CN103937804A - 一种先天性无虹膜症致病基因、检测该基因的试剂盒及其应用 - Google Patents
一种先天性无虹膜症致病基因、检测该基因的试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种先天性无虹膜症致病基因、检测该基因的试剂盒及其应用。所述的致病基因是突变的PAX6基因(Paired box6),该PAX6基因的第6外显子的第323位碱基,有一个C->A的点突变,导致编码第108位丝氨酸的遗传密码子(TCC)变成酪氨酸的遗传密码子(TAC),即发生了S108Y突变。本发明还提供了用于检测该先天性无虹膜症致病基因的试剂盒,包括:2mM dNTPs,10×PCR反应缓冲液,DNA聚合酶,PCR扩增引物对和双蒸水,其中,所述的PCR扩增引物对由引物1(SEQ ID NO:1所示)和引物2(SEQ ID NO:2)组成。本发明提供了一种新的先天性无虹膜症的致病基因,从而为先天性无虹膜症的基因诊断提供了新的技术手段,也为发病的分子机制的研究奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种基因检测试剂盒及其应用,具体地说是涉及一种先天性无虹膜症致病基因检测试剂盒及其应用。本发明属于疾病检测与诊断技术领域。
背景技术
无虹膜症是双眼发育性疾患,主要特征为先天性虹膜发育不良或正常虹膜的缺如,还可伴有多种眼疾,如角膜浑浊、小角膜、晶状体脱位、白内障、青光眼、黄斑发育不良、斜视、眼球震颤等,累及全眼球。
由于虹膜缺损程度不同,故临床表现不一,但都有畏光、皱眉及眯眼等表现,视力差并可能进行性减退。临床上有些患眼用手电筒或在裂隙灯检查时就可看见残存的周边虹膜,而有些只能在房角镜下才能见到残余的虹膜根部组织。较多患者早期就有周边角膜血管翳及角膜浑浊,随年龄增长逐渐发展至角膜中央部。偶有小角膜、角膜硬化症及角膜与晶状体粘连的情况。晶状体发育异常以先天性局限性晶状体浑浊为多见,亦可有晶状体异位或先天性缺损,发生进行性的白内障则可使视力明显减退。无虹膜亦可伴有脉络膜缺损、瞳孔残膜、小视神经***、斜视及上睑下垂等,如伴黄斑中心的发育不良可导致眼球震颤。无虹膜患者当伴有青光眼时,残留的虹膜则逐渐向前覆盖到小梁网,一旦功能小梁被阻挡,眼压就会逐渐升高,青光眼的严重程度与房角粘连情况有关。
先天性无虹膜症男女两性发病相同,可以孤立发生,可以合并其它眼部发育异常,或者是遗传性多***综合症的一部分。约有2/3的无虹膜患者有家族史,为常染色体显性遗传;1/3的患者呈散发性,多为隐性遗传。其遗传基础和发病机制尚不十分清楚。对先天性无虹膜症致病基因的突变检测是了解其发病的分子机制的重要步骤。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种新的先天性无虹膜症致病基因;
本发明的目的之二在于提供所述先天性无虹膜症致病基因在制备诊断或检测先天性无虹膜症试剂中的应用;
本发明的目的之三在于提供一种可用于上述先天性无虹膜症致病基因检测的试剂盒;
本发明的目的之四在于提供所述试剂盒在制备诊断或检测先天性无虹膜症试剂中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
本发明的一种先天性无虹膜症致病基因,其特征在于所述的致病基因是突变的PAX6基因(Paired box6),该PAX6基因的第6外显子的第323位碱基(以cDNA第一个核苷酸作为1计算),有一个C->A的点突变。
该PAX6基因的gDNA Gene Bank登录号为NC_000011,cDNA的Gene Bank登录号为NM_001604,所对应的蛋白质的Gene Bank登录号为NP_001595。
突变前的PAX6基因的第6外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,突变后的PAX6基因的第6外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
该突变导致编码第108位丝氨酸的遗传密码子(TCC)变成酪氨酸的遗传密码子(TAC),即发生了S108Y突变。
进一步的,本发明还提出了所述的先天性无虹膜症致病基因在制备诊断或检测先天性无虹膜症试剂中的应用。
本发明的一种用于先天性无虹膜症致病基因检测的试剂盒,包括:2mM dNTPs,10×PCR反应缓冲液,DNA聚合酶,PCR扩增引物对和双蒸水,其特征在于:所述的PCR扩增引物对由引物1和引物2组成,其中,引物1的核苷酸序列为:CGTAAGCTTGTCATTGTTTAATGC(SEQ ID NO:1所示),引物2的核苷酸序列为AGAGAGGGTGGGAGGAGGTA(SEQ ID NO:2所示)。
该试剂盒用于先天性无虹膜症致病基因的扩增,其采用Touch-down PCR进行扩增,反应程序为:
95℃预变性2分钟,然后进入第一个循环,95℃变性40秒,63℃退火复性30秒,72℃延伸1min,之后每循环一次降低0.5℃,共进行14个循环,之后进入主循环,95℃变性40秒,57℃退火复性30秒,72℃延伸1min,共进行25个循环,72℃延伸10min,4℃保存,表2所示。
进一步的,本发明还提出了所述的一种先天性无虹膜症致病基因检测试剂盒在制备诊断或检测先天性无虹膜症试剂中的应用。
一种利用本发明的试剂盒检测先天性无虹膜症致病基因的方法,包括以下步骤:
(1)使用QIAGEN公司QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒抽提血液样品基因组DNA;
(2)设计引物:
正向测序引物序列为:CGTAAGCTTGTCATTGTTTAATGC(SEQ ID NO:1所示);
反向测序引物序列为:AGAGAGGGTGGGAGGAGGTA(SEQ ID NO:2所示);
(3)对样本DNA目标片段进行PCR体外扩增;
PCR体系如表1所示:
表1
PCR反应在9700PCR仪上进行,PCR反应程序为表2所示:
表2
PCR产物电泳检测:
PCR反应结束后,取2μl反应产物加入2μl的2×Loading Buffer,4000rpm离心30秒,上样于1.5%的琼脂糖凝胶中,100V电压下电泳15min,凝胶摄像仪拍摄检测;
(4)对PCR产物进行纯化
采用SAP降解残余dNTP,Exo降解残余引物,将SAP和Exo两种酶和10×缓冲液预先混合后保存,每微升混合液中含SAP和EXO各0.5单位,对于每个纯化反应,取PCR产物1.5-2μl加入SAP酶1.5μl;
反应程序为:SAP/Exo在37℃处理PCR产物40分钟,接着85℃持续20分钟灭活SAP/Exo酶,然后4℃保温;
(5)对PCR产物进行测序
测序反应体系为5μl,包含纯化后的PCR产物,测序引物3.2pmol以及BDT0.5μl,剩下体积用ddH2O补齐,
测序反应程序为表3所示:
表3
本发明的检测方法还可以包括:
1、测序反应结束后,测序产物再次纯化,该纯化步骤如下:
1)测序反应的96孔板中每孔加25μl醋酸钠—乙醇溶液,即3M醋酸钠+100%乙醇,体积比为1:25;4℃,4000rpm离心45分钟;倒置,600rpm离心1分钟甩干;
2)再加入50μl70%乙醇溶液;4℃,4000rpm离心10分钟;倒置600rpm离心1分钟甩干;重复一次;
3)室温静置半小时。
2、测序产物再次纯化之前,先对DNA样品进行变性,变性的方法是在纯化后的样品中加入10μl HiDi,在PCR仪上95℃保持5分钟使之完全变性,变性后即刻放入冰中至少2分钟。
为了验证本发明的效果,本发明收集到一个先天性无虹膜症家系。家系成员经调查走访或做全身检查以排除其它疾病和***异常。对家系成员进行了详细的眼科检查,包括视力、裂隙灯显微镜、散瞳后的眼底检查。所有患者经裂隙灯显微镜拍照。所有参加调查和被采集血样的家系成员都了解本研究的目的意义并签署了知情同意书。该家系共4代,36个家系成员,其中患者9人。患者临床表现为眼内虹膜全部缺失。抽取志愿者外周静脉血5m1,用EDTA作抗凝处理后,-20℃冰箱保存。另外采集正常汉族个体100人,采集外周静脉血5ml,EDTA抗凝,-20℃冰箱保存作为对照组。其对比结果如图1和图2所示。
双向测序结果表明先天性无虹膜症家系的PAX6基因第6外显子第323位碱基(以cDNA第一个核苷酸作为1计算),有一个C->A的点突变,导致编码第108位丝氨酸的遗传密码子(TCC)变成酪氨酸的遗传密码子(TAC),即发生了S108Y突变。家系所有无虹膜症患者都具有相同的点突变,而家系内其余正常个体和100名正常对照都没有此突变。从而排除了它是罕见的SNP的可能性。确定PAX6基因突变是该家系的致病基因突变。
附图说明
图1是家系正常人正向测序图;
图2是家系患者正向测序图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1一种用于先天性无虹膜症致病基因检测的试剂盒的制备
1、引物对的设计及合成
引物1:CGTAAGCTTGTCATTGTTTAATGC(SEQ ID NO:1所示)
引物2:AGAGAGGGTGGGAGGAGGTA(SEQ ID NO:2所示);
采用自动DNA合成仪合成,稀释为20μmol/L。
2、试剂盒的组装
包括:2mM dNTP、10×PCR反应缓冲液,DNA聚合酶,PCR扩增引物对和双蒸水。
实施例2一种用于先天性无虹膜症致病基因检测的试剂盒在临床检测中的应用
1、检测样本和实验材料:
实验材料:基因组DNA提取试剂盒QIAamp DNA Blood Mini Kit购于QIAGEN公司;PCR检测试剂盒购自Qiagen,Hilden,Germany。
检测样本:临床上收集到一个先天性无虹膜症家系。家系成员经调查走访或做全身检查以排除其它疾病和***异常。对家系成员进行了详细的眼科检查,包括视力、裂隙灯显微镜、散瞳后的眼底检查。所有患者经裂隙灯显微镜拍照。所有参加调查和被采集血样的家系成员都了解本研究的目的意义并签署了知情同意书。该家系共4代,36个家系成员,其中患者9人。患者临床表现为眼内虹膜全部缺失。
2、检测方法:
(1)使用QIAGEN公司QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒抽提家系成员血液样品中的基因组DNA;
(2)设计引物:
引物1:CGTAAGCTTGTCATTGTTTAATGC(SEQ ID NO:1所示)
引物2:AGAGAGGGTGGGAGGAGGTA(SEQ ID NO:2所示);
(3)样本DNA目标片段的体外扩增(PCR)
PCR体系如下:
测序首先需要通过PCR反应得到样本DNA目标片段。反应体系如下表1:
表1
PCR反应程序:采用Touch-down PCR。
PCR反应在9700PCR仪上进行。PCR反应程序如下表2所示:
表2
PCR产物电泳检测
PCR反应结束后,取2μl反应产物加入2μl的2×Loading Buffer,4000rpm离心30秒。上样在1.5%的琼脂糖凝胶(5g Agarose、100ml1×TBE、1.5μl10mg/ml EB)中,100V电压下电泳15min,凝胶摄像仪拍摄检测。
(4)PCR产物纯化
PCR产物中残余的引物和dNTP对于后续的测序反应会产生不良影响。我们采用SAP(北极虾碱性磷酸酶)降解残余dNTP,Exo(核酸外切酶)降解残余引物。为便于使用,通常将SAP和Exo两种酶和10×缓冲液预先混合后保存,每微升混合液中含SAP和EXO各0.5单位。
对于每个纯化反应,取PCR产物1.5-2μl加入SAP酶1.5μl。
反应程序为:SAP/Exo在37℃处理PCR产物40分钟,接着85℃持续20分钟灭活SAP/Exo酶,然后4℃保温。
(5)对PCR产物进行测序
测序反应需要在纯化后的PCR产物中加入测序引物和BDT(BigDye Terminator3.1,Applied Biosystems)。由于目的是筛选致病基因的突变,所以我们进行了正反向引物的双向测序。
测序反应体系为5μl,包含纯化后的PCR产物,测序引物3.2pmol以及BDT0.5μl,剩下体积用ddH2O补齐。
测序反应程序如下表3所示。
表3
测序反应结束后,需要对测序产物再次纯化(测序后纯化),以除去测序反应带来的小分子物质,避免其对测序的干扰。纯化步骤如下:
1)测序反应的96孔板中每孔加25μl醋酸钠—乙醇溶液(3M醋酸钠+100%乙醇,体积比为1:25);4℃,4000rpm离心45分钟;倒置,600rpm离心1分钟甩干。
2)再加入50μl70%乙醇溶液;4℃,4000rpm离心10分钟;倒置600rpm离心1分钟甩干;重复一次。
3)室温静置约半小时让其自然干燥。
在测序以前先要使DNA样品变性。变性的方法是在纯化后的样品中加入10μlHiDi(去离子甲酰胺),在PCR仪上95℃保持5分钟使之完全变性。变性后即刻放入冰中至少2分钟防止其复性。
接着上样至ABI PRISM3100测序仪/分型仪(Applied Biosystems)进行测序。
3、结果
双向测序结果表明先天性无虹膜症家系的PAX6基因第6外显子第323位碱基,有一个C->A的点突变,突变前的PAX6基因的第6外显子的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示,突变后的PAX6基因的第6外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。导致编码第108位丝氨酸的遗传密码子(TCC)变成酪氨酸的遗传密码子(TAC),即发生了S108Y突变。家系所有无虹膜症患者都具有相同的点突变,而家系内其余正常个体和100名正常对照都没有此突变。其对比结果如图1和图2所示。
由此说明,本发明的突变位点并非是罕见的SNP位点。同时也确定了PAX6基因第323位碱基的C->A点突变是该家系的致病基因突变。
Claims (5)
1.一种先天性无虹膜症致病基因,其特征在于所述的致病基因是突变的PAX6基因(Paired box6),该PAX6基因的第6外显子的第323位碱基,有一个C->A的点突变。
2.权利要求1所述的先天性无虹膜症致病基因在制备诊断或检测先天性无虹膜症试剂中的应用。
3.一种用于先天性无虹膜症致病基因检测的试剂盒,其特征在于该试剂盒包括:2mM dNTPs,10×PCR反应缓冲液,DNA聚合酶,PCR扩增引物对和双蒸水,其特征在于:所述的PCR扩增引物对由引物1和引物2组成,其中,引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于该试剂盒用于先天性无虹膜症致病基因的扩增,其采用Touch-down PCR进行扩增,反应程序为:
95℃预变性2分钟,然后进入第一个循环,95℃变性40秒,63℃退火复性30秒,72℃延伸1min,之后每循环一次降低0.5℃,共进行14个循环,之后进入主循环,95℃变性40秒,57℃退火复性30秒,72℃延伸1min,共进行25个循环,72℃延伸10min,4℃保存。
5.权利要求3或4所述的一种先天性无虹膜症致病基因检测试剂盒在制备诊断或检测先天性无虹膜症试剂中的应用。
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