CN103952381A - 一个不依赖nad+催化3-羟基丙醛产3-羟基丙酸的醛氧化酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

一个不依赖NAD+催化3-羟基丙醛产3-羟基丙酸的醛氧化酶及其应用属于生物化工生产领域，涉及一个不依赖NAD+的醛氧化酶，使肺炎克雷伯氏杆菌（Klebsiella pneumoniae）能够在催化3-羟基丙醛产生3-羟基丙酸的过程中，保持胞内辅酶的平衡。醛氧化酶的序列为序列表中的SEQ ID NO:1。经过大量筛选，发现在假单胞菌（Pseudomonas sp.）中的醛氧化酶不依赖NAD+，并可催化醛类物质氧化成对应的羧酸。在此基础上，在肺炎克雷伯氏杆菌体内对该醛氧化酶进行了超表达，对其进行了体内及体外催化3-羟基丙醛的能力进行了测定。该酶具有较好的生产3-羟基丙酸的能力。

Description

一个不依赖NAD+催化3-羟基丙醛产3-羟基丙酸的醛氧化酶及其应用
技术领域
本发明属于生物化工生产领域，涉及一个不依赖NAD+的醛氧化酶，使肺炎克雷伯氏杆菌（Klebsiella pneumoniae）能够在催化3-羟基丙醛产生3-羟基丙酸的过程中，保持胞内辅酶的平衡。 
背景技术
3-羟基丙酸是一种重要的平台化合物，由于化学合成法合成难度较大，近年来生物合成法受到更多关注。肺炎克雷伯氏杆菌因其生长迅速及较高的甘油耐受性，是生物法生产3-羟基丙酸的理想宿主。甘油在肺炎克雷伯氏杆菌体内经过甘油脱水酶的催化生成中间产物3-羟基丙醛，随后3-羟基丙醛被NAD+依赖型的醛脱氢酶催化生成3-羟基丙酸。 
在3-羟基丙酸的生物法生产中，过表达的醛脱氢酶导致了细胞内NAD+的过量消耗，造成了体内辅酶代谢的紊乱。发酵过程中，由于NAD+的缺少，3-羟基丙酸的合成速率、菌体生长速率及甘油转化率均受到严重影响。因此，亟待开发出一种NAD+独立型的关键酶用于3-羟基丙醛的催化。 
经过大量筛选，发现在假单胞菌（Pseudomonas sp.）中的醛氧化酶不依赖NAD+，并可催化醛类物质氧化成对应的羧酸。在此基础上，在肺炎克雷伯氏杆菌体内对该醛氧化酶进行了超表达，对其进行了体内及体外催化3-羟基丙醛的能力进行了测定。该酶具有较好的生产3-羟基丙酸的能力。 
发明内容
鉴于现有催化3-羟基丙醛的醛脱氢酶均为NAD+依赖型，在细胞内超表达后会导致菌体辅酶代谢紊乱，本发明旨在寻找一种NAD+独立的关键酶催化3-羟基丙醛。本发明的技术方案概述如下： 
经过大量的筛选，发现了一个NAD+独立的醛氧化酶。将该酶编码基因的序列进行分析后，对该基因进行了化学合成。 
醛氧化酶的序列为：atgcgtatcg cattcatcgg cctgggcaac atgggcgcgc ccatggcccg caacctgatc aaggccgggc accagctgaa cctgttcgac cttaaccaga ccgtgctggc cgagctcgccgaactcggcg ggcaggtcag cgcctcgccc aagaacgcgg ctgccagcag cgagctggtg attaccatgttgccggcggc ggcccatgtc cgcagcgtct acctgggcga cgatggcgtg ctggccggcg tgcgccccggcacgccgacc gtggattgca gcaccatcga cccgcagacc gcccgcgagg tgtccaaggc tgcggcggccaagggtgtgg acatgggcga tgcgccggtg tccggtggca ccggtggcgc agcggcaggt acgttgacgttcatggttgg cgccagcgcc gagctgttcg ccgcgctcaa gccggtgctc gagcagatgg gccgtaacatcgtgcattgt ggtgaagtcg gcaccggaca gatcgccaag atctgcaaca acctgctgct gggcatctcgatgatcggcg tgtccgaggc gatggccctg ggcaacgcgc tcggcatcga cacccaggtg ctggccgggatcatcaacag ttcgaccggg cgttgctgga gttccgatac ctacaacccg tggccgggca tcatcgagaccgcgccggcg tcgcgtggtt ataccggtgg ctttggtgcc gagctgatgc tcaaggacct gggcctggccaccgaggccg cccgccaggc gcatcaaccg gtgatcatgg gcgcactggc gcagcagctg taccaggccatgagcctgcg cggcgatggc ggcaaggact tctcggcgat cgtcgagggc taccgcaaga aggactga，共888bp。 
测序完成后，将该酶在肺炎克雷伯氏杆菌体内超表达，测定体内及体外对3-羟基丙醛的催化能力。在体外，该酶对3-羟基丙醛的酶活达到13.7U/mg，Km和Vmax值分别达到6.68mM和41.8μM/min/mg。经过摇瓶发酵，改造后的工程菌在24小时时3-羟基丙酸合成量达到0.89g/L，比对照组的0.47g/L多出近一倍。在5L发酵罐中培养该工程菌，24小时后3-羟基丙酸产量达到3g/L。由于该酶为NAD+独立型，不会影响细胞内辅酶代谢，因此具有很好的应用前景。 
附图说明
图1A在摇瓶发酵实验中，24h3-羟基丙酸产量对照图。 
图1B在上罐发酵实验中，24h时3-羟基丙酸产量对照图。 
具体实施方式
下面的具体方法可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。 
本发明方法的具体步骤包括： 
1.肺炎克雷伯氏杆菌中醛氧化酶酶的克隆 
菌株及质粒：大肠杆菌（E.coli）top10购自北京博迈德公司，肺炎克雷伯氏杆菌（Klebsiella pneumoniae）DSM2026从德国DSM购买，表达载体pET-pk为本实验室保存。 
培养基：LB培养基（g/L）蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，pH7.0。固体培养基中加入1.5%的琼脂。抗性培养基需加入50μg/mL硫酸卡那霉素。 
肺炎克雷伯氏杆菌发酵培养基（g/L）：K2HPO4·3H2O，3.4；KH2PO4，1.3；(NH4)2SO4，4；MgSO4·7H2O，0.5；CaCO3，0.1；酵母粉，3；甘油，40；微量元素，1.25mL/L。 
微量元素溶液（g/L）FeSO4·7H2O，1；ZnCl2，0.07；CuCl2·2H2O，0.02；MnCl2·4H2O，0.1；NiCl2·6H2O，0.025；H3BO3，0.06；Na2MO4·2H2O，0.035；CoCl2·2H2O，0.2；HCl(37%),4mL。 
分子克隆及表达：将筛选得到的基因序列进行化学合成，连接至载体pET-pk中，转入大肠杆菌top10中进行测序验证。之后将提取的质粒电穿孔转化至肺炎克雷伯氏杆菌并进行验证。验证结果显示醛氧化酶连接正确。 
2.醛氧化酶的表达 
在发酵培养基中培养重组菌，在第12h取出发酵液，12000rpm离心10min，去上清。将收集到的菌体用50mM的PBS缓冲液（KH2PO4，0.27g/L；Na2HPO4，1.42g/L；NaCl，8g/L；KCl，0.2g/L）重悬。随后将菌体置于冰上，超声破碎细胞，功率为100W，工作3s，停止2s，共50次。破碎后将适量破碎液加入至酶活反应体系（50mMPBS缓冲液，0.2mM3-羟基丙醛，0.4mM氨基安替比林，7mM苯酚，7U过氧化氢酶）中，37℃进行反应5min后在500nm下测定吸光度。酶活定义为在该条件下，1min催化生成1μmol过氧化氢所需要的酶量。 
实验结果表明，醛氧化酶在体外对3-羟基丙醛的活性达到了13.7U/mg。经过计算，醛氧化酶在该反应条件下对3-羟基丙醛的Km和Vmax值分别达到6.68mM和41.8μM/min/mg。该实验首次找到了一个在体外没有NAD+存在的条件下能催化3-羟基丙醛的关键酶，测出了其活性。 
3.含醛氧化酶工程菌的摇瓶及上罐发酵 
在250ml摇瓶中装入100ml发酵培养基，置于摇床中，37℃150rpm进行摇瓶发酵。每隔3h取出一次发酵液进行3-羟基丙酸产量的测定。上罐发酵在5L发酵罐（上海保兴）中完成，装液量为3L，在37℃下进行，pH自动维持在7.0，通气量1.5vvm，搅拌转速为400rpm，每3h取样测定，使甘油的含量维持在30g/L左右。分析方法如下：发酵液中的产物质量浓度采用岛津高效液相色谱SPD-20A测定，色谱柱为C18柱，柱温30℃，流动相为0.05%磷酸，工作流速为0.8mL/min，检测器采用紫外检测器。取1mL发酵液12000rpm离心10min，取上清液用于高效液相色谱检测，样品分析前经0.22μm微滤膜过滤。甘油的测定方法使用的是高碘酸钠氧化法。 
实验结果表明，在摇瓶发酵实验中，24h时3-羟基丙酸产量达到了0.89g/L，对照组仅为0.47g/L（图1A），实验组3-羟基丙酸产量是对照组的1.89倍。在上罐发酵实验中，24h时3-羟基丙酸产量达到3g/L（图1B）。摇瓶发酵和上罐发酵的结果表明，醛氧化酶在肺炎克雷伯氏杆菌体内发挥了良好的作用，提高了3-羟基丙酸的产量。作为NAD+独立的一个关键酶，有着巨大的应用前景。 

Claims (2)

1.一个不依赖NAD+催化3-羟基丙醛产3-羟基丙酸的醛氧化酶，其特征在于：
醛氧化酶的序列为序列表中的SEQ ID NO:1。
2.根据权利要求1所述的一个不依赖NAD+催化3-羟基丙醛产3-羟基丙酸的醛氧化酶的应用，其特征在于：应用于生产3-羟基丙酸。
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