发明内容
本发明公开了如下式I或式II化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物:
本发明的式I和式II化合物对M3毒蕈碱性受体具有高效的拮抗活性,尤其令人惊喜的是,与噻托溴铵、阿地溴铵和格隆溴铵相比,本发明的式I和式II化合物作为吸入型COPD治疗药物具有更适中的血浆稳定性,因而,在确保药物疗效强度的同时,可降低药物全身循环所带来的副作用风险,并有望实现每天给药一次。
本发明还公开了式I或式II化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物在制备预防或治疗慢性阻塞性肺疾病、支气管炎、支气管反应过度、咳嗽、鼻炎、哮喘、膀胱过度活动症、尿频、尿急、尿失禁、慢性膀胱炎、神经源性或不稳定性膀胱、膀胱痉挛、过敏性倡导综合症、痉挛性结肠炎、憩室炎或消化性溃疡的药物中的用途。
本发明的式I和式II化合物可参照如下反应式制备:
具体包括以下步骤:
式I化合物的制备:
(1)以2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯为原料,在碱性条件下与3R-3-羟基-1-甲基吡咯烷发生酯交换,得到式III化合物,采用的碱性试剂选自甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钠、钠氢、钠、叔丁醇钾等,优选钠氢、钠、叔丁醇钾;采用的溶剂选自甲苯、正己烷、N,N-二甲基甲酰胺,优选甲苯;采用的反应时间为1~10小时,优选1~3小时;采用的温度为50~150℃,优选70~130℃。
(2)溴甲烷与式III化合物反应制得式I化合物,采用的溶剂为丁酮、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、丙酮、***、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、异丙醇中的一种溶剂或者一种以上的混合溶剂,溶剂优选丁酮、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷中的一种溶剂或者一种以上的混合溶剂;采用的反应时间为1~120小时,优选1~60小时;采用的温度为-20~40℃,优选-5~30℃。
式II化合物的制备:
(1)以2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯为原料,在碱性条件下与3S-3-羟基-1-甲基吡咯烷发生酯交换,得到式IV化合物,采用的碱性试剂选自甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钠、钠氢、钠、叔丁醇钾等,优选钠氢、钠、叔丁醇钾;采用的溶剂选自甲苯、正己烷、N,N-二甲基甲酰胺,优选甲苯;采用的反应时间为1~1小时,优选1~3小时;采用的温度为50~150℃,优选70~130℃。
(2)溴甲烷与式IV化合物反应制得式II化合物,采用的溶剂为丁酮、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、丙酮、***、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、异丙醇中的一种溶剂或者一种以上的混合溶剂,溶剂优选丁酮、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷中的一种溶剂或者一种以上的混合溶剂;采用的反应时间为1~120小时,优选1~60小时;采用的温度为-20~40℃,优选-5~30℃。
本发明的式I或式II化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物具有高效的M3毒蕈碱性受体拮抗活性,更为重要的是,本发明的式I和式II化合物比噻托溴铵、阿地溴铵和格隆溴铵具有更适中的血浆稳定性,因而可在确保药物疗效强度的同时,降低药物全身循环所带来的副作用,并允许每天给药一次。
本发明的式I或式II化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物可用于制备预防或治疗呼吸***疾病、泌尿***疾病或肠胃道疾病的药物。所述呼吸***疾病包括慢性阻塞性肺疾病、支气管炎、支气管反应过度、咳嗽、鼻炎或哮喘。所述泌尿***疾病包括膀胱过度活动症、尿频、尿急、尿失禁、慢性膀胱炎、神经源性或不稳定性膀胱或膀胱痉挛。所述肠胃道疾病包括过敏性肠道综合症、痉挛性结肠炎、憩室炎或消化性溃疡。
本发明的式I或式II化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物可以单独给药,或与其他具有可以有效治疗此类疾病的药物联用,如与β2受体激动剂、固醇类、抗过敏药物、磷酸二酯酶4抑制剂和/或白三烯D4(LTD4)拮抗剂同时、独立或序贯联合给药,用于预防和治疗呼吸***疾病。
本发明还提供了一种预防或治疗所述的呼吸***疾病、泌尿***疾病或肠胃道疾病的药物组合物,所述药物组合物中含有治疗有效量的本发明的式I或式II化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物作为活性成份和药学上可接受的载体。所述药物组合物可以是吸入气雾剂、吸入粉雾剂、普通片剂、缓释片剂、控释片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、糖浆剂、口服液或注射剂。
本发明的药物组合物中,所述式I或式II化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物的剂量随症状和年龄等不同而不同。对成人而言,在以吸入气雾剂或吸入粉雾剂给药时,一次给药量的下限是0.001mg,上限是50mg;在口服或静脉给药时,一次给药量的下限是0.001mg,上限是100mg。也可根据疾病程度的不同和剂型的不同而偏离此剂量范围。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中,以下所述的实施例是为了更好的阐述本发明,而不是用来限制本发明的范围。
实施例1
3R-1-甲基-3-(2-羟基-2,2-二噻吩-2-基乙酰氧基)吡咯烷
将2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯(1.0g,3.9mmol)溶解于25mL无水甲苯中,加入3R-3-羟基-1-甲基吡咯烷(465mg,4.6mmol),升温到120℃,分3批加入钠氢(85mg,2.1mmol),反应2h。将反应液用2N盐酸萃取3遍,合并水层并用少量乙酸乙酯洗涤,用固体碳酸钠调节水层至碱性(到无气泡放出),水层用乙酸乙酯萃取三遍,合并有机层,有机层分别用1N氢氧化钠溶液和饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,蒸干溶剂,得到黄色固体(450mg,35%),熔点:107℃~109℃,[α]D 25=-7.5(c=0.42,MeOH);1H NMR(DMSO,500MHz)δ7.47(m,2H),7.26(s,1H),7.10(m,2H),7.05(m,2H),5.18(m,1H),2.63(n,2H),2.52(m,1H),2.26(m,1H),2.18(s,3H),2.176(m,1H),1.69(m,1H);m/z:324.1[M+1]+.
实施例2
3R-1,1-二甲基-3-(2-羟基-2,2-二噻吩-2-基乙酰氧基)吡咯烷溴化物(式I化合物)
将3R-1-甲基-3-(2-羟基-2,2-二噻吩-2-基乙酰氧基)吡咯烷(100mg,0.31mmol)溶于0.4mL丁酮中,冰浴下滴加溴甲烷(58.8mg,0.62mmol),缓慢升温到室温,反应过夜。减压蒸除低沸点物质,残余物经硅胶柱层析(二氯甲烷-甲醇,40:1)纯化得到灰白色固体(98mg,75%),[α]D 20=-7(c=0.1,MeOH);1H NMR(DMSO,500MHz)δ7.51(m,2H),7.48(s,1H),7.13(m,2H),7.00(m,2H),5.52(m,1H),3.93(m,1H),3.73(m,2H),3.63(m,1H),3.20(s,3H),3.03(s,3H),2.74(m,1H),2.16(m,1H);13C NMR(DMSO,125MHz)δ170.33,146.63,126.69,126.24,125.75,125.70,76.24,73.85,69.09,63.94,52.66,51.91,29.74;m/z:338.1[M-Br]+;HRMS for C16H20NO3S2Br-Br calcd338.0885,found338.0888.
实施例3
3S-1-甲基-3-(2-羟基-2,2-二噻吩-2-基乙酰氧基)吡咯烷
将2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯(0.5g,1.9mmol)溶于13mL无水甲苯中,加入3S-3-羟基-1-甲基吡咯烷(233mg,2.3mmol),升温到120℃,分3批加入钠氢(33mg,0.8mmol),反应2h。将反应液用2N盐酸萃取3遍,合并水层并用少量乙酸乙酯洗涤,用固体碳酸钠调节水层至碱性(到无气泡放出),水层用乙酸乙酯萃取三遍,合并有机层,有机层分别用1N氢氧化钠溶液和饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,蒸干溶剂,得到黄色固体(217mg,34%),熔点:107℃~109℃,[α]D 25=+7.7(c=0.42,MeOH);1H NMR(DMSO,500MHz)δ7.47(m,2H),7.26(s,1H),7.10(m,2H),7.05(m,2H),5.18(m,1H),2.63(m,2H),2.52(m,1H),2.26(m,1H),2.18(s,3H),2.176(m,1H),1.69(m,1H);m/z:324.1[M+1]+.
实施例4
3S-1,1-二甲基-3-(2-羟基-2,2-二噻吩-2-基乙酰氧基)吡咯烷溴化物(式II化合物)
将3S-1-甲基-3-(2-羟基-2,2-二噻吩-2-基乙酰氧基)吡咯烷(100mg,0.31mmol)溶于0.4mL丁酮中,冰浴下滴加溴甲烷(58.8mg,0.62mmol),缓慢升温到室温,反应过夜。减压蒸除低沸点物质,残余物经硅胶柱层析(二氯甲烷-甲醇,40:1)纯化得到灰白色固体(119mg,91%),[α]D 20=5(c=0.1,MeOH);1H NMR(DMSO,500MHz)δ7.52(m,2H),7.46(s,1H),7.13(m,2H),7.01(m,2H),5.52(m,1H),3.86(m,1H),3.70(m,2H),3.53(m,1H),3.16(s,3H),3.01(s,3H),2.73(m,1H),2.17(m,1H);13C NMR(DMSO,125MHz)δ170.31,146.62,126.67,126.23,125.73,76.23,73.83,69.09,63.94,52.66,51.92,29.72;m/z:338.1[M-Br]+;HRMS for C16H20NO3S2Br-Brcalcd338.0885,found338.0888.
实施例5
受试化合物对M3毒蕈碱性受体的拮抗活性和亲合力测试
1.实验目的:测定化合物对M3毒蕈碱性受体的拮抗活性和亲合力(通过与同位素标记的阳性化合物[3H]NMS竞争)。
2.实验材料:本发明化合物用结合缓冲液溶解为20mM,并立即应用与检测。其它材料:a)[3H]NMS:82Ci/mmol,珀金埃尔默;b)阿托品,Sigma-Aldrich;c)表达人M3毒蕈碱性受体的膜制剂,金斯瑞;d)UniFilter-96GF/C过滤板,珀金埃尔默;e)结合缓冲液:50mMTris-HCl,5mM MgCl2,pH7.4,4℃过滤并保存;f)洗涤缓冲液:50mM Tris-HCl,pH7.4,4℃过滤并保存。
检测仪器:微孔板闪烁发光计数仪,珀金埃尔默
3.实验步骤:
3.1试验操作步骤:
(1)微孔板预PEI处理:a)Unifilter96孔板GF/C使用前每孔用100uL0.5%聚亚乙基亚胺(用超纯水溶解)在4℃浸泡30-60分钟以减少滤膜降解。b)用微孔多头抽真空装置(8-15mmHg)抽滤,用冷的孵育缓冲液(4-8℃)洗板,2ml/well,抽滤。
(2)结合:根据方案,在96孔反应板上配置反应体系。25℃孵育2小时,摇床速度500转/分。
(3)过滤:不需要的孔用顶盖密封A(透明的)封住顶部。用枪把样品快速转移到96孔板,真空抽去液体(5~10mm Hg)留下配体/受体结合复合物。
(4)漂洗:用冰的洗涤缓冲液洗孔,3mL/孔。
(5)封底:用吸水纸小心吸去板下方悬液,在通风橱风干30分钟;用干净的底水封(非透明)把底部封紧。
(6)每孔加20uL闪烁液MicroScint20。
(7)在样品板上方用顶盖密封A封好
(8)在微孔板闪烁发光计数仪上检测1分钟的计数值(CPM)。
3.2试验条件:
3.3数据分析:采用绘制医学图表软件第四版进行数据处理。计算公式为%置换=100×(1-(样品CPM/总结和CPM))
4.实验结果:见表1。
表1、受试化合物对M3受体的拮抗活性和亲合力
活性测试结果显示,式I化合物和式II化合物均具有高效的M3毒蕈碱性受体拮抗活性,其中,式I化合物的活性强于噻托溴铵和格隆溴铵,式II化合物的活性与噻托溴铵和格隆溴相当。
实施例6
受试化合物对M3毒蕈碱性受体的拮抗作用的功能性实验
1.实验目的:通过功能性试验测定化合物对M3毒蕈碱性受体的拮抗活性(通过检测钙流的变化,对M3受体有作用的化合物会引起过量稳定表达M3受体的CHO-k1细胞内钙离子浓度的变化)。
2.实验材料:a)表达人M3毒蕈碱性受体的膜制剂,金斯瑞;b)Calcium4assay kit钙流试剂盒,美国分子仪器公司;c)卡巴胆碱,金斯瑞;d)DAU5884盐酸盐,Tocris Bioscience。
3.实验步骤:
3.1试验操作步骤:提前18小时将20uL CHO-k1细胞膜制剂置于384孔板(37℃/5%CO2),浓度为15000cell/well。加入20uL染色缓冲液。将受试化合物溶解于DMSO中,用HBSS缓冲液配置为受试浓度(测试浓度最高10μM,10倍稀释,8个浓度,双复孔),将10uL5×测试浓度的样品加入384孔板。以DAU5884盐酸盐为对照品。37℃孵育1小时,室温孵育15分钟。读取FLIPR时,在20秒加入卡巴胆碱,于之后的100秒内读取信号。
3.2数据分析:采用ScreenWorks(3.1版)和GraphPad Prism5进行数据处理。
4.实验结果:见表2。
表2、受试化合物对M3受体拮抗作用的功能性试验结果
功能性试验测试结果显示,式I化合物和式II化合物均具有高效的M3毒蕈碱性受体拮抗活性,其中,式I化合物的活性显著强于阿地溴铵和格隆溴铵,式II化合物的活性与阿地溴铵和格隆溴铵相当。
实施例7
受试化合物在人血浆中的稳定性实验
1.实验目的:采用LC-MS/MS法考察受试物在人血浆中的稳定性。
2.实验材料:a)受试物;b)甲醇和乙腈(Burdick&Jackson公司);c)甲酸(J&K公司);d)甲苯磺丁脲(Tolbutamide,Sigma公司);d)华法林(Warfarin,Sigma公司;e)去离子水,由密理博纯水仪制得。
3.仪器设备:a)液相色谱仪(岛津公司LC),包括溶液输送泵(LC-20AD)、在线脱气仪(DGU-20A3)、自动进样器(SIL-20AC)、控制器(CBM-20A)、柱温箱(CTO-20A);b)质谱仪(APl4000,美国应用生物***公司),配备电喷雾离子源(ESI)、串联四极杆质量分析器、Analyst数据处理***(软件版本号1.5.1);c)其他仪器:微型旋涡混合器(XW-80A,上海沪西分析仪器厂有限公司);离心机(TGL-16B,上海安亭科学仪器厂);微量分析天平(XP26,梅特勒-托利多仪器上海有限公司);微孔过滤超纯水仪;水浴锅。
4.实验操作
4.1实验步骤:在37℃下,将1μM的受试物样品溶液分别加入标准人血浆中,在0,5,10,15,30,45,60min下各自取双份50μL样品至离心管中,立即加入3倍体积含内标的冰乙腈溶液终止反应。然后16000rpm离心5分钟沉淀蛋白后,取100μL上清液至自动进样小瓶中进行LC-MS/MS分析,检测样品中受试药物的剩余比例。
4.2液相条件
色谱柱:Agilent Zorbax SB-CN3.5μ(100mm×2.10nn)
流动相:0.1%甲酸水溶液(A相)和0.1%甲酸乙腈溶液(B相)
梯度:
时间(min) |
A(%) |
B(%) |
0.01 |
80 |
20 |
0.4 |
25 |
75 |
1.00 |
25 |
75 |
1.01 |
80 |
20 |
3.00 |
80 |
20 |
流速:500μL/min
柱温:常温
进校量:5μL或3μL
5.实验结果:在37℃条件下,式I化合物、式II化合物、阿地溴铵、噻托溴铵和格隆溴铵在人血浆中的稳定性结果如下表3所示。图3-7为各化合物对应的稳定性曲线。
表3、37℃条件下受试化合物在人血浆中的稳定性(药物剩余率)
6.结论:在37℃条件下,噻托溴铵和格隆溴铵在人血浆中的稳定性非常强,60分钟时药物在血浆中的剩余率均高于90%,这将导致药物在全身循环时间较长,从而带来潜在的毒副作用。而阿地溴铵在人血浆中的稳定性非常差,T1/2仅为2.52min,这应该是该药需要每天给药两次的主要原因,从而导致给药不方便和患者的依从性较差。相对而言,式I化合物和式II化合物在人血浆中的稳定性非常适中,T1/2分别为9.34min和19.25min,从而有望在保证药物疗效强度的同时,减少药物全身循环所带来的副作用,并允许每天给药一次。
实施例8
药用组合物的制备:吸入气雾剂
将3R-1,1-二甲基-3-(2-羟基-2,2-二噻吩-2-基乙酰氧基)吡咯烷溴化物(式I化合物,0.5g)溶于22g乙醇中,制备活性成分的浓缩液。将该浓缩液加入到合适的罐装设备中,将活性成分浓缩液分装到气雾剂容器中,向所述容器顶端空间冲入氮气或HFC-134A蒸汽(所冲入成分不得含有超过1ppm氧),用阀密封。将115Ghfc-134A抛射器加压充入所述密封的容器中。
实施例9
药用组合物的制备:吸入气雾剂
将3R-1,1-二甲基-3-(2-羟基-2,2-二噻吩-2-基乙酰氧基)吡咯烷溴化物(式I化合物,0.5g)溶于22g乙醇中,制备活性成分的浓缩液。将该浓缩液加入到合适的罐装设备中,将活性成分浓缩液分装到气雾剂容器中,向所述容器顶端空间冲入氮气或HFC-134A蒸汽(所冲入成分不得含有超过1ppm氧),用阀密封。将115Ghfc-134A抛射器加压充入所述密封的容器中。
实施例10
药用组合物的制备:片剂
将3R-1,1-二甲基-3-(2-羟基-2,2-二噻吩-2-基乙酰氧基)吡咯烷溴化物(式I化合物,1g)与23g乳糖和5.7g微晶纤维素用混合机混合。用滚轴压紧机将所得混合物压制成型,值得薄片状压制物料。用锤式粉碎机将所述薄片状压制物料研磨成粉,使所得粉状物料通过20目筛过筛。将一份0.3g轻质二氧化硅和0.3g硬脂酸镁加入到已过筛的物料中,并混合。所得混合产物用制片机压片。
实施例11
药用组合物的制备:片剂
将3R-1,1-二甲基-3-(2-羟基-2,2-二噻吩-2-基乙酰氧基)吡咯烷溴化物(式I化合物,1g)与23g乳糖和5.7g微晶纤维素用混合机混合。用滚轴压紧机将所得混合物压制成型,值得薄片状压制物料。用锤式粉碎机将所述薄片状压制物料研磨成粉,使所得粉状物料通过20目筛过筛。将一份0.3g轻质二氧化硅和0.3g硬脂酸镁加入到已过筛的物料中,并混合。所得混合产物用制片机压片。