CN103966196A

CN103966196A - 一种利用酿酒酵母二酪氨酸层疏松型孢子固定化酶的方法

Info

Publication number: CN103966196A
Application number: CN201410199369.XA
Authority: CN
Inventors: 高晓冬; 中西秀树; 施李兵; 李子杰
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2014-05-12
Filing date: 2014-05-12
Publication date: 2014-08-06

Abstract

本发明公开了一种利用酿酒酵母二酪氨酸层疏松型孢子固定化酶的方法，属于微生物和固定化酶技术领域。本发明将带有自身信号肽的α-半乳糖苷酶基因***到质粒pRS424-TEFpr上，得到重组质粒pRS424-TEF_pr-MEL1，然后转化OSW2基因缺陷型酿酒酵母，通过以醋酸盐为唯一或主要碳源，并辅以缺乏氮源的条件培养重组酵母，最终收集纯化获得固定化酶。该微胶囊固定化酶一方面可以利用二酪氨酸层将酶包裹在孢子的周质间隙上，同时二酪氨酸层变得疏松后便于底物分子与酶分子进行接触，提高了反应效率。这种独特的空间定位提高了对蛋白酶的稳定性、无需蛋白纯化和固定化操作、降低生产成本等。

Description

一种利用酿酒酵母二酪氨酸层疏松型孢子固定化酶的方法

技术领域

本发明涉及一种利用酿酒酵母二酪氨酸层疏松型孢子固定化酶的方法，属于微生物和固定化酶技术领域。

背景技术

酵母菌泛指能发酵糖类的一大类单细胞真菌，最典型的酵母菌是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。酿酒酵母在良好的营养和生长条件下，生长迅速，以出芽繁殖的方式进行生殖。但以醋酸盐为唯一或主要碳源，并辅以缺乏氮源等特定条件，如只有乙酸钾存在，酿酒酵母就会以孢子生殖的方式进行繁殖，在胞内形成孢子，此时的细胞即称为子囊。子囊经自然或人为破壁后，可释放出其中的子囊孢子。

OSW2基因的具体功能虽然尚不明确，但是可以肯定的是其对正确组装酿酒酵母孢子壁是必须的。曾有文献报道过敲除OSW2基因后酿酒酵母孢子对***敏感，而野生型孢子对***不敏感。酿酒酵母在以醋酸盐为唯一或主要碳源的状态下在可以产生子囊孢子，其孢子壁由四层组成，从内到外依次为：甘露糖，β-葡聚糖，壳聚糖，二酪氨酸。

在本发明中，我们使用一种酿酒酵母缺陷型菌株osw2Δ，此菌株产生的孢子壁虽然含有最外的二酪氨酸层，但是其孢子壁结构变得疏松，空隙变大，使得某些大小适中的底物可以通过。我们通过分子生物学的方法使目的酶固定在此缺陷型的孢子壁上壳聚糖层和二酪氨酸层之间的周质间隙，得到孢子固定化酶，一方面可以利用孢子二酪氨酸层将酶包裹在孢子的周质间隙上，同时二酪氨酸层变得疏松后便于底物分子与酶分子进行接触，提高了反应效率。这种独特的空间定位使其相对于游离酶而言具有很多优良特性，如温度(有机溶剂、蛋白酶)稳定性、重复使用性、无需蛋白纯化和固定化操作、降低生产成本等。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用酿酒酵母二酪氨酸层疏松型孢子固定化酶的方法，是构建OSW2基因缺陷型酿酒酵母，以其为宿主构建表达目的酶的重组酿酒酵母，培养重组酿酒酵母使其以孢子生殖的方式进行繁殖，在胞内形成孢子，目的酶表达定位在酿酒酵母孢子的壳聚糖层和二酪氨酸层之间的周质间隙，收集孢子获得固定化酶。

所述酶优选α-半乳糖苷酶、蔗糖酶或植酸酶。

所述方法包括以下步骤：

1)通过同源重组敲除酿酒酵母孢子壁合成相关基因OSW2，筛选验证得到酿酒酵母缺陷菌株osw2Δ，其孢子壁二酪氨酸层疏松；

所述OSW2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)将带有自身信号肽的α-半乳糖苷酶基因(MEL1)***到质粒pRS424-TEFpr上，得到重组质粒pRS424-TEF_pr-MEL1；

所述α-半乳糖苷酶基因(MEL1)来自酵母，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

3)将得到的重组质粒pRS424-TEF_pr-MEL1通过醋酸锂/PEG的转化方法转化酿酒酵母osw2Δ，得到重组酿酒酵母osw2Δ/pRS424-TEF_pr-MEL1；

4)将重组酿酒酵母接种到SD-Trp液体培养基中，28℃～32℃培养，过夜；所述SD-Trp培养基成分为无氨基酸酵母氮源、去离子水，灭菌后，补加单独灭菌的葡萄糖和不含色氨酸的氨基酸混合物；

5)将步骤3)中的菌液转接到YPAce培养基中，28℃～32℃摇床12h～16h；所述YPAce培养基成分为酵母提取物、蛋白胨、腺嘌呤以及醋酸钾；

6)离心收集步骤4)中的菌体，清洗，然后用1.5％～3％(m/v)醋酸钾重悬，28℃～32℃摇床24h～48h；

7)收集重组酿酒酵母细胞，用PBS溶液洗2～3次，然后再用PBS溶液重悬；

8)向步骤7)中的细胞悬浮液加入lyticase(溶壁酶)，冰上超声；

9)用PBS溶液将步骤8)的破碎细胞洗2～3次，弃去上清得到酿酒酵母二酪氨酸层疏松型孢子微胶囊固定化酶。

所述培养温度优选30℃，醋酸钾浓度优选2％。

所述步骤9)还包括对得到的孢子微胶囊固定化酶进行纯化，将得到的孢子微胶囊固定化酶用0.5％Triton X-100溶液洗涤，然后将孢子悬浮在0.5％Triton X-100溶液中；配制不同浓度梯度的Percoll溶液；将不同浓度梯度的Percoll溶液按照从高浓度到低浓度依次加入到离心管中，最后加入孢子悬浮液，离心后，溶液分层，孢子将会位于离心管的底部，将上层液体和细胞碎片除去，用0.5％Triton X-100溶液洗涤孢子2～3次，并冷冻干燥。

所述SD-Trp培养基优选无氨基酸酵母氮源与去离子水的质量百分比为0.67％，葡萄糖终浓度2％，氨基酸混合物终浓度0.67％。其中，氨基酸混合物粉末成分及比例如下：

所述YPAce培养基优选：2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％醋酸钾，0.003％腺嘌呤。

本发明提供的固定化酶的制备方法只需要通过基因工程的方法对酶进行克隆、表达，必要的时候还可以对其进行基因改造优化；作为固定化的载体细胞，酿酒酵母孢子是一种可以廉价大规模培养的环保载体，此外，通过敲除酿酒酵母孢子壁合成相关基因OSW2，在抵御不良环境对酶活力影响的同时，还可以提高酶的催化效率。与游离酶相比，本发明制备的固定化酶可抵御不同水解酶的侵袭和耐受较高温度，同时可以重复利用多次。

附图说明

图1将分别表达α-半乳糖苷酶的不同孢子(wt、osw2Δ、dit1Δ)和表达α-半乳糖苷酶的酿酒酵母SK1营养细胞经高盐溶液洗脱前后α-半乳糖苷酶活性，注：veg-营养细胞；wt-野生型孢子；osw2Δ-二酪氨酸层疏松型孢子；dit1Δ-孢子壁最外层不含有二酪氨酸层；chs3Δ-孢子壁不含有最外层的二酪氨酸层和次外层壳聚糖层；MEL1-半乳糖苷酶基因。

图2表达α-半乳糖苷酶的不同孢子经4次洗涤后α-半乳糖苷酶活性相对值，注：wt-野生型孢子；osw2Δ-二酪氨酸层疏松型孢子；dit1Δ-孢子壁最外层不含有二酪氨酸层。

图3表达α-半乳糖苷酶的不同孢子经β-葡聚糖酶处理后的剩余酶活相对百分比活性，注：wt-野生型孢子；osw2Δ-二酪氨酸层疏松型孢子；dit1Δ-孢子壁最外层不含有二酪氨酸层。

图4α-半乳糖苷酶游离酶和表达α-半乳糖苷酶的不同孢子经蛋白酶K处理后的剩余酶活相对百分比活性，注：wt-野生型孢子；osw2Δ-二酪氨酸层疏松型孢子；dit1Δ-孢子壁最外层不含有二酪氨酸层。

图5α-半乳糖苷酶在不同孢子孢子壁上的表达定位，注：wt-野生型孢子；osw2Δ-二酪氨酸层疏松型孢子；dit1Δ-孢子壁最外层不含有二酪氨酸层；chs3Δ-孢子壁不含有最外层的二酪氨酸层和次外层壳聚糖层。

具体实施方式

实施例1酿酒酵母SK1osw2Δ菌株的构建

引物设计：依据酿酒酵母OSW2基因序列设计引物如下：

上游引物P1：

TATTCCTAAGCCTTTCTTTCTTTTTTTGAAGGCAAGAACTCGCATTAGTTCGGATCCCCGGGTTAATTAA；

下游引物P2：

AATTTTGCGCATCCCACCCCTTATTAACAATCACATTTTTTTTTTTAATAGAATTCGAGCTCGTTTAAAC。

利用上游引物P1和下游引物P2对质粒pFA6a-His3MX6进行PCR扩增，获得含酿酒酵母OSW2基因上下游序列的敲除片段。

OSW2基因的敲除：通过醋酸锂/PEG的转化方法将PCR扩增得到的含有HIS3标记的敲除片段导入到酿酒酵母SK1的单倍体细胞4B和16D中，并进行筛选。

缺陷性菌株的筛选：使用SD-His缺陷型平板进行筛选，将得到的转化菌株涂布到SD-His缺陷性平板上，待长出菌落后，挑取一定数目的菌落提取基因组，并进行PCR验证，以与野生型菌株的基因组进行对比，若验证成功，再将单倍体在SD-Leu-Arg平板上融合，得到缺陷型的二倍体菌株SK1osw2Δ。验证引物如下：上游引物：AGCACATAGACGCACGATAC；下游引物：GTGCAACAACCGCTTTCTAC。

质粒pFA6a-His3MX6的构建方法参见文献Longtine M S,McKenzie III A,Demarini D J,etal.Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification inSaccharomyces cerevisiae[J].Yeast,1998,14(10):953-961。酿酒酵母SK1保藏于中国高校工业微生物资源平台(CICIM，保藏号Y0702)。

实施例2基于酿酒酵母二酪氨酸层疏松型孢子的微胶囊固定化酶的制备

(1)将带有自身信号肽的α-半乳糖苷酶基因(MEL1)***到质粒pRS424-TEFpr上，得到重组质粒pRS424-TEF_pr-MEL1；

(2)将得到的重组质粒pRS424-TEF_pr-MEL1通过醋酸锂/PEG的转化方法转化酿酒酵母SK1osw2Δ，得到重组酿酒酵母SK1osw2Δ/pRS424-TEF_pr-MEL1；

(3)将重组酿酒酵母接种到SD-Trp培养基中，30℃培养，过夜；所述SD-Trp培养基成分为无氨基酸酵母氮源、去离子水，灭菌后，补加单独灭菌的葡萄糖和不含色氨酸的氨基酸混合物；其中无氨基酸酵母氮源与去离子水的质量百分比为0.67％，葡萄糖终浓度2％，氨基酸混合物终浓度0.67％。

氨基酸混合物粉末成分及比例如下：

(4)将步骤3)中的菌液按体积比1：30转接到YPAce培养基中，30℃摇床15h；所述YPAce：2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％醋酸钾，0.003％腺嘌呤；

(5)离心收集步骤4)中的菌体，清洗，然后用2％醋酸钾重悬，30℃摇床36h；

(6)收集重组酿酒酵母细胞，用PBS溶液洗2～3次，然后再用PBS溶液重悬；

(7)向步骤(6)中的细胞悬浮液加入10μg/mL lyticase，冰上超声；

(8)用PBS溶液将步骤(7)的破碎细胞洗2～3次，弃去上清得到酿酒酵母重组孢子。

(9)酿酒酵母重组孢子的纯化：将得到的酿酒酵母重组孢子用Triton X-100溶液洗涤，然后将孢子悬浮在Triton X-100溶液中；配制不同浓度梯度的Percoll溶液；将不同浓度梯度的Percoll溶液按照从高浓度到低浓度依次加入到离心管中，最后加孢子悬浮液，离心后，溶液分层，纯净的孢子将会位于离心管的底部，将上层液体和细胞碎片除去，用PBS溶液洗涤孢子2～3次，冷冻干燥。

浓度梯度为50％，60％，70％，80％的Percoll溶液：

(1)80％Percoll，10％0.5％Triton-X，10％2.5M蔗糖；

(2)70％Percoll，20％0.5％Triton-X，10％2.5M蔗糖；

(3)60％Percoll，30％0.5％Triton-X，10％2.5M蔗糖；

(4)50％Percoll，40％0.5％Triton-X，10％2.5M蔗糖。

质粒pRS424-TEFpr的构建方法见文献Longtine M S,McKenzie III A,Demarini D J,et al.Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification inSaccharomyces cerevisiae[J].Yeast,1998,14(10):953-961。酿酒酵母SK1保藏于中国高校工业微生物资源平台(CICIM，保藏号Y0702)。

实施例3基于酿酒酵母二酪氨酸层疏松型孢子的微胶囊固定化酶的酶活测定

2mg纯化后表达有α-半乳糖苷酶的孢子(或营养细胞)悬浮到1mL的乙酸缓冲液(0.2M乙酸-乙酸钠pH4.6)。为了防止葡萄糖诱导单倍体孢子萌发融合成二倍体细胞而导致孢子壁破裂，反应体系均加入终浓度40μg/mL的环己酰亚胺(cycloheximide)，底物为5％蜜二糖(melibiose)，溶于上述乙酸缓冲液。反应体系为：1mL孢子或细胞悬液，1mL5％蜜二糖溶液。充分混匀后，置于37℃反应10min，最后置于沸水浴中静置1min终止反应。9,000r.min^-1离心5min收集反应液上清，稀释适当倍数后利用葡萄糖检测试剂盒检测反应生成的葡萄糖量。一个单位α-半乳糖苷酶活性定义如下：37℃下，反应10min所产生的葡萄糖的量(mg)。对于湿细胞而言，细胞的定量根据下面网站上对应的OD₆₆₀计算相应的细胞数量http://www.pangloss.com/seidel/Protocols/ODvsCells.html。为了尽量避免培养基中原有葡萄糖对结果的影响，在处理营养细胞时利用不含葡萄糖的培养基YPAce，首先将细胞培养于YPAD，然后转接至YPAce扩大培养。

由图1可以看到，同野生型(wt)孢子、osw2Δ孢子表达的α-半乳糖苷酶相比，dit1Δ孢子表达的α-半乳糖苷酶的活性最高，可能的原因是由于二酪氨酸层的缺失，使得底物更易于与酶接触发生反应；osw2Δ孢子表达的α-半乳糖苷酶的活性要比野生型孢子要高，可能的原因是osw2Δ孢子的二酪氨酸层有较小程度的缺失，导致比野生型孢子更容易使底物穿过二酪氨酸层。虽然dit1Δ孢子表达的α-半乳糖苷酶的活性最高，但由于二酪氨酸层的缺失，导致dit1Δ孢子表达的酶可能不能够紧密地固定在孢子壁。为了验证这种可能性，对各种表达α-半乳糖苷酶的孢子用含有去垢剂的高盐溶液(0.6M NaCl and0.1％Triton X-100)进行洗涤，然后测定洗涤后的活性，结果如图1所示：同野生型孢子和osw2Δ孢子相比，dit1Δ孢子表达的酶活下降得最为明显，又经过四次洗涤，dit1Δ孢子表达的酶活下降了约50％，野生型孢子和osw2Δ孢子表达的酶活下降了约25％(如图2所示)。由此可以推断，osw2Δ孢子疏松二酪氨酸层的存在能够阻止α-半乳糖苷酶从孢子壁上的释放，并且使底物更容易通过二酪氨酸层，从而提高酶活。

实施例4酵母孢子壁对α-半乳糖苷酶保护作用的检测

包括分别用β-葡聚糖酶和蛋白酶K处理孢子微胶囊固定化酶，具体过程如下：

(1)分别将表达有α-半乳糖苷酶的不同孢子(wt、osw2Δ、dit1Δ)与β-葡聚糖酶(β-glucanase)一同温育处理，其处理方法如下：

约2mg经上述纯化干燥后的含有α-半乳糖苷酶的重组孢子粉末重悬于1mL原生质体溶液(50mM磷酸缓冲液pH7.5，1.4M山梨醇，40mMβ-巯基乙醇)，充分混匀后加入10μLβ-葡聚糖酶储液(1mgβ-葡聚糖酶溶于500μL50％甘油)，充分混匀后，置于30℃摇床处理3h，再用含有0.1％TritonX-100的0.6M NaCl溶液洗涤数次，离心收集处理后细胞，根据上述方法检测α-半乳糖苷酶活性。结果如图3显示，野生型酿酒酵母SK1孢子(wt)和osw2Δ孢子表达的α-半乳糖苷酶活性几乎未受影响，然而，dit1Δ孢子表达的α-半乳糖苷酶活性急剧下降。(2)将表达有α-半乳糖苷酶的不同孢子(wt、osw2Δ、dit1Δ)和培养液中的游离半乳糖苷酶分别与蛋白酶K一同温育处理，其处理方法如下：

约2mg经上述纯化干燥后含有α-半乳糖苷酶的重组孢子粉末重悬于1mL蛋白酶K缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5,10mM CaCl₂)，加入蛋白酶K,终浓度500μg/mL，充分混匀后，置于30℃摇床过夜处理，再用含有0.1％TritonX-100的0.6M NaCl洗涤数次，离心收集处理后细胞，根据上述方法检测α-半乳糖苷酶活性。分泌至培养基中的α-半乳糖苷酶的处理如下：表达α-半乳糖苷酶的野生型孢子首先经过5mL SD-TRP选择培养基预培养，再经30mLYPAce扩大培养后，离心收集上清，上清浓缩至约300μL(蛋白质终浓度6mg/mL)，每次实验取10μL。酶活测定参照实施例3。结果如图4显示，野生型酿酒酵母SK1孢子和osw2Δ孢子表达的α-半乳糖苷酶其活性几乎未受影响，dit1Δ孢子表达的α-半乳糖苷酶其活性略有下降。然而，培养液中游离的α-半乳糖苷酶经蛋白酶K处理后其活性急剧下降。

实施例5检测α-半乳糖苷酶在孢子壁上的表达定位

1)将含有自身信号肽的α-半乳糖苷酶基因MEL1(不含有终止密码子)***到质粒pRS424-TEFpr上，得到重组质粒pRS424-TEF_pr-MEL1；

2)将PCR扩增得到的RFP基因(SEQ ID NO.3)连接到质粒pRS424-TEF_pr-MEL1，从而得到重组质粒pRS424-TEF_pr-MEL1-RFP，并通过醋酸锂/PEG的转化方法分别转化酿酒酵母SK1、osw2Δ、dit1Δ，分别得到相应的重组酿酒酵母；产孢过程及孢子纯化过程参照实施例2。

3)孢子或营养细胞经过离心后，无菌水洗涤数次后，重悬于适量无菌水中。取5μL细胞悬液与洁净载玻片上，盖上盖玻片，置于尼康Eclipse Ti-E荧光倒置显微镜下，100倍油镜观察，并使用软件NIS-Element AR进行图像分析。

对于酿酒酵母SK1野生型孢子、osw2Δ孢子表达的融合蛋白均定位在孢子壁上；值得注意的是，dit1Δ孢子表达的融合蛋白也定位于孢子壁上，而chs3Δ孢子表达的融合蛋白不能表达定位在孢子壁上，呈弥散状，说明对于α-半乳糖苷酶，不需要二酪氨酸层的存在，壳聚糖层就可以将该酶表达定位在孢子壁上，可能和该酶的特殊性质有关，但由于二酪氨酸层的缺失，导致dit1Δ孢子表达的酶可能不能够紧密地固定在孢子壁，如图2所示，反复洗涤后活性下降比较明显。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种利用酿酒酵母二酪氨酸层疏松型孢子固定化酶的方法，其特征在于，构建OSW2基因缺陷型酿酒酵母，以其为宿主，构建表达目的酶的重组酿酒酵母，培养重组酿酒酵母使其以孢子生殖的方式进行繁殖，在胞内形成孢子，目的酶表达定位在酿酒酵母孢子的壳聚糖层和二酪氨酸层之间的周质间隙，收集孢子获得固定化酶。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶是α-半乳糖苷酶，编码所述α-半乳糖苷酶及其自身信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，酶在信号肽的引导下表达在周质间隙。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述OSW2基因缺陷型酿酒酵母是通过同源重组敲除酿酒酵母孢子壁合成相关基因OSW2，并筛选验证得到；所述OSW2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将SEQ ID NO.2所示的带有自身信号肽的α-半乳糖苷酶基因***到质粒pRS424-TEFpr上，得到重组质粒pRS424-TEF_pr-MEL1，然后转化OSW2基因缺陷型酿酒酵母osw2Δ，通过以醋酸盐为唯一或主要碳源，并辅以缺乏氮源的条件培养重组酵母，最终收集纯化获得酿酒酵母二酪氨酸层疏松型孢子固定化酶。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将带有自身信号肽的α-半乳糖苷酶基因***到质粒pRS424-TEFpr上，得到重组质粒pRS424-TEF_pr-MEL1；

(2)将得到的重组质粒pRS424-TEF_pr-MEL1转化酿酒酵母osw2Δ，得到重组酿酒酵母osw2Δ/pRS424-TEF_pr-MEL1；

(3)将重组酿酒酵母接种到SD-Trp培养基中，28℃～32℃培养，过夜；

(4)将步骤(3)中的菌液转接到YPAce培养基中，28℃～32℃摇床12h～16h；

(5)离心收集步骤(4)中的菌体，清洗，然后用1.5％～3％醋酸钾重悬，28℃～32℃摇床24h～48h，使酿酒酵母在胞内形成孢子；

(6)收集、破碎重组酿酒酵母细胞，收集、纯化获得在壳聚糖层和二酪氨酸层之间表达了α-半乳糖苷酶的孢子。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)收集重组酿酒酵母细胞，用PBS溶液洗2～3次，然后再用PBS溶液重悬；向细胞悬浮液加入Lyticase，冰上超声；用PBS溶液将破碎细胞洗2～3次，弃去上清得到重组酿酒酵母孢子。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，将收集得到的重组酿酒酵母孢子用TritonX-100溶液洗涤，然后将孢子悬浮在Triton X-100溶液中；利用Percoll分层液，离心获得纯净的孢子，用PBS溶液洗涤孢子2～3次，冷冻干燥。

9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述SD-Trp培养基成分为无氨基酸酵母氮源、去离子水，灭菌后，补加单独灭菌的葡萄糖和不含色氨酸的氨基酸混合物。

10.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述YPAce培养基成分为酵母提取物、蛋白胨、腺嘌呤以及醋酸钾。