CN103976994B - 一种肿瘤相关疾病药物靶点及其应用 - Google Patents
一种肿瘤相关疾病药物靶点及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103976994B CN103976994B CN201410196622.6A CN201410196622A CN103976994B CN 103976994 B CN103976994 B CN 103976994B CN 201410196622 A CN201410196622 A CN 201410196622A CN 103976994 B CN103976994 B CN 103976994B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- cancer
- carcinoma
- protein
- tumor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明公开了人核糖体蛋白L10作为防治肿瘤相关疾病的药物靶标的用途,所述人核糖体蛋白L10的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。人核糖体蛋白L10可以作为药物靶标用于防治肿瘤相关疾病药物的体外筛选。
Description
技术领域
本发明涉及一种肿瘤相关疾病药物靶点及其特异性结合化合物的用途。
背景技术
癌症己成为仅次于心血管病的第二大死因。近年来,随着生命科学研究的飞速发展,对恶性肿瘤产生机制的认识逐渐深入,由此发现的新药物作用靶标日益增多。但是,与肿瘤细胞生长、增殖、转移等过程相关的机制及其耐药性尚未完全阐明。因此,发现和验证特异性抗肿瘤药物靶标是当今科学研究中的热点之一。
核糖体蛋白质,简称“核糖体蛋白”,是参与构成核糖体所有蛋白质的统称,与核糖体RNA通过非共价键结合的形式组成了核糖体。真核生物80S核糖体中目前发现有82种核糖体蛋白,广泛分布于各种细胞中,其中构成核糖体40S小亚基的有约33种蛋白,另有49种核糖体蛋白构成核糖体60S大亚基。核糖体蛋白在细胞内蛋白质生物合成中发挥重要作用,进来人们研究发现其在细胞发育和细胞分化等核糖体外功能有重要的调控作用。在肝癌、胃癌、结肠癌和食管癌等肿瘤中有某些核糖体蛋白基因高表达,通过对这些高表达的核糖体蛋白的研究,可以进一步帮助人们推测肿瘤发生、发展的机制。
人核糖体蛋白L10是QM蛋白,基因定位于X染色体长臂28位,由qm基因编码,分子量大小为24.5KDa,全长214个氨基酸。它最早发现于Wilm’s肾母细胞瘤,现有证据表明QM突变或高度表达与肿瘤发生密切相关。(DowdyS.F.,LaiK.M.,WeissmanB.E.,MatsuiY.,HoganB.L.M.,StanbridgeE.J.,TheisolationandcharacterizationofanovelcDNAdemonstratinganalteredmRNAlevelinnontumorigenicWilms'microcellhybridcells.NucleicAcidsRes.,1991,19,5763-5769.)目前普遍认为QM与糙面型内质网中的60S核糖体蛋白质合成有关,QM可以与核糖体上的60S大亚基结合,在40S核糖体亚基与60S核糖体亚基结合中起着关键作用。仅解析了QM核心区的晶体结构,其核心域的晶体结构揭示了与真核细胞的特定蛋白基序的保守折叠。有与细菌、古细菌同源的α+β结构。QM核心区的晶体结构的解析为进一步研究其功能奠定了结构基础。(NishimuraM.,KaminishiT.,KawazoeM.,etal.CrystalstructureofhumanribosomalproteinL10coredomainrevealseukaryote-specificmotifsinadditiontotheconservedfold.J.Mol.Biol.2008,377,421-430.)。
近期功能学研究表明,QM不仅参与了蛋白质合成,还可以作为转录因子或转录辅因子参与了多种信号转导过程,QM可以与多种核转录因子如c-Jun、c-Yes、c-Fos等特异性相互作用。已有研究证实QM的同源类似物Jif-1(Jun-interactingfactor1)能够结合转录因子复合体AP-1中的成员c-Jun(另一个成员为c-Fos),并抑制由c-Jun激活的转录过程,该过程受Zn2+和蛋白激酶C(PKC)的调控,磷酸化后的Jif-1与c-Jun的结合显著降低。(MonteclaroFS.,VogtPK.,Ajunbindingproteinrelatedtoaputativetumorsuppressor.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,1993,90,6726-6730.)虽然有报道称由于QM亚细胞定位于内质网不可能直接作用于c-Jun参与转录调节过程,但有文献表明早老素Presenilin1(PS1)可将QM转运至细胞核从而调控c-Jun介导的转录调控过程。(I.Imafuku,T.Masaki,M.Waragai,S.Takeuchi,etal.Presenilin1suppressesthefunctionofc-JunhomodimersviainteractionwithQM/Jif-1.J.CellBiol.1999,147,121-133.)。
小白菊内酯(Parthenolide,PTL,分子式为C15H20O3,分子质量为248.3,化学结构如下图所示。)是从菊科植物中获得的一种倍半萜内酯类化合物,具有抗炎、抗风湿及抗病毒等作用。(KnightDW.Feverfew:chemistryandbiologicalctivity.Nat.Prod.Rep.1995;12:271-276.)研究表明,其抗炎活性是通过NF-κB介导的信号转导通路发挥作用的,长期以来小白菊内酯被认为是一种典型的NF-κB抑制剂。近年来的研究发现,小白菊内酯除公认的抗炎活性外还具有显著的抗肿瘤活性,有望成为一类新的抗肿瘤先导化合物。它可抑制多种肿瘤细胞株的生长增殖,对鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、***、膀胱癌等肿瘤细胞株均具有较强的抑制作用。(RajasubramaniamS,VetrichelvanJ,YesimGP.Resortingchemotherapyandhormonetherapysensitivitybyparthenolideinaxenografthormonerefratoryprotatecancermodel.TheProstate,2006,66:1498-1511.)然而,目前对其抗肿瘤作用机制的认识尚未明确,存在多种不同的实验结果和假设:NF-κB通路、STAT通路、JNK通路、氧化应激机制等。(PajakB,GajkowskaB,OrzechowskiA.Molecularbasisofparthenolide-dependentproapoptoticactivityincancercells.FoliaHistochem.Cytobiol.,2008;46(2):129-135.)目前对小白菊内酯抗肿瘤的作用机制众说纷纭,亟待采用新的研究方法和手段阐明其明确的作用靶标和机制。
小白菊内酯结构图
发明内容
虽然现有研究报道与肿瘤相关的生物大分子有很多,但是多数研究仅仅停留在相关性上,被发现能够成为药物靶标的生物大分子少之又少。由于药物靶标不仅要求与疾病有确定的相关性,更重要的是能够和药物特异性结合,而这正是抗肿瘤药物靶标发现的难点。
本发明提供了一种肿瘤相关疾病的药物靶标,即人核糖体蛋白L10(QM)。所述人核糖体蛋白L10的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。
上述人核糖体蛋白L10可以作为药物靶标用于防治肿瘤相关疾病药物的体外筛选。所述药物优选小白菊内酯或以小白菊内酯为母核的衍生物。
本发明利用小白菊内酯C2环中的双键经迈克尔加成反应制备亲和柱材,采用系列亲和色谱技术在人胰腺癌细胞株(PANC-1)中获得了与小白菊内酯特异结合的蛋白质,通过SDS-PAGE分离、酶水解、HPLC肽段分离和MALDI-TOF质谱检测各肽段分子量后,该蛋白质被鉴定为人核糖体结合蛋白L10(即QM蛋白)。
上述靶向药物涉及的肿瘤类型主要包括:肺癌、***癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、鼻咽癌、口腔癌、卵巢癌、***、脑癌、神经瘤、淋巴癌、胰腺癌、胃癌、食管癌、喉癌、舌癌、乳腺癌、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、肾癌、黑色素瘤、胶质瘤、骨肉瘤和多发性骨髓瘤等。
本发明采用蛋白质印记法检测了细胞内可能与QM相互作用的蛋白质以及QM可能参与的细胞信号通路,包括转录因子c-Jun、c-Fos、c-Yes、c-Myc和上游信号通路分子ERK、p-ERK、MEK、p-MEK、Ras、Raf,发现QM会影响与其相互作用的转录因子c-Jun蛋白的表达量并且随着小白菊内酯的加入有明显的剂量依赖性。同时发现由转录因子c-Jun调控转录的MEK/MAPK信号通路的上游分子MAPK蛋白表达也发生了改变且随着小白菊内酯浓度的增加有剂量依赖性。但是MAPK活化的磷酸化形式由于不受c-Jun的调控并没有明显变化。
本发明揭示了人核糖体蛋白L10(QM)作为***相关疾病的药物靶标的作用,提供了小白菊内酯在制备抗肿瘤靶向药物中的应用。
附图说明
图1是EAHSepharose4B与小白菊内酯的亲和柱材制备的红外检测结果。
图2是利用系列亲和色谱技术寻找与小白菊内酯可以特异性结合的靶蛋白的SDS-PAGE分析。
图3是小白菊内酯特异性结合蛋白水解肽段的质谱分析。
图4是小白菊内酯刺激人胰腺癌细胞后检测QM蛋白及与其相互作用的转录因子表达水平的变化。
图5是小白菊内酯刺激人胰腺癌细胞后检测c-Jun转录的信号分子蛋白表达水平的变化。
具体实施方式
实施例一:EAHSepharose4B-PTL亲和柱的制备及柱参数考察
取10mlEAHSepharose4B与15mg小白菊(PTL)内酯混合,在含有50%三乙胺的乙醇溶液中室温下振摇反应过夜。反应液3000rpm离心3min,上清保留用于考察偶联率,柱材用三蒸水洗涤除去反应溶剂,贮存于30ml20%的乙醇溶液中备用。另取少量反应后的柱材用丙酮洗涤除水,进行红外鉴定。利用高效液相色谱方法检测制得的亲和柱材,按下列公式计算偶联量和偶联率:
偶联量(mg/ml)=(加入PTL的量-未偶联的PTL的量)/EAHSepharose4B体积;
偶联率(%)=(加入PTL的量-未偶联的PTL的量)/加入PTL的量
通过公式计算可得,小白菊内酯(PTL)可以与EAHSepharose4B亲和连接,偶联量为0.8121mg/ml,偶联率为54.14%,红外结果如图1所示,证明药物已经连接到柱材上,表明已经成功制备了EAHSepharose4B-PTL亲和柱。
实施例二:系列亲和色谱法寻找与小白菊内酯特异性结合的蛋白
本实验选取人胰腺癌细胞PANC-1在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中进行培养。待细胞生长至适当数量后,弃去培养基并用PBS轻轻荡洗2遍,加入NP40细胞裂解液冰上裂解30分钟得细胞裂解液,4℃12000rpm离心15min,收集上清液,用于亲和层析。取1mlPANC-1的细胞裂解液加入100μl亲和柱材,混合均匀,冰浴振摇反应离心(3000rpm,1min,0~4℃),取柱材沉淀进行鉴定,上清液则再次加入100μl亲和柱材,混匀,振摇反应40min。依此方法连续进行5次亲和反应,所有反应均在冰浴中进行。5次反应所得的柱材沉淀分别用PBS溶液洗涤5次。洗涤后向沉淀中加入30μlSDS-PAGE上样缓冲液,95℃加热3min,充分释放结合在柱材上的蛋白,10000rpm离心2min,上清用于下一步的SDS-PAGE鉴定,分离胶的浓度为12%。电泳后用银染方法染色,根据染色结果,找出在5个系列里浓度以此减少的蛋白条带即为特异性结合的目的蛋白。结果如图2所示(图中所示的蛋白为与PTL进行特异性结合的目的蛋白,系列1-5为依次进行亲和色谱反应后的蛋白样品)。目的蛋白条带经过胰蛋白水解酶水解,利用高效液相色谱方法进行分离,对目的但不水解的多肽片段进行MALDI-TOF结构鉴定,鉴定此结合蛋白为QM,结果如图3所示。
实施例三系列亲和色谱法寻找与小白菊内酯特异性结合的蛋白
采用与实施例二中同样的方法,分别培养来自于肺癌(A549细胞、L78细胞、H460细胞)、***癌(PC-3细胞、DU145细胞)、结直肠癌(SW620细胞、LS513细胞)、膀胱癌(BIU-87细胞、5637细胞、EJ细胞)、肝癌(HepG2细胞、SMMC-7721细胞、Hep3b细胞)、鼻咽癌(C666-1细胞、CNE-1细胞)、口腔癌(HB细胞、KB细胞)卵巢癌(A2780细胞、CAOV3细胞、SKOV-3细胞)、***(Hela细胞)、脑癌(SF126细胞)、神经瘤(SH-SY5Y细胞、M17细胞)、淋巴癌(DS-1细胞)、胰腺癌(BxPC-3细胞、SW1990细胞)、胃癌(SGC7901细胞、MGC-803细胞)、食管癌(CaES-17细胞、Ec109细胞)、喉癌(Hep-2细胞)、舌癌(Tca8113-P160细胞、TSCCA细胞)、乳腺癌(MCF7细胞、A231细胞)、皮肤癌(A431细胞、HS-1细胞)、白血病(K562细胞、HL-60细胞)、淋巴瘤(U937细胞)、肾癌(A498细胞、SW13细胞)、黑色素瘤(A875细胞、M21细胞)、胶质瘤(U251细胞、BT-325细胞)、骨肉瘤(MG-63细胞、Saos-2细胞)和多发性骨髓瘤(RPMI-8226细胞),收集细胞裂解液与制备的EAHSepharose4B-PTL亲和柱材孵育。亲和反应后的样品进行SDS-PAGE蛋白电泳,电泳后用银染方法染色,找出特异性结合的蛋白条带,目的蛋白条带经检测分析后证实是QM蛋白。
实施例四:蛋白质印迹法检测QM蛋白及与其相互作用的转录因子表达水平的变化
首先在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中正常培养人胰腺癌细胞PANC-1,待细胞生长至适当量后向培养基中加入以下浓度的小白菊内酯刺激细胞,小白菊内酯的具体浓度为0.05nM/L、0.1nM/L、0.2nM/L、0.4nM/L、0.8nM/L、和1.6nM/L,同时设定一个不加药的阴性对照组继续培养细胞24小时。第二天,弃去培养基并用PBS轻轻荡洗2遍,加入NP40细胞裂解液冰上裂解提取蛋白质用于WesternBlot检测目的蛋白表达水平的变化。经过BAC法测定样品蛋白浓度后,确定每孔上样的总蛋白量为20μg,选用浓度为12%分离胶进行SDS-PAGE电泳。电泳后,320mA恒定电流冰水浴里转膜60分钟,再用5%脱脂奶粉室温封闭2小时,TBST溶液洗脱后加入稀释比例为1:1000的一抗稀释液4℃孵育过夜。次日先用TBST溶液洗脱掉非特异性结合的杂蛋白,在室温下加入稀释比例为1:10000的二抗稀释液继续孵育1小时。TBST洗脱后,加入化学发光显色液完成曝光并保存图片。结果如图4所示,图中1—7对应的是0、0.05μM/L、0.1μM/L、0.2μM/L、0.4μM/L、0.8μM/L、和1.6μM/L的小白菊内酯给药浓度。WesternBlot结果显示在加入小白菊内酯刺激人胰腺癌细胞后,QM蛋白及与其相互作用的转录因子c-Jun蛋白量均有下降,且有剂量依赖性,但转录因子c-Fos的蛋白表达量没有明显的变化。
实施例五:蛋白质印迹法检测c-Jun转录的信号分子蛋白表达水平的变化
采用与实施例四中同样的方法,检测c-Jun转录的信号分子蛋白表达水平的变化。结果如图5所示,图中1—7对应的是0、0.05μM/L、0.1μM/L、0.2μM/L、0.4μM/L、0.8μM/L、和1.6μM/L的小白菊内酯给药浓度。c-Jun转录的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)p42/p44的蛋白表达水平均有明显下降,但是其活化的磷酸化形式由于不受c-Jun的调控并没有明显变化。
Claims (3)
1.人核糖体蛋白L10作为药物靶标在防治肿瘤相关疾病药物的体外筛选中的用途,所述人核糖体蛋白L10的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于所述防治肿瘤相关疾病的药物是小白菊内酯。
3.如权利要求1所述的用途,其特征在于所述肿瘤相关疾病是肺癌、***癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、鼻咽癌、口腔癌、卵巢癌、***、脑癌、神经瘤、淋巴癌、胰腺癌、胃癌、食管癌、喉癌、舌癌、乳腺癌、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、肾癌、黑色素瘤、胶质瘤、骨肉瘤或多发性骨髓瘤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410196622.6A CN103976994B (zh) | 2014-05-09 | 2014-05-09 | 一种肿瘤相关疾病药物靶点及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410196622.6A CN103976994B (zh) | 2014-05-09 | 2014-05-09 | 一种肿瘤相关疾病药物靶点及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103976994A CN103976994A (zh) | 2014-08-13 |
CN103976994B true CN103976994B (zh) | 2016-03-16 |
Family
ID=51269323
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410196622.6A Expired - Fee Related CN103976994B (zh) | 2014-05-09 | 2014-05-09 | 一种肿瘤相关疾病药物靶点及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103976994B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105906615B (zh) * | 2016-04-29 | 2019-06-04 | 常州大学 | 小白菊内酯类似物的制备方法及应用 |
CN107184984B (zh) * | 2017-06-08 | 2019-11-05 | 复旦大学附属金山医院 | Rpl10的抑制剂在制备治疗卵巢癌的药物中的应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009045443A2 (en) * | 2007-10-02 | 2009-04-09 | The University Of Rochester | Methods and compositions related to synergistic responses to oncogenic mutations |
CN102435750A (zh) * | 2008-09-07 | 2012-05-02 | 苏州爱生基因有限公司 | 一种筛选治疗或预防癌症的药物的方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040142379A1 (en) * | 2003-01-16 | 2004-07-22 | Carlsberg Research Laboratory | Affinity fishing for ligands and proteins receptors |
-
2014
- 2014-05-09 CN CN201410196622.6A patent/CN103976994B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009045443A2 (en) * | 2007-10-02 | 2009-04-09 | The University Of Rochester | Methods and compositions related to synergistic responses to oncogenic mutations |
CN102435750A (zh) * | 2008-09-07 | 2012-05-02 | 苏州爱生基因有限公司 | 一种筛选治疗或预防癌症的药物的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103976994A (zh) | 2014-08-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Qin et al. | Therapeutic potential and biological applications of cordycepin and metabolic mechanisms in cordycepin-producing fungi | |
Yan et al. | Naringenin ameliorated kidney injury through let‐7a/TGFBR1 signaling in diabetic nephropathy | |
Ohdo et al. | Chronopharmacological strategies: Intra-and inter-individual variability of molecular clock | |
Kato et al. | The antidiabetic drug metformin inhibits gastric cancer cell proliferation in vitro and in vivo | |
Cai et al. | Hedyotis diffusa Willd inhibits colorectal cancer growth in vivo via inhibition of STAT3 signaling pathway | |
Zhang | Ganoderma lucidum (Reishi) suppresses proliferation and migration of breast cancer cells via inhibiting Wnt/β-catenin signaling | |
Xiang et al. | HOTAIR-mediated reciprocal regulation of EZH2 and DNMT1 contribute to polyphyllin I-inhibited growth of castration-resistant prostate cancer cells in vitro and in vivo | |
Lien et al. | Inhibition of anchorage‐independent proliferation and G0/G1 cell‐cycle regulation in human colorectal carcinoma cells by 4, 7‐dimethoxy‐5‐methyl‐l, 3‐benzodioxole isolated from the fruiting body of Antrodia camphorate | |
Neamtu et al. | A comprehensive view on the quercetin impact on colorectal cancer | |
Kumavath et al. | Emergence of cardiac glycosides as potential drugs: Current and future scope for cancer therapeutics | |
Yang et al. | Traditional Chinese medicine curcumin sensitizes human colon cancer to radiation by altering the expression of DNA repair-related genes | |
Sun et al. | Danggui buxue decoction sensitizes the response of non-small-cell lung cancer to gemcitabine via regulating deoxycytidine kinase and P-glycoprotein | |
Belfiore et al. | IGF2: a role in metastasis and tumor evasion from immune surveillance? | |
Zhang et al. | Basic transcription factor 3 is required for proliferation and epithelial–mesenchymal transition via regulation of FOXM1 and JAK2/STAT3 signaling in gastric cancer | |
Bhaduri et al. | Rise of TRIM8: a molecule of duality | |
Serratì et al. | Tomatine displays antitumor potential in in vitro models of metastatic melanoma | |
Nakajima et al. | Family with sequence similarity 107: A family of stress responsive small proteins with diverse functions in cancer and the nervous system | |
Gong et al. | A functional interplay between Δ133p53 and ΔNp63 in promoting glycolytic metabolism to fuel cancer cell proliferation | |
CN103976994B (zh) | 一种肿瘤相关疾病药物靶点及其应用 | |
Mallet et al. | Polyphenol-enriched blueberry preparation controls breast cancer stem cells by targeting FOXO1 and miR-145 | |
Fang et al. | Polygonum cuspidatum extract (Pc-Ex) containing emodin suppresses lung cancer-induced cachexia by suppressing TCF4/TWIST1 complex-induced PTHrP expression | |
Hung et al. | Semaphorin 6C suppresses proliferation of pancreatic cancer cells via inhibition of the AKT/GSK3/β-catenin/cyclin D1 pathway | |
Arakawa et al. | Characterization of LRRFIP1 | |
Wang et al. | Effects of sweet corncob polysaccharide on pancreatic protein expression in type 2 diabetic rats | |
Shin et al. | Lucidumol A, Purified Directly from Ganoderma lucidum, Exhibits Anticancer Effect and Cellular Inflammatory Response in Colorectal Cancer |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160316 Termination date: 20170509 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |