CN103954771A - 一种低成本捕获/释放及检测生物分子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种低成本捕获/释放及检测生物分子的方法，利用蛋白质相转变方法，将溶菌酶固定到无污染表面，在此基础上，再利用生物分子间的特异性结合原理，进一步固定目标生物分子，实现生物分子的特异性捕获，然后，通过胍溶液清洗基材表面，清洗后的基材表面不仅仍保持着最初的抗污染性能，还能进一步的吸附溶菌酶相转变产物，实现了在生物惰性和生物活性基材之间近100％的可逆转变。本发明操作简单，可直接从血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等中高灵敏度检测目标生物分子，且可实现基材的重复利用，降低了成本，实现了绿色化学。

Description

一种低成本捕获/释放及检测生物分子的方法
技术领域
本发明属于生物分子的检测技术领域，具体涉及一种通过生物活性基材和生物惰性基材之间的可逆转变实现生物分子的低成本、高灵敏度检测的方法。
背景技术
在惰性无机或有机材料表面固定生物分子对于生物医用材料来说具有重要意义。固定细胞、蛋白质、酶甚至DNA片段的生物载体被广泛用于细胞培养基、医用支架、蛋白质芯片、生物传感器和基因芯片之中。而固定了生物分子的基材，在实现目标分析检测之后的循环多次利用，可有效降低成本，实现绿色化学。
首先在基材制备方面，固定生物分子的方法之一就是对表面进行改性，在表面上产生官能团，实现表面功能化。传统的芯片制备工艺，由于惰性基材表面化学结构仅有有限的反应效率，需要对固相载体表面进行特殊、复杂的物理/化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上(如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等)，根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白(存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等)，经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析。很少有人报道条件温和、环境友好且高效的制备方法。如罗伯特·S·马特森等发现了一种制备用于排列生物分子或细胞的基底的方法，方法包括如下步骤：(a)提供带有表面的固体载体；及(b)通过化学等离子体介导的聚合方法在所述表面上沉积聚合涂层，其中所述聚合涂层包括至少一个侧官能团，其能结合所述生物分子或细胞。可见，上述方法需要对基材表面进行复杂的物理/化学处理，这就不利于保持基材本身性质的完整性。
其次，在各种生物应用领域，迫切需要生物分子的可逆结合/释放体系。这样的转变将会有效地引导一个理想的进程，即促进在线净化和低浓度生物分子的富集及进一步检测。此外，智能型的捕获/释放生物分子在诸多其他高科技领域如生物医药、组织工程和信息反馈等也有广泛应用。实际的生物医学方法需要利用生物分子/细胞捕获/释放的可逆体系，这种可逆转变，先分离目标生物分子/细胞，从生物体液中固定并集中到表面，最后将其释放，以便作随后的光谱/荧光检测和细胞膜片/生物膜分离。尽管很多方法是合理且可取的，但要实现捕获和释放完全可逆很具挑战性，因为在传统的智能基材表面上广泛存在非特异性吸附，不易除去非特异性吸附、不能达到生物活性和生物惰性100％的可逆转变。因此，相关设备的优良性能受到了限制。故探索一种新的体系来实现生物分子的可逆捕获/释放，具有重要意义。
再次，为实现绿色化学，充分利用资源和能源，降低成本，除了采用无毒、无害的原料外，还应该减少废物向环境排放；这就提出了一个新问题，即如何实现抗污染基材的重复再利用。它要求二次利用的无污染表面，不仅保持着其原始的抗污染性能，还能进一步在温和条件下固定生物分子，实现基材的多次循环利用。要完全将生物活性表面去活化成惰性表面，由于低的化学反应产率和速度受到了极大的限制，因此不能实现近100％的完全转变。因此要实现生物活性基材表面到生物惰性基材表面的有效转换，同样具有挑战性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有生物分子检测方法中，抗污染基材必须经过复杂、苛刻的物理/化学处理，且检测后的基材无法重复使用的缺点，提供一种成本低廉，抗污染基材处理条件温和，处理后的基材能够特异性捕获目标生物分子，且检测后的基材可重复利用的高灵敏度检测生物分子的方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、制备生物活性基材
以10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液为溶剂，分别配制50mmol/L pH值为7.4的三(2-羧乙基)膦溶液和质量-体积浓度为1～5mg/mL的生物素标记的溶菌酶溶液，然后将配制的两种溶液按体积比为1:1混合均匀，用蛋白质点样仪立即点样到抗污染基材表面，在湿润环境下常温培养1～4小时，然后依次用10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、去离子水清洗，制备成生物活性基材。
2、检测目标生物分子
以10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液为溶剂，配制质量-体积浓度为0.01～1mg/mL的链霉亲和素溶液，然后将其铺展到步骤1制备的生物活性基材表面，在湿润环境下常温培养1～4小时，然后依次用10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、去离子水清洗，在基材表面固定生物素标记的目标生物分子的抗体或抗原，用此抗体或抗原检测待测样品中的目标生物分子。
3、基材重复利用
将步骤2中检测完后的基材在3～6mol/L的胍水溶液浸泡1～2分钟，取出，用去离子水清洗，自然晾干，按照步骤1的方法重新制备成生物活性基材，重复使用。
上述的制备生物活性基材步骤1中，优选以10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液为溶剂，分别配制50mmol/L pH值为7.4的三(2-羧乙基)膦溶液和质量-体积浓度为2mg/mL的生物素标记的溶菌酶溶液，然后将配制的两种溶液按体积比为1:1混合均匀，用蛋白质点样仪立即点样到抗污染基材表面，在湿润环境下常温培养2小时，然后依次用10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、去离子水清洗，制备成生物活性基材。
上述的检测目标生物分子步骤2中，所述的链霉亲和素溶液的质量-体积浓度优选0.1～0.5mg/mL。
上述的基材重复利用步骤3中，所述的胍水溶液的浓度优选3mol/L。
本发明的有益效果是：
1、本发明不对抗污染背景做任何活化和钝化处理，直接采用简易温和且环境友好的方法快速将生物分子固定在抗污染基材表面，操作简单，制备效率高，且所用原料无毒、来源广泛。
2、本发明可直接从血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等中高灵敏度检测目标生物分子，如肿瘤标志物、癌细胞，且检测完后的基材经胍溶液清洗即可实现在生物惰性和生物活性基材之间近100％的可逆转变，实现了基材的循环多次利用，降低了成本，收集的洗液还可以作后续的光谱/荧光检测和细胞膜片/生物膜分离。
附图说明
图1是检测血清中不同浓度甲胎蛋白的荧光照片。
图2是检测缓冲液中不同浓度绿色荧光蛋白的荧光照片。
图3是检测缓冲液和血清中不同浓度菁类染料Cy-5标记的链霉亲和素的荧光光谱图。
图4是不同基材的浊度柱状图。
图5是实施例1中重新制备的生物活性基材固定异硫氰酸荧光素标记的链霉亲和素的荧光照片。
图6是图5中的基材经胍溶液清洗后的荧光照片。
图7是图6中的基材固定异硫氰酸荧光素标记的链霉亲和素的荧光照片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、制备生物活性基材
将聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯加入甲醇与蒸馏水的体积比为1:1的混合液中，配制成质量-体积浓度为0.01g/mL聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯溶液，然后将其旋涂在干净的玻璃表面，自然条件下晾干，得到抗污染基材。以10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液为溶剂，分别配制50mmol/L pH值为7.4的三(2-羧乙基)膦溶液和质量-体积浓度为2mg/mL的生物素标记的溶菌酶溶液，然后将配制的两种溶液按体积比为1:1混合均匀，用蛋白质点样仪立即点样到得到的抗污染基材表面，在湿润环境下常温培养2小时，然后依次用10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、去离子水各清洗2次，每次15分钟，制备成生物活性基材。
2、检测血清中的甲胎蛋白
以10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液为溶剂，分别配制质量-体积浓度为0.1mg/mL的链霉亲和素溶液、0.2mg/mL生物素标记的甲胎蛋白抗体溶液、0.01mg/mL异硫氰酸荧光素标记的甲胎蛋白抗体溶液。将质量-体积浓度为0.1mg/mL的链霉亲和素溶液铺展到步骤1制备的生物活性基材表面，在湿润环境下常温培养2小时，依次用10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、去离子水各清洗2次，每次15分钟，然后将质量-体积浓度为0.2mg/mL的生物素标记的甲胎蛋白抗体溶液铺展到基材表面，在湿润环境下常温培养2小时，依次用10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、去离子水各清洗2次，每次15分钟，再将质量-体积浓度为10μg/mL甲胎蛋白的血清铺展到基材表面，在湿润环境下常温培养2小时，依次用10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、去离子水各清洗2次，每次15分钟，最后将质量-体积浓度为0.01mg/mL异硫氰酸荧光素标记的甲胎蛋白抗体溶液铺展到基材表面，在湿润环境下常温培养2小时，依次用10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、去离子水各清洗2次，每次15分钟，采用生物芯片扫描仪检测荧光信号。
3、基材重复利用
将步骤2中检测完后的基材在3mol/L的胍水溶液浸泡1分钟，取出，用去离子水清洗，自然晾干，按照步骤1的方法重新制备成生物活性基材，重复使用。
实施例2
在实施例1的步骤2中，以10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液为溶剂，分别配制质量-体积浓度为0.01mg/mL的链霉亲和素溶液、0.01mg/mL生物素标记的绿色荧光蛋白抗体溶液，10μg/mL绿色荧光蛋白溶液，将质量-体积浓度为0.01mg/mL的链霉亲和素溶液铺展到步骤1制备的生物活性基材表面，在湿润环境下常温培养2小时，依次用10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、去离子水各清洗2次，每次15分钟，然后将质量-体积浓度为0.01mg/mL生物素标记的绿色荧光蛋白抗体溶液铺展到基材表面，在湿润环境下常温培养2小时，依次用10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、去离子水各清洗2次，每次15分钟，再将含质量-体积浓度为10μg/mL绿色荧光蛋白溶液铺展到基材表面，在湿润环境下常温培养2小时，依次用10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、去离子水各清洗2次，每次15分钟，采用倒置荧光显微镜检测荧光信号。其他步骤与实施例1相同。
为了证明本发明的有益效果，发明人进行了大量的实验室研究试验，具体试验情况如下：
1、特异性捕获/释放试验
采用实施例1的方法对含不同浓度甲胎蛋白的血清进行检测，同时以血清作为空白对照，用生物芯片扫描仪检测荧光信号，试验结果见图1。由图1可见，血清中不含甲胎蛋白(即空白)时，未检测到荧光信号，血清中甲胎蛋白的浓度为10ng/mL时，出现微弱的荧光信号，血清中甲胎蛋白的浓度为100ng/mL以上时，荧光信号明显增强，说明本实施例方法能够特异性捕获血清中的甲胎蛋白，实现甲胎蛋白的高灵敏度检测，检出限为1～10ng/mL。
采用实施例1的方法对含不同浓度的绿色荧光蛋白的缓冲液进行检测，同时以缓冲液作为空白对照，用倒置荧光显微镜检测荧光信号，试验结果见图2。由图2可见，缓冲液中不含绿色荧光蛋白(即空白)时，未检测到荧光信号，缓冲液中绿色荧光蛋白的浓度为0.1μg/mL时，出现微弱的荧光信号，缓冲液中绿色荧光蛋白的浓度为10μg/mL时，荧光信号明显增强，说明本实施例方法可捕获缓冲液中的绿色荧光蛋白，实现绿色荧光蛋白的高灵敏度检测，检出限为0.1μg/mL。
采用实施例1的方法对缓冲液和血清中含有不同浓度菁类染料Cy-5标记的链霉亲和素溶液进行检测后，用3mol/L的胍水溶液清洗基材，然后采用荧光光谱仪对清洗液进行测试，测试结果见图3。由图3可见，缓冲液或血清中菁类染料Cy-5标记的链霉亲和素的浓度为10ng/mL时，出现微弱的荧光信号，缓冲液或血清中菁类染料Cy-5标记的链霉亲和素的浓度为100ng/mL时，荧光信号明显增强，说明本实施例方法可捕获/释放缓冲液或血清中的菁类染料Cy-5标记的链霉亲和素，实现菁类染料Cy-5标记的链霉亲和素的高灵敏度检测，检出限为1～10ng/mL。
2、浊度测试
发明人采用紫外分光光度计对实施例1中的抗污染基材、检测完后的基材以及检测完用胍溶液清洗后的基材分别进行浊度测试，结果见图3，图中1～6依次是抗污染基材、检测完后的基材以及检测完后用胍溶液清洗15秒、30秒、45秒、60秒的浊度。
由图4可见，检测完后基材表面的浊度较原抗污染基材明显增大，而用胍溶液清洗60秒后，基材表面的浊度基本恢复至与原抗污染基材相同，说明采用胍溶液可以将基材表面快速清洗干净，清洗后的基材可重复使用。
3、接触角测试
采用视频接触角测量仪对实施例1中的抗污染基材及检测完用胍溶液清洗60秒后的基材进行接触角测试，实验结果显示，抗污染基材表面的接触角为67±2°，检测完用胍溶液清洗60秒后的基材表面接触角为68±2°，说明基材表面性质不变，进一步证明基材可重复使用。
4、基材重复利用试验
将实施例1步骤3中用胍溶液清洗后的基材按照实施例1步骤1的方法进行处理，然后将质量-体积浓度为0.01mg/mL异硫氰酸荧光素标记的链霉亲和素溶液铺展到处理后的基材表面，在湿润环境下常温培养2小时，依次用10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、去离子水各清洗2次，每次15分钟，采用倒置荧光显微镜检测荧光信号，结果见图5，然后将基材在3mol/L的胍水溶液浸泡1分钟，取出，用去离子水清洗，自然晾干，继续检测荧光信号，结果见图6，再按照上述方法在基材表面固定异硫氰酸荧光素标记的链霉亲和素，检测荧光信号，结果见图7。
由图5～7可见，用胍溶液清洗后的基材仍可制备成所需的生物活性基材，用于检测生物分子，实现了基材的重复使用。

Claims (4)

1.一种低成本捕获/释放及检测生物分子的方法，其特征在于它由下述步骤组成：
(1)制备生物活性基材
以10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液为溶剂，分别配制50mmol/L pH值为7.4的三(2-羧乙基)膦溶液和质量-体积浓度为1～5mg/mL的生物素标记的溶菌酶溶液，然后将配制的两种溶液按体积比为1:1混合均匀，用蛋白质点样仪立即点样到抗污染基材表面，在湿润环境下常温培养1～4小时，然后依次用10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、去离子水清洗，制备成生物活性基材；
(2)检测目标生物分子
以10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液为溶剂，配制质量-体积浓度为0.01～1mg/mL的链霉亲和素溶液，然后将其铺展到步骤(1)制备的生物活性基材表面，在湿润环境下常温培养1～4小时，然后依次用10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、去离子水清洗，在基材表面固定生物素标记的目标生物分子的抗体或抗原，用此抗体或抗原检测待测样品中的目标生物分子；
(3)基材重复利用
将步骤(2)中检测完后的基材在3～6mol/L的胍水溶液浸泡1～2分钟，取出，用去离子水清洗，自然晾干，按照步骤(1)的方法重新制备成生物活性基材，重复使用。
2.根据权利要求1所述的低成本捕获/释放及检测生物分子的方法，其特征在于：所述的制备生物活性基材步骤(1)中，以10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液为溶剂，分别配制50mmol/L pH值为7.4的三(2-羧乙基)膦溶液和质量-体积浓度为2mg/mL的生物素标记的溶菌酶溶液，然后将配制的两种溶液按体积比为1:1混合均匀，用蛋白质点样仪立即点样到抗污染基材表面，在湿润环境下常温培养2小时，然后依次用10mmol/L pH值为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、去离子水清洗，制备成生物活性基材。
3.根据权利要求1所述的低成本捕获/释放及检测生物分子的方法，其特征在于：在检测目标生物分子步骤(2)中，所述的链霉亲和素溶液的质量-体积浓度为0.1～0.5mg/mL。
4.根据权利要求1所述的低成本捕获/释放及检测生物分子的方法，其特征在于：在基材重复利用步骤(3)中，所述的胍水溶液的浓度为3mol/L。
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