CN103983625B - 荧光编码微球的解码方法及*** - Google Patents
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Abstract
本发明公开了荧光编码微球的解码方法及***,该荧光编码微球的解码方法包括如下步骤:激发步骤,用激光对某个荧光微球进行照射;接收步骤,接收所述某个荧光微球被激光激发后发出的光谱波形;判定步骤,在参考光谱波形库中的多个参考光谱波形中,选择与所述光谱波形最为接近的某个参考光谱波形,判定所述某个荧光微球为所述某个参考光谱波形对应的参考荧光微球。本发明可以利用更多的荧光物质对微球进行编码;提高了判别荧光微球的准确度;制备、运输和保存荧光微球更加简单;可以采用更多的波形码,即是说增加了微球编码的数目。
Description
【技术领域】
本发明涉及检测领域,尤其涉及荧光编码微球的解码方法及***。
【背景技术】
生物芯片(biochip)技术是融微电子学、生命科学、计算机科学和光电化学为一体的高通量生物分子检测技术,是生命科学领域的一场重大革命。传统形式的生物芯片技术又称为微阵列(microarray)技术,其原理是将已知序列的生物分子(DNA、RNA、多肽、蛋白质等)集成于固体表面形成探针阵列,用被标记的待检测生物分子与上述探针阵列进行杂交反应,通过检测相应位置的杂交探针,实现生物分子检测的目的。传统生物芯片杂交属于固-液相杂交,其分立的固-液反应环境及洗涤因素使其在检测灵敏度及稀有样品的检测中显现出不足之处。
随着人类基因组计划的进行及人类对自身健康发展的需要,更快速、更高效、更高通量的生物分子检测技术显得尤为重要。因此在传统生物芯片技术的基础上发展出了液相生物芯片(Liquidbiochip)技术。
液相生物芯片技术是集流式技术、荧光微球化学合成技术、生物分子杂交技术、高效数字信号处理技术为一体的尖端生物分子检测技术。液相生物芯片技术的核心是荧光编码标记的功能性高分子微球。目前,荧光微球的编码和解码思想是:以Luminex100为例,***采用红色和橙色两种荧光染料对直径为5.5~5.6um大小的聚苯乙烯微球进行编码,将每种染料以荧光强度分成10等分,形成10×10的100种不同荧光编码,分别偶联上100种不同的探针分子用于生物检测。检测时用激光逐个激发荧光微球,使激发出的荧光信号通过一系列二向色镜和滤光片,再用光电倍增管(PMT)进行收集,最终将信号送入处理器进行处理。
与传统固基芯片相比,液相生物芯片技术具有如下优点:(1)通量高:可同时对100或500种目的分子进行定性、定量分析,实现多成分检测的目的;(2)样本用量少:实现单样本的多成分检测,大量节省了样本用量,能够实现对稀有样品的检测分析,弥补了传统生物芯片技术的不足;(3)灵敏度高:杂交反应在接近生物体***内部环境的液相环境下进行,能够保持蛋白质和DNA的天然构象和活性,而具有较大表面积的微球上可偶联成千上万的探针分子,如此高密度的探针分子能够最大程度的捕获被检测分子,保证杂交反应的充分进行,从而提高了检测的灵敏度;(4)速度快:基于液相反应动力学使杂交反应快速高效,大大缩短了孵育时间,而且流式细胞术使检测分析时间大大缩短;(5)成本低:单样本的多成分检测可有效节约样本、时间和劳动,芯片技术核心的微球制备工艺简单成熟,可实现大规模生产,使检测成本降低;(6)另外,还有检测范围广、准确性高、操作简单灵活、可重复性强等优点。
尽管有如此多的优点,但随着新技术的不断出现以及社会发展对检测技术的进一步要求,液相生物芯片技术仍面临一些困难。
【发明内容】
经过研究发现,目前在临床和实验中,对微球荧光信号的处理方法是先将激发出的微球荧光信号通过一系列二向色镜和滤光片,再用光电倍增管(PMT)进行收集。这种方法具有其局限性,(1)当***的二向色镜和滤光片确定之后,***所能接收的荧光波段也就确定了,使得应用中只能选择一些特定波段的荧光物质进行编码;(2)由于相邻波段的荧光光谱有重叠区域,因此在解调时需要采用经验补偿的方法对重叠区荧光强度进行补偿,这样就影响了***的检测精度;(3)根据检测的需要,同一批次制备的每个微球荧光发光强度必须十分均一,而且需要考虑在储存过程中微球荧光物质的漂白、猝灭等问题,使得荧光微球的制备与储存具有较高的难度,否则由于同一批次规格的荧光微球的荧光强度不一致,在计算机进行分析时,可能会出现解码错误。
为了克服现有技术的不足,本发明提供了一种荧光编码微球的解码方法及***。
荧光编码微球的解码方法,包括如下步骤:
激发步骤,用激光对某个荧光微球进行照射;
接收步骤,接收所述某个荧光微球被激光激发后发出的光谱波形;
判定步骤,在参考光谱波形库中的多个参考光谱波形中,选择与所述光谱波形最为接近的某个参考光谱波形,判定所述某个荧光微球为所述某个参考光谱波形对应的参考荧光微球。
在一个实施例中,还包括如下步骤:
将所述光谱波形分别与参考光谱波形库中的多个参考光谱波形进行相关运算,将与所述光谱波形相关程度最高的参考光谱波形判定为最为接近的某个参考光谱波形。
在一个实施例中,将所述光谱波形进行归一化后进行所述判定步骤。
在一个实施例中,还包括如下步骤:
分别用激光对同一批次的多个荧光微球进行照射;
分别接收所述同一批次的多个荧光微球被激光激发后发出的对应光谱波形;
将多个所述对应光谱波形进行平均后作为所述参考光谱波形库中的参考光谱波形。
在一个实施例中,还包括如下步骤:
将多个所述对应光谱波形进行平均后的波形进行归一化作为所述参考光谱波形库中的参考光谱波形。
在一个实施例中,所述参考光谱波形库中的任意两个参考光谱波形之间的相关系数小于设定相关系数。
本发明还提供了一种荧光编码微球的解码***,包括:激光源、第一透镜、处理器、线阵光电探测器、色散装置、第二透镜、二向色镜和第三透镜;
所述激光源发出的激光经过所述第一透镜准直后,被所述二向色镜反射,然后经过所述第三透镜的聚焦后照射到某个荧光微球;
所述某个荧光微球被激光激发发出的荧光经过所述第三透镜的准直后,透过所述二向色镜,然后经过所述第二透镜的聚焦,并经过色散装置的作用被所述线阵光电探测器接收而得到荧光的光谱波形;
所述处理器用于,在参考光谱波形库中的多个参考光谱波形中,选择与所述光谱波形最为接近的某个参考光谱波形,判定所述某个荧光微球为所述某个参考光谱波形对应的参考荧光微球。
在一个实施例中,还包括扫描装置,所述扫描装置用于,对经过所述二向色镜反射的激光进行移动,使得经过所述第三透镜聚焦的激光依次照射到不同的荧光微球上。
在一个实施例中,所述处理器还用于,将所述光谱波形分别与参考光谱波形库中的多个参考光谱波形进行相关运算,将与所述光谱波形相关程度最高的参考光谱波形判定为最为接近的某个参考光谱波形。
在一个实施例中,所述处理器还用于,将所述光谱波形进行归一化后,选择与所述光谱波形最为接近的某个参考光谱波形。
在一个实施例中,所述处理器还用于,将多个荧光微球对应的光谱波形进行平均后的波形进行归一化作为所述参考光谱波形库中的参考光谱波形。
在一个实施例中,所述参考光谱波形库中的任意两个参考光谱波形之间的相关系数小于设定相关系数。
一些实施例的荧光编码微球的解码方法及***,由于线阵光电探测器接收的是整个可见光波段的光谱信息,对荧光物质的中心波长没有限制,因此可以利用更多的荧光物质对微球进行编码;从另一个方面讲,采用光谱波形对微球进行编码和解码提高了判别荧光微球的准确度;由于不需要利用精确的光强来判别解码荧光微球,所以同一批次荧光微球的发光强度不需要严格一致,使得制备、运输和保存荧光微球更加简单;另外,采用相关运算可以区分出差别很小的光谱波形,因而可以采用更多的波形码,即是说增加了微球编码的数目。
【附图说明】
图1是本发明一种实施例的同一批次的多个荧光微球受激发得到的光谱波形曲线图;
图2是对图1的光谱波形进行归一化处理得到的归一化光谱波形曲线图;
图3是4种归一化参考光谱波形图;
图4是第一批次的荧光微球受激发后的光谱波形图;
图5是第二批次的荧光微球受激发后的光谱波形图;
图6是第三批次的荧光微球受激发后的光谱波形图;
图7是第四批次的荧光微球受激发后的光谱波形图;
图8是将四个批次的荧光微球的光谱波形归一化后放在同一个坐标系中的波形图;
图9是本发明一种实施例的荧光编码微球的解码***。
【具体实施方式】
以下对发明的较佳实施例作进一步详细说明。
经过大量的实验发现,尽管同一批次制备的荧光微球被激发后发出的荧光信号的亮度不一样,但这一批次的荧光微球被激发后发射出的荧光光谱具有很高的相似度。
如图1所示,是用激光对同一批次的多个荧光微球进行激发得到的对应的一系列光谱波形曲线图,其中,横坐标表示像素,纵坐标表示荧光的强度,从图中可以看出,虽然荧光微球受激发而发出的荧光的强度相差较大,但是,光谱波形的形状大致相同,如图2所示,对图1所示的一系列光谱波形进行归一化处理,得到光谱波形的归一化光谱波形曲线图,从图2则可以更加清晰地看出,这一系列的归一化光谱波形图的形状非常接近,因此,归一化光谱波形可以作为参考光谱波形,如果某个荧光微球受到激光激发后的光谱波形与该参考光谱波形接近,则将该荧光微球判别为属于该参考光谱波形对应的荧光微球,即完成了对荧光微球的解码。
可以建立一个参考光谱波形库,里面包含有多个参考光谱波形,每一个参考波形代表一个编码,在判别某个荧光微球属于哪种荧光微球时,在参考光谱波形库中,选择与这个荧光微球的光谱波形最为接近的某个参考光谱波形,该荧光微球即属于所述某个参考光谱波形对应的荧光微球。
当然,参考光谱波形并不局限于上述的归一化光谱波形,也可以利用比较标准的荧光微球激发的光谱波形作为参考光谱波形,或者对同一批次的多个荧光微球激发的光谱波形相加后取平均后作为参考光谱波形,或者对同一批次的多个荧光微球激发的光谱波形相加后取平均后再进行归一化的波形作为参考光谱波形。
参考光谱波形也并不局限于连续的波形,只要采样得到的离散光谱波形能够一定程度反映荧光信号的光谱特征,就可以作为参考光谱波形。拿线阵光电探测器来说,根据线阵光电探测器阵列单元的数目不同,采样得到的光谱波形离散程度不同,采样的精度也不同。
在另一个实施例中,还可以通过相关运算来判断某个光谱波形与哪个参考光谱波形最为接近,将与该光谱波形最为相关的某个参考光谱波形判别为最为接近的参考光谱波形。更为具体的实施例中,通过分别计算该光谱波形与参考光谱波形的相关系数,并选取相关系数最大时对应的参考光谱波形作为最为接近的参考光谱波形。
在一个更为具体的实施例中,可以采用如下的相关运算算法计算相关系数。
在数学上,两个函数的相关性可以用相关函数来描述。相关函数是描述两组信号之间相似性的一种量度。对于两个随机序列,其相关函数定义为:
Rxy[n]=E{x[k]y[k+n]}(l);,
其中Rxy[n]表示y[k]延迟n个序列后与x[k]的相关函数值。
相关系数是对相关函数进行归一化处理,相关系数值可作为判定两个随机序列相似程度的一个指标,其表达式为:
相关系数值越大,说明两组序列相关性越强,当rxy[n]=1时,说明y[k]在延迟n个序列后与x[k]完全相关。本实施例中,将参考光谱波形与待测的光谱波形视为离散序列,选用n=0时的相关系数值rxy[0]来判定参考光谱波形与待测的光谱波形的相关性。
在一个实施例中,通过如下步骤确定参考光谱波形库中的参考光谱波形:
1)设定阈值相关系数(设定相关系数)为0.9900;
2)然后制作四批荧光微球,制作同一批次荧光微球的其中一个方法如下:将第一份数的第一颜色的荧光物质和第二份数的第二颜色的荧光物质倒入容器中调匀,然后将微球放入该容器,使微球充分结合荧光物质从而得到同一批次的荧光微球。
3)分别将一定数量每一批的荧光微球受激发的光谱波形,经过平均、归一化后得到四组归一化光谱波形图,如图3所示:光谱波形A,光谱波形B,光谱波形C和光谱波形D。
4)分别计算两两光谱波形之间的相关系数分别为:AB=0.4786,AC=0.8106,AD=0.5538,BC=0.8985,BD=0.9821,CD=0.9350。这些相关系数均小于0.9900,因而,光谱波形A,光谱波形B,光谱波形C和光谱波形D可以作为参考光谱波形库中的参考光谱波形。因为相关系数是一个相对值,与所选择的信号序列长度(即光谱波形的横坐标长度)及相关运算方法有关,本实施例中采用的是2149个序列长度的归一化相关系数,因而,阈值相关系数的大小可以根据不同条件进行相应调整,以达到能够充分区别不同的参考光谱波形的目的。
在对微球附着荧光物质时,需要考虑生成的荧光微球激发出的光谱波形两两之间并不相关。例如,如果含有红色荧光物质和绿色荧光物质比(份数比)为1:1激发的光谱波形与含有红色荧光物质和绿色荧光物质比(份数比)为1:2激发的光谱波形的相关系数大于阈值相关系数,则不应同时采用上述两种荧光微球用于检测。
图4是:与光谱波形A对应的荧光微球同一批次的荧光微球受激发后的光谱波形(记为第一批次);图5是:与光谱波形B对应的荧光微球同一批次的荧光微球受激发后的光谱波形(记为第二批次);图6是:与光谱波形C对应的荧光微球同一批次的荧光微球受激发后的光谱波形(记为第三批次);图7是:与光谱波形D对应的荧光微球同一批次的荧光微球受激发后的光谱波形(记为第四批次)。从图4至图7显示,每一组的光谱波形的幅度相差较大,但是形状相似度较高,从图8中进一步可以看出,将这四组分别归一化后放入同一个坐标系中,这四组归一化光谱波形具有明显的区别区域。
利用上述公式(2),对这四个批次的所有光谱波形分别与作为参考光谱波形的光谱波形A,光谱波形B,光谱波形C和光谱波形D进行相关运算,将与某个参考光谱波形之间的相关关系数最大的光谱波形判定为与该参考光谱波形对应的某个批次的荧光微球。例如,某个荧光微球对应的光谱波形分别与光谱波形A,光谱波形B,光谱波形C和光谱波形D进行相关运算,若在这四个计算的结果中该光谱波形与光谱波形A之间的相关系数最大,则判定该荧光微球属于第一批次的荧光微球。
将四个批次的荧光微球的光谱波形依次与参考波形进行相关运算,根据验证,其判定的准确率为100%。
如图9所示,一种实施例的荧光编码微球的解码***,包括:激光源1、第一透镜2、线阵光电探测器3、色散装置4、处理器、小孔5、第二透镜6、二向色镜7、扫描装置8、第三透镜9和工作台10;
所述激光源1发出的激光经过第一透镜2的准直后,经过所述二向色镜7的反射到扫描装置8,然后从扫描装置射出再经过第三透镜9的聚焦后照射到工作台10上的某个荧光微球,荧光微球即被激发而发出荧光;
所述某个荧光微球被激光激发发出的荧光经过第三透镜9的准直后,透过所述二向色镜7后、再经过第二透镜6的聚焦后,并通过小孔5后再经过色散装置4的作用后被线阵光电探测器3接收,从而获得荧光的光谱波形;
其中,小孔5设置于第二透镜6的焦点处,用于仅仅让经过该焦点处的所述某个荧光微球发出的荧光信号通过;色散装置4用于将通过小孔5的光进行色散,例如可以采用棱镜、光栅等;线阵光电探测器3用于将经过色散装置4色散的光进行光电转换,从而得到对应的光谱波形;所述处理器用于,对线阵光电探测器3获得的光谱波形进行处理,并在参考光谱波形库中的多个参考光谱波形中,选择与所述光谱波形最为接近的某个参考光谱波形,判定所述某个荧光微球为所述某个参考光谱波形对应的参考荧光微球。本处理器还可以采用前述多个实施例的方法,对荧光微球进行判别解码。
扫描装置8用于对从二向色镜7反射出来的激光进行移动,进而使激光经过第三透镜10的聚焦之后移动到工作台10上的不同荧光微球上,从而可以对检测平台上的不同荧光微球进行照射,处理器据此可以快速分析多个荧光微球。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。
Claims (12)
1.荧光编码微球的解码方法,其特征是,包括如下步骤:
激发步骤,用激光对某个荧光微球进行照射;
接收步骤,接收所述某个荧光微球被激光激发后发出的光谱波形;
判定步骤,在参考光谱波形库中的多个参考光谱波形中,选择与所述光谱波形最为接近的某个参考光谱波形,判定所述某个荧光微球为所述某个参考光谱波形对应的参考荧光微球,其中,所述参考光谱波形库是指包含有多个参考光谱波形的库。
2.如权利要求1所述的荧光编码微球的解码方法,其特征是,还包括如下步骤:将所述光谱波形分别与参考光谱波形库中的多个参考光谱波形进行相关运算,将与所述光谱波形相关程度最高的参考光谱波形判定为最为接近的某个参考光谱波形。
3.如权利要求1所述的荧光编码微球的解码方法,其特征是,将所述光谱波形进行归一化后进行所述判定步骤。
4.如权利要求1所述的荧光编码微球的解码方法,其特征是,还包括如下步骤:
分别用激光对同一批次的多个荧光微球进行照射;
分别接收所述同一批次的多个荧光微球被激光激发后发出的对应光谱波形;
将多个所述对应光谱波形进行平均后作为所述参考光谱波形库中的参考光谱波形。
5.如权利要求4所述的荧光编码微球的解码方法,其特征是,还包括如下步骤:
将多个所述对应光谱波形进行平均后的波形进行归一化作为所述参考光谱波形库中的参考光谱波形。
6.如权利要求1、4或5所述的荧光编码微球的解码方法,其特征是:
所述参考光谱波形库中的任意两个参考光谱波形之间的相关系数小于设定相关系数。
7.一种荧光编码微球的解码***,其特征是,包括:激光源、第一透镜、处理器、线阵光电探测器、色散装置、第二透镜、二向色镜和第三透镜;
所述激光源发出的激光经过所述第一透镜准直后,被所述二向色镜反射,然后经过所述第三透镜的聚焦后照射到某个荧光微球;
所述某个荧光微球被激光激发发出的荧光经过所述第三透镜的准直后,透过所述二向色镜,然后经过所述第二透镜的聚焦,并经过色散装置的作用被所述线阵光电探测器接收而得到荧光的光谱波形;
所述处理器用于,在参考光谱波形库中的多个参考光谱波形中,选择与所述光谱波形最为接近的某个参考光谱波形,判定所述某个荧光微球为所述某个参考光谱波形对应的参考荧光微球,其中,所述参考光谱波形库是指包含有多个参考光谱波形的库。
8.如权利要求7所述的荧光编码微球的解码***,其特征是,还包括扫描装置,所述扫描装置用于,对经过所述二向色镜反射的激光进行移动,使得经过所述第三透镜聚焦的激光依次照射到不同的荧光微球上。
9.如权利要求7所述的荧光编码微球的解码***,其特征是:
所述处理器还用于,将所述光谱波形分别与参考光谱波形库中的多个参考光谱波形进行相关运算,将与所述光谱波形相关程度最高的参考光谱波形判定为最为接近的某个参考光谱波形。
10.如权利要求7所述的荧光编码微球的解码***,其特征是:所述处理器还用于,将所述光谱波形进行归一化后,选择与所述光谱波形最为接近的某个参考光谱波形。
11.如权利要求7所述的荧光编码微球的解码***,其特征是:
所述处理器还用于,将多个荧光微球对应的光谱波形进行平均后的波形进行归一化作为所述参考光谱波形库中的参考光谱波形。
12.如权利要求7所述的荧光编码微球的解码***,其特征是:
所述参考光谱波形库中的任意两个参考光谱波形之间的相关系数小于设定相关系数。
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