CN103966318A - 利用dna稳定性同位素探针原位揭示判别稻田甲酸利用型产甲烷古菌的方法 - Google Patents

利用dna稳定性同位素探针原位揭示判别稻田甲酸利用型产甲烷古菌的方法 Download PDF

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Abstract

利用DNA稳定性同位素探针原位揭示判别稻田甲酸利用型产甲烷古菌的方法，包括以下步骤：（1）采集水稻土样品；（2）进行13C-甲酸的微宇宙培育实验；（3）利用超高速离心机对13C-甲酸培育土壤的微生物总DNA进行离心分层；（4）对分层后多个浮力密度中的产甲烷古菌基因进行实时定量PCR分析和指纹图谱分析，判断该水稻土中是否含有代谢活性的甲酸利用型产甲烷古菌。综上，本发明通过基于DNA稳定性同位素探针（DNA-basedStableIsotopeProbing）能够敏锐的、原位的揭示稻田甲酸利用型产甲烷古菌，对于了解微生物驱动的稻田养分循环过程和稻田产甲烷古菌功能群的生态功能认知都有重大的意义。

Description

利用DNA稳定性同位素探针原位揭示判别稻田甲酸利用型产甲烷古菌的方法
技术领域
本发明涉及一种利用DNA稳定性同位素探针（DNA-based Stable Isotope Probing）原位揭示判别稻田甲酸利用型产甲烷古菌的方法，属于土壤微生物生态学领域。
背景技术
全球稻田面积约1.5亿公顷，75%处于淹水状态。厌氧环境使得水稻土含有丰富的小分子有机酸。通过代谢这些物质，微生物驱动着稻田生态***的生物地球化学循环过程。甲酸是稻田有机质降解过程中重要中间产物之一，在水稻土中的浓度可以高达150 μM。水稻土中多种微生物可以代谢甲酸，如Clostridia纲内多种厌氧细菌可利用甲酸为电子供体执行硫酸盐还原和铁还原过程。同时，甲酸也是稻田甲烷排放的重要前体：每年稻田甲烷排放量占每年全球甲烷排放量的4-9%，约25-54 Tg，其中甲酸和H2/CO2产生的甲烷量合占稻田甲烷排放量的10-30%。鉴于甲酸是稻田甲烷排放的重要前提，以及甲酸在水稻土中的高含量，我们推测水稻土中一定存在能够直接代谢甲酸的产甲烷古菌。然而，水稻土中甲酸利用型产甲烷古菌却尚未见报道。其原因第一，目前可培养的微生物只占全部微生物的1%，大量微生物只能在特定的生境中存活和执行生态功能，还无法纯培养；第二、产甲烷古菌是严格厌氧微生物，其对生长环境的要求很高，传统方法很难筛选到；第三、虽然在纯培养条件下部分产甲烷古菌能够利用甲酸生长，但是纯培养条件不能代表水稻土中的原位生境，所以获得的菌株不能反映水稻土中的真实情况。近年发展起来的DNA稳定性同位素探针技术（DNA-based Stable Isotope Probing）为我们的原位鉴定提供了可能。
DNA稳定性同位素探针技术结合实时定量PCR和指纹图谱等分子生物学方法，能够定向发掘复杂土壤环境中参与特定生态过程的微生物资源，是当前土壤功能微生物原位鉴定较为有效的手段之一。DNA稳定性同位素探针技术基本原理是在土壤中添加含有稳定性同位素标记的代谢底物，当特定土壤微生物利用该标记底物生长繁殖，就会同化代谢底物上含标记的元素，并用于合成其生物质，如DNA等。因此，通过对环境DNA进行提取分离鉴定和比对分析，即可鉴别出土壤中驱动特定生态过程的功能微生物。该方法能够准确揭示执行特定功能的微生物，已成为原位鉴定功能微生物的重要手段之一。鉴于稻田甲酸和产甲烷古菌在生物地球化学循环过程中的重要性，该技术在水稻土中甲酸利用型产甲烷古菌鉴定上的应用，将有助于扩大我们对微生物所驱动的稻田养分循环过程和稻田产甲烷古菌功能群的生态功能的认知。
发明内容
解决的技术问题：本发明所要解决的技术问题在于提供一种DNA稳定性同位素探针（DNA-based Stable Isotope Probing）原位揭示判别稻田甲酸利用型产甲烷古菌的方法，以填补相关的理论空白，对于了解微生物驱动的稻田养分循环过程和稻田产甲烷古菌功能群的生态功能认知都有重大的贡献。
技术方案：本发明所述的一种利用DNA稳定性同位素探针（DNA-based Stable Isotope Probing）原位揭示判别稻田甲酸利用型产甲烷古菌的方法，其工艺流程如图1所示，具体包括以下步骤：
（1）采集水稻土样品；
（2）进行13C-甲酸的微宇宙培育实验；
（3）利用超高速离心机对13C-甲酸培育的土壤微生物总DNA进行离心分层；
（4）对分层后多个浮力密度中的产甲烷古菌基因进行实时定量PCR分析和指纹图谱分析，最终确定该水稻土中具有代谢活性的甲酸利用型产甲烷古菌。
所述的微宇宙培育实验的步骤为：将100 mg 13C-甲酸加入到装有5克干土重的120 mL玻璃瓶中，用无菌去离子水调至田间土壤最大持水重量的60%，并用氮气置换玻璃瓶中空气后用橡胶塞密封，以保持培养体系的厌氧环境；同时以12C-甲酸和不加甲酸的处理为分别为对照，放置28℃培养箱恒温培养，每隔3天抽出1.2 mL上层空气，利用气相色谱仪测定甲烷气体浓度变化，待甲烷浓度开始降低停止培育实验。
所述的超高速离心分层步骤为：微宇宙培育实验停止后，用土壤DNA提取试剂盒提取土壤微生物总DNA；将2.0 μg的土壤微生物总DNA、Gradient Buffer缓冲液和1.85 g/mL氯化铯溶液按0.1 mL、0.9 mL和4.9 mL体积混合，取5.1 mL混合液上超高速离心机；在20℃下45 krpm的离心速度离心44小时；离心结束后，用固定流速泵对离心管中的混合液进行分层，每层340 μL体积，分15层；用PEG6000和70%乙醇洗涤每层DNA。
所述实时定量PCR分析和指纹图谱分析的判断方法为：基于如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的产甲烷古菌特异性引物1106F/1378R，利用实时定量PCR对各个浮力密度层中的产甲烷古菌基因拷贝数进行分析；利用PCR-DGGE指纹图谱和PCA图对浮力密度重层和轻层中的产甲烷古菌群落组成进行分析；利用***发育树分析判断浮力密度重层中产甲烷古菌物种。
有益效果：综上，本发明通过基于DNA稳定性同位素探针（DNA-based Stable Isotope Probing）能够敏锐的、原位的揭示稻田甲酸利用型产甲烷古菌，对于了解微生物驱动的稻田养分循环过程和稻田产甲烷古菌功能群的生态功能认知都有重大的意义。
附图说明
图1为技术路线示意图；
图2为微宇宙培育过程中甲烷排放变化示意图；
图3为不同浮力密度层中产甲烷古菌基因拷贝数分布示意图，其中A为已知产甲烷古菌16S rRNA基因拷贝数和Cycle threshold（C T）值的标准曲线和线性方程；B为产甲烷古菌16S rRNA基因拷贝数，PCR产物经溶解曲线（Melting curve analysis）和琼脂糖电泳验证示意图；
图4为不同浮力密度层中产甲烷古菌16S rRNA基因拷贝数关系图；
图5为不同浮力密度层中产甲烷古菌群落组成的指纹图谱示意图；
图6为不同浮力密度层中产甲烷古菌群落组成分异的PCA分析示意图；
图7为产甲烷古菌的***发育树分析示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施实例进一步详细描述本发明的技术方案，所述实施实例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
实施例1
以扬州江都水稻土为研究对象，应用DNA稳定性同位素探针原位揭示判别水稻土中甲酸利用型产甲烷古菌物种。
（1）13C-甲酸的微宇宙培育实验
将100 mg的13C-甲酸加入到装有5克干土重的120 mL玻璃瓶中，无菌去离子水调至田间土壤最大持水重量的60%，用氮气置换玻璃瓶中空气后用橡胶塞密封，以12C-甲酸和不加甲酸土壤培育分别为对照。放置28℃培养箱恒温培养，每隔3天抽出1.2 mL上层空气，利用气相色谱仪测定甲烷气体浓度变化（图2），待甲烷浓度开始降低停止培育实验。
（2）对土壤微生物总DNA进行超高速离心分层
微宇宙培育实验停止后，用土壤DNA提取试剂盒提取土壤微生物总DNA；将2.0 μg的土壤微生物总DNA、Gradient Buffer缓冲液和1.85 g/mL氯化铯溶液按0.1 mL、0.9 mL和4.9 mL体积混合，取5.1 mL混合液上超高速离心机；在20℃下45 krpm的离心速度（约为190000×g）离心44小时；离心结束后，用固定流速泵对离心管中的混合液进行分层，每层340 μL体积，分15层；用PEG6000和70%乙醇洗涤每层DNA。
（3）分层后各个浮力密度中的产甲烷古菌基因拷贝数的分析
将DNA分层后，基于产甲烷古菌特异性引物1106F（5'-TTWAGTCAGGCAACGAGC-3'）/1378R（5'-TGTGCAAGGAGCAGGGAC-3'），利用CFX96TM Thermal Cycler（Bio-Rad）仪对不同处理的各个浮力密度层中的产甲烷古菌16S rRNA基因片段进行定量PCR测定，具体步骤如下：首先建立产甲烷古菌16S rRNA基因片段的标准曲线，利用1106F/1378R引物对扩增产甲烷古菌标准菌株16S rRNA基因片段，获得产甲烷古菌16S rRNA基因片段的PCR产物，用Promega克隆试剂盒对PCR产物进行TA克隆，通过蓝白斑挑选和PCR验阳找到含有正确片段大小的克隆子，将该克隆子在含有氨苄的液体LB培养基中培养扩大；利用Takara MiniBEST Plasmid Purification Kit提取克隆子扩大液中的质粒DNA并纯化，利用超微量核酸浓度测定仪Nanodrop测定质粒DNA浓度，根据质粒的分子量和阿伏伽德罗常数（6.02×1023分子/mol）折算出每微升质粒DNA中含有产甲烷古菌16S rRNA基因片段的拷贝数；以10倍稀释法稀释成一系列每微升1.0×103~1.0×108 基因拷贝数标样，利用实时荧光定量PCR试剂盒和实时荧光定量PCR仪CFX96TM Thermal Cycler（Bio-Rad）建立已知产甲烷古菌16S rRNA基因拷贝数和Cycle threshold（C T）值的标准曲线和线性方程（图3A），实时荧光定量PCR体系依据SYBR Premix Ex Taq TM Kit（TaKaRa）试剂盒说明。依据该线性方程，利用外标法根据环境样品的C T值计算出环境样品中产甲烷古菌16S rRNA基因拷贝数，PCR产物经溶解曲线（Melting curve analysis）和琼脂糖电泳验证（图3B），确认其专一性和有效性。
从图4可以看出13C-甲酸处理中产甲烷古菌的基因拷贝数最大值出现在浮力密度重层即1.735 g/mL；与之相反，12C-甲酸处理中产甲烷古菌的最大基因拷贝数出现在浮力密度轻层（1.717 g/mL）。此外，添加甲酸处理的产甲烷古菌基因拷贝数最大值都大于不添加甲酸处理。该结果说明部分水稻土中有产甲烷古菌利用甲酸生长，从而其基因拷贝数增加，此外13C-甲酸处理中有产甲烷古菌代谢了13C-甲酸，从而其自身DNA“变重”，在浮力密度重层的数量增加。
（4）分层后多个浮力密度层中的产甲烷古菌群落组成的PCR-DGGE指纹图谱分析
随后，对13C-甲酸处理浮力密度轻层和重层，以及12C-甲酸和不添加甲酸处理的浮力密度轻层进行PCR-DGGE指纹图谱分析（图5），具体步骤如下：使用8%聚丙烯酰胺凝胶，电泳缓冲液为1 × TAE，变性梯度45%75%；PCR产物上样量为200 ng DNA；电压80 V，60℃，电泳13 h；用SYBR Green I (Invitrogen) (1:10 000, V/V)染色30 min，后用Gel DocTM EQ imager (Bio-Rad)成像拍照。结果显示13C-甲酸处理浮力密度重层的产甲烷古菌群落组成和其它差异很大，例如在13C-甲酸处理重层中条带6、7、8和10的光密度值要明显大于在其它浮力密度层。主成分分析法（PCA）进一步显示不同处理浮力密度层中产甲烷古菌群落组成的差异（图6）：13C-甲酸处理浮力密度重层的产甲烷古菌群落组成相似，聚在一起，而远离浮力密度轻层中的产甲烷古菌群落。指纹图谱和PCA分析一致说明部分产甲烷古菌代谢了13C-甲酸，使得自身DNA“变重”，从而出现在浮力密度重层，因此在浮力密度重层中的产甲烷古菌群落组成和轻层明显不同。
（5）对指纹图谱中浮力密度重层的物种进行***发育树分析
对PCR-DGGE指纹图谱中的特异性条带割胶、回收，克隆、测序（图5），并建立***发育树分析（图7）。结果显示13C-甲酸处理浮力密度重层中的产甲烷古菌都隶属于Methanobacteriaceae，即Methanobacteriaceae是供试水稻土中主要的甲酸利用型产甲烷古菌。该结果首次揭示了水稻土中甲酸利用型产甲烷古菌，拓展了目前对稻田产甲烷古菌生态功能以及甲酸驱动的微生物地球化学循环过程的认知。
序列表
<110> 中国科学院南京土壤研究所
<120> 利用DNA稳定性同位素探针原位揭示判别稻田甲酸利用型产甲烷古菌的方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttwagtcagg caacgagc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgtgcaagga gcagggac 18

Claims (4)

1.利用DNA稳定性同位素探针原位揭示判别稻田甲酸利用型产甲烷古菌的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）采集水稻土样品；
（2）进行13C-甲酸的微宇宙培育实验；
（3）利用超高速离心机对13C-甲酸培育土壤的微生物总DNA进行离心分层；
（4）对分层后多个浮力密度中的产甲烷古菌基因进行实时定量PCR分析和指纹图谱分析，判断该水稻土中是否含有代谢活性的甲酸利用型产甲烷古菌。
2.根据权利要求1所述利用DNA稳定性同位素探针原位揭示判别稻田甲酸利用型产甲烷古菌的方法，其特征在于所述的微宇宙培育实验的步骤为：将100 mg 13C-甲酸加入到装有5克干土重的120 mL玻璃瓶中，用无菌去离子水调至田间土壤最大持水重量的60%，并用氮气置换玻璃瓶中空气后用橡胶塞密封，以保持培养体系的厌氧环境；同时以12C-甲酸和不加甲酸的处理为分别为对照，放置28℃培养箱恒温培养，每隔3天抽出1.2 mL上层空气，利用气相色谱仪测定甲烷气体浓度变化，待甲烷浓度开始降低停止培育实验。
3.根据权利要求1所述利用DNA稳定性同位素探针原位揭示判别稻田甲酸利用型产甲烷古菌的方法，其特征在于所述的超高速离心分层步骤为：微宇宙培育实验停止后，用土壤DNA提取试剂盒提取土壤微生物总DNA；将2.0 μg的土壤微生物总DNA、Gradient Buffer缓冲液和1.85 g/mL氯化铯溶液按0.1 mL、0.9 mL和4.9 mL体积混合，取5.1 mL混合液上超高速离心机；在20℃下45 krpm的离心速度离心44小时；离心结束后，用固定流速泵对离心管中的混合液进行分层，每层340 μL体积，分15层；用PEG6000和70%乙醇洗涤每层DNA。
4.根据权利要求1所述利用DNA稳定性同位素探针原位揭示判别稻田甲酸利用型产甲烷古菌的方法，其特征在于所述实时定量PCR分析和指纹图谱分析的判断方法为：基于如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的产甲烷古菌特异性引物1106F/1378R，利用实时定量PCR对各个浮力密度层中的产甲烷古菌基因拷贝数进行分析；利用PCR-DGGE指纹图谱和PCA图对浮力密度重层和轻层中的产甲烷古菌群落组成进行分析；利用***发育树分析判断浮力密度重层中产甲烷古菌物种。
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