CN103954772A - 一种猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒抗体的三联金标检测试纸条 - Google Patents

一种猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒抗体的三联金标检测试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒抗体的三联金标检测试纸条，其包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述金标垫上喷射有金标CSFV反应原性多肽、金标PRRSV反应原性多肽、金标猪PRV反应原性多肽；所述硝酸纤维素膜上设有三条检测线和一条质控线，所述三条检测线上分别固定有CSFV反应原性多肽、PRRSV反应原性多肽、PRV反应原性多肽，所述质检线上固定有CSFV抗体、PRRSV抗体和PRV抗体。本发明的试纸条具有多联、特异、敏感，使用简便、快速等优点，可为我国生猪养殖基层提供高效、实用的抗体检测技术与产品，为生猪疫病的防疫监督提供有效的技术支撑。

Description

一种猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒抗体的三联金标检测试纸条
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种利用多肽抗原制备的猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒抗体的三联金标检测试纸条。
背景技术
近年来危害我国养猪业的主要疫病有猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟和伪狂犬病、***和圆环等，其中蓝耳病危害最为严重。美国、欧洲养猪业发达国家普遍采用疫病净化战略，针对一些重要疫病如猪***、猪瘟、伪狂犬等已停止使用疫苗，严格检疫、监测和净化的措施予以防控。我国因为现有基础条件和疫病形势的原因，目前尚不能完全照搬国外疫病净化的策略，疫苗免疫与疫病监控依然是我国生猪疫病防控最为有效的措施之一。
由于国内疫苗种类繁多，质量参差不齐，免疫流程与技术人员操作各不相同，因此，疫苗免疫后抗体效价与免疫效果的监测就显得极为重要，各类抗体水平的监测急需免疫检测技术与产品的支持。我国目前常用的免疫学检测方法有ELISA技术与乳胶凝集技术，然而ELISA技术需耗时2-3个小时，对操作人员有较高的技术要求，不太适应我国基层推广。乳胶凝集则敏感性较低。免疫胶体金层析技术因兼有ELISA与乳胶凝集技术的优点，既比ELISA快速（仅需5-10分钟），又比乳胶凝集敏感（接近ELISA, 可达ng/mL水平），成为国内外动物疫病及抗体水平监测技术研究的热点之一。
猪瘟，是由猪瘟病毒（CSFV）引起的一种急性、热性和高度接触的病毒性传染病，该病以流行广、发病率和死亡率高为特征，给养猪业带来惨重损失。该病被国际动物法规列入A类16种传染病之一，被我国动物卫生法规列为一类传染病。
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的猪的一种繁殖障碍与呼吸***传染病。猪是此病的唯一天然宿主。该病以接触性、高度传染性、高发病率，慢性和高死亡率为特征。病猪生长十分缓慢，甚至停滞生长，严重影响养猪业的经济效益，因此对该病及时做出诊断有利于降低经济损失。
伪狂犬病是由伪狂犬病毒（PRV）引起的多种家畜、野生动物的一种以发热、脑脊髓炎为主的急性传染病。猪是本病的主要宿主和带毒者。通常引起妊娠母猪流产、产木乃伊胎、死胎和弱仔；初生仔猪出现神经症状，感染率和病死率可达100%。伪狂犬病(PR)一旦传入猪群，将导致巨大的经济损失，且很难根除。
目前，酶联免疫吸附试验（ELISA）在上述几种病的诊断中已得到普遍应用，ELISA虽然灵敏度比较高，甚至可以区分野毒感染和疫苗免疫接种产生的抗体,但操作需要专门的技术人员和分析仪器,不适合基层的使用，因此，适用于现场使用的快速诊断与检测试剂如胶体金试纸条、核酸分子检测技术如实时荧光定量PCR技术，以及对一些多病原检测的试剂如核酸检测生物芯片等的研制与开发也很受关注。胶体金试纸卡应用简单、快速、直观，不需要配备专门的仪器以及技术人员，适于基本养殖场的检测需求，节省人力、物力成本。而目前猪病抗体的检测模式多是养殖场采集血清样本然后送到专门的检测单位通过ELISA方法进行检测，从样本送检到报告结果一般需要3-4天有时甚至更多的时间，不利于降低检测成本及提高检测速度。
就胶体金试纸条研发方面而言，目前文献报道的多是针对病原检测的单联、多联试纸卡以及各猪病抗体检测的单联试纸卡，尚无同时检测CSFV、PRRSV、PRV三种疾病抗体的胶体金检测试纸卡，且已有的检测用金标抗原多是利用表达蛋白或是全病毒抗原，利用多肽作为金标抗原的也尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于一种猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒抗体的三联金标检测试纸条。
本发明所采取的技术方案是：
一种猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒抗体的三联金标检测试纸条，包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述金标垫上喷射有金标猪瘟病毒反应原性多肽、金标猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、金标猪伪狂犬病毒反应原性多肽；所述硝酸纤维素膜上设有三条检测线和一条质控线，所述三条检测线上分别固定有猪瘟病毒反应原性多肽、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、猪伪狂犬病毒反应原性多肽，所述质检线上固定有猪瘟病毒抗体、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒抗体和猪伪狂犬病毒抗体。
作为优选的，所述猪瘟病毒反应原性多肽选自以下任一条：
SEQ ID NO.1：c-HKVRNEVMVHWFDDE；
SEQ ID NO.2：GLSTAENALLVALFGYV；
SEQ ID NO.3：CTAVSPTTLRTE；
SEQ ID NO.4：KYNTTLLNGSA-c。
作为优选的，所述猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽选自以下任一条：
SEQ ID NO.5：c-GFMVPPGLSSEGHLT；
SEQ ID NO.6：KTKSVKSLPGNKPVP-c。
作为优选的，所述猪伪狂犬病毒反应原性多肽选自以下任一条：
SEQ ID NO.7：VALALLLLALAAA；
SEQ ID NO.8：YYKNVIVTTYWSGSTYA；
SEQ ID NO.9：LAIGLLYLAGLYAAFLAYR；
SEQ ID NO.10：LLAALLAALYARTTL。
作为优选的，所述金标垫上喷涂的金标猪瘟病毒反应原性多肽、金标猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、金标猪伪狂犬病毒反应原性多肽分别为猪瘟病毒反应原性多肽-生物素-链霉亲和素-胶体金颗粒复合物、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽-生物素-链霉亲和素-胶体金颗粒复合物、伪狂犬病毒反应原性多肽-生物素-链霉亲和素-胶体金颗粒复合物。
作为优选的，硝酸纤维素膜检测线上固定的猪瘟病毒反应原性多肽、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、猪伪狂犬病毒反应原性多肽先与非蛋白多聚体偶联，得到多聚体偶联反应原性多肽，再进一步将多聚体偶联反应原性多肽固定到检测线上。
所述非蛋白多聚体具有可偶联基体，可偶联基团为氨基（-NH2），羧基 (-COOH)，巯基（-SH）中的至少一种。
在这一步的操作中，我们可通过对非蛋白载体的选择，对多肽、非蛋白载体、偶联剂的反应顺序的控制，将多肽序列抗原表位中非抗原决定簇位点的一端定向偶联到非蛋白载体上，形成一个具有方向性的多肽抗原复合物，从而大大提高多肽捕获抗体的能力。
所述多聚体偶联反应原性多肽的制备方法如下：
1）选取反应原性多肽溶解，得到反应原性多肽溶液；
2）取非蛋白多聚体溶解，得到非蛋白多聚体溶液；
3）在反应原性多肽溶液或非蛋白多聚体溶液中加入偶联剂，混合均匀；
4）将反应原性多肽溶液与非蛋白多聚体溶液混合均匀，搅拌反应，使反应原性多肽偶联到非蛋白多聚体上；
5）用透析袋去除未参与结合的偶联剂及游离多肽，纯化，冻干，得到多聚体偶联反应原性多肽。
所述非蛋白多聚体为聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(poly(lactide-co-glycolide)，PLGA)、聚苯乙烯磺酸钠(poly(styrene sulfonate)，PSS)、壳聚糖、葡聚糖硫酸钠、海藻糖中的任一种。
所述偶联剂为EDC 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、乙烯基三乙氧基硅烷、1，5-戊二醛（Glutaraldehyde）中的任一种。
一种猪瘟、猪蓝耳、伪狂犬病毒抗体三联金标检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1）合成猪瘟病毒反应原性多肽、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、猪伪狂犬病毒反应原性多肽；
2）包被膜制备：将硝酸纤维素膜粘到PVC板上，用划膜喷金机将CSFV、PRRSV、PRV抗体的混合溶液喷涂到硝酸纤维素膜上，形成质检线；将与非蛋白多聚体偶联的猪瘟病毒反应原性多肽、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、猪伪狂犬病毒反应原性多肽分别喷涂到硝酸纤维素膜上，形成三条检测线，干燥后保存备用；
3）金标垫制备：用胶体金颗粒标记链霉亲和素，然后与生物素化的猪瘟病毒反应原性多肽、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、猪伪狂犬病毒反应原性多肽结合形成金标结合物，用金子稀释液稀释浓缩的金标结合物到10%～20%，再用划膜喷金机定量喷涂到玻璃纤维膜上，干燥保存备用；
4）样品垫制备：用样品处理液均匀处理玻璃纤维膜，干燥保存备用；
5）组装：金标垫与吸水纸分别紧密连接于硝酸纤维素膜的两端，然后将样品垫紧密连接于金标结合垫上组装成大板，再进一步切割成试纸条。
本发明的有益效果是：
本发明采用筛选到的猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒反应原性多肽作为金标抗原，并将该特异性的反应原性多肽偶联到非蛋白多聚体上，形成一个具有方向性的多肽抗原复合物，以该抗原复合物包被在试纸条的T线上，用于检测相应的抗体。由于该抗原复合物上的多肽具有方向性，因此其捕获抗体的能力大大提高，以此为基础研制的胶体金试纸条敏感性亦可得到显著提高。
本发明的试纸条具有多联、特异、敏感，使用简便、快速等优点，可为我国生猪养殖基层提供高效、实用的抗体检测技术与产品，为生猪疫病的防疫监督提供有效的技术支撑。
附图说明
图1为本发明三联金标检测试纸条的结构示意图；
图2为抗体结构示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1一种猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、伪狂犬病毒（PRV）抗体的三联金标检测试纸条
一、反应原性多肽的筛选
利用生物软件对多肽序列进行对比，分析其抗原性，筛选得到如下特异性多肽抗原，送由生物公司进行合成。
猪瘟病毒特异性反应原性多肽：
SEQ ID NO.1：c-HKVRNEVMVHWFDDE（Cys His Lys Val Arg Asn Glu Val Met Val His Trp Phe Asp Asp Glu）
SEQ ID NO.2：GLSTAENALLVALFGYV（Gly Leu Ser Thr Ala Glu Asn Leu Leu Val Ala Leu Phe Gly Tyr Val）
SEQ ID NO.3：CTAVSPTTLRTE（Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu）
SEQ ID NO.4：KYNTTLLNGSA-c（Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Cys）
猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒特异性反应原性多肽：
SEQ ID NO.5：c-GFMVPPGLSSEGHLT  （Cys- Gly Phe Met Val Pro Pro Gly Leu Ser Ser Gly His Leu Thr）
SEQ ID NO.6：KTKSVKSLPGNKPVP-c （Lys Thr Lys Ser Val Lys Ser Leu Pro Gly Asn Lys Pro Val Pro- Cys）
猪伪狂犬病毒特异性反应原性多肽：
SEQ ID NO.7：VALALLLLALAAA（Val Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala）
SEQ ID NO.8：YYKNVIVTTYWSGSTYA（Tyr Tyr Lys Asn Val Ile Val Thr Thr Tyr Trp Ser Gly Ser Thr Tyr Asn）
SEQ ID NO.9：LAIGLLYLAGLYAAFLAYR（Leu Ala Ile Gly Leu Leu Tyr Leu Ala Ala Phe Leu Ala Tyr Arg）
SEQ ID NO.10：LLAALLAALYARTTL（Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Leu Tyr Ala Arg Thr Thr Leu）
二、样品垫的制备
用25mL样品处理液均匀处理25×30cm玻璃纤维膜，20%-30%湿度的环境下干燥180min，密封干燥保存，备用。所述样品处理液为1.9-5.7g硼砂，8.67-11.15g 硼酸，10-20gBSA，5.0-20gPVP，10-20ml TritonX-100溶于800mL双蒸水中，混匀后用双蒸水定容至1000mL。
三、金标垫的制备
1、生物素化多肽的制备
取SEQ ID NO.1～10所示的反应原性多肽5mg于1.5mL EP管中，加入10μL DMSO预溶，然后加1mL灭菌PBS溶解，待用。称取10mg生物素（Biotin）溶于200μL 灭菌蒸馏水中，混匀溶解。将溶解后的Biotin 200μL加入到1mL CSFV/PRRSV/PRV多肽溶液中，室温震荡混匀3h，然后将偶联后的多肽抗原装于透析袋（MW：4000-6000）中PBS透析，每隔4h换液1次，换液3次，最后一次4℃透析过夜，得到反应原性多肽-生物素复合物。
2、胶体金的制备
取10 mL/L氯金酸1 mL加超纯水至100 mL，所得氯金酸溶液浓度为0.1 mL/L，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热搅拌下快速加入10 g/L柠檬酸三钠水溶液2.8 mL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色，无沉淀和漂浮物。胶体金颗粒经紫外分光光度计测其520nm处吸收峰，得到的颗粒直径约为21-25 nm左右，冷却后置于棕色瓶中，4℃冰箱保存。
3、反应原性多肽-生物素-链霉亲和素-胶体金颗粒复合物的合成
（1）链霉亲合素（SA）与胶体金（G）结合最佳pH的筛选
取1.0mL胶体金，加入到1.5mL的离心管中，用0.2M  K2CO3溶液调节胶体金的PH值为7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6，混匀。在每个离心管中分别加入20μg的SA，混匀，室温反应15min。在每个离心管中分别加入40μL的25%BSA，混匀，室温反应5min。在高速冷冻离心机上，以8000rpm/min离心20min，去上清，用金标复溶液溶解沉淀物，观察溶液的颜色，结果如表1所示，当溶液颜色稳定显示为红色时的pH值为最佳pH值，因此选择链霉亲合素（SA）与胶体金结合的最佳pH值为8.2。
表1链霉亲合素(SA)与胶体金结合最佳pH选择
（2）链霉亲合素（SA）与胶体金（G）结合最佳标记量的确定
取1.0mL胶体金，加入到1.5mL的离心管中，用0.2M  K2CO3溶液调节胶体金的pH值为7.4，混匀。在每个离心管中分别加入0、5.0、10、15、20、25、30、35、40μg的SA，混匀，室温反应30min。30分钟后，在每个离心管内分别加入0.lmL10%NaCL后，混匀静止2小时以上观察结果。未加SA及加入量不足以稳定胶体金的离心管，即呈现出红变黑（紫）的聚沉现象，而SA加入量达到或超过最低稳定量的试管则胶体金的红颜色不变，其中含SA用量最低的离心管对应值为稳定1.0 mL胶体金的必需链霉亲合素量。结果如表2所示：链霉亲合素SA与胶体金结合最佳标记量为30μg/mL时，颜色稳定显示红色不变，因此选取的最佳标记量为30μg/mL。
表2链霉亲合素(SA)与胶体金结合最佳标记量的确定
（3）反应原性多肽-生物素-链霉亲和素-胶体金颗粒复合物的合成
取1.0mL胶体金，加入到1.5mL的离心管中，用0.2M K2CO3溶液调节胶体金的pH值为8.2；混匀。在离心管中加入30μg SA，混匀，室温反应15min。在离心管中加入40μL的25%BSA，混匀，室温反应5min。在离心管中加入10μg反应原性多肽-生物素复合物，混匀，室温反应5min。在高速冷冻离心机上，以8000rpm/min离心20min，去上清，用金标复溶液溶解沉淀物，4℃保存备用。所述金标复溶液为1.9-5.7g硼砂，8.67-11.15g 硼酸，10-20gBSA，10-20g蔗糖溶于800mL双蒸水中，混匀后用双蒸水定容至1000mL。
（4）金标垫的制备
将制备得到的CSFV反应原性多肽-生物素-链霉亲和素-胶体金复合物、PRRSV反应原性多肽-生物素-链霉亲和素-胶体金复合物、PRV反应原性多肽-生物素-链霉亲和素-胶体金复合物用划膜喷金机按5μL/cm定量喷涂到玻璃纤维膜上，37℃恒温干燥60min，密封干燥保存，备用。
四、包被膜的制备
1、CSFV、PRRSV、PRV反应原性多肽的偶联
分别称取 10 mg 的CSFV、PRRSV、PRV反应原性多肽，加50μL DMSO预溶，然后加入10 mL灭菌双蒸水中，室温震荡，混匀溶解；称取0.5- 5 mg多糖多聚体，所采用的多糖多聚体为聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(poly(lactide-co-glycolide)，PLGA)（此外，所述多糖多聚体还可以为聚苯乙烯磺酸钠(poly(styrene sulfonate)，PSS)、壳聚糖、葡聚糖硫酸钠、明胶中的任一种），加1 mL PBS溶解，在多糖溶液内加5-10 mg 偶联剂EDC（此外，所述偶联剂还可采用乙烯基三乙氧基硅烷或1，5-戊二醛），混匀，最后与多肽溶液混合，室温震荡反应3-5h。使用透析袋（MWCO 10000 -12000）透析6-8 h，去除未参与结合的偶联剂（EDC）及游离多肽，纯化、冻干，制得偶联多肽。
用包被稀释液将上述制备得到的CSFV、PRRSV、PRV偶联多肽稀释成0.3mg/mL-0.7mg/mL，然后用BioJet XYZ3000型点膜仪以0.8μL/cm定量包被到硝酸纤维素膜上，每一种多肽划一条检测线；用包被稀释液将CSFV、PRRSV、PRV混合抗体稀释成0.5 mg/mL，然后用BioJet XYZ3000型点膜仪以0.8μL/cm定量包被到硝酸纤维素膜上，形成质检线。在45℃恒温干燥60分钟，密封保存备用。所述包被稀释液为7.164g磷酸氢二钠，1g海藻糖溶于800mL双蒸水中，混匀后用双蒸水定容至1000mL。所述CSFV、PRRSV、PRV混合抗体是用CSFV、PRRSV、PRV抗原免疫兔子，按常规方法制备纯化的多抗。
五、试纸条的组装
金标垫与吸水纸分别紧密连接于硝酸纤维素膜的两端，然后将样品垫紧密连接于金标垫上组装成大板；用数控切条机将组装好的大板，切割成4mm的试纸条。将试纸条和干燥剂、滴管一起用铝箔袋密封包装，室温保存。
组装得到的金标检测试纸条的结构示意图见图1。
各部分的缩写如下：
猪瘟病毒反应原性多肽：CSFVpt；猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽：PRRSVpt；猪伪狂犬病毒反应原性多肽：PRVpt；生物素：B；链霉亲合素：SA；胶体金颗粒：G；非蛋白多糖多聚体：PLGA；抗体：Ab。
其工作原理如下：
将血清样品滴入样品垫中，在上端吸水纸的吸引力作用下，样品中的PRRSV、CSFV、PRV抗体首先经过金标垫，分别与金标垫上的PRRSVpt -B-SA-G、CSFVpt-B-SA-G和PRVpt -B-SA-G结合；然后经过T1、T2、T3检测线分别被事先包被在NC膜上的PRRSVpt-PLGA、CSFVpt-PLGA、PRVpt-PLGA捕获，形成G-SA-B-pt-Ab-pt-PLGA结合物而产生显色反应（颜色的深浅表示样品中抗体的含量高低）；没有与抗体结合的过量PRRSVpt-B-SA-G、CSFVpt-B-SA-G、PRVpt-B-SA-G胶体金结合物继续前进，经过C线时被C线处包被的PRRSV、CSFV及PRV抗体捕获而产生显色反应。如果样品中不含有抗体，则pt-B-SA-G复合物不能被检测线上的pt-PLGA复合物捕获，不产生显色反应。
图2是抗体结构示意图，抗体分子含有左右两个抗原结合位点，这两部分均可以结合抗原，但是当其中一部分与pt-B-SA-G复合物结合后会产生一定的空间位阻作用，这是因为金标垫的pt-B-SA-G复合物的分子量很大，其与抗体结合后就会影响另一大分子抗原复合物与抗体的结合，，即使得抗体Ab不能同时和金标垫上的两个pt-B-SA-G相结合；而pt-PLGA抗原复合物的分子相对较小，就可以与抗体的另一个位点结合。由于多糖载体有多个空间位点，可以跟大量的多肽分子进行结合，且多肽分子与多糖载体偶联后具有一定的方向性，从而增加了多肽抗原与抗体的结合效率。因此当G-SA-B-pt-Ab经过NC膜时，Ab空置的另一个抗原决定簇容易与NC膜上分子量小的pt-PLGA结合，从而形成检测线。
实施例2  CSFV、PRRSV、PRV抗体三联金标检测试纸条的性能验证
将SEQ ID NO.1-- SEQ ID NO.10分别制备成10种胶体金检测试纸卡。用IDEXX 猪病抗体ELISA 试剂盒检测CSFV、PRRSV、PRV临床血清样本，选取相应阳性样本60份，阴性样本60份，调制成作为判断试纸条灵敏度的标准阴、阳性血清；用ELISA 试剂盒检测确认CSFV、PRRSV、PRV、PCV2（圆环病毒2型）、PPV（细小病毒）、FMDV（***病毒）等的阳性及阴性血清作为检测试纸卡特异性的质控血清，检测SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.10多肽的灵敏度和特异性，根据显色结果判断SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.10多肽的特性。
表3 猪瘟病毒特异性反应原性多肽的灵敏度检验
由检测结果可见：SEQ ID NO.1～4的猪瘟病毒特异性反应原性多肽均有较好的灵敏度和显色梯度。
表4 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒特异性反应原性多肽的灵敏度检验
由检测结果可见：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒特异性反应原性多肽均有较好的灵敏度和显色梯度。
表5 猪伪狂犬病毒特异性反应原性多肽的灵敏度检验
由检测结果可见：SEQ ID NO.7~10的猪伪狂犬病毒特异性反应原性多肽均有较好的灵敏度和显色梯度。
表6  CSFV、PRRSV、PRV多肽的特异性检验
由检测结果可见：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、 SEQ ID NO.9多肽的特异性良好。SEQ ID NO.3对PRV有微弱交叉，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10对CSFV有微弱交叉。
以下实验中针对各个病毒抗体所采用的反应原性多肽序列分别为：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7。
1、灵敏度检验：用IDEXX 猪病抗体ELISA 试剂盒检测CSFV、PRRSV、PRV临床血清样本，选取相应阳性样本60份，阴性样本60份，调制成作为判断试纸条灵敏度的标准阴、阳性血清，根据显色结果，判定区域设为强阳性（+++），阳性（++）、弱阳性（+）、阴性（-）,然后选取ELISA测定为不同区域OD值的临床样本进行对比检测，灵敏度结果见表5。
表7三联试纸条灵敏度检测结果
  由检测结果可见：CSFV、PRRSV、PRV抗体检测试纸条检测抗体的灵敏度与ELISA试剂盒的灵敏度均一致。
2、特异性检验：用ELISA 试剂盒检测确认CSFV、PRRSV、PRV、PCV2（圆环病毒2型）、PPV（细小病毒）、FMDV（***病毒）等的阳性及阴性血清作为检测试纸卡特异性的质控血清，根据显色结果判断试纸条的特异性。结果见表6。由对比结果可知，试纸条特异性良好，与其他疾病阳性血清无交叉反应。
表8 三联试纸卡特异性检测结果
3、重复性检验
    应用ELISA试剂盒检测过CSFV、PRRSV、PRV的3个临床样本，每个样本重复检测5次，对比试纸卡的重复性。结果如表5所示，五次检测的结果一致，说明试纸卡重复性良好。
表9 三联试纸卡的重复性检验
4、试纸条与IDEXX 抗体检测ELISA试剂盒平行检测试验
    收集经过IDEXX 抗体检测试剂盒检测过CSFV、PRRSV、PRV等项目的猪血清样本，应用三联试纸卡进行平行检测，对比二者的符合率。具体结果见表6-8。
表10 CSFV抗体ELISA方法与试纸条平行检测对比结果
表11 PRRSV抗体ELISA方法与试纸条平行检测对比结果
表12 PRV抗体ELISA方法与试纸条平行检测对比结果
   
以上实验数据表明，本发明的试纸条具有多联、特异、敏感，使用简便、快速等优点，可为我国生猪养殖基层提供高效、实用的抗体检测技术与产品，为生猪疫病的防疫监督提供有效的技术支撑。
<110>   广东海大畜牧兽医研究院有限公司
<120>  一种猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒抗体的三联金标
       检测试纸条
<130> 
<160>  10   
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  16
<212>  PRT
<213>  人工序列
<400>  1
Cys His Lys Val Arg Asn Glu Val Met Val His Trp Phe Asp Asp Glu
1               5                   10                  15     
 
 
<210>  2
<211>  17
<212>  PRT
<213>  人工序列
<400>  2
Gly Leu Ser Thr Ala Glu Asn Ala Leu Leu Val Ala Leu Phe Gly Tyr
1               5                   10                  15     
Val
   
 
 
<210>  3
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<400>  3
Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu
1               5                   10         
 
 
<210>  4
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<400>  4
Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Cys
1               5                   10         
 
 
<210>  5
<211>  16
<212>  PRT
<213>  人工序列
<400>  5
Cys Gly Phe Met Val Pro Pro Gly Leu Ser Ser Glu Gly His Leu Thr
1               5                   10                  15     
 
 
<210>  6
<211>  16
<212>  PRT
<213>  人工序列
<400>  6
Lys Thr Lys Ser Val Lys Ser Leu Pro Gly Asn Lys Pro Val Pro Cys
1               5                   10                  15     
 
 
<210>  7
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列
<400>  7
Val Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala
1               5                   10             
 
 
<210>  8
<211>  17
<212>  PRT
<213>  人工序列
<400>  8
Tyr Tyr Lys Asn Val Ile Val Thr Thr Tyr Trp Ser Gly Ser Thr Tyr
1               5                   10                  15     
Ala
   
 
 
<210>  9
<211>  19
<212>  PRT
<213>  人工序列
<400>  9
Leu Ala Ile Gly Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Leu Tyr Ala Ala Phe Leu
1               5                   10                  15     
Ala Tyr Arg
           
 
 
<210>  10
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
<400>  10
Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Leu Tyr Ala Arg Thr Thr Leu
1               5                   10                  15

Claims (10)

1.一种猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒抗体的三联金标检测试纸条，包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，其特征在于：所述金标垫上喷射有金标猪瘟病毒反应原性多肽、金标猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、金标猪伪狂犬病毒反应原性多肽；所述硝酸纤维素膜上设有三条检测线和一条质控线，所述三条检测线上分别固定有猪瘟病毒反应原性多肽、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、猪伪狂犬病毒反应原性多肽，所述质检线上固定有猪瘟病毒抗体、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒抗体和猪伪狂犬病毒抗体。
2.根据权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，所述猪瘟病毒反应原性多肽选自以下任一条：
SEQ ID NO.1：c-HKVRNEVMVHWFDDE；
SEQ ID NO.2：GLSTAENALLVALFGYV；
SEQ ID NO.3：CTAVSPTTLRTE；
SEQ ID NO.4：KYNTTLLNGSA-c。
3.根据权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽选自以下任一条：
SEQ ID NO.5：c-GFMVPPGLSSEGHLT；
SEQ ID NO.6：KTKSVKSLPGNKPVP-c。
4.根据权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，所述猪伪狂犬病毒反应原性多肽选自以下任一条：
SEQ ID NO.7：VALALLLLALAAA；
SEQ ID NO.8：YYKNVIVTTYWSGSTYA；
SEQ ID NO.9：LAIGLLYLAGLYAAFLAYR；
SEQ ID NO.10：LLAALLAALYARTTL。
5.根据权利要求1～4任一项所述的检测试纸条，其特征线在于，金标垫上喷涂的金标猪瘟病毒反应原性多肽、金标猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、金标猪伪狂犬病毒反应原性多肽分别为猪瘟病毒反应原性多肽-生物素-链霉亲和素-胶体金颗粒复合物、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽-生物素-链霉亲和素-胶体金颗粒复合物、伪狂犬病毒反应原性多肽-生物素-链霉亲和素-胶体金颗粒复合物。
6.根据权利要求1～4任一项所述的检测试纸条，其特征在于，硝酸纤维素膜检测线上固定的猪瘟病毒反应原性多肽、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、猪伪狂犬病毒反应原性多肽先与非蛋白多聚体偶联，得到多聚体偶联反应原性多肽，再进一步将多聚体偶联反应原性多肽固定到检测线上。
7.根据权利要求6所述的检测试纸条，其特征在于，所述多聚体偶联反应原性多肽的制备方法如下：
1）选取反应原性多肽溶解，得到反应原性多肽溶液；
2）取非蛋白多聚体溶解，得到非蛋白多聚体溶液；
3）在反应原性多肽溶液或非蛋白多聚体溶液中加入偶联剂，混合均匀；
4）将反应原性多肽溶液与非蛋白多聚体溶液混合均匀，搅拌反应，使反应原性多肽偶联到非蛋白多聚体上；
5）用透析袋去除未参与结合的偶联剂及游离多肽，纯化，冻干，得到多聚体偶联反应原性多肽。
8.根据权利要求7所述的检测试纸条，其特征在于，所述非蛋白多聚体为聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物、聚苯乙烯磺酸钠、壳聚糖、葡聚糖硫酸钠、海藻糖中的任一种。
9.根据权利要求7所述的检测试纸条，其特征在于，所述偶联剂为EDC 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、乙烯基三乙氧基硅烷、1，5-戊二醛中的任一种。
10.一种猪瘟、猪蓝耳、伪狂犬病毒抗体三联金标检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1）合成猪瘟病毒反应原性多肽、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、猪伪狂犬病毒反应原性多肽；
2）包被膜制备：将硝酸纤维素膜粘到PVC板上，用划膜喷金机将CSFV、PRRSV、PRV抗体的混合溶液喷涂到硝酸纤维素膜上，形成质检线；将与非蛋白多聚体偶联的猪瘟病毒反应原性多肽、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、猪伪狂犬病毒反应原性多肽分别喷涂到硝酸纤维素膜上，形成三条检测线，干燥后保存备用；
3）金标垫制备：用胶体金颗粒标记链霉亲和素，然后与生物素化的猪瘟病毒反应原性多肽、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒反应原性多肽、猪伪狂犬病毒反应原性多肽结合形成金标结合物，用金子稀释液稀释浓缩的金标结合物到10%～20%，再用划膜喷金机定量喷涂到玻璃纤维膜上，干燥保存备用；
4）样品垫制备：用样品处理液均匀处理玻璃纤维膜，干燥保存备用；
5）组装：金标垫与吸水纸分别紧密连接于硝酸纤维素膜的两端，然后将样品垫紧密连接于金标结合垫上组装成大板，再进一步切割成试纸条。
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