CN103940709A

CN103940709A - 一种实时微生物粒子计数器

Info

Publication number: CN103940709A
Application number: CN201410189510.8A
Authority: CN
Inventors: 黄惠杰; 张佩; 杨巍; 朱永康; 王光辉
Original assignee: Naijing Zhongke Shenguang Technology Co Ltd
Current assignee: Naijing Zhongke Shenguang Technology Co Ltd
Priority date: 2014-05-06
Filing date: 2014-05-06
Publication date: 2014-07-23

Abstract

本发明公开了一种实时微生物粒子计数器，包括光路、与光路相交的气路、与光路连接的信号处理***，光路包括用于照射被测粒子的照明光路和沿照明光路前进方向上设置的收集光路，收集光路还包括用于分离光路并对分离光路分开探测的转像***；气路用于采样被测粒子；信号处理***，用于分析和处理信号，包括荧光前置放大器和散射光前置放大器。本发明以激光诱导荧光检测为原理，实时监测空气中微生物粒子的浓度。通过检测单个粒子在激发光照射下发出的散射光和荧光强度判断被测粒子的粒径大小和生物属性，并对采样气流中的粒子进行计数，实现浮游菌微生物浓度的自动化检测，操作简便，检测实时性强、灵敏度高、准确度高。

Description

一种实时微生物粒子计数器

技术领域

本发明属于悬浮微生物检测领域，特别涉及一种实时微生物粒子计数器。

背景技术

传染性病菌或病毒等微生物都是以气溶胶粒子状态存在于大气中，当大气中传染性病菌或病毒的浓度超过某一阈值时，将对人类和动植物的健康造成威胁。与此同时，由于微生物能产生各种休眠体，可在空气中长时间存活，并借助空气介质扩散和传输，从而导致各种传染病的爆发与蔓延，造成严重危害。所以急需能够实时检测周围环境中微生物粒子的技术与设备。

微生物粒子含有多种有机分子，其中主要的荧光物质为色氨酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、核黄素以及吡啶二羧酸(DPA)等。生物体的这些代谢物在紫外光或蓝紫光照射下会发出本征荧光，其中，色氨酸有三个吸收峰，分别为220nm、280nm和288nm；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)有两个吸收峰，分别为260mn和340nm；核黄素有三个吸收峰，分别为240nm、370nm和450nm；吡啶二羧酸(DPA)主要存在于细菌芽孢内壁，吸收波段约为320～420nm，吸收峰值约为400nm。不同的微生物粒子所含的成分往往不同，如细菌、真菌、孢子中往往含有上述各种有机分子，而病毒、毒素中一般仅含有氨基酸成分。所以，不同的微生物粒子呈现不同的光吸收与发光特性。

空气中微生物粒子的检测不仅广泛应用于医药工业洁净室、医院洁净手术部、生物制品洁净室等室内环境空气质量的评价，而且在军事与反恐领域可有效地用于生物武器预警。

现有的微生物检测方法主要是浮游菌采样培养法：通过浮游菌采样器收集悬浮在空气中的活性微生物粒子于培养皿的培养基上，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以培养皿中的菌落数来判定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室(或洁净区)的生物粒子洁净度。

上述现有方法存在如下缺点：

(1)测试步骤复杂，流程繁琐。

每次测试均要经过消毒、采样、培养、计数等步骤，测试过程中都需要人员操作。测试前，需要具备浮游菌采样器、培养皿、培养基、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、放大镜等多种设备与器材。

(2)检测周期长，不具有实时性。

浮游菌采样培养法一般需要几天时间才能得到检测结果，检测周期较长，不具有实时性。因此该方法无法应用于对实时性要求较高的应用领域，如生物武器预警。

(3)漏报率较高。

浮游菌采样培养法通过对微生物进行培养后进行计数，但不同的微生物生长周期也并不相同，因此难以保证对所有微生物的数量进行完全统计。在培养时间内，有些微生物可能尚未繁殖到可计数程度，有些微生物则可能已经死亡。另外，空气中存在大量的不可培养微生物，它们无法在培养基上形成菌落，也无法通过浮游菌采样培养法进行计数。

发明内容

发明目的：本发明提供了一种实时微生物粒子计数器，能实时监测空气中微生物粒子的浓度。

技术方案：一种实时微生物粒子计数器，包括光路、与光路相交的气路、与光路连接的信号处理***：

光路，包括用于照射被测粒子的照明光路和沿照明光路前进方向上设置的收集光路，收集光路还包括用于分离光路并对分离光路分开探测的转像***；

气路，用于采样被测粒子；

信号处理***，用于分析和处理信号，包括荧光前置放大器(31)和散射光前置放大器(36)。

其中气路为采样气路，含有进气嘴、出气嘴及真空气泵。进气嘴与出气嘴分别位于照明光路的光照射区域的两侧。在真空气泵的驱动下，被采样气体从进气嘴进入，气体中的粒子以一定的速度逐个通过光照射区域，之后由出气嘴排出。

所述照明光路与转像***之间还依次设有曲面镜、第一光陷阱、非球面透镜，曲面镜的焦点位于所述光路和气路交汇形成的光敏感区。

所述曲面镜为抛物面集光镜，所述抛物面集光镜的焦点位于光敏感区的中心。

所述转像***包括沿收集光路前进方向上依次设置的准直镜、分色镜和荧光收集光路，分色镜反射方向的下方设有散射光收集光路。

所述转像***还包括用于吸收多余散射光的第二光陷阱，第二光陷阱设置在分色镜反射方向的上方，与散射光收集光路相对。

所述分色镜的入射角度为30°～60°。

所述荧光收集光路包括沿收集光路前进方向上依次设置的荧光滤光片、荧光聚焦镜、荧光光阑和荧光探测器，荧光光阑位于荧光聚焦镜的焦面处，荧光探测器与荧光前置放大器相连。

所述散射光收集光路包括沿分色镜反射方向向下依次设置的散射光聚焦镜、散射光光阑以及散射光探测器，散射光光阑位于散射光聚焦镜的焦面处，散射光探测器与散射光前置放大器相连。

在转像***之前，散射光光路和荧光光路是共光路的，通过设置在转像***中的分色镜后，散射光和荧光被分开，散射光反射转折后，经散射光聚焦镜会聚于散射光探测器的光敏面上，而荧光则直接透过分色镜和荧光滤光片后再经荧光聚焦镜会聚于荧光探测器的探测面上。

所述转像***还包括第一光阑，第一光阑位于所述准直镜和非球面透镜的共焦面处。

所述信号处理***还包括顺次连接的转换模块、处理器、缓存器以及上位机，转换模块的输入端分别与荧光前置放大器的输出端和散射光前置放大器的输出端相连。信号处理***用于分析和处理散射光探测器和荧光探测器输出的原始脉冲信号。散射光探测器和荧光探测器输出的原始脉冲信号均为微弱电流信号，分别经过散射光前置放大器和荧光前置放大器处理后均成为模拟电压信号，然后同时进入转换模块，转换后的数字信号被送入处理器提取脉冲峰值，脉冲幅值经过缓存器后传送到上位机，上位机对脉冲幅值进行分析与处理，最终计算出各个粒径段内的粒子的数量以及生物粒子的数量。

所述照明光路包括依次设置的半导体激光器、照明准直镜和柱面镜，所述光敏感区为柱面镜聚焦的光照区域与气路的相交区域，所述气路垂直于柱面镜的焦线与照明光路的光轴所组成的平面。半导体激光器发出的激光束经过照明准直镜准直后，被柱面镜一维聚焦成细长光斑，用于照射被测粒子。柱面镜的焦点处形成的光照射区域与采样气流的相交区域称为光敏感区，照明光路的光轴与柱面镜焦线的交点即为光敏感区的中心。照明光路的光轴、抛物面集光镜的中心轴线及荧光光路的光轴三者共线，抛物面集光镜的焦点与光敏感区的中心重合，反射转折后的散射光光路的光轴与荧光光路的光轴垂直。采样气流的中心轴线经过光敏感区的中心。

所述半导体激光器为波长为350nm～410nm的激光二极管。可有效激发含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、核黄素或吡啶二羧酸(DPA)等荧光物质的细菌、真菌、芽孢等绝大部分生物体产生荧光。

工作原理：半导体激光器发出激光束，经照明准直镜后在垂直于照明光路光轴的方向上形成横截面为矩形的激光束，该激光束的长边与采样气流中心轴线相同，接着沿矩形光束的长边方向被柱面镜一维聚焦至光敏感区，穿过光敏感区的激光束进入第一光陷阱并被吸收。在气泵的驱动下，待测粒子随采样气流进入进气嘴，经过光敏感区后从出气嘴排出。每个待测粒子在经过光敏感区的时候，会产生强度与其粒径大小成一定比例的散射光信号，如果是生物粒子，与此同时还会产生一定强度的荧光信号。待测粒子被激光束照射的时候刚好位于抛物面集光镜的焦点附近，因此，其发出的散射光和荧光经过抛物面集光镜反射后平行于照明光路的光轴方向射出，然后依次经非球面透镜聚焦和准直镜准直后到达分色镜。分色镜对散射光高反且对荧光高透，因此散射光经分色镜后被反射，然后经散射光聚焦镜聚焦于散射光光阑，穿过散射光光阑后投射到散射光探测器上。荧光经分色镜后直接透过荧光滤光片后被荧光聚焦镜会聚于荧光光阑，最终到达荧光探测器上，第二光陷阱用于吸收多余的散射光。散射光探测器将信号传输到散射光前置放大器上，得到与散射光强度成一定比例的模拟电压脉冲信号；荧光探测器将信号传输到荧光前置放大器上，得到与荧光强度成一定比例的模拟电压脉冲信号。转换模块至少含有两路转换通道，可同时将所述的两路模拟电压脉冲信号转换为数字信号。转换后的数字信号被送入处理器提取脉冲幅值，脉冲幅值经过缓存器后传送到上位机，由此，上位机同时获得被测粒子的散射光和荧光强度信息。上位机根据被测粒子的散射光强度信息排除伪生物粒子的干扰，然后计算出不同粒径区间内的粒子浓度和生物粒子浓度值。

有益效果：本发明通过检测单个粒子在激发光照射下发出的散射光和荧光强度判断被测粒子的粒径大小和生物属性，并对采样气流中的粒子进行计数。与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)可实现浮游菌微生物浓度的自动化检测，操作简便。

每次使用前，对仪器外壳进行严格消毒之后，开启仪器后即可进行微生物浓度检测，检测完成后可通过仪器的上位机获取检测结果。本发明属于自动检测仪器，对操作人员的技能要求低。另外，本发明无需采用采样滤膜、培养基等耗材，因此操作步骤更为简便。

(2)检测灵敏度高，实时性强。

采样培养法一般需要几天时间才能得到检测结果，而本发明开启后即可进行现场实时检测，检测周期短，实时性好。本发明可探测到单个生物粒子，空气中的微生物粒子即使浓度很低时，仍然可以被检测到，因此本发明的检测灵敏度高。

(3)检测准确度高。

本发明是以激光诱导荧光检测为原理，能检测到包括不可培养的微生物在内的几乎所有微生物粒子。另外，本发明可根据被测粒子的散射光信息排除伪生物粒子的干扰，从而有效降低误报率。因此，本发明检测准确度高。

附图说明

图1为本发明中照明光路与收集光路的示意图；

图2为本发明中气路与照明光路的示意图；

图3为本发明中信号处理***的示意图；

图4为空气中不同种类粒子的粒径覆盖范围；

图5为本发明的收集光路中荧光滤光片的透过率曲线图。

具体实施方式

一种实时微生物粒子计数器，包括光路、气路以及信号处理***，光路包括照明光路、收集光路，气路为采样气路。

如图1所示，照明光路包括半导体激光器101、照明准直镜102、柱面镜103，半导体激光器101发出的激光束经过照明准直镜102准直后，被柱面镜103一维聚焦成细长光斑。柱面镜103的焦点处形成的光照射区域与气路的采样气流的相交区域形成光敏感区118，照明光路的光轴与柱面镜焦线的交点即为光敏感区118的中心。

收集光路包括沿照明光路前进方向上依次设置的曲面镜、第一光陷阱105、非球面透镜106和转像***，曲面镜为抛物面集光镜104。转像***包括准直镜108、分色镜109、第二光陷阱110、荧光滤光片111、荧光聚焦镜112、荧光光阑113、荧光探测器114、散射光聚焦镜115、散射光光阑116以及散射光探测器117。荧光滤光片111、荧光聚焦镜112、荧光光阑113、荧光探测器114构成荧光收集光路；散射光聚焦镜115、散射光光阑116以及散射光探测器117构成散射光收集光路。分色镜109为45°分色镜。在转像***之前，散射光光路和荧光光路是共光路的，通过设置在转像***中的45°分色镜后，散射光和荧光被分开，散射光反射转折90°后，经散射光聚焦镜115会聚于散射光探测器117的光敏面上，而荧光则直接透过分色镜109和荧光滤光片111后再经荧光聚焦镜112会聚于荧光探测器114的探测面上，第二光陷阱110用于吸收多余的散射光。

照明光路的光轴、抛物面集光镜104的中心轴线及荧光光路的光轴三者共线，记为OO'，抛物面集光镜104的焦点与光敏感区118的中心O重合，反射转折后的散射光光路的光轴O₁O₁'与荧光光路的光轴OO'垂直。

如图2所示，采样气路包括进气嘴21、出气嘴22及真空气泵。在真空气泵的驱动下，被采样气体从进气嘴21进入，气体中的粒子以一定的速度逐个通过光敏感区118，之后由出气嘴22排出。采样气流的中心轴线O₂O₂'经过光敏感区118的中心O，且垂直于柱面镜103的焦线与照明***的光轴OO'所组成的平面。

如图3所示，信号处理***用于分析和处理散射光探测器117和荧光探测器114输出的原始脉冲信号。信号处理***包括荧光前置放大器31、散射光前置放大器36、转换模块32、处理器33、缓存器34以及上位机35，转换模块32为A/D转换模块，处理器33为FPGA处理器，缓存器34为FIFO缓存器；散射光探测器117和荧光探测器114输出的原始脉冲信号均为微弱电流信号，分别经过散射光前置放大器36和荧光前置放大器31处理后均成为模拟电压信号，然后同时进入转换模块32，转换后的数字信号被送入处理器33提取脉冲峰值，脉冲幅值经过缓存器34后传送到上位机35，上位机35对脉冲幅值进行分析与处理。收集光路中包括3个消杂光光阑，第一光阑107设置于非球面透镜106和准直镜108的共焦面处，荧光光阑113设置于荧光探测器114之前荧光聚焦镜112的焦面处，散射光光阑116设置于散射光探测器117之前散射光聚焦镜115的焦面处。

半导体激光器101发出激光束，经照明准直镜102后在垂直于照明光路光轴OO'的方向上形成横截面为矩形的激光束，该激光束的长边与采样气流中心轴线O₂O₂'相同，接着沿矩形光束的长边方向被柱面镜103一维聚焦至光敏感区118，穿过光敏感区118的激光束进入第一光陷阱105并被吸收。在真空气泵的驱动下，待测粒子随采样气流进入进气嘴21，经过光敏感区118后从出气嘴22排出。每个待测粒子在经过光敏感区118的时候，会产生强度与其粒径大小成一定比例的散射光信号，如果是生物粒子，还会产生一定强度的荧光信号。待测粒子被激光束照射的时候刚好位于抛物面集光镜104的焦点O附近，因此，其发出的散射光和荧光经过抛物面集光镜104反射后平行于照明光路的光轴OO'方向射出，然后依次经非球面透镜106聚焦和准直镜108准直后到达45°分色镜，第一光阑107用于消除杂散光。

分色镜109对散射光高反且对荧光高透，因此散射光经分色镜109后被90°反射，然后经散射光聚焦镜115聚焦于散射光光阑116，穿过散射光光阑116后投射到散射光探测器117上。荧光经分色镜109后直接透过荧光滤光片111后被荧光聚焦镜112会聚于荧光光阑113，最终到达荧光探测器114上。散射光探测器117将信号传输到散射光前置放大器36上，得到与散射光强度成一定比例的模拟电压脉冲信号；荧光探测器114将信号传输到荧光前置放大器31上，得到与荧光强度成一定比例的模拟电压脉冲信号。A/D模块含有两路A/D转换通道，可同时将所述的两路模拟电压脉冲信号转换为数字信号。转换后的数字信号被送入FPGA处理器提取脉冲幅值，脉冲幅值经过FIFO缓存器后传送到上位机35，由此，上位机35获得被测粒子的散射光和荧光强度信息。上位机35根据被测粒子的散射光强度信息排除伪生物粒子的干扰，然后计算出不同粒径区间内的粒子浓度和非生物粒子浓度值。空气中含有尘埃、烟雾、细菌、真菌、花粉等多种粒子，除细菌、真菌、孢子外，花粉、香烟粒子等在405nm波长光源的激发下也能产生荧光，会对微生物粒子的检测造成干扰。由图4可知，不同种类的尘埃粒子所覆盖的粒径范围不同，据此可以排除花粉等过敏原以及部分香烟粒子的干扰。

本实施例半导体激光器101采用波长为405nm的激光二极管，功率约为70mW。可有效激发含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、核黄素或吡啶二羧酸(DPA)等荧光物质的细菌、真菌、芽孢等绝大部分生物体产生荧光。照明准直镜102为非球面透镜，焦距为7.8mm。半导体激光器101发出的激光束经过准直镜102后约为平行光，光束截面约为4mm×2mm的矩形。柱面镜103为平凸镜，采用光学玻璃K9，焦距为45.3mm，激光束经过柱面镜103后在光敏感区118的中心O处形成的焦线尺寸约为2mm×0.027mm。抛物面集光镜104对光敏感区118的中心O所张的立体角为2.204π球面度。非球面透镜106的第一面为椭球面，第二面为球面，焦距为119.8mm。荧光经非球面透镜106聚焦后数值孔径为0.292，即转像***的物方数值孔径为0.292。第一光阑107的通光孔径为7mm×1mm。收集光路中的准直镜108、荧光聚焦镜112和散射光聚焦镜115采用具有相同结构参数的双胶合透镜，焦距为35.0mm，数值孔径NA＝0.329，其值大于来自非球面透镜106聚焦后荧光的数值孔径，因此不会造成能量损失。分色镜109材料为K9玻璃，其反射带中心波长为405nm，带宽为380-420nm，透射带波长范围为430-650nm。荧光滤光片111的透过率曲线如图5所示。荧光光阑113和散射光光阑116的通光孔径均为Φ6.0mm。荧光探测器114为具有多碱光电阴极材料的侧窗型光电倍增管，在200-800nm波段内具有很高的量子效率，且典型增益高。散射光探测器117为具有高灵敏度和高响应频率的硅PIN型光电二极管，光谱响应范围为320-1100nm。

第一光陷阱105由吸收玻璃和内壁具有消光纹的光陷阱座组成。吸收玻璃的外形为具有45°斜面的圆柱体，材料采用中性灰色玻璃，45°斜面抛光后镀405nm高透膜。来自半导体激光器101的激光束绝大部分透射进入吸光玻璃被吸收掉，少数未被吸收的激光束被45°斜面反射到光陷阱座的内壁上，经多次反射后被光陷阱内壁的消光纹几乎完全吸收。第二光陷阱110采用内部具有锥形消光纹的光陷阱，用于吸收多余的散射光。

进气嘴21的出口内径和出气嘴22的入口内径分别为Φ1.1mm和Φ1.5mm。荧光前置放大器31和散射光前置放大器36均是以高性能场效应管型双运算放大器为核心构成的电流/电压转换及电压放大电路。A/D模块采用含有两路A/D转换通道的高速A/D采样芯片，FPGA处理器对A/D模块传输过来的信号进行处理后提取出脉冲幅值，因为FPGA处理器没有存储功能，需要外加FIFO缓存器作为寄存器，以满足空气中颗粒物浓度较高时的处理要求。最后上位机35根据同时测得的散射光和荧光信息判断被测粒子的粒径大小和生物属性，并计算出不同粒径区间内的粒子浓度和非生物粒子浓度值。实施例的最小探测分辨率为1个生物粒子，空气采样流量为1L/min。

Claims

1.一种实时微生物粒子计数器，包括光路、与光路相交的气路、与光路连接的信号处理***，其特征在于：

气路，用于采样被测粒子；

2.如权利要求1所述的实时微生物粒子计数器，其特征在于，所述照明光路与转像***之间还依次设有曲面镜、第一光陷阱(105)、非球面透镜(106)，曲面镜的焦点位于所述光路和气路交汇形成的光敏感区(118)。

3.如权利要求2所述的实时微生物粒子计数器，其特征在于，所述曲面镜为抛物面集光镜(104)，所述抛物面集光镜(104)的焦点位于光敏感区(118)的中心。

4.如权利要求1所述的实时微生物粒子计数器，其特征在于，所述转像***包括沿收集光路前进方向上依次设置的准直镜(108)、分色镜(109)和荧光收集光路，分色镜(109)反射方向的下方设有散射光收集光路。

5.如权利要求4所述的实时微生物粒子计数器，其特征在于，所述转像***还包括用于吸收多余散射光的第二光陷阱(110)，第二光陷阱(110)设置在分色镜(109)反射方向的上方，与散射光收集光路相对。

6.如权利要求4或5所述的实时微生物粒子计数器，其特征在于，所述分色镜(109)的入射角度为30°～60°。

7.如权利要求4所述的实时微生物粒子计数器，其特征在于，所述荧光收集光路包括沿收集光路前进方向上依次设置的荧光滤光片(111)、荧光聚焦镜(112)、荧光光阑(113)和荧光探测器(114)，荧光光阑(113)位于荧光聚焦镜(112)的焦面处，荧光探测器(114)与荧光前置放大器(31)相连。

8.如权利要求4所述的实时微生物粒子计数器，其特征在于，所述散射光收集光路包括沿分色镜反射方向向下依次设置的散射光聚焦镜(115)、散射光光阑(116)以及散射光探测器(117)，散射光光阑(116)位于散射光聚焦镜(115)的焦面处，散射光探测器(117)与散射光前置放大器(36)相连。

9.如权利要求4所述的实时微生物粒子计数器，其特征在于，所述转像***还包括第一光阑(107)，第一光阑(107)位于所述准直镜(108)和非球面透镜(106)的共焦面处。

10.如权利要求1所述的实时微生物粒子计数器，其特征在于，所述信号处理***还包括顺次连接的转换模块(32)、处理器(33)、缓存器(34)以及上位机(35)，转换模块(32)的输入端分别与荧光前置放大器(31)的输出端和散射光前置放大器(36)的输出端相连。

11.如权利要求1所述的实时微生物粒子计数器，其特征在于，所述照明光路包括依次设置的半导体激光器(101)、照明准直镜(102)和柱面镜(103)，所述光敏感区(118)为柱面镜(103)聚焦的光照区域与气路的相交区域，所述气路垂直于柱面镜(103)的焦线与照明光路的光轴所组成的平面。

12.如权利要求11所述的实时微生物粒子计数器，其特征在于，所述半导体激光器(101)为波长为350nm～410nm的激光二极管。