CN103977122A - 龙眼肉有效部位在制备与抗衰老机制相关的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了中药龙眼肉有效部位在制备与抗衰老机制相关的药物中的应用。具体是在体外龙眼肉水部位对Aβ_25-35致PC12细胞的毒性具有明显保护作用，在体内龙眼肉水部位具有明显改善老年性痴呆模型小鼠SAMP8的记忆行障碍作用，具有提高SOD、GSH-PX含量而发挥抗氧化的作用。

Description

龙眼肉有效部位在制备与抗衰老机制相关的药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种中药制药领域，具体涉及中药龙眼肉水部位在制备与抗衰老机制相关的药物中的应用。

背景技术

氧是人类生存必须的元素，但如果体内的氧化还原平衡遭到破坏，多余的氧自由基会对身体造成氧化损伤。越来越多的研究证明，此类氧化损伤直接参与了老年痴呆症等多种神经退行型疾病的病理过程。搞清楚氧化应激损伤的来源及有效的抗氧化途径，对理解老年痴呆症等神经退行型疾病的致病机理以及发展新型的治疗方法有很重要的意义。

老年性痴呆(阿尔茨海默病，Alzheimer's disease，AD)，是一种原因未明、以认知功能减退为主要临床表现的神经***退行性疾病，已成为世界范围内危害人类蚀康最严重的疾病之一。起病缓、进展慢，病程为5～10年，临床上表现为记忆障碍、失语、失用、失认、视空间功能损坏、抽象思维和计算损坏、人格和行为改变等。随着老年人群的增长，AD已成为现代社会的常见病。研究发现，75～85岁老人中，痴呆的发病率与心脏病相似，约为2.4％；美国的Baltimore市和瑞典的研究显示，60～65岁AD发病率为1％。其他社区研究显示：65岁以上严重痴呆的患病率4.6％，其中轻至中度认知功能障碍者超过10％。近年流行病学资料显示，目前我国65岁以上人群的患病率约为5％，而85岁以上患病率约为20％，而且随着我国人口期望寿命的增加，其患病人数会逐渐增多。预计到2050年，我国AD患者将达2500万以上，到时将成为影响家庭和社会发展的一个重要制约因素。防治AD已成为目前世界医药界的热点和难点。对于AD的治疗，国内外学者都进行了大量的研究工作，而且也取得了一些新的进展。但由于AD的形成过程比较复杂，也涉及多环节，多个***的异常。所以对于AD的治疗至今还缺乏比较理想的药物。因此，深入探讨AD的发病机制，寻找有效预防和治疗AD的药物有重要的意义。

龙眼别名桂圆、益智，无患子科，龙眼属；性味，甘、平温、无毒。归经，入心、脾、胃。龙眼肉具有有壮阳益气、补益心脾、养血安神等多种功效。有抗老防衰的作用，因为它能抑制人体内使人衰老的一种酶的活性，加上所含的丰富的蛋白质维生素及矿物质，久食可“使人轻身不老”；龙眼还能补气养血，对神经衰弱、智力减退都有很好的疗效，是健脑益智的佳品。现代药理研究表明用不同浓度龙眼肉连续灌胃30d AD模型小鼠，做跳台实验和Y迷宫实验发现治疗组学习记忆能力显著升高，龙眼肉具有调节过氧化酶活性，预防氧化应激功能，龙眼肉提取物不仅可以调节大脑中内源性的氧化应激损伤，而且对神经毒诱导的氧化应激也有调节作用，还可以影响海马区淀粉样蛋白级联，改变β淀粉样蛋白在PSAPP小鼠脑内的病理学，调整伴随阿尔茨海默病神经变性改变的氧化应激反应。

发明内容

本发明公开了一种龙眼肉水部位提取物及其应用。龙眼肉用乙醇浸提得总提物，加水溶解成混悬液，离心取上清液，减压浓缩干燥，得水部位提取物。通过体内、体外药理实验均证明水部位具有抗氧化与抗老年痴呆的药理作用，可用于制备与抗氧化机制相关的抗老年性痴呆药物的药物。

具体方法和结果通过以下实验证实：

一、龙眼肉水部位的制备

1药材龙眼肉：龙眼肉购于广西南宁中药材批发站，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为无患子科龙眼属植物龙眼(Dimocarpus longan Lour.)的果肉。

2提取与分离：将干燥的龙眼肉制成粗粉，分别用95％、70％、50％乙醇浸渍提取3次，每次浸泡4～5d，合并提取液，减压回收乙醇，得乙醇总提取物，再用水溶解成混悬液，再离心取上清液，减压浓缩干燥，即得水部位。

二.余龙眼肉水部位药效研究

(一)龙眼肉水部位对AD细胞模型的药效学研究

1实验材料

1.1受试药物

龙眼肉水部位。

1.2细胞株

小鼠肾上腺嗜铬瘤细胞株PC12，购自上海细胞生物研究所细胞库。

1.3仪器

CO₂培养箱(Thermo Forma)，美国产，型号：381

倒置荧光显微镜(Nikon)，日本产，型号：TE2000-U

倒置显微镜(Olympus)，日本产，型号：CK40

酶标仪(Thermo Forma)，美国产，型号：MULTISKANMK3

万分之一克电子天平，瑞士产，型号：AG135

培养瓶，美国Promega Corporation产

96孔板，corning，美国产

微量加样器，日本产，型号：Nichipet

低速台式离心机，上海安亭仪器厂，型号：TDL-5

自动高压灭菌器，日本产，型号：HV-50

制冰机，日本产，型号：SIM-F124

超净工作台：荷兰Clean Air Techniek型号：DLF560

自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂，型号：SZ-93

精密pH计，上海安平雷磁仪器厂，型号：PHS-3C

调速多用振荡器，常州国华电器有限公司，型号：HY-4

大功率磁力搅拌器，常州国华电器有限公司，型号：99-1

滤器，美国产，型号：Millex-GP

低压吸引器，上海医疗器械工业(集团)公司医用吸引器厂，型号：DY-1

低温冰箱(Thermo Forma)，美国产，型号：725

电热恒温干燥箱，上海跃进医疗器械厂，型号：202-3

电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂，型号：500-BS-11

1.4试剂

MTT(四甲基噻唑蓝)为美国Amresco公司产品，批号：0793

FBS(胚胎牛血清)为美国Hyclone公司产品，批号：070205

HBS(马血清)为美国GIBCO公司产品，批号：201404

Aβ_25-35片段为美国GIBCO公司产品，批号：050M4765

RPMI1640培养基为美国GIBCO公司产品

Trypsin(胰蛋白酶)购自上海西宝生物科技有限公司，批号：900207D

DMSO(二甲基亚砜)购自天津汇英化学试剂有限公司，批号：T20070605

HCl(盐酸)购自洛阳市化学试剂厂，批号：100412

Hoechst33258购自凯基生物科技发展有限公司，批号：090104

碳酸氢钠购自天津博迪化工股份有限公司，批号：20101203

丙酮酸钠购自天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20100110

L-谷氨酰胺购自恒因生物

1.5主要试剂及药物的配制

1.5.1RPMI1640培养基：称取0.3g L-谷氨酰胺，0.1g丙酮酸钠，2g碳酸氢钠，一包RPMI1640干粉，溶于1L双蒸水中，调PH为7.2～7.4，微孔滤膜过滤分装，4℃保存。

1.5.2Trypsin液：溶于双蒸水中，超声溶解，0.22μm的微孔滤膜过滤分装，-20℃保存备用。

1.5.3MTT液(5mg/mL)：精密称取100mg MTT，溶于20mL双蒸水中，超声溶解，0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，4℃避光保存，2w内用完。

1.5.4100μM(μmol/L)Aβ_25-35溶液配制：取500μgAβ_25-35粉末溶于4.72mL无菌双蒸水稀释，用有机相0.22μm微孔滤膜除菌分装后，置于37℃恒温培养箱中孵育7d以达到“老化”Aβ_25-35的目的，-30℃保存。

1.5.5Hoechst33258储存液：称取Hoechst33258粉末1mg，20mL蒸馏水溶解后过滤，4℃避光保存。用时蒸馏水10倍稀释成工作液。

1.5.6封片液：20nmol/L柠檬酸，50nmol/L磷酸氢二钠，体积分数为50％甘油。

1.5.7固定液：甲醇与冰醋酸体积比3∶1混合，4℃保存备用。

1.5.8培养液的配制：RPMI1640+5％HBS+2.5％FBS

1.5.8受试药物

龙眼肉水部位：称取4.8mg水部位，用少量DMSO(使得药物中DMSO的终浓度为0.5％)和双蒸水溶解至3mL，使药物浓度为1.6mg/mL，然后用无菌双蒸水稀释，使得药物终浓度为80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL。所有样品最后均用有机相0.22μm微孔滤膜除菌分装，4℃保存备用。

2实验方法

采用Aβ_25-35损伤PC12细胞来建立AD细胞模型。评价龙眼肉水部位对AD的疗效。首先探索Aβ_25-35的浓度，这是因为Aβ_25-35浓度过低不能产生反映AD细胞模型的病理改变，浓度偏高，细胞受损严重亦不能正确地反映AD模型，也就不能正确地评价疗效。根据文献报道结合我们的预试，我们认为Aβ_25-35在培养液中的浓度以20μM为宜。

2.1龙眼肉水部位对AD细胞模型的预防作用

2.1.1细胞培养(复苏、培养、传代和冻存)

冻存于液氮的肾上腺嗜铬瘤细胞PC12细胞株立即置于37℃的水浴中，使之快速融解，室温2000r/min离心5min，弃上清液，细胞稀释成10⁵个/mL的细胞悬液，放入培养瓶，37℃，10％CO₂培养箱中培养，每隔一天换培养液一次。取对数生长期细胞，弃旧培养液，加入0.25％胰酶适量消化，2000r/min离心5min，反复吹打使成单个细胞，重悬于含10％DMSO的冻存液中(10⁷个/mL)，于冻存管分装，缓慢冻存。

2.1.2MTT法

取对数生长期的PC12细胞，胰酶消化，调整浓度为3×10⁵个/mL的单细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100μL，24h后分别加入不同浓度的药物培养液及终浓度为20μM的Aβ_25-35溶液，对照组加入等体积溶剂的培养液(含0.5％终浓度的DMSO)，每组设4个复孔，置培养箱中培养72h，终止前每孔加入200μL新鲜配制的含0.2mg/mLMTT的无血清培养液，继续培养4h，弃上清液，每孔加入200μLDMSO，振荡混匀后，在酶标仪上以波长为500nm测定OD值，计算细胞存活率。

计算方法：存活率(％)＝(实验组细胞活力/空白对照组细胞活力)×100％。

2.1.3统计学处理

以SPSS11.7统计学软件包进行统计学处理。计量资料以表示。组间比较采用配对t检验。

2.2龙眼肉水部位对AD细胞模型的治疗作用

2.2.1MTT法

取对数生长期的PC12细胞，胰酶消化，调整浓度为3×10⁵个/mL的单细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100μL，24h后加入终浓度为20μM的Aβ_25-35溶液，对照组加入等体积溶剂的培养液(含0.5％终浓度的DMSO)，待Aβ_25-35作用24h后分别加入不同浓度的药物培养液及终浓度为20μM的Aβ_25-35溶液，对照组加入等体积溶剂的培养液(含0.5％终浓度的DMSO)，每组设4个复孔，置培养箱中培养72h，终止前每孔加入200μL新鲜配制的含0.2mg/mL MTT的无血清培养液，继续培养4h，弃上清液，每孔加入200μL DMSO，振荡混匀后，在酶标仪上以波长为500nm测定OD值，计算细胞存活率。

计算方法：存活率(％)＝(实验组细胞活力/空白对照组细胞活力)×100％。

3实验结果

3.1龙眼肉水部位对AD细胞模型的预防作用

3.1.1MTT法

无Aβ_25-35溶液的PC12细胞OD值与无药物且含20μlAβ_25-35溶液的PC12细胞OD值相比有非常显著的差异(P＜0.05)，以无Aβ_25-35溶液的PC12细胞的存活率作为基数(即100％)，无药物且含20μlAβ_25-35溶液的PC12细胞的存活率为75.93％，即凋亡率为24.07％，说明造模成功。

实验结果见表1。龙眼肉水部位在浓度5～80μg/mL范围内对含有20μMAβ_25-35溶液的PC12细胞的增殖均有不同程度的促增长作用(以含有20μMAβ_25-35溶液，药物浓度为0μg/mL的PC12细胞存活率为基数)，其中40～80μg/mL呈浓度依赖性，均随着药物浓度的升高存活率逐渐增加，与空白对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)，其中80μg/mL有非常显著性差异(P＜0.05)。

表1 不同浓度水部位作用于AD预防模型后的OD值，存活率(％)

注：与不含Aβ_25-35及药物的空白对照组相比，·P＜0.05；与含20μM的Aβ_25-35溶液及不含药物的空白对照组相比，ΔP＜0.05

3.1.2龙眼肉水部位含药血清对体外Aβ_25-35损伤PC12细胞增殖影响

龙眼肉水部位含药血清对体外Aβ_25-35损伤PC12细胞体外有促进增殖的作用，10％龙眼肉水部位含药血清与空白含药血清比较，无显著性意义(P＜0.05)；2.5％龙眼肉水部位含药血清对体外Aβ_25-35损伤PC12细胞具有增值趋势，但与空白含药血清相比较。无显著性意义。见表2。

表2 龙眼肉水部位10％含药血清体外实验

注：10％含药血清与空白对照组比较，^*P＜0.05

(二)龙眼肉水部位对SAMP8小鼠的保护作用研究

1实验材料

1.1药品和试剂

龙眼肉水部位、石杉碱甲(Hup-A，浙江震元制药有限公司；批号：110402)、谷胱甘肽-过氧化物酶试剂盒(Mouse GSH-PX Elisa kit，R&D，批号：201112)、超氧化物歧化酶试剂盒(Mouse SOD Elisa kit，R&D，批号：201112)

1.2实验器材

Morris水迷宫：北京中科院生理所生产(包括Morris水迷宫、电脑摄像***、配套软件分析***)、酶标仪(美国产，型号：MULTISKANMK3)、离心机(上海安亭仪器厂，型号：TDL-5)、旋涡混合器XH-C(金坛市医疗仪器厂)、高速离心机(Germany，型号：1-14)、手掌式离心机(海门市麒麟医用仪器厂，型号：LX-200)

1.3实验动物

健康快速老化痴呆模型小鼠SAMP8(以下简称小鼠)64只，体重20～30g。实验动物均由天津中医药大学提供(合格证号：SCXX(津)2008-0001)。

2实验方法

2.1急性毒性实验

因受浓度和体积的影响，一次给药无法测出其LD₅₀，故测定其最大耐受量。取健康小鼠20只，雌雄各半，体重18～22g。实验前，动物禁食不禁水12h，然后给小鼠灌胃龙眼肉水部位0.2mL/10g，灌胃2次，每隔6h灌胃1次，然后按常规饲养，观察14d。分别在给药后第7d、第14d各称重一次。于第14d处死小鼠，解剖，肉眼观察重要脏器(心，肝，脾，肺，肾)有无药物所致的病理性改变。按小鼠体重增长情况计算体重增长率。并计算小鼠的最大给药量。

2.2龙眼肉水部位对SAMP8小鼠记忆行为的改善作用

2.2.1动物分组

取SAMP8小鼠40只，随机分为5组，即模型对照组8只、Hup-A组8只、龙眼肉水部位高剂量组8只、龙眼肉水部位中剂量组8只、龙眼肉水部位低剂量组8只。

2.2.2给药

动物适应性喂养2w后给药。龙眼肉水部位，Hup-A组，以双蒸馏水调配后灌胃给药(ig)。龙眼肉水部位：高剂量1g/mL(生药量，下同)，中剂量0.5g/mL，低剂量0.25g/mL；Hup-A组0.038mg/kg；模型对照组给予相同容积的双蒸馏水灌胃(0.2mL/10g)。每天灌胃1次，连续给药2个月。

2.2.3小鼠学习与记忆行为测试

采用MWM测试法，进行定位航行实验和空间探索实验。MWM参照有关文献制作。迷宫置于房间中间，为一圆形不锈钢水池，直径200cm，高50cm，水深30cm，水温保持在26±1℃。根据东(E)、南(S)、西(S)、北(N)方位将水池等分为东北(EN，象限1)西北(WN，象限2)东南(ES，象限3)西南(WS，象限4)四个象限。在WN象限(象限2)中心放置一平台，平台为圆形，直径11cm，平台高29cm(即平台低于水面1cm，称隐藏平台)。迷宫正上方2m高处装有一个小型摄像机，并与另一房间的录像机和监视器连接，记录小鼠的游泳轨迹和游泳时间。迷宫水池里倒入适量墨水，以使池里水能被均匀染黑。房间密闭，保持安静，房间门窗遮以不透光窗帘，室内以恒定灯光照明，保证亮度均等，室内墙壁上贴以不同的画作为小鼠寻找平台的参照物，室内放置一录音机以小音量不间断播放音乐作为背景噪音。MWM测试程序如下：

(1)迷宫适应训练/游泳能力测定。MWM测试第1d，撤除平台，让痴呆模型小鼠在池中自由游泳2min，录下受试小鼠的游泳轨迹，计算各鼠游泳距离。

(2)定位航行实验(place navigation)。共进行5d。即MWM实验中的第2d至第6d，进行定位航行试验。平台位于第2象限，没于水下1cm，小鼠入水点为各象限池壁中点，每天分上下午两个时间段，每一个时间段每鼠训练4次，将小鼠面向池壁由4个入水点放水池中，测其60s内成功进驻平台(小鼠找到平台并滞留其上5s为成功进驻)所需时间(即逃避潜伏期，escape latency)。如在60s内小鼠不能成功进驻平台，则实验者将其引上平台并令其停留10s，记录逃避潜伏期为60s。小鼠每天入水点顺序为：第1d，WS-EN-WN-ES；第2d，ES-WN-EN-WS；第3d，WN-EN-WS-ES；第4d，WN-EN-ES-WS；第5d，WN-WS-ES-EN。

2.2.4评价指标与统计学方法

定向航行实验统计量为逃避潜伏期、寻求次数、停留时间、平台象限百分比。结果以SPSS11.7for Windows统计软件分析。

2.3药物对SAMP8小鼠体内自由基代谢的影响

2.3.1样品处理

小鼠行为检测结束后1w，各组小鼠处死后，在冰台上迅速剥离小鼠大脑组织于4℃预冷的生理盐水漂洗除去血液，用滤纸吸干多余水分，于电子天平上称重，并加9倍体积(重量/体积)的冰生理盐水，用高速分散匀质机制成10％的脑匀浆，取上清液按SOD、GSH-PX、试剂盒操作说明分别对各组小鼠脑组织进行各指标测定。

2.3.2指标测定及统计学处理：

选取SOD、GSH-PX、作为氧自由基代谢相关指标测定，以SPSS11.7for Windows统计软件进行统计学处理。

3实验结果

3.1急性毒性试验(MTD测定)

连续观察14d，所有动物的外观、体征、行为活动、精神状态、饮食、尿便等均未有异常改变。口、眼、鼻等处无异常分泌物，所有给药动物无死亡。第14d后脱颈处死，解剖，肉眼观查各主要脏器(心、肝脾、肺、肾)，结果显示主要脏器位置、颜色、大小均无异常。龙眼肉水部位小鼠体重雌性由原来的17.70±1.44g增至23.98±3.43g；雄性则由原来的25.67±4.67g增至36.54±3.87g，雌性小鼠体重增长率为49.54％，雄性小鼠体重增长率为58.19％。龙眼肉水部位经计算，小鼠灌胃给药的最大给药浓度1g/mL，相当于成人日用量的21倍，表明毒性较低。

3.2小鼠游泳能力测定

实验开始迷宫适应性训练中小鼠的游泳总距离一定程度上代表了小鼠的游泳能力。各组小鼠2min游泳的总距离见表3。实验数据显示Hup-A组高于模型对照组，低剂量组、中剂量组及高剂量组分别与模型对照组相比均大于模型对照组。

表3 水部位部位迷宫适应性训练中各组小鼠的运动距离

3.3定位航行实验

定位航行实验的统计学指标为潜伏期、寻求次数、停留时间、平台象限百分比、潜伏期是小鼠为逃避水害而寻找到平台，且成功进驻平台所需的时间。潜伏期能综合反映出小鼠的学***台而驻留其上的总时间，与寻求次数相结合可合理反映出小鼠学习、记忆和行为运动能力的综合变化。停留时间越长，一定程度上小鼠的各项综合能力越强。

3.3.1各组小鼠MWM行为学参数5d均值总体变化寻求次数、停留时间及平台象限百分比5d均值总体变化的结果详见表4。

表4 水部位各组MWM行为学相关参数5d均值总体比较

注：与模型对照组相比，*P＜0.05

寻求次数：从表4可看出，龙眼肉水部位高、中剂量组寻求次数明显多于模型对照组(P＜0.05)，说明其对痴呆小鼠记忆行为具有改善作用。

停留时间：从表4可看出，龙眼肉水部位高、中剂量组停留时间明显多于模型对照组(P＜0.05)，说明其对痴呆小鼠记忆行为具有改善作用。

综上所述，通过5d的记忆行为的训练，龙眼肉水部位高、中剂量组小鼠的训练成绩与模型对照组相比明显改善，说明本发明物龙眼肉水部位适宜剂量具有改善老年痴呆学习记忆行为障碍的作用。

3.4自由基代谢相关指标

3.4.1龙眼肉水部位

表5为各组自由基相关指标均值变化，由表可以看出模型对照组脑组织SOD、GSH-PX活性较其他各组低。龙眼肉水部位和Hup-A药能提高SOD、GSH-PX活性。

表5 各组自由基代谢相关指标均值变化

注：各组与模型对照组相比，*P＜0.05

(1)SOD：Hup-A组和高剂量组与模型对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，中剂量组与模型对照组相比有显著性差异，而模型对照组和低剂量组两两比较差异并不显著(P＞0.05)。参见表5可知高剂量组SOD水平明显高于其他各组，而中剂量组和Hup-A组SOD水平相当。这表明高剂量组、中剂量组和Hup-A药对快速老化痴呆模型所致的SOD水平低下均具有保护作用，能使SOD水平升高，增强机体抗氧化能力。

(2)GSH-PX：由表5可知，Hup-A组与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.05)，高剂量组与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.05)，但是低剂量组与模型对照组比较差异并不显著(P＞0.05)，这也说明龙眼肉水部位高剂量组和Hup-A组通过使GSH-PX的水平升高来增强机体抗氧化能力。

综上所述，龙眼肉水部位通过提高抗氧化酶SOD、GSH-PX水平起到抗氧化，清除体内自由基，从而延缓衰老的作用。

具体实施方式

实施例1：

称取干燥的龙眼肉粗粉，依次用95％、70％、50％乙醇浸渍提取三次，每次浸泡4～5天，合并提取液，减压回收乙醇，得乙醇总提取物。加水溶解成混悬液，离心取上清液，减压浓缩干燥，即得水部位。

龙眼肉水部位加入适宜药物辅料，制成相应的药物剂型，如胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂，既得利用本发明物制成的药物。

Claims (4)

1.一种龙眼肉有效部位提取物，可通过以下方法制备：

龙眼肉用乙醇浸提得总提物，加水溶解成混悬液，离心，取上清液，减压浓缩干燥，得水部位。

2.根据权利要求1所述的龙眼肉有效部位提取物，该提取物的制备方法特征在于该方法包括下列步骤：

a.龙眼肉净选，粉碎成粗粉；

b.将龙眼肉粗粉依次用95％、70％、50％乙醇浸渍提取三次，每次浸泡4～5天，合并提取液，减压回收乙醇，得乙醇总提取物；

c.将步骤b)所得的龙眼肉总提物，加水溶解成混悬液，离心取上清液，减压浓缩干燥，得水部位。

3.根据权利要求1所述的龙眼肉有效部位提取物在制备与衰老机制相关的抗老年性痴呆的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于其中所述的药物的剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂。