肌动蛋白抗体：北京博奥森生物技术有限公司，批号s-0156R；羊抗兔Ig-G：北京鼎国生物技术有限公司，批号0090915。

DYCZ-24D型垂直板电泳槽，北京六一仪器厂；

JS-250电泳仪，上海培清科技有限公司；

TS-2000A脱色摇床，江苏其林贝尔仪器制造有限公司；

MDF—U333低温冰箱，SANY0；Precisa XS125电子天平；

UV2550分光光度计，日本岛津。

1.3脑缺血大鼠模型的制备

大鼠术前禁食12 h、禁水4 h，用10％水合氯醛(0.30ml/100g)腹腔注射麻醉，仰卧固定于木制手术台上。颈前部备皮，酒精、碘酒消毒后，沿腹侧颈正中切开，依次钝性分离皮下脂肪、胸骨舌骨肌和胸锁***肌，再分别分离暴露左、右侧颈总动脉及气管，于近心端和远心端双重结扎后从中间剪断，然后逐层缝合肌肉、皮肤。正常对照组大鼠同法行颈前皮肤切开，分离皮下脂肪。

1.4 NO含量和NOS活性的测定

造模后第10周，各组大鼠断头取脑，去除嗅球、小脑，取出大脑海马称重，加入9倍冷生理盐水，电动匀浆机研磨，制成10％匀浆液，3000 r/min，离心10 min，取上清液，按试剂盒说明书测定NO含量和NOS活性。

各组大鼠新鲜脑组织海马抽提蛋白后取等量的蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至硝酸纤维素膜，室温封闭30 min，nNOS、iNOS、eNOS和t3肌动蛋白一抗500倍稀释于封闭液中，4℃反应过夜后室温孵育2 h。充分漂洗后辣根过氧化物酶标记的二抗羊抗兔IgG 1500倍稀释于封闭液中，室温孵育1 h。将膜置于DAB显色液中，显影、定影、曝光。利用Quantity one软件分析条带的灰度值。

1.5统计学方法

采用SPSS 12.0统计软件，数据以                                                表示，组问比较采用方差分析，方差齐者采用LSD检验，方差不齐者采用Tamhane’S检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组大鼠海马NO含量和NOS活性的比较

如表1所示，与正常对照组比较，模型组大鼠海马NO含量和NOS活性明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，尼莫地平组和中药组合物各剂量组大鼠海马NO含量和NOS活性明显降低(P＜0.05)；与阳性对照药尼莫地平相比，中药组合物各剂量组大鼠海马NO含量和NOS活性均显著降低(P＜0.05)，其中中药组合物高剂量组与尼莫地平治疗组相比具有极显著差异（P＜0.01）。

表1 各给药组大鼠海马NO含量和NOS活性比较

       与正常对照组相比，^**P＜0.01；与模型组相比，^￥P＜0.05，^￥￥P＜0.01；

与尼莫地平组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

2.2各组大鼠海马3种NOS亚型表达的比较

如表2所示，与正常对照组比较，模型组大鼠海马nNOS和iNOS表达明显升高，eNOS表达明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，尼莫地平组和高剂最组大鼠海马nNOS和iNOS表达明显降低，eNOS表达明显升高(P<0.05)；与阳性对照药尼莫地平相比，中药组合物各剂量组大鼠海马nNOS和iNOS表达明显降低，eNOS表达明显升高 (P＜0.05)，其中中药组合物高剂量组与尼莫地平治疗组相比具有极显著差异（P＜0.01）。

表2 各给药组大鼠海马NOS 3种亚型表达的比较

与正常对照组相比，^**P＜0.01；与模型组相比，^￥P＜0.05，^￥￥P＜0.01；

与尼莫地平组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

实施例8 中药组合物对脑缺血及其引发的脑梗塞的治疗作用

1.实验材料

本实验中所采用的实验动物为雄性SD大鼠，体重为250-300g，室温下12h昼夜节律下饲养,自由饮食。上述实验动物由山东大学实验动物中心提供。本实验中的供试品中药组合物的制备方法及处方同实施例7；对照品为纯水。

本实验使用的相关材料及试剂如下：MDA试剂盒（购自上海史瑞可生物科技有限公司），20%水合氯醛、碘伏、焦油紫、双氧水、酒精、二甲苯、4%多聚甲醛 、生理盐水均为实验室常用试剂。本实验主要仪器与设备：大鼠头部固定器、电凝器、721型可见分光光度计、病理组织漂烘处理仪、石蜡切片机、显微镜数码相机均为药理实验室常用仪器。

．实验方法

2.1 动物分组：将实验动物随机分为5组：模型组，假手术组，中药组合物高剂量组（100 mg/kg），中药组合物中剂量组，中药组合物低剂量组（10 mg/kg），每组10只。

2.2 大鼠脑缺血模型的建立：实验动物以20%水合氯醛（300-350mg/kg）腹腔注射麻醉后，分离双侧颈总动脉并电凝椎动脉。手术第二天动物于清醒状态下结扎双侧颈总动脉，缺血15分钟后放开动脉夹再灌。缺血时保持其直肠温度在36.5-37.5℃之间。以缺血动物体征表现判断缺血模型的可靠性。大鼠脑缺血模型鉴定标准如下：缺血前大鼠处于完全清醒状态，其生命体征正常。缺血后30-60秒内大鼠即失去知觉和活动能力，翻正反射消失，呈现角弓反张，同时痛觉消失，双侧瞳孔散大，对强光刺激闭睑反射消失,眼球颜色灰白（正常为鲜红色）。假手术组处理同实验组，但不结扎双侧颈总动脉。本实验中采用该方法制备的大鼠脑缺血模型造模成功率达94.5%。

2.3 给药途径与时间：中药组合物高剂量组（100 mg/kg）和低剂量组（10 mg/kg）均在缺血/再灌后第8小时按指定的剂量给药一次，首次给药16小时后以相同剂量再次给药。假手术组和模型组给予相同体积的蒸馏水，给药方案同中药组合物给药组。

、实验观察及指标测定

3.1 血清MDA含量测定：中药组合物组和模型组最后1次给药8h后处死大鼠，快速心腔内取血，离心取血清，-20℃冻存；采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法测定；操作方法严格按说明书进行。

3.2 脑梗死体积测量：经TTC染色的脑片，用数码相机拍照,应用高清晰度彩色病理图文报告分析***测出各区脑梗死面积。根据公式：梗死体积=［左侧半球体积-（右侧半球体积-苍白区体积）］/全脑体积，算出梗死体积百分比。

3.3 组织学方法：大鼠经腹腔注射水合氯醛麻醉后，开左胸暴露心脏，将针头自心尖穿过左心室***主动脉，先用38℃左右生理盐水约100ml快速灌洗，然后复灌入冰冷的4%的多聚甲醛250-300ml，30分钟内灌完，灌注后的大鼠断头取脑将其直接用4%的多聚甲醛后固定12小时左右。流水冲洗，冲洗时间同固定时间。然后70%（4h）、80% (4h)、90%(4-12h)、95%(2h×2次)、100%(2h×2次)梯度酒精脱水，二甲苯透明（1.5h）、60℃浸蜡（1h×3次）。取出包埋，4℃保存。石蜡切片机切片，厚5mm。45℃温水中贴片于明胶处理过的载玻片上，40℃烘烤过夜。切片经三次二甲苯脱蜡，100%、90%、70%梯度酒精浸水，0.1%焦油紫（Cresyl violet）染色10-20分钟, 按常规方法70%、80%、95%、100%梯度酒精分色，光镜下观察神经元紫色而背景基本无色为止。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片后，光镜观察。在高倍镜下观察神经元细胞的存活与凋亡。有清楚的细胞核，胞体着色良好的计为成活神经元细胞；核皱缩，不成形的为凋亡的神经元细胞。

数据处理：

实验结果应用SPSS12.0软件进行分析，各组计量资料以均数标准差（mean  SD）表示。各组间数据的显著性比较采用t检验；检验结果判定，以p＜0.05为差异有显著性。

实验结果

5.1 血清MDA含量测定结果：如表3所示，模型组MDA含量显著高于假手术组，表明脑缺血造模前后MDA含量具有显著差异。不论是中药组合物高剂量组还是中药组合物低剂量组，其血清MDA含量均与模型组MDA含量存在显著性差异（P＜0.05），其中中药组合物高剂量组与模型组存在极显著性差异（P＜0.01）。

5.2 脑梗死体积测量结果：如表3所示，假手术组无脑梗死。中药组合物治疗组的脑梗死体积与模型组脑梗死体积相比具有显著性差异（P＜0.05），其中中药组合物高剂量组与模型组相比具有极显著性差异（P＜0.01）。

表3 大鼠各给药组间血清MDA含量和脑梗死体积比较 

与模型组比较，^*P＜0.05；与模型组比较，^**P＜0.01。

本实验的实验结果显示，中药组合物不仅可以显著降低大鼠脑缺血模型的血清MDA含量，减少自由基对大鼠脑的损伤，而且可以减小脑缺血大鼠的脑梗塞面积，可见中药组合物对缺血性脑损伤疾病特别是脑缺血以及脑缺血引发的脑梗塞具有显著的治疗效果，且这种治疗效果具有剂量依赖性。

实施例 9 本发明中药组合物对对神经干细胞再生和微血管生成的影响

1.动物模型制作与分组给药

    随机选取40只wista大鼠，体重为200-250g， 用20% 乌拉坦腹腔麻醉仰卧固定， 做颈部正中切口，分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉, 钳夹颈外动脉和颈总动脉， 于颈内和颈外动脉分支处附近作切口，将16mm-17mm 长尼龙线从切口处沿颈内动脉完全***至大脑中动脉并结扎颈内动脉， 阻滞右侧大脑供血， 之后逐层缝合让其苏醒, 苏醒后选择向左侧做转圈运动的成功动物模型, 随机再分成四组， 即缺血性卒中组、阳性药物组（复方活脑舒胶囊，吉林省辉南长龙生化药业股份有限公司）、中药组合物高剂量组和中药组合物低剂量组， 每组10只，中药组合物的制备工艺如本发明实施例1所示。另取10只wista大鼠作为假手术组， 同样20%乌拉坦腹腔麻醉仰卧固定，做颈部正中切口， 只是分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉后就缝合伤口。

 各给药组的给药方案如下所示：假手术组和缺血性卒中组给以0.9% 生理盐水10m l /kg灌胃,阳性药物组（复方活脑舒胶囊组）按60mg/kg给予复方活脑舒胶囊。本发明中药组合物高剂量组按100mg/kg给予按实施例1制备方法制备得到的中药组合物，中药组合物高剂量组按10mg/kg给予按实施例1制备方法制备得到的中药组合物。各族给药体积10ml，每日灌胃1次, 连续7 d。

 2.样本收集与治标测定 

   腹腔注射Brdu及标本收集：各组于第7 d动物腹腔注射BrdU ( 50mg/kg, 连续给药3次, 给药间隔为8 h), 最后一次给予BrdU 腹腔注射6 h后,将动物过量麻醉并使用4% 多聚甲醛灌注取脑留取标本进行BrdU 免疫组化染色标记海马齿状回( dentate gyrus, DG)的新生细胞, CD31标记缺血区周围的微血管。

免疫组织化学染色：将注射了BrdU 标记细胞的大鼠同前制作脑切片, 取含海马DG 区域的脑切片行BrdU染色观察原位干细胞的增殖与分化。取含缺血区脑片行CD31染色观察缺血区周围的微血管。切片常规脱蜡、抗原修复后免疫组织化学染色, 显微镜观察, B rdu染色阳性细胞( Brdu+ 细胞)的细胞核中有棕黄色颗粒, CD31染色阳性细胞( CD31+ 细胞)的细胞浆呈棕褐色, 以40×10倍显微镜观察, 每张切片选择5个相邻的非重叠视野计数阳性细胞和总细胞数。

3、实验结果与讨论

                  表 4 本发明中药组合物对神经干细胞再生和微血管生成的影响

      与缺血性脑卒中组相比， ^*P＜0.05，^**P＜0.01，与阳性药物组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

本实验发现应用本发明中药组合物干预7 d 后, 其缺血BrdU+ 阳性细胞明显增加, 说明可促进内源性神经干细胞的激活、分化、增殖, 有利于缺血性损伤的神经细胞修复。本研究证实,本发明中药组合物能够激活内源性神经干细胞, 增加缺血区新生血管, 改善缺血区脑供血, 促进神经功能恢复。具体如下：与缺血性脑卒中组相比，阳性药物和本发明中药组合物均可以显著升高BrdU⁺细胞数量和CD31⁺细胞数量，其中本发明中药组合物在升高BrdU⁺细胞数量和CD31⁺细胞数量方面与阳性药物组相比具有显著性或极限著性的差异，本发明中药组合物对于神经干细胞的再生和脑微血管的生成体现出明显的剂量依赖性。

Claims (6)

1.一种用于缺血性脑卒中后神经再生的中药组合物，其特征在于由以下重量份的原料制得：巴戟天14-20份、乌药4-8份、石榴皮6-12份、木通6-12份、浙贝母6-12份、牛膝15-25份、丹参15-25份、肿节风6-12份、川芎4-8份、青葙子8份、黄柏14-20份、牛蒡子4-8份、蛇床子6-12份、甘草6-12份。

2.如权利要求1所述的用于缺血性脑卒中后神经再生的中药组合物，其特征在于由以下重量份的原料制得：巴戟天15份、乌药6份、石榴皮10份、木通10份、浙贝母10份、牛膝20份、丹参20份、肿节风10份、川芎5份、青葙子8份、黄柏15份、牛蒡子7份、蛇床子10份、甘草10份。

3.如权利要求1或2所述的用于缺血性脑卒中后神经再生的中药组合物，其特征在于所述中药组合物为合剂、片剂、胶囊剂。

4.一种制备如权利要求1或2所述的用于缺血性脑卒中后神经再生的中药组合物的方法，其特征在于它包括以下步骤：取各药材，加药材总重量的5-15倍的水，浸泡10-60分钟，煎煮1-4次，每次1-3小时，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩至相对密度1.05-1.25的浸膏，该相对密度是在60摄氏度下的检测结果，加入乙醇至含醇量为60-90%v/v，静置24小时，取上清液，回收乙醇至浓缩，即得。

5.如权利要求1或2所述的中药组合物在制备用于缺血性脑卒中后神经再生药物中的用途。

6.如权利要求1或2所述的中药组合物在制备用于制备治疗或预防脑缺血或脑梗死药物中的用途。