CN103981286A - 鉴别8种猪病毒病的GeXP快速检测试剂盒及其引物组 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴别8种猪病毒病的GeXP快速检测试剂盒及其引物组，发明人基于GeXP***研究设计了九对特异性引物和一对通用引物，据此建立了同时鉴别8种猪病毒病的GeXP快速检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。本发明具有特异性好、灵敏度高、方便高效等优点，应用本发明可同时检测和鉴别8种病原体，与病毒分离和血凝抑制实验等常规实验方法的鉴定结果相比，符合率达100％。本发明有效解决了多重PCR过程中的扩增偏爱性，为主要猪常见传染病及其病原体的检测提供了简便、高通量的检测手段，更符合实际的需要，应用前景广阔。

Description

鉴别8种猪病毒病的GeXP快速检测试剂盒及其引物组
技术领域
本发明属于猪病毒病检测技术领域，尤其涉及一种鉴别8种猪病毒病的GeXP快速检测试剂盒及其引物组。
背景技术
H1、H3亚型猪流感病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与障碍综合征病毒、猪乙脑病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型是严重危害猪的8种主要传染性疾病。随着猪养殖业的发展，猪传染性病毒病的发病率也在逐渐升高，已成为限制养猪业发展的一大重要因素。鉴别诊断这些猪传染性疾病的传统方法，主要包括病原分离鉴定和血清学试验等，但这些方法常受临床病料新鲜度、污染程度或病程的限制，操作也十分繁琐、费时，对多重混合感染的鉴别诊断更为困难。近年来，随着分子生物学的发展，PCR技术已被广泛应用于猪传染病的检测并建立了多重PCR检测技术，可同时检测几种病原，但需几对引物组合在一起同时竞争地扩增，引物之间会产生相互干扰，多增加一对引物，敏感性就越低。同时，PCR产物需通过琼脂糖电泳才可观察结果，该电泳难以区分50bp-100bp以内的条带，一般只可做到2-4重PCR，难以达到高通量的检测。多重荧光PCR一般只检测到3重，由于探针要标记不同发光波长的荧光基团，如标记太多的荧光基团，相互会产生干扰，因此，也只能检测到2-4重。由于在多重PCR反应体系中同时存在几对引物，使得形成复杂引物二聚体的概率大大增加，同时检测的目的基因数量有限(多在2-4个基因)，使得多重PCR还达不到高通量快速检测和分析的目的。
GeXP***(Gene Expression Profiler Genetic Analysis System)是美国BeckmanCoulter公司研发的用于研究多基因表达定量分析的平台，由两部分组成：用于设计引物的GeXP eXpression Profiler软件和用于结果分析的GenomeLabTM GeXP GeneticAnalysis System毛细管电泳仪，后者可清晰分离出相差7bp以上的相邻扩增片段。GeXP多重PCR扩增采用荧光标记通用引物和特异性嵌合引物(即基因特异性引物5’端连接通用引物序列)相结合引发多重体系扩增。PCR反应之初，先由反向特异性嵌合引物与原始模板结合进行逆转录反应，再由正向特异性嵌合引物合成cDNA的第二链，此后，由正、反向嵌合引物的特异性序列以cDNA为模板启动PCR反应，分别扩增出通用引物的互补序列；再由反应体系中占主导地位的荧光标记通用引物，与其互补序列结合，引发后续扩增,通用引物与反应体系中带有荧光标记的碱基序列互补，PCR产物经GeXP毛细管电泳分离，含有荧光标记的PCR产物经GeXP检测窗口检测，依据检测片段与标准分子片段(DNASize Standard,DSS)迁移时间计算出扩增片段的长度，荧光信号强度代表该分离片段的扩增含量。GeXP***可在同一个体系里对多达40个目的基因进行有效分析。
利用GeXP多重基因表达遗传分析***，建立一种能同时鉴别多种病原体的检测方法和检测试剂盒，关键和难点是设计特异性引物，并将多重引物有效组合，利用通用引物把多重引物的扩增转化为1对通用引物的扩增，从而达到高通量检测的目的。目前，尚未报道基于GeXP***的同时可检测猪病毒病多种传染性疾病病原体的试剂或试剂盒。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、方便高效的鉴别8种猪病毒病的GeXP快速检测试剂盒及其引物组。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
鉴别8种猪病毒病的GeXP快速检测引物组，包括九对特异性引物，分别是引物对SIV-M-1和SIV-M-2、引物对SIV-H1-1和SIV-H1-2、引物对SIV-H3-1和SIV-H3-2、引物对PRV-1和PRV-2、引物对CSFV-1和CSFV-2、引物对PRRSV-1和PRRSV-2、引物对JEV-1和JEV-2、引物对PPV-1和PPV-2、引物对PCV-1和PCV-2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.18的碱基序列。
上述鉴别8种猪病毒病的GeXP快速检测引物组，还包括一对通用引物，分别是上、下游通用引物Cy5-Tag-F和Tag-R，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.19至SEQ.ID.No.20的碱基序列。
鉴别8种猪病毒病的GeXP快速检测试剂盒，包括反转录RT反应液、PCR反应液、DEPC水、超纯水，PCR反应液中含有九对特异性引物和一对通用引物，分别是引物对SIV-M-1和SIV-M-2、引物对SIV-H1-1和SIV-H1-2、引物对SIV-H3-1和SIV-H3-2、引物对PRV-1和PRV-2、引物对CSFV-1和CSFV-2、引物对PRRSV-1和PRRSV-2、引物对JEV-1和JEV-2、引物对PPV-1和PPV-2、引物对PCV-1和PCV-2以及上、下游通用引物Cy5-Tag-F和Tag-R，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.20的碱基序列。
9对特异性引物对SIV-M-1和SIV-M-2、引物对SIV-H1-1和SIV-H1-2、引物对SIV-H3-1和SIV-H3-2、引物对PRV-1和PRV-2、引物对CSFV-1和CSFV-2、引物对PRRSV-1和PRRSV-2、引物对JEV-1和JEV-2、引物对PPV-1和PPV-2、引物对PCV-1和PCV-2在PCR反应体系对应的摩尔浓度分别为50nmol/L，50nmol/L，100nmol/L，50nmol/L，50nmol/L，50nmol/L，50nmol/L，50nmol/L，50nmol/L；通用引物在PCR反应体系中的摩尔浓度为500nmol/L。
反转录RT反应液每管9μL，含有5×Reverse Transcriptase Buffer5μL、50pmolRandom Primer(9mer)1μL、10mM dNTP Mixture2μL、40U Ribonuclease Inhibitor0.5μL和5U/μL AMV Reverse Transcriptase0.5μL；PCR反应液每管10.7μL，含有10×PCRbuffer2.5μL，25mM MgCl22.5μL，2.5mM dNTP Mixture2μL，9对特异性引物混合物1.25μL，10μM/L上、下游通用引物混合物1.25μL，JumpStart Taq DNA Polymerase1.2μL；DEPC水和超纯水各1mL。
8种猪病毒病的病原分别是H1亚型猪流感病毒、H3亚型猪流感病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与障碍综合征病毒、猪乙脑病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型。上述九对特异性引物引物对SIV-M-1和SIV-M-2、引物对SIV-H1-1和SIV-H1-2、引物对SIV-H3-1和SIV-H3-2、引物对PRV-1和PRV-2、引物对CSFV-1和CSFV-2、引物对PRRSV-1和PRRSV-2、引物对JEV-1和JEV-2、引物对PPV-1和PPV-2、引物对PCV-1和PCV-2分别用于鉴定或辅助鉴定H1亚型猪流感病毒、H3亚型猪流感病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与障碍综合征病毒、猪乙脑病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型。
针对目前缺乏对常见猪病毒病同时进行检测和诊断的有效可靠技术，发明人基于GeXP***研究设计了九对特异性引物和一对通用引物，据此建立了同时鉴别8种猪病毒病的GeXP快速检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。本发明具有特异性好、灵敏度高、方便高效等优点，应用本发明可同时检测和鉴别8种病原体，对H1亚型猪流感病毒、H3亚型猪流感病毒、伪狂犬病毒、猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与障碍综合征病毒、猪乙脑病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型的特异性强，灵敏度分别为10拷贝/μl、10拷贝/μl、10拷贝/μl、1000拷贝/μl、100拷贝/μl、10拷贝/μl、100拷贝/μl、100拷贝/μl、100拷贝/μl，与病毒分离和血凝抑制实验等常规实验方法的鉴定结果相比，符合率达100％。本发明有效解决了多重PCR过程中的扩增偏爱性，为主要猪常见传染病及其病原体的检测提供了简便、高通量的检测手段，更符合实际的需要，应用前景广阔。
附图说明
图1为H1、H3亚型猪流感病毒cDNA混合模板的GeXP九重PCR的毛细管电泳分析图。
图2为H1N2亚型猪流感病毒的cDNA、H3N2亚型猪流感病毒的cDNA、猪瘟病毒的cDNA、美洲型猪繁殖与障碍综合征病毒的cDNA和的猪圆环病毒2型的DNA混合模板的GeXP九重PCR的毛细管电泳分析图。
图3为8种猪传染性疾病病原的GeXP九重PCR的毛细管电泳分析图。
图1-3中，横坐标为PCR扩增产物的碱基数，纵坐标为荧光信号值。
具体实施方式
以下实施例中所使用的猪流感病毒RNA(H3N2、H1N2)、美洲型猪繁殖与障碍综合征RNA由广西大学惠赠；猪流感病毒(H1N1)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)均由广西壮族自治区兽医研究所分离并保存；猪伪狂犬病毒疫苗、猪乙脑病毒疫苗均购自中牧实业有限公司；猪瘟病毒购自广西丽原生物科技股份有限公司。
实施例1、特异性引物对的设计
以GenBank公布的引物序列为参考，从NCBI上下载已知序列使用DNASTAR软件进行序列比对，选取针对各个靶基因高度保守与特异的基因片段，由primer premier5.0软件设计了9重特异性引物，并在引物的5’端添加GeXP通用引物(表1)。
表1引物信息
表1中，兼并碱基代码R＝A/G，D＝A/G/T,Y＝C/T，下划线表示的是上、下游通用引物序列；荧光染料Cy5标记上游通用引物标签,下游引物不标记。根据实际检测的病原体的毒株不同以及GeXP***(如GenomeLabTM GeXP Genetic Analysis System毛细管电泳仪)的误差，使用上述引物对A—I及GeXP通用引物对检测获得的实际扩增产物长度可在预计扩增产物的长度基础上上下波动3bp。
表1中的引物对A—I分别用于检测是否含有H1亚型猪流感病毒、H3亚型猪流感病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与障碍综合征病毒、猪乙脑病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型。
实施例2、PCR引物对的特异性检测
一、模板的制备
1、病毒RNA的提取及cDNA的获得
1)病毒RNA的提取
使用DNA/RNA提取试剂盒(均购自北京全式金生物技术有限公司，目录号为ER201)，按照试剂盒说明书，分别提取猪流感病毒(H1N1、H1N2、H3N2)、猪乙脑病毒(JEV)、美洲型猪繁殖与障碍综合症病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)的RNA
2)cDNA的获得
将步骤1)获得的RNA样品分别按照如下反应体系和反应条件进行反转录，得到cDNA；以DEPC水作为总RNA的对照。
反应体系(25μL)：5×Reverse Transcriptase Buffer5μL,50pmol RandomPrimer(9mer)1μL、dNTP Mixture(10mM)2μL,40U Ribonuclease Inhibitor0.5μL,5U/μL AMV Reverse Transcriptase0.5μL，模板RNA1μg，DEPC水补足至25μL。反转录温度42℃1.5h，置于-20℃保存。
2、基因组DNA的提取
使用DNA/RNA提取试剂盒(均购自北京全式金生物技术有限公司，目录号为ER201)，按照试剂盒说明书，分别提取猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的DNA。
3、测定核酸含量
用核酸蛋白分析仪BioPhotometer测定其OD值，得出其浓度与纯度值，并以此控制核酸质量。
二、使用单重RT-PCR法验证引物
1、单重特异性引物(SP-Primer)稀释至工作浓度1μmol/L，Cy5-Tag-F和Tag-R稀释至工作浓度10μmol/L。按照Sigma JumpStartTaqDNA Polymerase的说明书配制25μL体系，包括10×PCR buffer2.5μL、25mM MgCl22.5μL、2.5mM dNTP Mixture2μL、SP-Primer F/R(1μmol/L)各取1.25μl(PCR体系终浓度50nmol/L)、Cy5-Tag-F和Tag-R(10μmol/L)各取1.25μl(PCR体系终浓度500nmol/L)，JumpStart Taq DNAPolymerase1.2μL、cDNA或DNA2μL，加灭菌水至25μL。每个cDNA/DNA设置3个重复。
反应程序：95℃30s，55℃30s，72℃30s，10个循环；95℃30s，63℃30s，72℃30s，10个循环；95℃30s，50℃30s，72℃30s，20个循环；4℃终止。
毛细管电泳：使用GenomeLab GeXP遗传分析***的各PCR产物同时进行毛细管电泳检测，操作步骤如下：用甲酰胺为上样缓冲液(美国贝克曼库尔特公司,目录编号608082)，DNA size standard Kit-400Base Pairs(美国贝克曼库尔特公司,目录编号608098)与上样缓冲液按体积比1:(80-160)彻底混匀，在样品板上每孔加入39μL混匀好的液体，用PCR产物进行10-100倍稀释，取稀释后的产物1μL加至样品板，吹打混匀，最后在每孔滴入一滴石蜡油封闭，以免甲酰胺氧化和样品蒸发。在缓冲液板上每孔加入2/3的缓冲液，进行毛细管电泳。毛细管电泳的条件如下：毛细管升温：温度50℃；变性：90℃,120s；注入样品：2.0KV，30s；分离：6.0KV，35min。利用GenomeLab GeXP遗传分析***确定各型特异引物扩增片段的实际检测大小。
2、引物对A的特异性检测
1)PCR扩增
用引物对A对步骤一中1获得的猪流感病毒(H1N1、H3N2、H1N2)、美洲型猪繁殖与障碍综合症病毒、猪乙脑病毒、猪瘟病毒的cDNA样品以及步骤一中2获得的猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型DNA样品分别进行PCR扩增，反应体系和反应程序及电泳按照步骤二中1的步骤进行。
2)结果：猪流感病毒毒株(H1N1、H1N2、H3N2)的cDNA样品均可扩增得到181—183bp的扩增产物，经测序证实，该扩增产物的序列为引物对A的靶序列；非猪流感病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对A的特异性很好，可特异检出3种亚型的猪流感病毒(H1N1、H3N2、H1N1亚型)。
3、引物对B的特异性检测
1)PCR扩增和毛细管电泳
用引物对B对步骤一中1获得的猪流感病毒(H1N1、H3N2、H1N2)、美洲型猪繁殖与障碍综合症病毒、猪乙脑病毒、猪瘟病毒的cDNA样品以及步骤一中2获得的猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型DNA样品分别进行PCR扩增，反应体系和反应程序及电泳按照步骤二中1的步骤进行。
2)结果：猪流感病毒毒株(H1N1、H1N2)的cDNA样品均可扩增得到119-121bp的扩增产物，经测序证实，该扩增产物的序列为引物对A的靶序列；非H1亚型的猪流感病毒(H3N2)及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对B的特异性很好，可以特异检出H1N1和H1N2亚型的猪流感病毒。
4、引物对C的特异性检测
1)PCR扩增和毛细管电泳
用引物对C对步骤一中1获得的猪流感病毒(H1N1、H3N2、H1N2)、美洲型猪繁殖与障碍综合症病毒、猪乙脑病毒、猪瘟病毒的cDNA样品以及步骤一中2获得的猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型DNA样品分别进行PCR扩增，反应体系和反应程序及电泳按照步骤二中1的步骤进行。
2)结果：H3N2亚型猪流感病毒毒株的cDNA样品可扩增得到322—325bp的扩增产物，经测序证实，该扩增产物的序列为引物对C的靶序列；非H3N2亚型猪流感病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对C的特异性很好，可以特异检出H3N2亚型猪流感病毒。
5、引物对D的特异性检测
1)PCR扩增
用引物对D对步骤一中2获得的猪伪狂犬病毒DNA样品进行扩增，同时对猪流感病毒(H1N1、H3N2、H1N2)、美洲型猪繁殖与障碍综合症病毒、猪乙脑病毒、猪瘟病毒的cDNA样品以及步骤一中2获得的猪细小病毒、猪圆环病毒2型DNA样品分别进行PCR扩增，反应体系和反应程序及电泳按照步骤二中1的步骤进行。
2)结果：猪伪狂犬病毒病毒毒株的DNA样品可扩增得到225-227bp的扩增产物，经测序证实，该扩增产物的序列为引物对D的靶序列；非猪伪狂犬病毒病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对D的特异性很好，可以特异检出猪伪狂犬病毒。
6、引物对E的特异性检测
1)PCR扩增
用引物对E对步骤一中1获得的猪瘟病毒的cDNA样品进行扩增，同时分别对猪流感病毒(H1N1、H3N2、H1N2)、美洲型猪繁殖与障碍综合症病毒、猪乙脑病毒的cDNA样品以及步骤一中2获得的猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型DNA样品分别进行PCR扩增，反应体系和反应程序及电泳按照步骤二中1的步骤进行
2)结果：猪瘟病毒的cDNA样品可扩增得到159—161bp的扩增产物，经测序证实，该扩增产物的序列为引物对E的靶序列；非猪瘟病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对E的特异性很好，可以特异检出猪瘟病毒。
7、引物对F的特异性检测
1)PCR扩增
用引物对F对步骤一中1获得的美洲型猪繁殖与障碍综合症病毒的cDNA样品进行扩增，同时分别对猪流感病毒(H1N1、H3N2、H1N2)、猪乙脑病毒、猪瘟病毒的cDNA样品以及步骤一中2获得的猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型DNA样品分别进行PCR扩增，反应体系和反应程序及电泳按照步骤二中1的步骤进行。
2)结果：美洲型猪繁殖与障碍综合症病毒的cDNA样品可扩增得到260—263bp的扩增产物，经测序证实，该扩增产物的序列为引物对F的靶序列；非美洲型猪繁殖与障碍综合症病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对F的特异性很好，可以特异性检出美洲型猪繁殖与障碍综合症病毒。
8、引物对G的特异性检测
1)PCR扩增
用引物对G对步骤一中1获得的猪乙脑病毒的cDNA样品进行扩增，同时对猪流感病毒(H1N1、H3N2、H1N2)、美洲型猪繁殖与障碍综合症病毒、猪瘟病毒的cDNA样品以及步骤一中2获得的猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型DNA样品分别进行PCR扩增，反应体系和反应程序及电泳按照步骤二中1的步骤进行。
2)结果：猪乙脑病毒的cDNA样品可扩增得到301—303bp的扩增产物，经测序证实，该扩增产物的序列为引物对G的靶序列；非猪乙脑病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对G的特异性很好，可以特异检出猪乙脑病毒。
9、引物对H的特异性检测
1)PCR扩增
用引物对H对步骤一中2的猪细小病毒的DNA样品进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一中1获得的猪流感病毒(H1N1、H3N2、H1N2)、猪乙脑病毒、美洲型猪繁殖与障碍综合症病毒、、猪瘟病毒的cDNA样品以及步骤一中2获得的猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型DNA样品分别进行PCR扩增，反应体系和反应程序及电泳按照步骤二中1的步骤进行。
2)结果：猪细小病毒的DNA样品可扩增得到137—139bp的扩增产物，经测序证实，该扩增产物的序列为引物对H的靶序列；非猪细小病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对H的特异性很好，可以特异检出猪细小病毒。
10、引物对I的特异性检测
1)PCR扩增
用引物对I对步骤一中2的猪圆环病毒2型的DNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一中1获得的猪流感病毒(H1N1、H1N2、H3N2)、猪乙脑病毒、美洲型猪繁殖与障碍综合症病毒、猪瘟病毒的cDNA样品以及步骤一中2获得的猪伪狂犬病毒、猪细小病毒DNA样品分别进行PCR扩增，反应体系和反应程序及电泳按照步骤二中1的步骤进行。2)结果：猪圆环病毒2型的DNA样品可扩增得到273—275bp的扩增产物，经测序证实，该扩增产物的序列为引物对I的靶序列；非猪圆环病毒2型及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对I的特异性很好，可以特异检出猪圆环病毒2型。
三、GeXP多重反应体系特异性验证
1)将引物对A、B、C、D、E、F、G、H、和I混合成多重混合引物(Mix-Primer)工作液，使PCR体系中SP-Primer终浓度均为50nmol/L，除SIV-H3-1和SIV-H3-2引物对终浓度为100nmol/L(即9对特异性引物对SIV-M-1和SIV-M-2、引物对SIV-H1-1和SIV-H1-2、引物对SIV-H3-1和SIV-H3-2、引物对PRV-1和PRV-2、引物对CSFV-1和CSFV-2、引物对PRRSV-1和PRRSV-2、引物对JEV-1和JEV-2、引物对PPV-1和PPV-2、引物对PCV-1和PCV-2在PCR体系中对应的的终浓度分别是50nmol/L，50nmol/L，100nmol/L，50nmol/L，50nmol/L，50nmol/L，50nmol/L，50nmol/L，50nmol/L)，将引物对J上、下游通用引物混合成工作浓度为10μmol/L,在PCR体系中的终浓度为500nmol/L，其余成分与引物验证的相同。以多株已知病毒核酸的单一阳性标本作为模板或8种病原的混合cDNA和DNA样品作为模板，进行多引物PCR反应，反应程序及电泳与引物验证的相同。
2)结果：9对引物对A-I混合后分别对8种病原体(H1N1、H1N2、H3N2亚型猪流感病毒、猪瘟病毒、猪乙脑病毒、美洲型猪繁殖与障碍综合征综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型)的单一cDNA或8种病原的混合cDNA和DNA进行检测。结果表明多引物单模版分别检出了121bp和183bp、181bp和325bp、227bp、160bp、260bp、303bp、137bp、274bp的扩增产物，阴性对照无任何扩增产物；多引物多模板结果表明8种猪病病毒的基因可被同时检出，验证了多重检测检测体系中的引物特异性。
上述结果表明：引物对A—I混合后对各引物对的特异性无影响，可用于特异地检出猪流感病毒(H1N1、H1N2和H3N2)、猪瘟病毒、猪乙脑病毒、美洲型猪繁殖与障碍综合征综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型的每种病原体。
实施例3、PCR引物对的灵敏度检测
一、制备含靶基因的单克隆质粒标准品
分别以实施例2中步骤一获得的猪流感病毒(H1N1、H1N2、H3N2)、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与障碍综合征病毒、猪乙脑病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型的cDNA或DNA样品为模板，将PCR扩增获得的猪流感病毒M基因、H1亚型猪流感病毒HA基因、H3亚型猪流感病毒HA基因、猪伪狂犬病毒GD基因、猪瘟病毒E2基因、美洲型猪繁殖与障碍综合征病毒NSP2基因、猪乙脑病毒M蛋白基因、猪细小病毒VP2基因、猪圆环病毒2型ORF1基因，分别与载体pMD18-T vector连接(购自大连宝生物公司)连接，获得9个重组质粒PA、PB、PC、PD、PE、PF、PG、PH、PI，经测序证实这9个重组质粒为质粒pMD18-T vector分别***了一种上述基因的重组质粒，且分别可作为上述9对引物对A—I的靶基因。
利用紫外分光光度计测定各含靶基因重组质粒的浓度，并根据重组质粒的分子量和浓度计算相应的拷贝数。将高浓度的各重组质粒分别稀释成靶基因浓度为103、102、101拷贝/μL的单一质粒稀释液。将各重组质粒混合，制成在混合溶液中各质粒的浓度均为106拷贝/μL的混合液，再按10倍比稀释为105、104、103、102拷贝/μL的混合质粒稀释液。
二、9对引物对混合的灵敏度检测
1.以引物对A—I混合为引物，不同浓度的不同单一质粒稀释液为模板，按照实施例2中步骤二的方法进行PCR扩增和电泳检测；结果，检测猪流感病毒(H1N1、H1N2、H3N2)、H1亚型猪流感病毒、H3亚型猪流感病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与障碍综合征病毒、猪乙脑病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型的灵敏度均为10拷贝/μL。
2.以引物对A—I混合为引物，不同浓度的混合十种质粒稀释液为模板，按照实施例2中步骤二的方法进行PCR扩增和电泳检测；结果，检测猪流感病毒(H1N1、H1N2、H3N2)的灵敏度为10拷贝/μL，检测H1亚型猪流感病毒的灵敏度为10拷贝/μL，检测H3亚型禽流感病毒的灵敏度为10拷贝/μL，检测猪伪狂犬病毒的灵敏度为1000拷贝/μL，检测猪瘟病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测美洲型猪繁殖与障碍综合征病毒的灵敏度为10拷贝/μL，检测猪乙脑病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测猪细小病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测猪圆环病毒2型的灵敏度为100拷贝/μL。
实施例4、检测试剂盒的组装
根据实施例1至3的研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。
鉴别8种猪病毒病的GeXP快速检测试剂盒，包括反转录RT反应液、PCR反应液、DEPC水、超纯水，PCR反应液中含有九对特异性引物和一对通用引物，分别是引物对SIV-M-1和SIV-M-2、引物对SIV-H1-1和SIV-H1-2、引物对SIV-H3-1和SIV-H3-2、引物对PRV-1和PRV-2、引物对CSFV-1和CSFV-2、引物对PRRSV-1和PRRSV-2、引物对JEV-1和JEV-2、引物对PPV-1和PPV-2、引物对PCV-1和PCV-2以及上、下游通用引物Cy5-Tag-F和Tag-R，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.20的碱基序列。
反转录RT反应液每管9μL，含有5×Reverse Transcriptase Buffer5μL、50pmolRandom Primer(9mer)1μL、10mM dNTP Mixture2μL、40U Ribonuclease Inhibitor0.5μL和5U/μL AMV Reverse Transcriptase0.5μL；PCR反应液每管10.7μL，含有10×PCRbuffer2.5μL，25mM MgCl22.5μL，2.5mM dNTP Mixture2μL，9对特异性引物混合物1.25μL，10μM/L上、下游通用引物混合物1.25μL，JumpStart Taq DNA Polymerase1.2μL；DEPC水和超纯水各1mL。
9对特异性引物对SIV-M-1和SIV-M-2、引物对SIV-H1-1和SIV-H1-2、引物对SIV-H3-1和SIV-H3-2、引物对PRV-1和PRV-2、引物对CSFV-1和CSFV-2、引物对PRRSV-1和PRRSV-2、引物对JEV-1和JEV-2、引物对PPV-1和PPV-2、引物对PCV-1和PCV-2在PCR反应体系对应的摩尔浓度分别为50nmol/L，50nmol/L，100nmol/L，50nmol/L，50nmol/L，50nmol/L，50nmol/L，50nmol/L，50nmol/L；通用引物在PCR反应体系中的摩尔浓度为500nmol/L。
实施例5、应用8种猪病毒病的GeXP快速检测试剂盒对临床感染的模拟实验
1、模拟临床感染
从上述8种病原体的cDNA或DNA样品中随机选择若干种病原体的cDNA或DNA混合，分如下两组试验：
第1组：H1亚型猪流感病毒(H1N1、H1N2)的cDNA和H3亚型猪流感病毒的cDNA混合作为模板。
第2组：H1N2亚型猪流感病毒的cDNA、H3N2亚型猪流感病毒的cDNA、猪瘟病毒的cDNA、美洲型猪繁殖与障碍综合征病毒的cDNA和的猪圆环病毒2型的DNA混合作为模板；
按实施例2中步骤三的方法检测，第1组可检出121.01bp和182.66、182.66bp和324.50三个目的峰(图1)，表明样品中含有H1、H3亚型猪流感病毒的模板，与实际相符；第2组可检出119.56bp和180.98bp、160.07bp、260.53p、273.81bp、180.98bp和322.55bp六个目的峰，无其他杂峰，表明样品中含有H1亚型猪流感病毒的cDNA、H3亚型猪流感病毒的cDNA猪瘟病毒的cDNA、美洲型猪繁殖与障碍综合征病毒的cDNA和的猪圆环病毒2型的DNA(图2)，与实际相符。
2、8种病原体混合
可检出9个目的峰(如图3所示)，无其他杂峰，表明检测样品中含有H1亚型猪流感病毒、H3亚型猪流感病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与障碍综合征病毒、猪乙脑病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型全部病原体的cDNA或DNA模板，与实际相符。

Claims (6)

1.鉴别8种猪病毒病的GeXP快速检测引物组，其特征在于包括九对特异性引物，分别是引物对SIV-M-1和SIV-M-2、引物对SIV-H1-1和SIV-H1-2、引物对SIV-H3-1和SIV-H3-2、引物对PRV-1和PRV-2、引物对CSFV-1和CSFV-2、引物对PRRSV-1和PRRSV-2、引物对JEV-1和JEV-2、引物对PPV-1和PPV-2、引物对PCV-1和PCV-2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.18的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的鉴别8种猪病毒病的GeXP快速检测引物组，其特征在于还包括一对通用引物，分别是上、下游通用引物Cy5-Tag-F和Tag-R，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.19至SEQ.ID.No.20的碱基序列。
3.鉴别8种猪病毒病的GeXP快速检测试剂盒，包括反转录RT反应液、PCR反应液、DEPC水、超纯水，其特征在于：所述PCR反应液中含有九对特异性引物和一对通用引物，分别是引物对SIV-M-1和SIV-M-2、引物对SIV-H1-1和SIV-H1-2、引物对SIV-H3-1和SIV-H3-2、引物对PRV-1和PRV-2、引物对CSFV-1和CSFV-2、引物对PRRSV-1和PRRSV-2、引物对JEV-1和JEV-2、引物对PPV-1和PPV-2、引物对PCV-1和PCV-2以及上、下游通用引物Cy5-Tag-F和Tag-R，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.20的碱基序列。
4.根据权利要求3所述的鉴别8种猪病毒病的GeXP快速检测试剂盒，其特征在于：所述九对特异性引物SIV-M-1和SIV-M-2、引物对SIV-H1-1和SIV-H1-2、引物对SIV-H3-1和SIV-H3-2、引物对PRV-1和PRV-2、引物对CSFV-1和CSFV-2、引物对PRRSV-1和PRRSV-2、引物对JEV-1和JEV-2、引物对PPV-1和PPV-2、引物对PCV-1和PCV-2在PCR反应体系中对应的的摩尔浓度分别为50nmol/L，50nmol/L，100nmol/L，50nmol/L，50nmol/L，50nmol/L，50nmol/L，50nmol/L，50nmol/L；所述通用引物在PCR反应体系中的摩尔浓度为500nmol/L。
5.根据权利要求4所述的鉴别8种猪病毒病的GeXP快速检测试剂盒，其特征在于：所述反转录RT反应液每管9μL，含有5×Reverse Transcriptase Buffer5μL、50pmolRandom Primer(9mer)1μL、10mM dNTP Mixture2μL、40U Ribonuclease Inhibitor0.5μL和5U/μL AMV Reverse Transcriptase0.5μL；所述PCR反应液每管10.7μL，含有10×PCR buffer2.5μL，25mM MgCl22.5μL，2.5mM dNTP Mixture2μL，9对特异性引物混合物1.25μL，10μM/L上、下游通用引物混合物1.25μL，JumpStart TaqDNA Polymerase1.2μL；所述DEPC水和超纯水各1mL。
6.根据权利要求1或3所述的鉴别8种猪病毒病的GeXP快速检测引物组或试剂盒，其特征在于：所述8种猪病毒病的病原分别是H1亚型猪流感病毒、H3亚型猪流感病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、美洲型猪繁殖与障碍综合征病毒、猪乙脑病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型。
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