CN103966149B - 一种生活垃圾和污泥腐熟菌剂及其应用和所制腐熟基质 - Google Patents

一种生活垃圾和污泥腐熟菌剂及其应用和所制腐熟基质 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种农村生活垃圾和污泥腐熟菌剂和使用方法，及用该菌剂和特定工艺发酵所制腐熟基质。菌剂按重量份数由枯草芽孢杆菌0.5～2份、细黄链霉菌0.5～2份、长柄木霉0.5～2份、黑曲霉0.5～2份和胶胨样芽孢杆菌0.5～2份复合而成，有效活菌数5×108个/g，可腐熟垃圾和污泥及除臭，可抗黄瓜枯萎病菌，应用于农作物可增产，处理垃圾和污泥发酵周期20天，未接菌剂的30天。腐熟基质是在每5方混合料中加入1公斤所述菌剂后经特定工艺发酵而成，混合料按重量百分数由40～60%的生活垃圾、20～40%的污泥和5～15%玉米秸秆混合而成，基质应用于黄瓜种植中亩增产11%，增收859元，节省农药200mL。

Description

一种生活垃圾和污泥腐熟菌剂及其应用和所制腐熟基质
技术领域
本发明属于农业微生物在处理农村生活垃圾和污泥上的应用领域，涉及一种农村生活垃圾和污泥的腐熟菌剂及其使用方法和所制腐熟基质。
背景技术
近几年，天津市经济的快速发展，带来了大量生活垃圾的产生，据统计，天津垃圾总量已超过200万吨/年，为此，天津市加大了垃圾的利用效率，以垃圾填埋为主逐渐发展成垃圾填埋与焚烧发电相结合，逐步减少垃圾填埋量，虽然经过焚烧，部分垃圾资源得到回收利用，但生活垃圾的燃值不高、含水量大，能量转化率低。另外，生活垃圾燃烧后，将产生大量有毒有害气体-二恶英，对人体健康构成严重威胁。另外，随着天津农村生态文明建设进程的加快，农村开始建立大量的污水处理场，相应的产生了大量的污泥，如果得不到良好的处理，容易产生二次污染，对人和环境造成构成巨大的威胁。
因此，寻找一条可资源化循环利用途径，是今后农村垃圾和污泥处理的可持续之路。其中生物处理技术是目前比较好的一种资源循环利用的技术。通过加入可快速分解垃圾和污泥中纤维素、蛋白质和淀粉，并能除臭的复合菌剂可以达到快速处理农村生活垃圾和污泥的目的。
基于此，特提出本发明，主要是提供一种专门用于农村生活垃圾和污泥的腐熟菌剂，生产可用于土壤改良和作为肥料的腐熟基质。
发明内容
本发明的目的是提供一种专门用于处理农村生活垃圾和污泥的腐熟菌剂及其使用方法，以及用该菌剂和特定工艺发酵生产的腐熟基质。
本发明提供的一种农村生活垃圾和污泥腐熟菌剂，其特征在于它由可分解纤维素、淀粉、蛋白质、除臭、抗病和菌肥多种功能的多种菌株复合而成，它的活性成分包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、细黄链霉菌（Streptomyces microflavus）、长柄木霉（Trichoderma longbrachiatum）、黑曲霉（Aspergillus nige）和胶胨样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）。它是由下述重量份数的各单菌株发酵物组成：枯草芽孢杆菌0.5～2份、细黄链霉菌0.5-2份、长柄木霉 0.5～2份、黑曲霉0.5～2份和胶胨样芽孢杆菌0.5～2份；
复合菌剂有效活菌数达到5×108个/g。
所述枯草芽孢杆菌具体可为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC11089的菌株。所述细黄链霉菌具体可为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC 40027的菌株。所述长柄木霉具体可为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC 30150的菌株。所述黑曲霉可为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC30171的菌株。所述胶胨样芽孢杆菌具体可为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC 10013的菌株。
所述农村生活垃圾和污泥腐熟菌剂具有多种功能，包括可对农村生活垃圾和污泥进行发酵腐熟和除臭，可抗黄瓜枯萎病菌及应用于农作物可增产，其中应用于甘蓝种植中亩增产17.9%。
本发明进一步公开了农村生活垃圾和污泥腐熟菌剂的使用方法，其特征在于按如下的步骤进行：
1、调整好农村生活垃圾和污泥的碳氮比（25～30:1）和水分（55～60%，用手一攥手缝滴水为宜），每5方农村生活垃圾和污泥加入1公斤复合菌剂，翻捣均匀。
2、将预处理好的农村生活垃圾和污泥堆成长梯形，堆顶宽1米，堆底宽2米，堆高夏秋季0.8～1米、冬春季1.2～1.4米，堆长根据场地而定，每堆体积不少于5方。
3、发酵开始后，当物料温度（20～30厘米深处）升至55℃时保持三天，然后翻捣一次。若发酵初期温度不上升，则调整水分至推荐比例并每天翻捣一次直至堆温上升。
4、当堆温再次升至55℃后，保持三天，然后翻捣一次；
5、之后根据堆温情况进行翻捣，温度上升时期不翻捣，温度停止上升则翻捣，并重复这一步骤，直到堆温与室外温度相同、水分降至30%以下时，即完成了发酵过程，整个发酵周期通常为15～25天。
本发明进一步公开了复合菌剂在农村生活垃圾和污泥发酵腐熟和除臭上的应用，以及在农作物栽培增产上的应用。
本发明进一步公开了农村生活垃圾和污泥腐熟剂生产生物有机肥料的方法,其特征在于按如下的步骤进行：
本发明还公开了一种腐熟基质，其特征在于它是由所述腐熟菌剂发酵农村生活垃圾和污泥而成，所述的发酵物料的重量份数如下：农村生活垃圾占40～60份、污泥占20～40份和玉米秸秆占5～15份。
本发明进一步公开了腐熟基质的生产方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）原料和配方：腐熟基质生产原料包括农村生活垃圾、污泥和玉米秸秆三种有机物料。按重量比，农村生活垃圾占40～60份、污泥占20～40份和玉米秸秆占5～15份。将上述原料进行混合，控制水份含量在50～60%。
（2）加入本发明复合菌剂：每5方混合料加入1公斤复合菌剂；
（3）堆置规格：将调节好水并加入了复合菌剂的混合料堆成长梯形，堆顶宽1米，堆底宽2米，堆高夏秋季0.8～1米、冬春季1.2～1.4米，堆长根据场地而定，每堆体积不少于5方；
（4）翻堆时间的控制：当20～30厘米深处物料温度升至55℃时保持三天，然后翻捣一次，当堆温再次升至55℃后，保持三天，然后翻捣一次，之后根据堆温情况进行翻捣，
（5）翻堆要求：翻垛过程中要做到调、匀、碎；调就是把垛中原来上层部分调到地表成为下层部分，而下层部分调到表层变为上层部分，以达到充分发酵的目的；匀就是对垛中原料混合还不均匀的部分，再次进行混匀工作；碎就是对在发酵过程中形成的块状发酵物进行破碎工作；
（6）目标菌的加入：在发酵开始降温时候，加入胶胨样芽孢杆菌单菌株菌剂，每方物料加入量为1kg。
（7）发酵终点控制：堆温与室外温度相同、水分降至30%以下时，即完成了腐熟基质的整个发酵生产过程，整个周期通常为15～20天，冬天时间25～30天；
（8）发酵质量控制：发酵完成后进行粉碎、过筛、检测、称量和包装，腐熟基质生产完成，有机质达到45%～55%，N、P、K总养分5%，有效活菌数＞0.2×108个/g，粪大肠菌群数呈阴性，蛔虫卵死亡率100%。
本发明进一步公开了腐熟基质在蔬菜抗病增产效果方面的应用。腐熟基质应用于黄瓜种植中亩增产11%，亩增收859元。
本发明提供的腐熟菌剂能快速腐熟农村生活垃圾和污泥，具有良好的除臭性能，进而产出高品质的可抗病的腐熟基质，该基质能显著增加土壤有机质及磷、钾等营养元素的含量，提高养分转化率及产品中有益微生物数量，促进土壤修复，培肥地力，可减少化肥使用量，同时增强作物的抗病性，改善作物品质，减少投入，提高产量，促进增收。
附图说明：
图1为生产腐熟基质的工艺流程图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
以下菌株均获自中国农业微生物菌种保藏管理中心 (Agricultural CultureCollection of China ，简称ACCC)：
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）：ACCC保藏编号为11089，简称ACCC11089；
细黄链霉菌（Streptomyces microflavus）：ACCC保藏编号为40027，简称ACCC40027；
长柄木霉（Trichoderma longbrachiatum）：ACCC保藏编号为30150，简称ACCC30150；
黑曲霉（Aspergillus nige）：ACCC保藏编号为30171，简称ACCC30171；
胶胨样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）：ACCC保藏编号为10013，简称ACCC10013。
实施例1：
培养基和菌种的准备
一、培养基的制备
1、马铃薯、葡萄糖琼脂培养基（PDA）
取去皮的马铃薯200克，切成小块，加水1000ml煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000ml，加葡萄糖20克，琼脂15克，溶化后分装，15磅灭菌30分钟，pH自然，配制液体培养基时不加琼脂。
2、营养肉汁琼脂
由蛋白胨5g、氯化钠5g、牛肉膏3g和蒸馏水1000ml组成。pH7.0（固体培养基加入琼脂15-20g）。
3、高氏合成1号培养基
KNO3 1g， K2HPO4 0.5g， NaCl 0.5g，FeSO47H2O 0.01g，MgSO47H2O 0.5g可溶性淀粉20g，pH7.2～7.4，蒸馏水1000ml。
4、钾细菌培养基
酵母膏 0.4g、甘露醇 10.0g、K2HPO4 0.5g、MgSO47H2O 0.2g、FeCl3 0.005g、CaCO3 1.0g、蒸馏水1000.0ml、pH7.0—7.2，配制固体培养基时加15克琼脂。
5、固体发酵培养基
麦麸80g，豆粕10g，(NH4)2SO4 1.0g，KH2PO4 0.2g，MgSO4·7H200.05g,80mL蒸馏水。
二、菌种的活化
枯草芽孢杆菌菌接种在营养肉汁琼脂培养基上；长柄木霉和黑曲霉接种在PDA培养基上；细黄链霉菌接种在高氏合成1号培养基上；胶胨样芽孢杆菌接种在钾细菌培养基上
将枯草芽孢杆菌、细黄链霉菌、长柄木霉、黑曲霉和胶胨样芽孢杆菌分别进行斜面转接，接入相应斜面培养基，活化培养3-7天。
三、单菌种制备
1、枯草芽孢杆菌的培养和发酵
斜面培养基和摇瓶培养基都为营养肉汁琼脂，配制固体培养基时加15克琼脂，种子罐和发酵罐培养基为1000kg水、8.75kg大豆的豆浆、6.5kg的淀粉、1kg葡萄糖，CaCO3100g，FeCl310g，pH7.0，经121℃实罐灭菌30分钟后，在28℃～30℃培养24～36小时，当每ml发酵液中菌数达到10×108个/g。然后按分别重量比3份的发酵液吸附于1份的蛭石上常温晾干即得到枯草芽孢杆菌单菌株菌剂。
2、胶胨样芽孢杆菌的培养和发酵
斜面培养基和摇瓶培养基都为钾细菌培养基，种子罐和发酵罐培养基为1000kg水、8.75kg大豆的豆浆、6.5kg的淀粉、1kg葡萄糖，CaCO3100g，FeCl310g，pH7.0，经121℃实罐灭菌30分钟后，在28℃～30℃培养48小时，当每ml发酵液中菌数达到5×108个/g。然后按分别重量比3份的发酵液吸附于1份的蛭石上常温晾干即得到胶胨样芽孢杆菌单菌株菌剂。
3、长柄木霉和黑曲霉的培养和发酵
斜面和摇瓶培养基为马铃薯、葡萄糖琼脂培养基，斜面培养基加琼脂。把液体培养基经灭菌后分装于500ml三角瓶中，接入各真菌斜面菌种，摇床速度180r/min，28℃～30℃培养48小时，当摇瓶内出现密度大，菌丝球明显不浑浊即可。种子罐和发酵罐中发酵培养基为1000kg水、8.75kg大豆的豆浆、6.5kg的淀粉、1kg葡萄糖及2kg土豆的蒸煮液，pH7.0，经121℃实罐灭菌30分钟后，在28℃～30℃培养48小时，当发酵液出现密度大的菌丝球后，接种到固体发酵培养基上，接种量10%，121℃，0.1MPa高压灭菌30min，25℃固体发酵培养48h，孢子数均达6×108个/g。
4、细黄链霉菌的培养和发酵
斜面和摇瓶培养基为高氏合成1号培养基，斜面培养基加琼脂。把液体培养基经灭菌后分装于500ml三角瓶中，接入各真菌斜面菌种，摇床速度180r/min，28℃～30℃培养5～7天，当摇瓶内出现密度大，菌丝球明显不浑浊即可。种子罐和发酵罐中发酵培养基为1000kg水、8.75kg大豆的豆浆、6.5kg的淀粉、1kg葡萄糖及2kg土豆的蒸煮液，pH7.0，经121℃实罐灭菌30分钟后，在28℃～30℃培养48小时，当发酵液出现密度大的菌丝球后，接种到固体发酵培养基上，接种量10%，121℃，0.1MPa高压灭菌30min，25℃固体发酵培养5～7天，孢子数达6×108个/g。
四、腐熟菌剂（以下用复合菌剂表示）的制备
按上述方法制取的枯草芽孢杆菌、细黄链霉菌、长柄木霉、黑曲霉和胶胨样芽孢杆菌单菌种重量比为0.5～2:0.5～2: 0.5～2:0.5～2: 0.5～2。混合拌匀后制得复合菌剂，复合菌剂有效活菌数达到5×108个/g。
实施例2：
复合菌剂组成
一种农村生活垃圾和污泥腐熟菌剂，配制如下（按重量份数）：
表1 农村生活垃圾和污泥腐熟菌剂的组成
名称 枯草芽孢杆菌 细黄链霉菌 长柄木霉 黑曲霉 胶胨样芽孢杆菌
（1） 0.5 2.0 1.0 1.5 2.0
（2） 1.0 1.5 2.0 1.0 1.5
（3） 1.5 1.0 1.5 0.5 1.0
（4） 2.0 0.5 0.5 2.0 0.5
其中有效活菌数为5×108个/g；
实施例3：
菌株间的相互拮抗实验
将活化后的枯草芽孢杆菌、细黄链霉菌、长柄木霉、黑曲霉和胶胨样芽孢杆菌进行菌株间的相互拮抗实验，两两组合，共分成20种组合方式，每个组合三个重复。
采用钢圈法进行抑菌试验，将菌株在相应培养基中培养3-7天（190r/min，28℃）制成发酵液。取其中一种菌（A）的发酵液0.1mL涂于PDA平板上，然后在每个平板的固体培养基上摆放两个事先灭菌的钢圈，再在每个钢圈中加入0.25mL的A菌之外任何一种菌（B）的发酵液，每个处理重复三次，以只接A菌的平皿为对照。28℃培养并定期观察抑菌情况，结果见表2。
表2 菌种间的拮抗效果
枯草芽孢杆菌 细黄链霉菌 长柄木霉 黑曲霉 胶胨样芽孢杆菌
枯草芽孢杆菌 - - - -
细黄链霉菌 - - - -
长柄木霉 - - - -
黑曲霉 - - - -
胶胨样芽孢杆菌 - - - -
注： “—”表示拮抗反应阴性，“+”表示拮抗反应阳性
试验结果表明枯草芽孢杆菌、细黄链霉菌、长柄木霉、黑曲霉和胶胨样芽孢杆菌5种菌之间无抑制作用，拮抗反应均为阴性。
实施例4：
单个菌株与复合菌剂的纤维素、蛋白质和淀粉分解能力的测定
一、纤维素酶活性测定方法
1、试剂和溶液
底物溶液：准确称取0.625 g羧甲基纤维素钠盐，溶于100.0 mL磷酸钠缓冲液(0.2M，pH 6.0），加热搅拌使之溶解。
DNS显色剂：称取10.0 g 3,5-二硝基水杨酸溶于蒸馏水中，加入20.0 g 氢氧化钠、200.0 g 酒石酸钾钠和500.0 ml水，加热溶解后再加入重蒸酚2.0 g、无水亚硫酸钠0.5g待全部溶解后冷却，定溶至1000.0 mL。
2、仪器设备
分光光度计，电子天平，振荡器培养箱。
3、标准曲线绘制
标准葡萄糖溶液：用蒸馏水溶解25.0mg葡萄糖定容至25.0mL。
取5支带有20.0 ml刻度的试管，按上表量取试剂。每管中各加1.0 ml 2.0 M氢氧化钠溶液和2.0 ml DNS显色液，摇匀后置于沸水浴中准确加热5.0 min后，流水冷却，蒸馏水定容至20.0 ml，摇匀后于490 nm处测定各管的OD值，以葡萄糖的μg数为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。
表3 标准曲线绘制表
试管号 标准葡萄糖溶液（ml） 磷酸钠缓冲液(0.2M pH 6.0)（ml） 试管中葡萄糖量（μg）
1 0 5 0
2 0.4 4.6 400
3 0.7 4.2 800
4 1.6 3.4 1600
5 3.2 1.8 3200
4、原样酶液
称取5.0g样品用蒸馏水稀释10倍，充分振荡，静止30min，过滤，其滤液即为原样酶液。
5、测定步骤
取3支带有20.0ml刻度的试管，1支作为空白对照，其余2支作为平行样品管。样品管中加1.0ml原样酶液，然后3支试管中分别加入4.0ml已预热至60℃的底物溶液，在60℃的水浴锅中反应20min取出，每管立即加入1.0ml的2.0M氢氧化钠溶液和2.0ml DNS显色液，摇匀后在对照管中再加入1.0ml原样酶液。将3支试管放入沸水浴中，显色5min后立即取出，流水冷却，定溶至20.0ml，用分光光度计于490nm处测其OD值。
6、纤维素酶活力计算:
根据标准曲线换算成葡萄糖μg数，U=（M1-M0）/20
式中：U：样品的酶活力（μg/min）； M0：对照葡萄糖量（μg）
M1：分解后样品重量（μg）； 20：酶与底物反应时间（min）
1ml原样酶液，每分钟产生1μg葡萄糖定义为1个酶活力单位（u）。
二、蛋白酶酶活测定方法
1、试剂：按照QB/T 1803中的规定。
2、原样酶液的制备
称取样品10.0g（或10.0ml），加入装有玻璃珠的三角瓶（150ml）中，再加入一定体积的磷酸缓冲液（pH7.5）溶解，200 r/min摇床振荡30min，然后四层纱布过滤，滤液再于3000r/min离心20min。离心后的上清液根据酶活力用缓冲液（pH7.5）稀释至适当浓度，供测试用。
3、测定步骤：其它按照QB/T1803的规定只是在具体测定中有两处改变：一是反应时间（加入酪素后）由10min改为30min；二是原静止过滤改为离心5min过滤。
三、淀粉酶酶活测定方法
1、试剂
按照QB/T 1803中的规定。
2、原样酶液的制备
称取样品10.0g（或10.0mL），加入装有玻璃珠的三角瓶（150mL）中，再加入一定体积的磷酸缓冲液溶解，200转/min摇床振荡30min，然后四层纱布过滤，滤液再于3000转/min离心20min。离心后的上清液根据酶活力用缓冲液稀释至适当浓度，供测试用。
3、标准曲线的绘制
可溶性淀粉标准溶液，按下表配置。
表4 标准曲线绘制表
分别取上述溶液各1.0mL（须做平行试验），加入到5mL稀碘液中，摇匀，于660nm测定吸光度,以不含可溶性淀粉的0管为空白对照。以吸光度为纵坐标，可溶性淀粉的浓度为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）。
根据作图或用回归方程，计算出吸光度为1时可溶性淀粉的量（mg），即为吸光常数K值，其值应在0.95~1.00范围内。
4、参照QB/T 1803-1993的方法进行测定。
在具体测定中以下三个方面略有变动：一是吸取2%可溶性淀粉溶液20.0mL改为1%可溶性淀粉溶液10.0mL；二是原磷酸盐缓冲液由10.0mL改为5.0mL；三是反应时间由5min变为30min。
5 、计算
X= ( 4.76-A×K )×21×n/30
试中：X：样品的酶活力，u/g(mL)；
4.76：1mL反应液中最初含有的可溶性淀粉的量（mg）；
A：样品平行试验的平均吸光度；K：吸光常数；
21：反应液的总体积，mL； n ：稀释倍数；30：反应时间，30min。
1g（mL）样品，于60℃、pH=6.0条件下，1分钟液化1mg可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以u/g(mL)表示。
四、酶活性测定结果
将制备好枯草芽孢杆菌、细黄链霉菌、长柄木霉、黑曲霉、胶胨样芽孢杆菌和复合菌剂按上述方法进行纤维素酶、淀粉酶活性和蛋白酶活性的测定，测定结果见下表。
表5 酶活性情况
处理 纤维素酶活性(u/ml) 蛋白酶活性(u/ml ) 淀粉酶活性(u/ mL)
枯草芽孢杆菌 68.00 47.20 18.90
细黄链霉菌 12.51 - 21.21
长柄木霉 95.08 15.74 12.53
黑曲霉 54.34 18.23 37.23
胶胨样芽孢杆菌 15.64 8.94 -
复合菌剂 60.08 21.37 18.63
检测结果表明，由枯草芽孢杆菌、细黄链霉菌、长柄木霉、黑曲霉、胶胨样芽孢杆菌5种菌株组成的复合菌剂具有很强的纤维素、蛋白质和淀粉分解能力，高于有机物料腐熟剂国家标准规定的纤维素酶活性30(u/ml)、蛋白酶活性15(u/ml)和淀粉酶活性10(u/ml)的要求，复合菌剂可以作为含蛋白、纤维和淀粉丰富的农村生活垃圾和污泥的腐熟剂进行使用。
实施例5：
单个菌株与复合菌剂的发酵除臭能力测定
一、所用试剂和发酵基质
1、硫酸溶液：硫酸0.005mol，用蒸馏水定容至1L。
2、淀粉指示液：1g淀粉加蒸馏水10ml，注入200ml煮沸的蒸馏水中，微沸2min。
3、溴甲酚绿乙醇溶液：0.10g溴甲酚绿，用乙醇定容至100ml。
4、甲基红-溴甲酚绿指示剂：3体积的0.1%溴甲酚绿乙醇溶液与1体积的0.2%甲基红乙醇溶液混合。
5、乙酸锌溶液：称取50g乙酸锌溶于少量蒸馏水中，加入2滴冰醋酸，搅动至溶液变清亮，加入2滴乙醇，用蒸馏水定容至1L。
6、甲基红乙醇溶液配制：0.20g甲基红，用乙醇定容至100ml。
7、硼酸溶液：20.41g硼酸和1000ml蒸馏水。
8、碘标准溶液：13g碘与35g碘化钾溶于100mL蒸馏水中，用蒸馏水定容至1000mL，摇匀存于棕色瓶中。
9、硫代硫酸钠溶液：13g五水硫代硫酸钠与0.5g碳酸钠，用蒸馏水定容至1L，缓慢煮沸10min，盛于棕色瓶中。
10、盐酸（1+1）溶液：将1体积水和1体积37%盐酸。
11、发酵除臭基质：由干鸡粪 60g、秸秆粉10g和水组成，含水量为50%。
二、测定方法
堆肥产生的臭气的主要成分是氨气和硫化氢，对人畜的危害很大，实施例中主要采用氨气检测、硫化氢检测和感官检测对微生物菌剂的除臭能力进行评价。
1、氨气检测方法
用2%硼酸溶液吸收气体中的氨气，然后用0.005mol/L硫酸溶液滴定，滴定时先滴加甲基红-溴甲酚绿混合指示剂5-6滴于吸收了氨气的硼酸溶液中，再用0.005mol/L硫酸溶液滴定直至变粉红色即到终点，根据硫酸溶液的用量（体积）计算氨气含量。
反应方程式为：(1)NH3+H3BO3→NH4H2BO3；(2)NH4H2BO3+H2SO4→(NH4)2SO4+2H3BO3。
氨气的物质的量的计算公式：n1=0.005*（V1-V01）*10-3；n1—氨气的物质的量（mol），0.005—硫酸的物质的量浓度（mol/L），V1—试液滴定时硫酸溶液的用量（ml），V01—空白滴定时硫酸溶液的用量（ml）。
2、硫化氢检测方法
碘量法是用醋酸锌吸收原料气中的硫化氢，在微酸性溶液中加过量碘标准滴定溶液把S2-氧化成单质S，剩余的碘用硫代硫酸钠溶液滴定，根据硫代硫酸钠溶液消耗量，计算硫化氢含量；将5mL碘标准溶液、5mL盐酸（1+1）溶液加入吸收了硫化氢的50g/L醋酸锌溶液中，密闭反应5分钟，用0.05mol/L硫代硫酸钠溶液滴定，近终点时滴加0.5%淀粉指示剂，至变为无色，记录所用的硫代硫酸钠溶液的体积，即可计算出硫化氢的含量。
碘量法滴定的反应式：（1）H2S+Zn2+→ZnS↓+2H+；(2)ZnS+I2→Zn2++2I-+S↓；(3)I2+2S2O3 2-→2I-+S4O6 2-。
硫化氢的物质的量的计算公式：n2=[0.5-0.05*（V02-V2）/2]*10-3；n2—硫化氢的物质的量（mol），0.5—标准碘液的物质的量（mol），0.05—硫代硫酸钠溶液的物质的量浓度（mol/L），V02—空白滴定时硫代硫酸钠溶液的用量（ml），V2—试液滴定时硫代硫酸钠溶液的用量（ml）。
3、实验方法
将活化后的枯草芽孢杆菌、细黄链霉菌、长柄木霉、黑曲霉和胶胨样芽孢杆菌分别用液体培养基培养2天，得到各个菌株的菌液。
将各个菌株的菌液和复合菌剂分别进行如下实验：将菌液接在发酵除臭基质内，于500mL烧杯中混匀（每份发酵除臭基质接种10mL菌液），作为实验样本，设置发酵除臭基质作为对照样本，各样本用牛皮纸及一层塑料纸封口。每个样本（六种实验样本和一种对照样本）设置三个平行处理，每个平行处理设置三个重复，结果取三个重复的平均值。在第一个平行中放置内盛20mL的2%硼酸溶液的小烧杯用以吸收发酵过程中产生的氨气，第7天用酸滴定法测定；在第二个平行中放置内盛20mL的50g/L乙酸锌溶液用以吸收发酵过程中产生的硫化氢，第7天用碘量法测定；第三个平行，第7天进行感官测定。
4、实验结果：结果见表5。
表6 发酵除臭能力
处理 臭气等级 氨气含量（10-3mol） 硫化氢含量（10-3mol）
枯草芽孢杆菌 + 0.00260 0.32321
细黄链霉菌 + 0.00250 0.32509
长柄木霉 +++ 0.00325 0.43461
黑曲霉 ++ 0.00310 0.40063
胶胨样芽孢杆菌 ++ 0.00310 0.40098
复合菌剂 + 0.00222 0.30653
对照 ++++ 0.00713 0.65432
注： “+”的多少表示感官测定臭气等级，“+”越多表示感官测定越臭。
结合感官检测和氨气和硫化氢含量的检测结果表明，由枯草芽孢杆菌、细黄链霉菌、长柄木霉、黑曲霉和胶胨样芽孢杆菌组成的复合菌剂除臭效果明显好于单个菌株和对照。
实施例6：
单个菌株与复合菌剂的抗病能力测定
采用钢圈法进行抑菌试验，将活化后的枯草芽孢杆菌、细黄链霉菌、长柄木霉、黑曲霉、胶胨样芽孢杆菌和复合菌剂分别与黄瓜枯萎病进行抑菌试验，每个组合三个重复。
将各菌株在相应培养基中培养2-3天（190r/min，28℃）制成发酵液，将培养好的黄瓜枯萎病菌制成孢子浓度为106个/mL的菌悬液。取黄瓜枯萎病菌菌悬液0.1mL涂于PDA平板上，然后在每个平板的固体培养基上摆放两个事先灭菌的钢圈，再在每个钢圈中加入0.25mL的上述各菌发酵液和复合菌液，每个处理重复三次，以只接黄瓜枯萎病菌菌悬液的平皿为对照。28℃培养并定期观察抑菌情况。
表7 各菌株与复合菌剂对黄瓜枯萎病的抑菌能力
注： “+”表示拮抗反应阳性，“+”越多表示抑制性越大。“-”表示拮抗反应阳性。
试验结果表明，枯草芽孢杆菌、细黄链霉菌、长柄木霉、黑曲霉、胶胨样芽孢杆菌和复合菌剂对黄瓜枯萎病均有抑菌效果，其中复合菌剂最强。
实施例7：
单个菌株与复合菌剂的增产效果
1、试验地点和种植品种
试验蔬菜为甘蓝。
2、田间设计
共7个处理，每个处理3个重复，常规施肥，小区面积96m2。
处理1: 枯草芽孢杆菌；处理2：细黄链霉菌；处理3：长柄木霉；处理4：黑曲霉；处理5：胶胨样芽孢杆菌；处理6：复合菌剂；处理7：对照。
3、试验结果
表8 各菌株与复合菌剂田间增产效果
处理 小区平均产量(kg) 平均亩产量（kg） 增产（%）
处理1 480 3335 14.3
处理2 482 3349 14.8
处理3 478 3321 13.8
处理4 460 3196 9.5
处理5 490 3404 16.7
处理6 495 3439 17.9
处理7 420 2918 -
试验结果表明，枯草芽孢杆菌、细黄链霉菌、长柄木霉、黑曲霉、胶胨样芽孢杆菌和复合菌剂在甘蓝种植上比对照均有增产效果，其中复合菌剂最佳，比单一菌株好，可以作为菌肥在农田中使用。
实施例8：
复合菌剂的使用方法和效果
一、复合菌剂的使用方法
1、调整好农村生活垃圾和污泥的碳氮比（25～30:1）和水分（55～60%，用手一攥手缝滴水为宜），每5方农村生活垃圾和污泥加入1公斤复合菌剂，翻捣均匀。
2、将预处理好的农村生活垃圾和污泥堆成长梯形，堆顶宽1米，堆底宽2米，堆高夏秋季0.8～1米、冬春季1.2～1.4米，堆长根据场地而定，每堆体积不少于5方。
3、发酵开始后，当物料温度（20～30厘米深处）升至55℃时保持三天，然后翻捣一次。若发酵初期温度不上升，则调整水分至推荐比例并每天翻捣一次直至堆温上升。
4、当堆温再次升至55℃后，保持三天，然后翻捣一次；
5、之后根据堆温情况进行翻捣，温度上升时期不翻捣，温度停止上升则翻捣，并重复这一步骤，直到堆温与室外温度相同、水分降至30%以下时，即完成了发酵过程，整个发酵周期通常为15～25天。
二、复合菌剂在农村生活垃圾和污泥上的使用效果
1、材料与方法
堆肥原料：可堆腐农村生活垃圾、污泥和玉米秸秆。
设两个处理，加本发明中所述的复合菌剂和未加菌剂的空白对照（CK），每个处理5方原料，露天堆制，每天测定堆温。发酵周期以发酵温度降至室温为止计算所得。
2、结果与分析
复合菌剂对堆肥初期温度及腐熟进程的影响。
表9 堆肥初期温度及完成发酵过程的天数
表9表明，接种复合菌剂的堆肥，第2天温度高于未接菌（对照）的堆肥，并在2天后温度达55℃，而对照的温度至第3天才上升到55℃。复合菌剂完成发酵的时间只需20天，而未接菌的对照需30天。
实施例9：
应用复合菌剂生产所制腐熟基质和田间应用效果
在一定的场地设施条件下，通过加入腐熟菌剂，农村生活垃圾和污泥发生生物降解、化学降解和物理变化，产生CO2、H2O和NH3等气体并释放热量，生成大量可被作物转化吸收利用小分子的无机和有机营养物质，形成稳定的物理结构和状态，得到本发明所述的腐熟料产品腐熟基质。
一、腐熟基质的生产和工艺
1、原料和配方
腐熟基质生产原料包括农村生活垃圾、污泥和玉米秸秆四种有机物料。
2、原料选择
农村生活垃圾为经过分类筛选的可堆腐垃圾，重金属含量合格；污泥为农村污水处理厂所出，重金属含量合格，玉米秸秆为晾干经粉碎后的。
3、原料配比
按重量比称取40～60%的农村生活垃圾、20～40%的污泥、5～15%的玉米秸秆。
表10 腐熟基质生产原料的配比（按重量百分数）
名称 农村生活垃圾（%） 污泥（%） 玉米秸秆（%）
（1） 40 40 10
（2） 45 30 15
（3） 50 30 5
（4） 60 20 15
4、原料的混合
把按重量称取好的农村生活垃圾、污泥和玉米秸秆进行混合。
5、调节水
控制水份含量在50～60%左右。
6、加入本发明复合菌剂
每5方混合料加入1公斤复合菌剂
7、堆置规格
将调节好水并加入了复合菌剂的混合料堆成长梯形，堆顶宽1米，堆底宽2米，堆高夏秋季0.8～1米、冬春季1.2～1.4米，堆长根据场地而定，每堆体积不少于5方。
8、翻堆时间的控制
堆置发酵开始后，若发酵初期温度不上升，如水份不够，则调整水分至推荐比例50～60%，如水份过量，则必须每天翻捣一次，增加垛中氧气含量，促使微生物快速生长，直至堆温上升。当物料温度（20～30厘米深处）升至55℃时保持三天，然后翻捣一次，以利杀死粪肠杆菌和蛔虫卵等有害病原微生物和虫卵。当堆温再次升至55℃后，保持三天，然后翻捣一次。之后根据堆温情况进行翻捣，温度上升时期不翻捣，温度停止上升则翻捣，当温度超过70℃时，需立即进行翻捣，通过降温消除高温对微生物生长的抑制，从而促使大量中温菌的活动，加快堆肥的进程。
9、翻堆要求
翻垛过程中要做到调、匀、碎。调就是把垛中原来上层部分调到地表成为下层部分，而下层部分调到表层变为上层部分，以达到充分发酵的目的；匀就是对垛中原料混合还不均匀的部分，再次进行混匀工作；碎就是对在发酵过程中形成的块状发酵物进行破碎工作。
10、目标菌的加入
在发酵后期，即发酵开始降温时候，加入胶胨样芽孢杆菌单菌株菌剂，每方物料加入量为1kg。
11、发酵终点控制
堆温与室外温度相同、水分降至30%以下时，外观黑褐色，无臭，即完成了腐熟基质的整个发酵生产过程，整个周期通常为15～20天，冬天时间25～30天。
12、发酵质量控制
发酵完成后进行粉碎、过筛、检测、称量和包装，腐熟基质生产完成，有机质达45%～55%，N、P、K总养分5%，有效活菌数＞0.2×108个/g，粪大肠菌群数呈阴性，蛔虫卵死亡率100%。
由于所述复合菌剂集纤维素分解、蛋白质分解、除臭、抗病和菌肥多种功能于一体，加入混合物料后，有益菌一方面分解农村生活垃圾和污泥形成稳定的生物有机肥，一方面利用农村生活垃圾进行自身扩大繁殖，把自有的抗病和菌肥功能移植于生成的腐熟基质中，使生成的腐熟基质同样具有了抗病和菌肥等多种性能,见工艺流程图。
二、使用方法
作为基肥用每亩施用200～300公斤，翻地前撒施与地表，然后伴随翻地均匀施入土壤内作为基肥使用；沟施时在菜田中开沟撒入肥料，然后移秧或点种，亩用量100公斤左右；点种或移栽时，可采取穴施的方法，可将肥料与细土混匀后放入每穴中，然后再移栽或点种，亩用量5公斤左右。
三、田间应用效果
试验作物为黄瓜，试验设计：设两个处理：1、常规施肥+腐熟基质，2、常规施肥（对照）；三次重复，顺序排列。
1、收获期的影响
5月12日第一次摘瓜，较对照早摘瓜3天，而且瓜条长、顺直，商品率高，同时使用腐熟基质的处理黄瓜生育期延长7天。
2、 对节药和产量的影响
处理1喷药5次，使用烟剂2次，对照区喷药7次，使用烟剂2次。整个生育期对照区采摘5011公斤/亩黄瓜，处理1共采摘5564公斤/亩黄瓜，增产553公斤，增产幅度11%，处理1节药200ml；按市场平均价格计算，增收1659元；节约肥料1790元，节约农药30元；但是示范区多用料1500元，雇工多支出1120元。整体效益计算示范区效益比对照高出859元/亩。
表11不同菌剂对黄瓜效益的影响
产量（kg） 增产幅度 增收（元/亩） 节药（mL）
对照 5011 - - -
处理1 5564 - - -
增加 553 11% 859 200

Claims (2)

1.一种腐熟基质的生产方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）原料和配方：农村生活垃圾占40～60份、污泥占20～40份和玉米秸秆占5～15份，将上述原料进行混合，控制水分含量在50～60%；
（2）加入复合菌剂：每5方混合料加入1公斤复合菌剂，所述复合菌剂的活性成分包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、细黄链霉菌（Streptomyces microflavus）、长柄木霉（Trichoderma longbrachiatum）、黑曲霉（Aspergillus niger）和胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus），它是由下述重量份数的各单菌株发酵物组成：枯草芽孢杆菌0.5～2份、细黄链霉菌0.5-2份、长柄木霉 0.5～2份、黑曲霉0.5～2份和胶冻样芽孢杆菌0.5～2份；复合菌剂有效活菌数达到5×108个/g；
（3）堆置规格：将调节好水并加入了复合菌剂的混合料堆成长梯形，堆顶宽1米，堆底宽2米，堆高夏秋季0.8～1米、冬春季1.2～1.4米，堆长根据场地而定，每堆体积不少于5方；
（4）翻堆时间的控制：当20～30厘米深处物料温度升至55℃时保持三天，然后翻捣一次，当堆温再次升至55℃后，保持三天，然后翻捣一次，之后根据堆温情况进行翻捣；
（5）翻堆要求：翻垛过程中要做到调、匀、碎；调就是把垛中原来上层部分调到地表成为下层部分，而下层部分调到表层变为上层部分，以达到充分发酵的目的；匀就是对垛中原料混合还不均匀的部分，再次进行混匀工作；碎就是对在发酵过程中形成的块状发酵物进行破碎工作；
（6）目标菌的加入：在发酵开始降温时候，加入胶冻样芽孢杆菌单菌株菌剂，每方物料加入量为1kg；
（7）发酵终点控制：堆温与室外温度相同、水份降至30%以下时，即完成了腐熟基质的整个发酵生产过程，整个周期为15～20天，冬天时间25～30天；
（8）发酵质量控制：发酵完成后进行粉碎、过筛、检测、称量和包装，腐熟基质生产完成，有机质达到45%～55%，N、P、K总养分5%，有效活菌数＞0.2×108个/g，粪大肠菌群数呈阴性，蛔虫卵死亡率100%；
所述的枯草芽孢杆菌为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC 11089的菌株;
所述的细黄链霉菌为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC 40027的菌株；
所述的长柄木霉为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC 30150的菌株；
所述的黑曲霉为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC 30171的菌株；
所述的胶胨样芽孢杆菌为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC 10013的菌株。
2.采用权利要求1所述方法制备的腐熟基质在抑制黄瓜枯萎病方面的应用。
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