CN103983496A

CN103983496A - 被子植物花部器官的线粒体荧光标记方法

Info

Publication number: CN103983496A
Application number: CN201410211027.5A
Authority: CN
Inventors: 王若涵; 张出兰; 张志翔; 纪翔宇; 刘翔宇
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2014-05-19
Filing date: 2014-05-19
Publication date: 2014-08-13
Anticipated expiration: 2034-05-19
Also published as: CN103983496B

Abstract

本发明公开了被子植物花部器官的线粒体荧光标记方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：将处理后的被子植物花部器官在含有Mitotracker Red CMXRos的缓冲液中染色，实现荧光标记被子植物花部器官线粒体。本发明的实验证明，本发明提供了一种被子植物花被片线粒体荧光标记的方法，有以下优点：1)标记效果好，可在激光共聚焦显微镜下观察到线粒体均匀的分布在细胞周围；2)用Mitotracker标记后的装片经固定液固定后，可制成永久制片观察；3)简单、快捷并迅速的标记花部器官中的线粒体；为花部器官线粒体分布及位移的研究奠定基础，实际应用价值高。

Description

被子植物花部器官的线粒体荧光标记方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及被子植物花部器官的线粒体荧光标记方法。

背景技术

花作为植物的繁殖器官，由萼片、花瓣、雄蕊群和雌蕊群组成，承担植物传粉、受精及结实的全部过程，因此成为植物学领域研究的重点对象。植物为响应外界环境变化，进化出多种响应机制，如植物的开花生热，自交不亲和现象，花柱引导组织分泌物质引导花粉管生长的等机制，对保证植物的生殖过程起着至关重要的作用。线粒体作为能量代谢的重要细胞器，能够响应细胞事件，进行运动及位移。花部器官为生殖生长的重要场所，代谢活动旺盛，是研究线粒体分布，位移的重要部位。

目前，对于线粒体分布，运动及位移的研究集中在根尖、裸子植物花粉管和叶片上表皮等部位。研究对象也均为拟南芥、洋葱及烟草等模式生物。迄今为止，在非模式生物花部器官中线粒体的荧光标记未见报道，从而导致对花部器官线粒体的研究比较滞后。

发明内容

本发明的目的是提供一种被子植物花部器官线粒体的荧光标记方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

将处理后的被子植物花部器官在含有Mitotracker Red CMXRos的缓冲液中染色，实现荧光标记被子植物花部器官线粒体。

上述方法中，Mitotracker Red CMXRos购于Molecular Probes，产品目录号M7512，其分子式为C₃₂H₃₂Cl₂N₂O，化学结构式为式1所示：

式1。

上述方法中，所述含有Mitotracker Red CMXRos的缓冲液中Mitotracker RedCMXRos的终浓度为50nM-200nM。

上述方法中，所述含有Mitotracker Red CMXRos的缓冲液中Mitotracker RedCMXRos的终浓度为50nM、100nM或200nM。Mitotracker Red CMXRos染色浓度在50nM-200nM之间均可，但以染色浓度为100nM最佳。Mitotracker浓度为200nM，花被片细胞易发生质壁分离。由于花柱切片并非单层细胞，所以染色浓度可为200nM，并适当延长染色时间，质壁分离现象不明显，染色效果好，花柱切片的最佳染色时间为20min。

上述方法中，所述含有Mitotracker Red CMXRos的缓冲液由Mitotracker RedCMXRos、蔗糖、硼酸和水组成，所述Mitotracker Red CMXRos在所述缓冲液中的终浓度为50nM、100nM或200nM，所述蔗糖在所述缓冲液中的质量百分含量为2％，所述硼酸在所述缓冲液中的质量百分含量为0.01％；

对于质壁分离严重的植物材料，可用蒸馏水代替缓冲液，但会一定程度上影响线粒体活性；所述含有Mitotracker Red CMXRos的缓冲液可以由Mitotracker RedCMXRos和水组成，所述Mitotracker Red CMXRos在所述缓冲液中的终浓度为50nM、100nM或200nM。

上述方法中，所述含有Mitotracker Red CMXRos的缓冲液的pH值为6.5-7.0。

上述方法中，所述染色的温度为23-28℃，所述染色的时间为15-20min。花被片最佳染色时间为15-17min，时间过短，不容易成功标记，而时间过长，细胞壁易被染成厚重红色，不易观察。

所述染色的时间具体为15min、17min或20min。

上述方法中，所述被子植物花部器官为花被片或雌蕊，所述雌蕊具体为花柱。

上述方法中，所述处理后的花被片按照如下方法制备：收集花被片上表皮细胞，得到处理后的花被片；

所述处理后的花柱按照如下方法制备：将花柱切片，得到处理后的花柱。

上述方法中，所述花被片上表皮细胞为单层细胞，且其面积为3.5-4.5mm²，其面积具体为4mm²；

所述花柱切片的厚度为75-85μm，其厚度具体为80μm。

上述方法中，所述花柱切片用Leica VT12000S震荡切片机进行纵切，且刀片与花柱保持20-30°夹角，也可以徒手用刀片纵切，只要花柱切片的厚度为75-85μm即可。

上述方法中，所述被子植物为白玉兰或杜鹃。

上述荧光标记后用Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜观察线粒体荧光标记，激发波长为540nm，接收波长范围为570-630nm。花被片染色后用63×水镜观察，花柱用40×物镜观察。应用激光共聚焦显微镜的xyt模式，可以记录细胞内线粒体的动态过程。

上述方法中，还包括洗涤花部器官的步骤，均采用2％蔗糖和0.01％硼酸组成的缓冲液。

本发明的实验证明，本发明提供了一种被子植物花被片线粒体荧光标记的方法，有以下优点：1)标记效果好，可在激光共聚焦显微镜下观察到线粒体均匀的分布在细胞周围；2)用Mitotracker标记后的装片经固定液固定后，可制成永久制片观察；3)简单、快捷并迅速的标记花部器官中的线粒体；为花部器官线粒体分布及位移的研究奠定基础，实际应用价值高。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为在激光共聚焦显微镜下观察到的白玉兰花被片上表皮线粒体的分布状态

图2为在激光共聚焦显微镜下观察到的白玉兰雌蕊薄层细胞线粒体分布状态

图3为在激光共聚焦显微镜下观察到的杜鹃花花柱徒手切片线粒体分布状态

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

Mitotracker Red CMXRos购于Molecular Probes，产品目录号M7512，其分子式为C₃₂H₃₂Cl₂N₂O，化学结构式为式1所示：

式1。

实施例1、白玉兰花被片线粒体的荧光标记方法

1、白玉兰花被片线粒体的荧光标记

含有100nM Mitotracker Red CMXRos的缓冲液由Mitotracker Red CMXRos、蔗糖、硼酸和水组成，Mitotracker Red CMXRos在所述缓冲液中的终浓度为100nM，蔗糖在所述缓冲液中的质量百分含量为2％，硼酸在所述缓冲液中的质量百分含量为0.01％，缓冲液pH值为6.5。

1)取新鲜花被片，用刀片镊子剥离花被片上表皮单层细胞4mm²，若不是单层细胞，用刀片轻刮上表皮至花被片上表皮呈现透明状态，得到处理后的花被片。

2)将处理后的花被片在含有100nM Mitotracker Red CMXRos的缓冲液中染色，25℃环境下染色15min，得到染色后花被片。

2、检测

将染色后花被片用2％蔗糖和0.01％硼酸组成的缓冲液洗涤3次，在载玻片上用2％蔗糖和0.01％硼酸组成的缓冲液展开，制片。

用激光共聚焦显微镜进行观察，激光共聚焦显微镜的激发波长为540nm，接收波长范围为570-630nm，用63×水镜观察。

结果如图1所示，可以看到，线粒体均匀分布于花被片上皮细胞周围。

实施例2、白玉兰花柱线粒体荧光染色及显微镜观测

1、白玉兰花柱线粒体的荧光标记

含有100nM Mitotracker Red CMXRos的缓冲液由Mitotracker Red CMXRos、蔗糖、硼酸和水组成，Mitotracker Red CMXRos在所述缓冲液中的终浓度为100nM，蔗糖在所述缓冲液中的质量百分含量为2％，硼酸在所述缓冲液中的质量百分含量为0.01％，缓冲液pH值为7.0。

1)取新鲜白玉兰花柱，用刀片纵切花柱，后用502胶水将花柱粘于Leica VT12000S震荡切片机载物台上，切片机刀片与花柱保持30°夹角，设置切片厚度参数为80μm，得到处理后的花柱。

2)将处理后的花柱在含有100nM Mitotracker Red CMXRos的缓冲液中染色，25℃环境下染色17min，得到染色后花柱。

2、检测

将染色后花柱用2％蔗糖和0.01％硼酸组成的缓冲液洗涤3次，在载玻片上用2％蔗糖和0.01％硼酸组成的缓冲液展开，制片。

结果如图2所示，可以看到，线粒体均匀分布于花柱周围。

实施例3、杜鹃花花柱线粒体荧光染色及显微镜观测

含有200nM Mitotracker Red CMXRos的缓冲液由Mitotracker Red CMXRos、蔗糖、硼酸和水组成，Mitotracker Red CMXRos在所述缓冲液中的终浓度为100nM，蔗糖在所述缓冲液中的质量百分含量为2％，硼酸在所述缓冲液中的质量百分含量为0.01％。

1)取新鲜杜鹃花花柱，用刀片纵切花柱，得到边缘为单层细胞的切片厚度参数为80μm的花柱纵切面，为处理后花柱。

2)将处理后的花柱在含有200nM Mitotracker Red CMXRos的缓冲液中染色，25℃环境下染色20min，得到染色后花柱。2、检测

结果如图3所示，可以看到，线粒体均匀分布于花柱周围。

Claims

1.一种被子植物花部器官线粒体的荧光标记方法，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有Mitotracker Red CMXRos的缓冲液中Mitotracker Red CMXRos的终浓度为50nM-200nM。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述含有Mitotracker Red CMXRos的缓冲液中Mitotracker Red CMXRos的终浓度为50nM、100nM或200nM。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：

所述Mitotracker Red CMXRos的缓冲液由Mitotracker Red CMXRos、蔗糖、硼酸和水组成，所述Mitotracker Red CMXRos在所述缓冲液中的终浓度为100nM，所述蔗糖在所述缓冲液中的质量百分含量为2％，所述硼酸在所述缓冲液中的质量百分含量为0.01％；

或所述Mitotracker Red CMXRos的缓冲液由Mitotracker Red CMXRos和水组成，所述Mitotracker Red CMXRos在所述缓冲液中的终浓度为100nM。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述含有Mitotracker RedCMXRos的缓冲液的pH值为6.5-7.0。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述染色的温度为23-28℃，所述染色的时间为15-20min。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：

所述被子植物花部器官为花被片或雌蕊，所述雌蕊具体为花柱。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：

所述处理后的花被片按照如下方法制备：收集花被片上表皮细胞，得到处理后的花被片；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

所述花被片上表皮细胞为单层细胞，且其面积为3.5-4.5mm²，其面积具体为4mm²；

所述花柱切片的厚度为75-85μm，其厚度具体为80μm。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：

所述花柱切片用Leica VT12000S震荡切片机进行纵切，且刀片与花柱保持20-30°夹角；所述被子植物为白玉兰或杜鹃。